本申请要求申请日为2007年12月27日的美国临时申请No.61/009,328的优先权，在此将其全部内容并入本文以作为参考。
技术领域：
本发明涉及培养哺乳动物细胞、特别是可分泌异源和/或重组体蛋白的哺乳动物细胞、更具体地讲是可分泌血液蛋白质比如凝血因子VIII(在下文中称为“因子VIII”、或仅称为“FVIII”)、ADAMTS-13、弗林蛋白酶或凝血因子VII(在下文称为“因子VII”、或仅称为“FVII”)的哺乳动物细胞的方法。
背景技术：
：凝血因子VIII是在哺乳动物中发现的微量血浆糖蛋白，并且在因子X的活化中作为IXa的辅因子被包含。因子VIII的遗传性缺乏导致出血病症A型血友病，该疾病能够用纯化的因子VIII成功地治疗。该因子VIII能够由血浆中萃取出来，或者能够通过基于重组DNA的技术而制备。在血浆中，其作为与vonWillebrand因子(vWF)的复合物而循环。重组因子VIII(rFVIII)能够被用载有编码因子VIII分子的DNA序列的载体转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产。某些情况下，重组因子VIII与重组vonWillebrand因子(rvwf)一起被共同产生，后者可稳定因子VIII。这种共同生产可能涉及到表达FVIII和VWF的各个细胞系的共培养、或者两种蛋白质在相同细胞中的共表达。参见US5250421(遗传学研究所)和Kaufman等((1989)Mol.Cell.Biol.9,1233-1242)。在用于制备重组体因子VIII的典型方法中，细胞在培养基中培养并且将因子VIII分泌入培养基中。然后因子FVIII可以，任选地作为与vWF的复合物，被从培养基中纯化出来。由于在本
技术领域：
已知的方法中得到相对低的产率，所以重组因子VIII的生产是昂贵的。单位细胞产量与可以得到的其他重组体蛋白的产量相比趋于较低。如果培养基不补充动物产品比如血清，培养基可能仅支持相对低的细胞密度。这会降低单位体积培养基的产量。然而，人们期望不用动物产品来补充培养基，以便降低病毒及其他可传染性试剂的污染风险。用于生产FVIII的无动物蛋白培养基已知例如被US6936441(巴克斯特公司)报道了。本发明提供了用于生产血液蛋白质包括rFVIII的方法，其中产率与本
技术领域：
已知的方法相比得到了提高。技术实现要素：本发明的第一个方面提供了一种在细胞培养上清液中培养分泌异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其中该细胞培养上清液保持在设定在X±0.9℃的温度下，其中X为35.1至36.5的值，附带条件是温度被设定为低于37℃。本发明的第二个方面提供了一种在细胞培养上清液中培养分泌异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其中，该细胞培养上清液被保持在设定为X±0.05的pH，其中X为7.15至7.20的值，附带条件是pH被设定为大于7.10。本发明的第三个方面提供了一种在细胞培养上清液中培养分泌异源蛋白质的哺乳动物细胞的方法，其中该细胞培养上清液的CO2浓度为1-10％。本发明的第四个方面提供了一种在包含细胞培养上清液的容器中连续培养分泌FVIII的哺乳动物细胞的方法，其中，在细胞培养上清液中的细胞密度通过在线(in-line)传感器测量，并且新鲜培养基进入容器的流入量被自动地控制，从而保持细胞的密度在期望的范围内。具体实施方式在本发明第一个方面的过程中，其中哺乳动物细胞被培养的细胞培养上清液被保持在设定为X±0.9℃的温度下，其中X为35.1至36.5的值，附带条件是温度被设定为低于37℃。在优选的实施方式中，温度被设定为36±0.9℃、优选36±0.5℃、更优选36±0.2℃，并且最优选36℃；或者35.1±0.9℃、优选35.1±0.5℃、更优选35.1±0.2℃，并且最优选35.1℃；或者36.5±0.9℃、36.5±0.5℃、更优选36.5±0.2℃，并且最优选36.5℃。术语“细胞培养上清液”是在其中培养哺乳动物细胞的培养基。该培养基不允许被与可能被加至培养物中的补料培养基相混，虽然补料培养基也优选在为细胞培养上清液所设置的温度处被加至培养物中。术语“培养物”，我们是指细胞培养上清液和在其中培养的哺乳动物细胞。通常，在37℃下培养哺乳动物细胞。令人惊讶的是，申请人发现，在较低温度比如36℃下培养哺乳动物细胞可提高重组体蛋白的产率。术语“培养”或“保持”的温度，我们指的是过程控制系统所设置的温度，换句话说，是预期的、目标温度。显然，随时间过去、以及在培养容器中从一个位置到另一个位置，培养物的温度将有小的变化。在此我们述及的“培养”或“保持”的设定为X±Y℃的温度，我们指的是设置值为从X+Y℃至X-Y℃。如此，例如，其中X是36.0±0.9℃，设定值被设定为从35.1到36.9的值。对于X的每一个优选值，设定值是在X±0.9℃、±0.8℃、±0.7℃、±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、或者±0.1℃的范围内。优选较窄的范围。X的一个设定值是最优选的。对于任何给定的设定值，可以发生轻微的温度变化。典型地，可以发生这种变化，因为加热和冷却装置仅在温度已经稍微偏离设定值之后才被启动。在该情形中，视情况而定，设定值是X(±Y)，并且当温度变化±Z℃时启动加热或冷却装置。典型地，温度在加热或冷却装置被启动之前偏离设定值的可允许的偏差度可以被过程控制系统编程。温度可以被受恒温器控制的加热和冷却装置控制到最接近±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃或甚至±0.1℃。较大的温度差别也可以被编程，比如±0.9℃、±0.8℃、±0.7℃或±0.6℃。温度也可以受培养容器在特定温度的加热池中的浸没情况所控制。可信地，因为不断地采用加热，没有偏离设定值。由于细胞培养上清液的温度测量误差，所以产生了另一个变化起源。在细胞培养设备中使用的典型温度计可以具有±0.3℃或±0.2℃、甚至±0.1℃的变化。若设定值被设定为在X±Y℃范围内的值，并且温度的容许偏差是±Z℃(即，视情况而定，当温度偏离±Z℃时，加热器或冷却器被启动)，则这还可以表示为(X-Y至X+Y)±Z℃的设定值。对于每个可能的X值，如上所述，可想到±Y℃与±Z℃的所有组合，附带条件是温度被设定为低于37℃。在一个优选的实施方式中，温度被设定为36±Y℃。优选温度被设定为(35.4-36.6)±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.5-36.5)±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.6-36.4)±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.7-36.3)±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.8-36.2)±0.7℃、±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.9-36.1)±0.8℃、±0.7℃±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者36±0.9℃、±0.8℃、±0.7℃、±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0℃。在另一个优选的实施方式中，温度被设定为35.1±Y℃。优选温度被设定为(34.5-35.7)±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(34.6-35.6)±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(34.7-35.5)±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(34.8-35.4)±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(34.9-35.3)±0.7℃、±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(35.0-35.2)±0.8℃、±0.7℃、±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者35.1±0.9℃、±0.8℃、±0.7℃、±0.6℃、±0.5℃、±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0℃.在另一个优选的实施方式中，温度被设定为36.5±Y℃。优选温度被设定为(36.1-36.9)±0；或者(36.2-36.8)±0.1℃或±0；或者(36.3-36.7)±0.2℃、±0.1℃或±0；或者(36.4-36.6)±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0；或者36.5±0.4℃、±0.3℃、±0.2℃、±0.1℃或±0。在本发明第二个方面的过程中，细胞培养上清液被保持在设定为X±0.05的pH下，其中，X为从7.15到7.20的值，附带条件是pH被设定为大于7.10。在优选的实施方式中，pH被设定为7.20±0.05、优选7.20±0.03、更优选7.20±0.01、并且最优选7.20；或者7.15±0.05、优选7.15±0.03、更优选7.15±0.01、并且最优选7.15。在生产重组体蛋白的普通方法中，细胞培养上清液被保持在pH7.1。令人吃惊的是，申请人发现，在更高的pH、比如pH7.2处培养哺乳动物细胞，可提高重组体蛋白的产率。术语“培养”或“保持”的pH，我们指的是过程控制系统所设置的pH，换句话说，是预期的、目标pH。在此述及的“在其下培养”或“在其下保持”的设定为X±Y的pH，我们是指设定值为从X+Y到X-Y。对于每一个优选的X值，设定值是在x±0.05、±0.04、±0.03、±0.02或±0.01范围内的值。优选范围较窄。X的一个设定值是最优选的。对于任何给定的设定值，可以发生轻微的pH变化。典型地，可以发生这种变化，因为控制pH的手段，例如通过添加酸或碱、或者改变鼓泡速度，是仅在pH已经稍微偏离设定值之后才被启动。典型地，控制pH至最接近±0.05、±0.04、±0.03、±0.02或±0.01的pH单位。若pH设定值被设定为在X±Y范围内的值，并且容许偏差是±Z，则该设定值还可以被表示为(X-Y至X+Y)±Z的设定值。对于每个可能的X数值，如上所述，所有±Y和±Z的组合，附带条件是pH被设定为大于7.10。在一个优选的实施方式中，pH被设定为7.20±Y。优选pH被设定为(7.15-7.25)±0；或者(7.16-7.24)±0.1或±0；或者(7.17-7.23)±0.2、±0.1或±0；或者(7.18-7.22)±0.3、±0.2、±0.1或±0；或者(7.19-7.21)±0.4、±0.3、±0.2、±0.1或±0；或者7.20±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1或±0.在另一个优选的实施方式中,pH被设定为7.15±Y。优选pH被设定为(7.11-7.19)±0；或者(7.12-7.18)±0.1或±0；或者(7.13-7.17)±0.2、±0.1或±0；或者(7.14-7.16)±0.3、±0.2、±0.1或±0；或者7.15±0.4、±0.3、±0.2、±0.1或±0.在本发明第三个方面的过程中，细胞培养上清液的CO2浓度为1至10％，例如4.0-9.0％、5.5-8.5％或约6-8％。通常，由于细胞产生的CO2不被从细胞培养上清液中除去，所以CO2浓度高于此浓度。令人惊讶的是，申请人已发现，CO2浓度保持在10％以下会提高重组体蛋白的产率。如果补料培养基被脱气(例如，通过空气鼓泡穿过该培养基)、以及在生物反应器中的细胞培养上清液被鼓泡，会有助于dCO2保持较低。优选本发明头三个方面中每一个的方法被操作得相对于本发明其他方面中一个或多个的方法而包括特定的限定特征。换句话说，其中，温度被保持在X±0.9℃，其中X为35.1至36.5℃的值；优选也还保持pH在X±0.05，其中X为7.15到7.20的值；并且CO2浓度在10％以下。若pH被保持在X±0.05，其中X为7.15至7.20的值；则有利的是还保持温度在X±0.9℃，其中X为35.1至36.5℃的值；并且/或者CO2浓度在10％以下。若CO2浓度被保持在10％以下；则有利的是还保持pH在X±0.05，其中X为7.15至7.20的值；并且/或者温度在X±0.9℃，其中X为35.1至36.5℃的值。监控这三个限定参数(温度、pH和CO2浓度)的方式是本
技术领域：
众所周知的，并且一般依赖于被插入生物反应器中、或者被包括在穿过培养基循环的回路中、或者被插入培养基的抽取样本中的探针。合适的在线dCO2传感器及其应用在文献Pattisonetal(2000)Biotechnol.Prog.16:769-774中被描述。合适的在线pH传感器是MettlerToledoInPro3100/125/Pt100(Mettler-ToledoIngold公司，Bedford，麻州)。用于测量除pH和pO2之外的dCO2的合适脱机系统是BioProfilepHOx(Nova生物医学公司，Waltham，麻州)。在该系统中，通过电位电极测量在3-200毫米汞柱范围内的dCO2，不精确性分辩率是5％。可以在37℃的温度下在该系统中测量pH，37℃的温度接近在生物反应器中的细胞培养上清液温度。改变限定参数以便保持其在预定水平的方式也是众所周知的。例如，保持温度恒定通常涉及到加热或冷却生物反应器或补料培养基(如果其是补料分批法或者连续法)；保持pH恒定通常涉及到选择和提供足够的合适缓冲液(典型地是碳酸氢盐)并且根据需要向补料培养基中添加酸比如盐酸、或者碱比如氢氧化钠、碳酸氢钠或其混合物；保持CO2浓度常数通常涉及到调节鼓泡速度(参见下文)、或者调节液面上空间CO2的流动。在线pH探针的校准可以随时间、比如在数天或数周培养细胞的整个期间变化是有可能的。在该情形中，可以有利于通过使用由最近校准的脱机探针获得的测量值来重新设置在线探针。合适的脱机探针是BioProfilepHOx(Nova生物医学公司，Waltham，麻州)。本发明人已发现，就活性蛋白质的生产而言，提高pH(例如通过添加NaOH)不足以取得最大益处。取而代之的是，优选降低CO2浓度。一般来讲，人们愿意保持该工艺的其他参数恒定。然而，本发明人发现，优选降低CO2浓度，但优选允许无需添加NaOH就使pH例如从7.1升高至7.15或7.2。哺乳动物细胞培养需要氧气用于细胞生长。一般来讲，这可通过将氧气经过进样口压入培养物而提供。还必需除去由于细胞呼吸而积累的CO2。这通过鼓泡而实现，即，使气体穿过生物反应器以便携带并吹洗CO2。通常，这还可以通过使用氧而进行。然而，本发明人发现，优选使用空气代替。研究发现，通常情况下，在鼓泡CO2时普通的惰性气体比如氮与使用空气相比效果较小。假定空气含约20％的氧气，人们或许认为将使用5倍的空气。然而，已发现在大规模培养中这是不够的，特别是在2500L规模下培养时。在2500L生物反应器中，使用7至10倍多的空气、优选约9倍多的空气。例如，在标准大气条件下，2500L生物反应器用气泡大小为10μm的O2以0.02VVH(每小时每体积培养物的O2体积)速率进行鼓泡。根据本发明的方法，使用相同的2500L生物反应器，将会用空气以10μm的气泡大小以0.18VVH的速率进行鼓泡。因此，已经发现使用惊人高的容量的空气来提供足够的供氧并且除去不希望有的CO2。在生产期期间，优选通过空气鼓泡来除去CO2，如上所述。在使用大容量生物反应器的情形中尤其如此，否则其中细胞培养上清液将会累积CO2至有害的高水平。然而，在培养开始、或小规模培养时，比如为1升或2.5L规模，液面上空间(headspace)可以被CO2覆盖。在这样的条件下，仍然可以取得低水平的dCO2。如果pH太过碱性，用CO2覆盖该液面上空间也可以被采用，来将pH降低至设定值。细胞可以是任何能够优选在生产工艺(即，至少1升)中被培养以便生产期望蛋白质比如FVIII的哺乳动物细胞。其例子包括：被SV40(COS-7，ATCCCRL1651)转化的猴肾CV1细胞系；人胚肾细胞系(293或用于在悬浮培养中生长的293细胞亚克隆，Grahametal,J.GenVirol.,36:59[1977])；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR，比如DUKX-B11亚克隆(CHO,Uriaubhe和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216[1980])；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather.Biol.Reprod.，23:243-251[1980])；猴肾细胞(CV1ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(Vero-76，ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL75)；人肝细胞(HEPESG2，HB8065)；小鼠乳腺瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Matheretal.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.,383:44-68[1982])；MRC5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(HEPESG2)。优选细胞系是啮齿动物细胞系，尤其是仓鼠细胞系比如CHO或BHK。制备可表达重组体蛋白的稳定的CHO细胞克隆的一种优选方法如下所述。基本上按照US5,250,421(Kaufman等，遗传学研究所公司)中描述的方法，用DHFR表达载体转染DHFR缺乏型CHO细胞系DUKX-BII，以便允许表达相应的重组体蛋白。用氨甲蝶呤对转染进行选择。通过在提高氨甲蝶呤浓度中增殖细胞，实现了用于表达重组体蛋白的相应编码区域和DHFR基因的扩增。如果合适的话，基本上按照US6,100,061(Reiter等，lmmunoAktiengesellschaft)中描述的方法，可以采用CHO细胞系用于在血清和/或无蛋白的培养基中培养。选择的用于培养寄主细胞系的基础培养基对于本发明而言不是关键的，并且可以是在本
技术领域：
已知的适合于培养哺乳动物细胞的那些培养基中的任何一种或组合的。培养基比如Dulbecco改进Eagle培养基、Ham'sF-12培养基、Eagle最低必需培养基和RPMI-1640培养基等可在市场上买到。生长因子比如重组胰岛素的添加是任选的。历史上，一直在含有动物血清的培养基中培养动物细胞。然而，这样的培养基是不完全限定的并且带有感染的风险。本领域的技术人员因此已设计出“无蛋白质的”培养基，其或者完全不含任何蛋白质，或者至少不含任何不是通过重组方式生产的蛋白质。由于因子VIII的不稳定本性，在无蛋白质的条件下，基因工程寄主细胞的生产率被严重降低。人血清白蛋白通常被用作无血清培养基补充物，用于重组蛋白的生产。该白蛋白本身可稳定FVIII，并且存在于血清衍生的白蛋白制品中的杂质还可以对白蛋白的稳定化作用做出贡献。因子比如脂蛋白已经被鉴定作为用于在无血清条件下生产重组因子VIII的人血清白蛋白的代替者。优选的培养基包括在US6171825(拜耳公司)和US6936441(巴克斯特公司)中公开的那些培养基。US6171825中的培养基由改进的Dulbecco最低必需培养基和Ham'sF-12培养基组成(50:50，以重量计地)，补充有重组胰岛素、铁、多元醇、铜和任选的其他痕量金属。胰岛素应该是重组体，并且可以由礼莱公司作为“Nucellin”胰岛素得到)。它能够被以0.1至20μg/ml(优选5-15μg/ml、或者约10μg/ml)的浓度加入。铁优选呈Fe2+离子形式，例如作为FeSO4EDTA提供，并且能够以5-100μm(优选约50μm)的浓度存在。合适的多元醇包括聚(氧化乙烯)和聚(氧化丙烯)的非离子型嵌段共聚物，其分子量的范围是约1000至约16,000。尤其优选的多元醇是PluronicF-68(BASF温多特公司)，其平均分子量是8400，并且由中心嵌段聚(氧化丙烯)(20wt％)和在两个末端的嵌段聚(聚(氧化乙烯)组成。也可使用购自UnichemaChemieBV的SynperonicF-68。其他的多元醇包括PluronicF-61、F-71和F-108。可以以相当于50-800nMCuSO4、优选100-400nM、通常约250nM的含量添加铜(Cu2+)。包含一组痕量金属比如锰、钼、硅、锂和铬能够导致进一步提高因子VIII产量。BHK细胞在这些无蛋白质的基础培养基中生长良好。US6936441的培养基也是基于DMEM和Ham'sF12为50/50的混合物，但是包括在0.1和100g/L之间、优选在1和5g/L之间的大豆蛋白胨或酵母提取物。作为尤其优选的实施方式，可以使用大豆萃取物例如大豆蛋白胨。大豆蛋白胨的分子量可以小于50kD、优选小于10kD。添加平均分子量是350道尔顿的超滤的大豆蛋白胨已经证明特别有利于重组细胞系的生产。大豆分离蛋白的总氮含量为约9.5％，并且游离氨基酸含量为约13％或约7-10％。尤其优选的培养基具有下述组合物：合成基本培养基(例如50/50DMEM/Ham'sF12)1至25g/L；大豆蛋白胨0.5至50g/L；L-谷氨酰胺0.05至1g/L；NaHCO30.1至10g/L；抗坏血酸0.0005至0.05g/L；乙醇胺0.0005至0.05；以及亚硒酸钠1至15μg/L。任选地，可以向培养基中添加非离子表面活性剂比如聚丙二醇(例如PluronicF-61、PluronicF-68、PluronicF-71或PluronicF-108)作为消泡剂。该试剂一般被用于保护细胞不受通气(“鼓泡”)的负面影响，因为在没有添加表面活性剂的情况下上升并破裂的气泡可以损害那些在气泡表面处的细胞。非离子表面活性剂的含量范围可以在0.05和10g/L中间、优选在0.1和5g/L之间。另外，培养基还可以含有环糊精或其衍生物。优选无血清和蛋白质的培养基含有蛋白酶抑制剂比如丝氨酸蛋白酶抑制剂，其适合于组织培养并且是源于合成或源于植物。在另一个优选的实施方式中，可额外地向上述培养基中添加下述氨基酸混合物：L-天冬酰胺(0.001至1g/L；优选0.01至0.05g/L；特别优选0.015至0.03g/L)、L-半胱氨酸(0.001至1g/L；优选0.005至0.05g/L；特别优选0.01至0.03g/L)、L-胱氨酸(0.001至1g/L；优选0.01至0.05g/L；特别优选0.015至0.03g/L)、L-脯氨酸(0.001至1.5g/L；优选0.01至0.07g/L；特别优选0.02至0.05g/L)、L-色氨酸(0.001至1g/L；优选0.01至0.05g/L；特别优选0.015至0.03g/L)和L-谷氨酰胺(0.05至10g/L；优选0.1至1g/L)。可以将这些氨基酸分别地或组合地添加至培养基。尤其优选组合添加含有上述所有述及的氨基酸的氨基酸混合物。在特定的实施方式中，使用的无血清和蛋白质的培养基额外含有上述氨基酸混合物和经纯化的、超滤的大豆蛋白胨的组合。US6936441的培养基特别非常适合于培养CHO细胞，但是同样可以用于其他的细胞。更合适的培养基是在US2007/0212770(Grillberger等；巴克斯特国际公司、巴克斯特保健股份有限公司)中公开的无寡肽的培养基。优选培养基是通过利用碳酸氢盐离子、典型地作为碳酸氢钠提供而被缓冲。适当地，培养基的渗透压度在210和650mOsm(毫克渗透压)之间，优选270至450mOsm，更优选310至350mOsm，并且最优选320mOsm。优选上清液的渗透压度保持在本发明全部方法的一个或多个这些范围内。培养可以是任何普通型的培养，比如分批、补料分批或者连续式，但是优选是补料分批式或连续式。合适的连续培养包括重复分批培养、恒化培养、恒浊培养或灌注培养。分批培养从所有的营养和需要的细胞开始，并且培养进行直至完成，即，直到营养被耗尽或者由于某种原因培养被停止。补料分批培养是一种分批方法，从意义上讲，其从细胞和营养开始，但是其然后以一种控制方式用进一步的营养进行补料，以便限制细胞的培养。该补料分批策略典型地在生物工业生产中被采用，以便在生物反应器中达到较高细胞密度。该补料溶液通常是高度浓缩物，以避免生物反应器的稀释。营养受控制的添加直接影响到培养物的生长速率，并且允许避免溢流新陈代谢(形成新陈代谢副产品)和氧气限制(厌氧生活)。最常见的情况是，生长限制性的营养是葡萄糖，其作为高度浓缩葡萄糖浆(例如600-850g/L)被供应至培养物。不同的策略能够被用于控制在补料分批法中的培养。例如，任何溶解氧张力(DOT、pO2)、摄氧率(OUR)、葡萄糖浓度、乳酸盐浓度、pH和氨水浓度能够通过保持参数恒定而被用于监控和控制培养物生长。在连续培养中，营养被添加，并且典型地，培养基被抽出，以便除去不希望有的副产品并保持稳定状态。合适的连续培养法被是重复的分批培养、恒化培养、恒浊培养和灌注培养。CHO细胞，例如，可以在灌注合适的培养基的搅拌罐或气升罐中培养，灌注速度是每天2至10个体积交换，并且氧浓度在40％和60％之间、优选约50％。另外，该细胞可以利用恒化器方法进行培养，采用上述给定的优选pH值，氧浓度在10％和60％之间(优选约20％)，以及稀释率D为0.25至1.0、优选约0.5。在重复的分批培养、亦称串联次培养(serialsubculture)中，细胞被置于培养基中并且生长至期望的细胞密度。为避免衰退期开始和细胞死亡，在细胞达到它们的最大浓度之前用完全生长培养基稀释培养物。稀释量和频数变化范围很大，并且取决于细胞系的生长特点和培养方法的便利性。该方法能够根据需要被多次重复，除非细胞和培养基在次培养中被弃去，培养物的体积将随每次稀释而逐级增加。增加的体积可以通过使反应器尺寸足够大以允许在容器内部稀释、或者通过将稀释的培养物分配入数个容器而被加工。这类培养的基本原理是保持细胞处于指数生长状态。串联次培养的特征在于，培养物的体积始终逐级增加，可以有多次收获，细胞持续生长，并且该方法能够如期持续下去。在恒化器和恒浊器方法中，抽出的培养基含有细胞。因此，保持在细胞培养容器中的细胞必须生长以保持稳定状态。在恒化器方法中，典型地通过控制稀释率即新鲜培养基加入速度来控制生长速率。细胞被在次最大生长速率下培养，这通过限制稀释率而实现。生长速率典型地较高。相反，在恒浊器方法中，稀释率被设定为在给定工作条件比如pH和温度下细胞能够取得的允许最大生长速率。在灌注培养中，抽出的培养基没有细胞，因为大多数细胞被保持在培养容器中，例如被保持在抽出的培养基所流过的薄膜上。然而，典型地，这样一种薄膜不会保留100％的细胞，并且如此当培养基被抽出时一部分被除去。对于以非常高的生长速率操作灌注培养可以不是关键的，因为主要的细胞被保留在培养容器中。连续培养，特别是重复的分批培养、恒化器培养和恒浊器培养，典型地被以较高的生长速率操作。根据普通的实践，典型的是设法保持生长速率在最大值、或者接近最大值，努力得到最大体积生产率。以每一时间间隔每体积培养物的蛋白质量或活性的单位测量体积测定生产率。较高的细胞生长等同于每天生产出较大体积的培养物，并且因此通常被认为反映了较高的体积生产率。本发明的发明人意外地发现，在特定的实施方式中，最大体积生产率不是在细胞的最大生长速率处获得的。如实施例中所述，在恒化培养中表达弗林蛋白酶的CHO细胞克隆的最大生长速率是在36.5℃的温度下观察到的，但是最大体积生产率是在35.1℃处观察到的。尽管由于在较低温度下导致较低的生长速率，得到较低的收获体积，但产生的重组蛋白含量却大得多，以至于总之越低的温度培养是产量越高。适当地，在本发明的第一、第二或第三个方面中，细胞培养上清液被保持在一个温度下，其被设定为低于观察到最大生长速率时温度至少0.5℃、优选至少1.0℃的温度。本实施方式中，优选培养是连续培养，特别是重复的分批培养、恒化器培养或恒浊器培养。哺乳动物细胞比如CHO和BHK细胞一般地被培养为悬浮培养液。也就是说，细胞被悬浮于培养基中，而不是粘附在固体支持物上。细胞可以可选地被固定化在载体上、尤其是在微载体上。多孔载体，比如或可以是特别合适的。通常在细胞培养物中监控细胞密度。原则上，高细胞密度将被认为是期望的，因为，假如要保持单位细胞生产率，这应该导致每生物反应器体积较高的生产率。然而，实际上提高细胞密度可能对细胞有害，并且单位细胞生产率被降低。因此需要监控细胞密度。迄今，在哺乳动物细胞培养方法中，这已经通过如下方法进行：抽取培养液样本，在显微镜下或者使用细胞计数装置比如购自德国Reutlingen市ScharfeSystems有限公司的CASYTT装置分析它们。我们目前已发现，利用合适的导入(或导入培养基穿过、并且悬浮细胞经过其、然后返回到生物反应器的回路)生物反应器本身的探针来分析细胞密度是有利的。这些探针是可从Aber仪器公司商业购买的，例如BiomassMonitor220、210、220或230。在培养物中的细胞可用作在电场影响下的微小电容器，因为绝缘的细胞膜允许堆积电荷。得到的电容能够被测量；这取决于细胞类型，并且与活细胞的浓度成正比。10至25mm直径的探针使用两个电极来把射频场施加到生物质和第二对电极上，以便测量最终的极化细胞的电容量。得到的信号的电子加工产生输出信号，其是活细胞浓度的一种精确测量手段。该系统对具有渗漏的细胞膜、培养基、气泡和碎片的细胞不敏感。典型地，细胞密度是1.0x106至5.0x106个细胞/ml、适当地为1.0x106至3.5x106个细胞/ml、适当地为1.4x106至2.8x106个细胞/ml、优选为1.6x106至2.6x106个细胞/ml、最优选1.8x106至2.4x106个细胞/ml。向优选范围的较高端提高细胞浓度能够提高体积生产率。尽管如此，可联想到包括作为范围较高端和较低端的上述设定值中任何一个的细胞密度的范围。培养典型地在生物反应器中进行，该生物反应器通常是1升至10000升容量例如5、10、50、100、1000、2500、5000或8000升的不锈钢、玻璃或塑料容器。该容器通常是刚性的，但是软质塑料袋能够被使用，特别是对于较小规模而言。这些容器一般是“一次使用”类型。通过本发明的头三个方面中的任何一种方法生产的异源的或重组的蛋白质优选是血液蛋白质。术语“血液蛋白质”，我们包括存在于或能够存在于人或动物血液中的任何蛋白质，包括被改造成用于静脉注射的蛋白质。合适的血液蛋白质包括：血清白蛋白，凝血因子I、II、III、V、VII、VIII、IX、X、XL、XII和XIII，弗林蛋白酶、vonWillebrand(冯维勒布兰特)因子，组织纤溶酶原激活物，白介素，干扰素，金属蛋白酶比如ADAMTS蛋白酶(例如ADAMTS-13)，免疫球蛋白比如IgG、IgM、IgA或IgE和免疫球蛋白片段。合适的抗体或免疫球蛋白片段包括：Fab样分子(Better等，(1988)Science，240，1041)；Fv分子(Skerra等，(1988)Science240，1038)；单链Fv(ScFv)分子，其中VH和VL伴侣结构域通过柔韧的寡肽被连接(Bird等，(1988)Science，242，423；Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85，5879)以及包含分离的V结构域的单域抗体(dAbs)(Ward等，(1989)Nature.341，544)。免疫球蛋白和它们的片段可以被“人源化”。换句话说，啮齿动物来源的可变域可以被融合于人类来源结构域的恒区，从而使得到的抗体保留了啮齿动物亲代抗体的抗原专一性(Morrisoneta/(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81,6851-6855)。在一种优选的实施方式中，细胞培养物被用于任选地与冯维勒布兰特因子(vWF)一起生产因子VIII。能够将vWF单独地加入培养基中，并且优选是重组体。作为另一种选择，vWF能够通过在培养物中包括分泌vWF的细胞、以及分泌FVIII的细胞而被共同生产。然而，优选FVIII和VWF被共表达，即，每个细胞可同时分泌FVIII和VWF。重组VWF可以按照在文献Schlokat等(1995)，“重组vonWillebrand因子的大规模生产”，ThrombosisandHaemostasis.78，1160或US6114146(巴克斯特公司)中描述的方法得到。后一专利还公开了能够被用于与分泌FVIII的细胞共同生产vWF的细胞。在US5250421(遗传学研究所)和Kaufman等(1989)，Mol.CellBiol.9,1233-1242中公开了共表达这两种蛋白质的细胞。在此使用的术语“因子VIII”表示具有凝血因子VIII活性的任何多肽或多肽复合体。激活的因子VIII在因子X向因子Xa的转化中具有辅助因子功能，该转化在存在磷脂和钙离子的条件下被因子IXa启动。通常，在合适的测定中，由促进因子X向因子Xa的转化的程度能够估计出活性因子VIII的数量。在典型的测定中，因子Xa水解特定的显色底物，从而释出生色团，其数量通过分光光度法确定。可商业购买的测定试剂盒包括：因子VIII显色分析试剂盒(DadeBehring，瑞士；US6,100,050)；以及Coatest因子VIII试剂盒(Chromogenix，瑞典)。在人类身上的因子VIII浓度限定为1IU/ml血液。Coatest因子VIII试剂盒能够确定相当于至少0.01IU/ml血液的FVIII活性。要被认为是如上限定的因子VIII，多肽或多肽复合体必须具有至少天然因子VIII的1％活性，以使得当以与天然因子VIII相同的纳摩尔浓度存在于血液中时，其活性可通过Coatest因子VIII测定法检测。用于本发明方法的生产的合适的FVIII是天然的、全长FVIII。猪FVIII可以根据本发明被生产出来，但是更优选人FVIII。作为天然FVIII的替代物，能够制备出变体和同功异质体。本
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已知例如美国专利No.5422260、4749780、4868112、4877614和5171844所述的变体和缺失衍生物。术语“重组因子VIII的缺失衍生物”被定义为具有因子VIII活性、由全长因子VIII多肽通过删除一个以上氨基酸而衍生的一种以上多肽链。优选地，所述缺失衍生物没有大部分B结构域，但是保留了B结构域的氨基端和羧基端序列部分，这些序列对于在体内将最初的翻译产物蛋白水解加工成两个多肽链而言是必不可少的。鉴定为“r-VIIISQ”的这样一种因子VIII缺失衍生物的生产在WO91/09122中被描述。术语“r-VIIISQ”定义为由全长因子VIII衍生并缺乏氨基酸743至1636的多肽链。缺乏全部或部分B结构域的进一步的FVIII变体在US6358703中有描述。在US5854021中公开了用于转化CHO和293S细胞的合适载体。表达FVIII的BHK细胞可以按照在文献Wood等(1984)，Nature.312，330-337中公开的方法制备出来，或者由ATCC作为培养物CRL-8544得到。表达删除B结构域的FVIII变体的CHO细胞在文献Lindetal(1995),Eur.J.Biochem.232,19-27和US5661008中有描述。三个这样的细胞类型被保藏在德国微生物菌种保藏中心，包藏编号为DSM6415、DSM6417、以及DSM6416。当FVIII和VWF被共同生产时，它们之间的复合体可以通过如下步骤进行提纯：离心培养基以除去细胞，然后在不会引起复合体分离的条件下，将得到的液体加载到含有FVIII或VWF的抗体、或者可特异性地结合FVIII或VWF的肽的固定化固体支持物上。合适的方法在US6307032(巴克斯特公司)和US5200510(ZymoGenetics)中有教导。FVIII(任选地与vWF复合)然后可以被配制并以已知的方式使用。例如，按照在例如在中US6586573(巴克斯特国际公司)、WO94/07510或US6599724中公开的方法，已经在不含动物性蛋白质的培养基中生产出的FVIII优选被配制在无蛋白质的组合物中，并且用于治疗A型血友病病人。若本发明的方法被用于生产FVIII，则优选细胞培养上清液被保持在设定为36±0.9℃、优选36±0.5℃、更优选36±0.2℃、并且最优选36℃的温度和/或被设定为7.20±0.05、优选7.20±0.03、更优选7.20±0.01、最优选7.20的pH并且/或者细胞培养上清液的溶解CO2浓度为1至10％、优选4.0至9.0％、更优选5.5至8.5％。优选地，这些参数中的至少两个是在优选的限定范围内，即，温度和pH、温度和dCO2、或pH和dCO2。最优选所有三个参数被控制在优选的限定范围内。如实施例中所示，当本发明被用于生产FVIII时，优选在细胞培养上清液中包括铜。典型地，细胞在包含4ppbCu2+的细胞培养上清液中被培养。优选地，在细胞培养上清液中Cu2+的浓度是至少5ppb，并且优选至少7、10、15或25ppb。在可供选择的优选实施方式中，细胞培养物被用于生产ADAMTS-13。ADAMTS-13，亦称可切割vonWillebrand因子的蛋白酶(vWF-cp)，是金属蛋白酶家族的成员。其具有通过切割在vWF中残基Tyr-842和Met-843之间的肽键将大VWF多聚体代谢为较小形式的能力。该金属蛋白酶被Ca2_/Ba2激活，并且不被丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂抑制。不足的vonWillebrand因子(vWF)降解已经与血栓性血小板减少性紫癜(TTP)有关。在遗传性的TTP中，ADAMTS-13缺失或者功能性缺损；而在非家族性的、获得性形式的TTP中，在大部分病人中可短暂地观察到抑制ADAMTS-13活性的自体抗体。人类ADAMTS-13基因的克隆和表达在文献Plaimauer等，2002，Blood.15；100(10):3626-32中有描述。与cDNA的完全序列一起的人类ADAMTS-13基因的克隆和表达也在US2005/0266528A1(Laemmle等)中被公开。用于本发明方法生产的合适的ADAMTS-13是天然的、全长ADAMTS-13，优选人类ADAMTS-13。作为天然FVIII的替代物，能够制备出变体和同功异质体。在此使用的术语“ADAMTS-13”表示具有ADAMTS-13活性、特别是切割vWF中在残基Tyr-842和Met-843之间肽键的能力的任何多肽或多肽复合体。通常，活性ADAMTS-13的数量可以通过功能性测定、比如使用修饰的冯维勒布兰特因子肽作为ADAMTS-13的底物的功能性测定而确定(Tripodi等.J.Thromb.Haemost.2008年9月；6(9)：1534-41)。优选的确定r-huADAMTS13活性的方法在文献Gerritsenetal.“基于降低的降解vWF的胶原结合亲合力的切割vonWillebrand因子(vWF)的蛋白酶的测定：用于诊断血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的工具”，ThrombHaemost.1999；82:1386-1389中被公开。在该测定中，1U相当于在库存的正常人血浆中ADAMTS-13活性的水平。要被认为是如上限定的ADAMTS-13，多肽或多肽复合体必须具有天然ADAMTS-13活性的至少1％。ADAMTS-13的数量还可以通过测量ADAMTS-13抗原而确定，例如使用在文献Riegeretal,2006,ThrombHaemost200695(2):212-20中公开的ELISA方法。按照Plaimauer等(2002，参见前述)和US2005/0266528A1中描述的方法，通过在哺乳动物细胞培养物中表达，可以制备出蛋白水解活性的重组ADAMTS-13。在文献PlaimauerB,ScheiflingerF.SeminHematol.2004Jan；41(1):24-33中公开了表达ADAMTS-13的细胞的重组培养方法。用于表达ADAMTS-13的优选的细胞类型包括HEK-293细胞和CHO细胞。US2005/0266528A1和Zheng等，2001，Blood.，98:1662-1666公开了纯化ADAMTS-13的方法。可以根据惯常的方法将纯化的ADAMTS-13进行配制并且进行治疗性使用，例如用于治疗TTP。若本发明的方法被用于生产ADAMTS-13，则优选细胞培养上清液被保持在设定为36.0±0.9℃、优选36.0±0.5℃、更优选36.0±0.2℃、并且最优选36.0℃的温度和/或被设定为7.15±0.05、优选7.15±0.03、更优选7.15±0.01、最优选7.15的pH；并且/或者细胞培养上清液具有1至10％、优选4.0至9.0％、更优选5.5至8.5％的溶解CO2浓度。优选地，这些参数中的至少两个是在优选的限定范围内，即，温度和pH、温度和dCO2、或pH和dCO2。最优选所有三个参数被控制在优选的限定范围内。在可供选择的优选实施方式中，细胞培养物被用于生产弗林蛋白酶。弗林蛋白酶，也被称为PACE(配对碱性氨基酸切割酶)，属于枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶组，其在切割前体蛋白酶中、尤其在分泌腺合成中起重要作用(VandeVenetal.,Crit.Rev.Oncogen.,4:115-136,1993)。它是钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶(endoprotease)，在结构上安排成数个功能区，即信号肽、前体肽、催化结构域、同型B或P-结构域、位于C-末端的半胱氨酸富集域、横膜结构域和细胞质尾部。该蛋白酶裂解位点包含特征为氨基酸序列Arg-X-Lys/Arg-Arg的识别序列。该蛋白酶--弗林蛋白酶可切割特别地在该共有序列之后的前体肽(Hosakaetal.,1991,J.Biol.Chem.266:12127-12130)。完整的弗林蛋白酶被并入高尔基体的膜系统，并且其在那里具有功能活性(Bresnahanetal.,J.CellBiol.1990；111:2851-9)。一旦将新合成的弗林蛋白酶前体由内质网转运到高尔基体隔室，前体肽就会自身催化地分两个加工步骤被除去(Anderson等，EMBOJ.1997；16：1508-18)。弗林蛋白酶还经由红细胞浆质囊泡(endosomalvesicles)在转运高尔基体网络(trans-Golginetwork)和细胞表面之间循环，从而在两种前体蛋白质转运穿过组成性分泌路径、以及分子进入内吞路径期间加工它们。弗林蛋白酶的细胞分配至加工隔室通过其细胞质尾部内部的限定的结构特点而被引导(Teuchert等，J.Biol.Chem.1999；74：8199-07)。因为天然弗林蛋白酶的过量表达会消极地影响连续培养的细胞培养物的生长，所以人们已经设法降低溶液中弗林蛋白酶对细胞的毒性影响。已经发现C-末端功能区对于弗林蛋白酶的功能活性并非是必需的，并且体外表达的75-80kD的天然弗林蛋白酶的平截形式能够作为被分泌蛋白质而在细胞上清液中被检测出来(Wise等，PNAS.1990；87:9378-82)。这种天然分泌的平截弗林蛋白酶也被称为“棚式(shed)弗林蛋白酶”(Vidricaire等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1993；195:1011-8；Plaimauer等，Biochem.J.，2001；354:689-95)，并且是N-末端被切割的横跨膜部分(Vey等，J.CellBiol.1994；127：1829-42)。通过基因工程平截的弗林蛋白酶蛋白，其中横跨膜和细胞质结构域的编码部分已经被删除，已经描述所述结构域中分别删除氨基酸Δ714-794(Leduc等，J.Biol.Chem.1992；267：14304-8；Molloy等，J.Biol.Chem.1992；267：16396-402)和氨基酸Δ716-794(“SoI-PACE”，Wasley等，J.Biol.Chem.1993；268:8458-65；Rehemtulla和Kaufman，Blood.1992；79:2349-55)和氨基酸Δ705-794(Hatsuzawa等，J.Biol.Chem.1992；267：16094-9)。额外包含一个半胱氨酸富集区域的缺失的弗林蛋白酶突变体也已被描述(Hatsuzawa等，J.Biochem.1992；101:296-301；Creemers等，J.Biol.Chem.1993；268:21826-34)。WO2008/141824(巴克斯特国际公司、巴克斯特保健股份有限公司)公开了一种平截的缺少氨基酸578至794，即Δ578-794的人类弗林蛋白酶。在此使用的术语“弗林蛋白酶”表示具有弗林蛋白酶蛋白质分解活性的任何多肽或多肽复合体。弗林蛋白酶、平截的弗林蛋白酶或者弗林蛋白酶衍生物的蛋白质分解活性的评价能够通过任何合适的测试进行，例如使用由弗林蛋白酶对其特异的二碱基裂解位点所组成的荧光底物(Schlokat等，Biotechnol.Appl.Biochem.1996；24:257-67)。所述测定的1个单位被定义为于30℃下在1分钟内由荧光底物Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC释放1pmol的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)所用弗林蛋白酶的量。用于该测试的限定的量典型地是0.625U/ml。作为另一种选择，还可以通过将弗林蛋白酶与前体蛋白质、例如前体rvWF一起孵育足够的时间来测量蛋白质分解活性。例如通过Westernblotting能够分析前体rvWF的加工程度。能够通过ELISA测试来测量弗林蛋白酶抗原的定量。合适的ELISA测试手段是购自明尼苏达州R&D系统公司的人弗林蛋白酶DuoSet、Mn(目录编号DY1503)，其中小鼠抗人弗林蛋白酶被用作捕获抗体，并且生物素化山羊抗人弗林蛋白酶被用作检测抗体。用于本发明方法生产的合适的弗林蛋白酶是天然的、全长弗林蛋白酶，优选人类弗林蛋白酶。作为天然的替代物，能够制备出变体和同功异质体，包括如上所述的那些。用于使用弗林蛋白酶或弗林蛋白酶变体转化哺乳动物细胞、特别是CHO细胞的合适载体，连同用于纯化如此生产的弗林蛋白酶的方法一起在WO2008/141824(巴克斯特国际公司、巴克斯特保健股份有限公司)中有描述。WO91/06314(荷兰生物技术公司)描述了弗林蛋白酶表达载体、在哺乳动物细胞特别是COS-1细胞中表达弗林蛋白酶的方法、以及通过重组方式产生的弗林蛋白酶的纯化。WO92/09698(遗传学研究所和Chiron公司)描述了弗林蛋白酶或者单独、或者与vWF或因子IX结合一起在CHO细胞中的表达。在细胞培养期间，前体rVWF被内源产生的弗林蛋白酶加工成其成熟形式，该弗林蛋白酶在许多细胞类型中以相对低的水平被表达(Wise等，1990，PNAS.87:9378-9382)。通过异源弗林蛋白酶与前体rVWF的共表达，前体-rVWF加工能够被更有效率地完成。作为另一种选择，WO2008/141824建议，纯化的弗林蛋白酶可以适合于用作促进rVWF加工的试剂。若本发明的方法被用于生产弗林蛋白酶，则优选细胞培养上清液被保持在设定为35.1±0.9℃、优选35.1±0.5℃、更优选35.1±0.2℃、并且最优选35.1℃的温度和/或被设定为7.15±0.05、优选7.15±0.03、更优选7.15±0.01、最优选7.15的pH；并且/或者细胞培养上清液具有1至10％、优选4.0至9.0％、更优选5.5至8.5％的溶解CO2浓度。优选地，这些参数中的至少两个是在优选的限定范围内，即，温度和pH、温度和dCO2、或pH和dCO2。最优选所有三个参数被控制在优选的限定范围内。在可供选择的优选实施方式中，细胞培养物被用于生产因子VII。“因子VII多肽”包括野生型因子VII(即，具有在美国专利No.4,784,950中公开的氨基酸序列的多肽)，以及相对于野生型因子VII显示出基本上相同的或提高的生物活性的因子VII变体，并且因子VII变体相对于野生型因子VII具有基本上改变的或降低的生物活性。术语“因子VII”应当包括呈未被切割的(酶原)形式的因子VII多肽，以及已经被蛋白水解加工从而产生它们各自的生物活性形式的(可以被称为因子VIIa)的那些多肽。典型地，因子VII在残基152和153之间被切割而产生因子VIIa。术语“因子VII多肽”还包括多肽，包括其中因子VIIa生物活性相对于野生型因子VIIa的活性已经基本上改变或稍微降低的变体在内。这些多肽包括，但不限于，其特定的氨基酸序列中已经导入变化的因子VII或因子VIIa，所述变化改变或破坏了多肽的生物活性。因子VIIa在凝血中的生物活性来自其(i)结合组织因子(TF)并且(ii)催化因子IX或因子X的蛋白水解切割从而产生活化的因子IX或X(分别为因子IXa或因子Xa)的能力。因子VII多肽的生物活性(“因子VII生物活性”)可以按照例如美国专利No.5,997,864或WO92/15686中描述的方法，通过使用缺乏因子VII的血浆和促凝血酶原激酶来测量制品促进凝血的能力而被定量。在该测定中，生物活性被表示为相对于对照样品的凝固时间减少，并且通过与含有1个单位/mL因子VII活性的库存人血清标准相比较而被转算成“因子VII单位”。作为另一种选择，因子VIIa生物活性可以通过下述方法定量：(i)测量因子VIIa(或因子VII多肽)在包含包埋于类脂膜和因子X中的TF的体系中产生活化因子X(因子Xa)的能力(Persson等，J.Biol.Chem.272:19919-19924，1997)；(ii)测量在含水体系中的因子X水解情况；(iii)使用基于表面胞质基因共振的仪器测量因子VIIa(或因子VII多肽)对TF的物理结合(Persson，FEBSLetts.413:359-363，1997)；(iv)测量合成的底物被因子VIIa(或因子VII多肽)体外水解的情况；或者(v)测量在不取决于TF的体外系统中凝血酶的产生。作为另一种选择，可以通过ELISA确定FVII抗原。合适的ELISA是购自AssayPro公司(StCharles市，密苏里州)的AssayMaxHumanFactorVII(FVII)ELISA试剂盒，目录编号EF1007-1，其使用了单克隆抗人FVII作为捕获抗体，并且生物素化多克隆抗人FVII作为检测抗体。优选的用于天然(野生型)因子VIIa和/或因子VIIa变体的体外蛋白水解测定是在微孔板(MaxiSorp，Nunc，丹麦)中进行，如US2007/0219135(NovoNordisk保健公司)所述。因子VIIa(10nm)和因子X(0.8mM)在100ml含有0.1MNaCl、5mMCaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白的50mMHEPES，pH7.4中被孵育15分钟。然后通过添加的50mL含有0.1MNaCl、20mMEDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50mMHEPES，pH7.4来终止因子X切割。通过添加终浓度0.5mM的显色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺(S-2765，Chromogenix，瑞典)，测量产生的因子Xa的量。在340板中连续地测量在405nm处的吸光度。在减去不包含FVIIa的空白孔吸光度之后，在10分钟期间读出吸光度，可以用来计算变体的蛋白水解活性与野生型因子VIIa的蛋白水解活性之间的比率：比率＝(A405nm因子VIIa变体)/(A405nm因子VIIa野生型)。在该测定的变化中，FVII被确定。促凝血酶原激酶被包括在内。样品中的FVII与Ca2+离子和产生少量FXa的组织因子形成复合物。FXa将FVII活化成FVIIa。可在市场上买到的FVII活性测定手段是购自Aniara(Mason，俄亥俄州)的HEMOCLOTFVII试剂盒，目录编号ACK081K，其中促凝血酶原激酶钙引起的凝血被测量。相对于野生型因子VIIa具有基本上相同或提高的生物活性的因子VII变体包括这样的变体：当在凝固性测定、蛋白水解测定、或如上所述TF结合性测定中的一个或多个中测试时，相对于已经在相同细胞类型中产生的因子VIIa，显示出至少约25％、优选至少约50％、更优选至少约75％、并且最优选至少约90％的比活力。相对于野生型因子VIIa具有基本上降低的生物活性的因子VII变体包括这样的变体：当在凝固性测定、蛋白水解测定、或如上所述TF结合性测定中的一个或多个中测试时，相对于已经在相同细胞类型中产生的野生型因子VIIa，显示出小于约25％、优选小于约10％、更优选小于约5％、并且最优选小于约1％的比活力。相对于野生型因子VII具有基本上改变的生物活性的因子VII变体包括，但不限于，显示出不取决于TF的因子X蛋白质分解活性的因子VII变体和结合TF但是不切割因子X的那些变体。与野生型因子VII相比较是否显示出基本上相同的或更好的生物活性、或者可选地相对于野生型因子VII显示出基本上改变的或降低的生物活性的因子VII的变体，包括，但不限于，具有因插入、缺失、或取代一个以上氨基酸而不同于野生型因子VII的氨基酸序列的多肽。具有与野生型因子VII基本上相同生物活性的因子VII变体的非限制性例子包括：S52A-FVIIa、S60A-FVIIa(Lino等，Arch.Biochem.Biophys.352：182-192，1998)；在美国专利No.5,580,560中公开的显示出提高的蛋白水解稳定性的因子VIIa变体；在残基290和291之间或者在残基315和316之间已经被蛋白水解切割的因子VIIa(Mollerup等，Biotechnol.Bioeng.48:501-505，1995)；氧化形式的因子VIIa(Kornfelt等，Arch.Biochem.Biophys.363:43-54，1999)；在PCT/DK02/00189中公开的因子VII变体；以及在WO02/38162中公开的显示出提高的蛋白水解稳定性的因子VII变体(Scripps研究所)；在WO99/20767(明尼苏达大学)中公开的具有修饰的Gla结构域并且显示出增强的膜结合性的因子VII变体；以及在WO01/58935(MaxygenApS)中公开的因子VII变体。与野生型因子VIIa相比具有提高的生物活性的因子VII变体的非限制性例子包括：在WO01/83725、WO02/22776、WO02/077218、WO03/27147、WO03/37932、WO02/38162中公开的因子VII变体(Scripps研究所)；以及在JP2001061479中公开的具有增强活性的因子VIIa变体(Chemo-Sero-Therapeutic研究所)。相对于野生型因子VII具有基本上降低或改变的生物活性的因子VII变体的非限制性例子包括：Rl52E-FVIIa(Wild-goose等，Biochem.29:3413-3420,1990)、S344A-FVIIa(Kazama等，J.Biol.Chem.270:66-72,1995)、FFR-FVIIa(Hoist等，Eur.J.Vase.Endovasc.Surg.15:515-520,1998)、以及缺乏Gla结构域的因子VIIa(Nicolaisen等，FEBSLetts.317:245-249,1993)。在产生FVII之后，可以将多肽从培养基中提纯出来。因子VII多肽的纯化可以包括：例如，在抗因子VII抗体柱子上进行亲和色谱(参见，例如，Wakabayashi等，J.Biol.Chem.261:11097，1986；以及Thim等，Biochem.27:7785，1988)；以及使用因子XIIa或具有胰蛋白酶样特异性的其他蛋白酶比如，例如，因子IXa、激肽释放酶、因子Xa、以及凝血酶，通过蛋白水解切割进行活化。参见，例如Osteoidetal,Biochem11:2853(1972)；Thomas,美国专利No4,456,591；以及Hedneretal,JClinInvest71:1836(1983)。作为另一种选择，因子VII可以使其穿过离子交换层析柱子比如Mono(Pharmacia)等而活化。因子VII或活化的因子VII可以被配制，并且按已知的方式使用。例如，其可以在治疗血友病患者的出血中使用。若本发明的方法被用于生产因子VII，则优选细胞培养上清液被保持在设定为36.5±0.9℃、优选36.5±0.5℃、更优选36.5±0.2℃、并且最优选36.5℃的温度和/或被设定为7.20±0.05、优选7.20±0.03、更优选7.29±0.01、最优选7.29的pH；并且/或者细胞培养上清液具有1至10％、优选4.0至9.0％、更优选5.5至8.5％的溶解CO2浓度。优选地，这些参数中的至少两个是在优选的限定范围内，即，温度和pH、温度和dCO2、或pH和dCO2。最优选所有三个参数被控制在优选的限定范围内。以下用实施例进一步阐明本发明，但并不是对本发明作任何限制。实施例1：基础细胞培养物FVIII生产典型的培养物是通过使用在文献Kaufman等(1989)，MoI.Cell.Biol.9:1233-1242和US5250421中描述的被转化成共表达因子VIII和冯维勒布兰特因子的10A1C6CHO细胞系的亚克隆而在生物反应器中建立。通过采用不包含动物来源产物的标准培养基、并且在微孔板中进行亚克隆而获得特定的亚克隆。标准培养基是：DMEM/Ham'sF1250/5011.76g/kg，其中加入下述成分：基本的DMEM/Ham'sF1250/50培养基含有足以使完全培养基包含4.3ppbCu2+的1.3mg/kgCu2+。ADAMTS-13生产使用磷酸钙共沉淀法转染CHODUKX-B11细胞，导入ADAMTS-13基因。细胞在新霉素选择条件下培养，并且在氨甲蝶呤和G418处理后进行选择。在进行无血清适应(serum-freeadaptation)后，细胞被亚克隆，并且挑选亚克隆640-2作为生产克隆。标准培养基是以在US2007/0212770中公开的培养基(Grillberger等；巴克斯特国际公司、巴克斯特保健股份有限公司)为基础的无血清的、无胰岛素的、并且无寡肽的培养基。弗林蛋白酶生产使用磷酸钙共沉淀法转染CHODUKX-B11细胞，导入弗林蛋白酶基因。使用不含次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷和甘氨酸的DHFR培养基选择细胞。通过在含有100nM氨甲蝶呤的培养基中进行亚克隆和选择来鉴定生产用克隆488-3，接着进行无血清适应(serum-freeadaptation)。标准培养基是以在US2007/0212770中公开的培养基(Grillberger等；巴克斯特国际公司、巴克斯特保健股份有限公司)为基础的无血清的、无胰岛素的、并且无寡肽的培养基。FVII生产用双顺反子载体转染CHODUKX-B11细胞以便允许共表达FVII和VKORC(维生素K环氧化物还原酶复合体)。基因表达被CMV启动子驱动，并且内部核糖体进入位点(internalribosomalentrysite，IRES)被定位于FVII基因和VKORC基因之间。使用磷酸钙沉淀法转染细胞。选择培养基含有200μg/mL潮霉素B。细胞在无血清条件下被亚克隆，并且挑选高表达亚克隆1E9作为生产克隆。因为在连续培养条件下就生长而言具有有利的特性、生产率和稳定性，所以选择1E9。在恒化器模式中评估稳定性两个月的期限。标准培养基是基于在US6,936,441(巴克斯特公司)中公开的培养基，并且尤其含有2.5g/L大豆蛋白胨和5mg/L胰岛素(礼莱公司；或NovoNordisk公司)。用于FVIII生产的标准方法5L连续培养培养基在CO2培养箱(5-15％CO2)中在37℃下预适应数小时。为了建立培养物，解冻至少一个1mL小瓶(107个CHO细胞/mL)，并且细胞在含有60mL预适应的培养基的Roux烧瓶(200mL)中稀释，并且在CO2培养箱中在37℃下培养。在约3天后，将60mL培养物加至含140mL新鲜培养基的1号转瓶(1.8L)中。转瓶被用15％CO2鼓泡，并且在37℃下转动培养。在两天后，细胞被分离出1/3，并且在含新鲜培养基(200mL培养基+100mL培养物＝300mL每转瓶)的2个转瓶中培养。在两天或进一步三天后，细胞再次分离出1/3，并且在含如上所述新鲜培养基的总共6个转瓶中培养。一旦达到要求的大约1x106个细胞/mL细胞密度，就将1800mL接种物接种于已经按如上所述预适应的3.2L培养基中，并且在5L生物反应器中培养。在标准条件下，5L生物反应器在pH7.2、细胞密度1.4x106个细胞/ml和温度37℃下操作。在标准条件下，培养物用气泡大小为10μm的O2以0.25VVH(每体积培养物每小时的O2体积)的速率鼓泡。在40L生物反应器中建立接种物基本上按如上所述进行5L连续培养，得到了接种物存储液。然而，存储液大约是5L，并且由18个而不是6个转瓶得到。清洁BR-40生物反应器，并且在操作前灭菌，并且在接种以前将大约8L的培养基转接至BR-40生物反应器中。将大约5L的接种物存储液从存储罐经由输送管路转移至生物反应器中，达到培养物的总体积为大约13L。一旦细胞密度达到≥9x105个细胞/ml，就将培养物用培养基稀释(1:3)。在1至3或更多天后，细胞浓度再次达到≥9x105个细胞/ml，并且进行接种物向320L生物反应器的转移。在320L生物反应器中扩充清洁BR-320生物反应器，并且在操作前灭菌，并且在接种以前将大约80L的培养基转接至BR-320生物反应器中。将大约40L的接种物从BR-40生物反应器经由输送管路转移至BR-320生物反应器，达到大约为120L的初始培养体积。一旦细胞密度达到≥9x105个细胞/ml，就将培养物用培养基稀释(1:3)。在3至6天(总时间)后，细胞浓度再次达到≥9x105个细胞/ml，并且进行接种物向2500L生物反应器的转移。2500L生物反应器建立将大约320L的接种物从BR-320生物反应器经由已经含有大约630L培养基的输送管路转移至BR1生物反应器，达到大约为950L的初始培养体积。一旦细胞密度达到≥9x105个细胞/ml，就将培养物用培养基稀释(1:3)至大约2500L的终体积。在4至7天(总时间)后，细胞浓度再次达到≥9x105个细胞/mL，并且将大约1150L的接种物从BR1生物反应器转移至含有大约1350L培养基的BR2生物反应器。在转移后，将大约1150L的培养基加至生物反应器BR1中，达到大约2500L的最终培养物体积。恒化器一旦在每个生物反应器中的细胞浓度达到≥1.2x106个细胞/mL，就启动“恒化器”培养模式。将每天大约1250L的培养基以连续方式加入每个生物反应器中。在每个2500L生物反应器中的细胞浓度是在9x105-1.6x106个细胞/mL之间。大约1250L/天/生物反应器的多次收获物被存放在2-8℃下的无菌袋中。培养以恒化器模式保持约50-57天。在标准条件下，将pH设定为7.2，温度设定为37℃，并且用气泡大小10μm的O2以0.02VVH(每体积培养物每小时的O2体积)速率对培养物鼓泡。类似的培养方法也被应用于表达ADAMTS-13、弗林蛋白酶或FVII的CHO细胞的培养。实施例2：各种参数改变对FVIII生产率的影响在各种培养条件下确定实施例1中描述的表达FVIII和vWF的CHO细胞克隆的FVIII生产率。在单独的实验中，在5L规模的连续培养中改变pH、细胞密度和温度。在每个情形中，对照试验采用pH7.1、1.4x106个细胞/mL的细胞密度和37℃。当细胞密度上升时，FVIII的体积生产率(IU每升每天)、对于细胞密度1.2x106个细胞/ml的数值，有如下所述的提高：因此，能够通过提高细胞密度而实现生产率的显著提高。该结果未曾被预测到，因为提高细胞密度可能会降低单位细胞的生产率。另外，在特定的细胞密度下，发现生产率的提高是大于细胞密度的提高，这更是令人惊奇。通过改变鼓泡参数，pH被增加到7.2。在对照容器中，在pH7.1处，用气泡大小10μm的O2以0.25VVH(每体积培养物每小时的O2体积)的速率对培养物鼓泡。在试验容器中，在7.2处，用气泡大小10μm的空气以1.25VVH(每体积培养物每小时的空气体积)的速率对培养物鼓泡。通过pH从7.1提高到7.2，生产率能够提高约16％。通过温度从37℃降至36℃，生产率提高约22％。实施例3：细胞密度和铜浓度对FVIII生产率的影响在各种培养条件下确定实施例1中描述的表达FVIII和vWF的CHO细胞克隆的FVIII生产率。对照培养在pH7.1、37℃、4ppbCu2+和1.4x106个细胞/mL的细胞密度下操作。对比培养在pH7.2和36℃下操作。在一个培养中，细胞密度增加到1.6x106个细胞/mL，并且在另一个培养中，其被增加到2.0x106个细胞/ml。在第三个培养中，细胞密度是2.0x106个细胞/ml，并且铜浓度从4ppb提高到6ppb。结果：通过降低温度、提高pH、并增加提高细胞密度至1.6x106个细胞/ml(提高14％)，FVIII生产率提高了41-50％。进一步将细胞密度增加到2.0x106个细胞/ml(43％)，生产率(与对照培养相比)增长了39-77％。当在2.0x106个细胞/ml培养物中的铜增加到6ppb时，生产率(与对照培养相比)提高了48-98％。因此，通过略微地提高pH、略微地降低温度、增加细胞密度仅43％并且增大铜浓度50％，就能够使FVIII生产率几乎加倍。实施例4：细胞密度和铜浓度对vWF生产率的影响重复实施例3，不同的是测量vWF的体积生产率。在1.6x106个细胞/ml和4ppb铜(36℃、pH7.2)下，生产率是对照物的124％。在2.0x106个细胞/ml和6ppb铜下，生产率是182％。因此，通过进行看起来较小的工艺参数改变，能够再次实现生产率的明显提高。实施例5：细胞密度、pH和dCO2的影响在各种培养条件下确定实施例1中描述的表达FVIII和vWF的CHO细胞克隆的FVIII生产率。在该实验中，细胞密度从1.41x106个细胞/ml提高至2.03x106个细胞/ml、pH从7.1提高至7.2，而dCO2浓度从减少9.5％到6.2％。FVIII的体积生产率(IU每升每天)提高了98％，并且FVIII的比生产率(IU每百万细胞每天)提高了36％。实施例6：pH和温度对弗林蛋白酶生产的影响表达弗林蛋白酶的CHO细胞在2.5L生物反应器中被以恒化器模式培养。对于单个的培养物，细胞密度保持平均1.52x106和1.78x106个细胞/ml，培养5天。在所有的实验中溶解氧被控制在20％空气饱和度的设定值下。通过用CO2覆盖生物反应器的液面上空间，溶解CO2浓度被保持在5％-6％之间。利用“实验设计方法”，将不同温度与不同的pH值进行组合，以确定得到最大体积生产率的弗林蛋白酶的条件。根据“Doehlert矩阵”，将5个温度与3个pH值相组合，得到7个如下所述温度和pH的组合：发酵批次温度(℃)pH135.17.20235.87.10335.87.30436.57.20536.57.20637.27.10737.27.30837.97.2036.5℃和pH7.20的组合被选为中点，将其应用于两批发酵(上述表中的4和5)。通过表面响应方法(ResponseSurfaceMethodology，RSM)、使用“Minitab”软件，用统计学分析了包括体积生产率和比生产率、以及生长速率的数据。温度，但不是pH，会明显地影响生长速率，生长速率最大值出现在36.5℃。通过温度从37℃降低到35.1℃，体积生产率能够被提高大约2.7倍。对于比生产率，可看到类似的趋势。这是个令人惊奇的结果，因为人们或许一致认为最大体积生产率将会被观察发生在其生长速率是最大的温度处。pH对于比生产率和体积生产率的影响在7.20+/-0.1的研究范围内是较小的。在7.15+/-0.05(或者在7.10和7.20之间)的较低pH范围内观察到略微较高的生产率，因此pH7.15被选为用于弗林蛋白酶生产的设定值。实施例7：dCO2对弗林蛋白酶生产的影响在2.5L生物反应器中以恒化器模式平行地进行两个发酵操作，一个操作具有大约7.5％的CO2浓度，而另一个具有大约12％的CO2浓度。通过改变在液面上空间流动中的CO2组分而调节CO2浓度。在37℃、pH7.15和20％pO2下进行发酵。在12天的高CO2培养中，细胞计数是大约1.07x106个细胞/ml，并且在低CO2培养中为1.49x106个细胞/ml。CO2浓度从12％降低到7.5％具有体积生产率提高大约2.78倍、和比生产率提高2倍的影响。在低CO2培养中的细胞生长速率也是更高。实施例8：pH和温度对FVII生产的影响将表达FVII的CHO细胞在2.5L生物反应器中以恒化器模式培养，其中对于单个的培养，细胞密度被保持在约2.5x106个细胞/ml的平均值(在2x106和3x106个细胞/ml之间)，培养4周。在所有的实验中溶解氧被控制在20％空气饱和度的设定值下。通过用CO2覆盖生物反应器的液面上空间，溶解CO2浓度被保持在4％-7％之间。利用“实验设计方法”，将不同温度与不同的pH值进行组合，以确定得到最大体积生产率的FVII的条件。根据“Doehlert矩阵”，将3个温度与3个pH值相组合，得到5个如下所述温度和pH的组合：发酵批次温度(℃)pH136.07.15236.07.25336.57.20437.07.15537.07.25平均最大体积动力生产率是在36.5℃和pH设定值7.20处取得的。存在有正相互作用的参数，使得两个参数优化的结果大于分别地优化每个参数的组合效应。实施例9：dCO2对FVII生产的影响在小规模连续培养中测试4个不同CO2浓度(5.0、6.3、7.6和8.9％)对FVII生产率的影响。培养细胞直至第8天恒化器，然后转移入2.5LRushton生物反应器，并且在连续条件下于pH7.20和36.5℃下培养几乎4周。由于在第一周期间需要平衡至不同的CO2浓度，所以分析仅最后3周的数据。通过离线测量法和添加CO2入生物反应器的液面上空间来控制CO2水平。记录的细胞密度从CO2水平为8.9％时的2.36x106个细胞/ml变化为在CO2水平为5.0％时的2.87x106个细胞/ml。相同范围内的生长速率是0.42d-1和0.49d-1。在低CO2水平处提高的比生长速率与提高的比生产率有相互关系。CO2对生长速率和比生产率的物质影响导致对体积生产率的根本影响。CO2浓度从8.9％降低到5％使比生长速率提高了17％，比生产率提高了10％，并且体积动力学生产率提高了35％。实施例10：温度和pH对ADAMTS-13生产的影响在1.5L生物反应器中以恒化培养方式培养表达重组体ADAMTS-13的转染的CHO细胞。在第一个实验中，将pH和温度设定为在36℃至38℃和pH7.10至7.30范围内的不同设定值。通过ELISA分析了来自稳定状态的样本的细胞计数和ADAMTS-13表达，并且测量了来自恒化培养的稀释率，从而计算出生长速率和体积ADAMTS-13表达。一旦发现最适条件是在设计空间的外侧范围处，就将第二实验设置为从35℃至37℃温度范围和pH7.05至7.15，并且分析了来自稳定状态的数据。细胞密度范围为1.17-1.71x106个细胞/ml。通过用CO2覆盖液面上空间来控制CO2，达到溶解CO2浓度为4-6％。使用统计软件Minitab，归一化并且分析两次实验的数据。通过使用用于pH和温度的二次方程式模型，发现在pH7.13和36.0℃处比生长速率具有其最优值。温度对生长速率的影响是很弱的。在pH7.15和36.0℃处发现体积生产率具有最佳值。尽管温度对生长速率的影响很小，但温度对体积生产率有相对较强的影响。假定恒温37℃，pH从7.10提高至7.15的影响会使体积生产率增加10％。假定恒定pH7.10，温度从37℃降低至36℃的影响会使体积生产率增加14％。改变条件从pH7.10和温度37℃至pH7.15和温度36℃的总体影响是使体积生产率增加24％。引用的所有参考文献的内容在此以参考方式被包括在本文中。当前第1页1 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