一种热不稳定的UNG酶及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及UNG酶。

背景技术：

如今，PCR在临床检测、疾病防控等领域，有着越来越广泛的应用。由于PCR反应过程中，核酸被放大至少上百万倍(20个循环)，少许PCR产物形成的气溶胶就足以造成假阳性扩增。

为了解决这种由PCR产物带来的假阳性现象，在核酸扩增中，UNG酶被大量应用(6,187,575，Roche Diagnostics，Thermolabile uracil-DNA-glycosylas,process for its preparation and use for removing uracil from DNA；5,945,313，Life Technologies，Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions)。在PCR体系中，使用dUTP替代dTTP，带有dUTP的单链或双链DNA会被UNG酶降解，而不会消化不含dUTP的单链或双链DNA。通过这种方式，第一轮产生的带dUTP的PCR产物会被UNG酶降解，不会作为模板对第二轮PCR产生假阳性影响。UNG酶自身会在PCR的预变性步骤(95℃10min)后失活，从而不会将第一轮的带dUTP的PCR产物降解。

但是目前为止，并没有任何一种UNG酶可以直接用于RNA的一步法扩增。这是因为如果在一步法体系中加入UNG酶，反转录酶合成cDNA的同时，UNG酶会对含有dUTP的cDNA进行降解，从而大幅度削弱PCR检测的灵敏度。如图1所示，1-1组扩增曲线为沙门氏菌DNA扩增时使用和不使用UNG/dUTP的效果对比，几乎无差别(沙门氏菌DNA浓度相同，缓冲液相同，引物探针浓度相同)。1-2组扩增曲线和1-3组扩增曲线分别是不使用UNG/dUTP和使用UNG/dUTP扩增HCV RNA的效果对比，由图1可见，使用UNG/dUTP后，灵敏度大幅度下降(HCV RNA浓度相同，缓冲液相同，引物探针浓度相同)。

所述扩增沙门氏菌所用的上游引物为

CTCACCAGGAGATTACAACATGG，下游引物为

AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC，荧光探针为5‘-6Fam-

CACCGACGGCGAGACCGACTTT-3’BHQ1，(SN/T 1059.7-2010)。

所述扩增HCV所用的上游引物为AGCGTCTAGCCATGGCGT，下游引物为GGTGTACTCACCGGTTCCG，荧光探针为5‘-6Fam-MCYCCCCCTYCCGGGAGAGCCAT-3’BHQ1。(《实时荧光定量PCR》)

所述不使用UNG酶/dUTP的扩增反应液为：Tris 10mM，KCl 50mM，MgCl₂ 3mM，dNTP200μM，上游引物和下游引物各2μM，探针1.2μM，热启动taq酶1U，mmlv酶1U。

所述使用UNG酶/dUTP的扩增反应液为：Tris 10mM，KCl 50mM，MgCl₂ 3mM，dUTP mix 200μM(dATP、dGTP、dCTP浓度为200μM，dUTP浓度为400μM)，上游引物和下游引物各2μM，探针1.2μM，热启动Taq酶1U，MMLV酶1U，UNG酶1U。

所述扩增程序为:45℃20min，95℃15min；94℃15s，60℃35s，40个循环。

所述扩增在ABI 7500荧光定量PCR仪上完成。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种改造的UNG酶，可实现UNG酶在RNA一步法扩增中的应用，从而解决现有技术中存在的问题。

在第一个方面，本发明提供一种UNG酶，所述UNG酶是在野生型UNG酶的基础上进行改造，所述野生型UNG酶的序列如SEQ ID NO:1所述；改造后的UNG酶的序列包括以下一种或多种：

在一些实施方案中，所述UNG酶的第15位的氨基酸为N或G或I或T或C或P中的一种。

在一些实施方案中，所述UNG酶的第32～42位氨基酸为GVAX₁X₂X₃EEX₄X₅D，其中所述X₁可为A或L，所述X₂可为L或G或D，所述X₃可为A或T或I或V，所述X₄可为N或T或D或K或S，所述X₅可为R或S或G。

在一些实施方案中，所述UNG酶的第145-189位为基序DVKVX₇X₈X₉GQDPYHGPNQAHGLCFSVX₁₀RPVPPPPSLENIX₁₁KELSTD，其中，所述X₇为V之外的任何氨基酸残基，所述X₈为I之外的任何氨基酸残基，所述X₉为I、C之外的任何氨基酸残基，所述X₁₀为P、D之外的任何氨基酸残基，所述X₁₁为Y或F。

在一些实施方案中，所述UNG酶的第226-251位为基序HKERGWEQFX₁₂DX₁₃VVSWLNX₁₄NSNGLVF，其中，所述X₁₂为T之外的任何氨基酸残基，所述X₁₃为A或V，所述X₁₄为W、Q、H或E。

在一些实施方案中，所述UNG酶的第311位为S或T。

所述改造的UNG酶的序列不是SEQ ID NO:1所示序列。

在一种具体的实施方案中，所述UNG酶的序列为：

MIGQKTLYSF FSPSX₀ARKRH APSPEPAVQG TGVAAX₂X₃EEX₄X₅DAAAIPAK KAPAGQEEPG TPPSSPLSAE QLDRIQRNKAAALLRLAARN VPVGFGESWK KHLSGEFGKP YFIKLMGFVAEERKHYTVYP PPHQVFTWTQ MCDIKDVKVI VLGQDPYHGPNQAHGLCFSV X₁₀RPVPPPPSL ENIYKELSTD IEDFVHPGHGDLSGWAKQGV LLLNAVLTVR AHQANSHKER GWEQFVDX₁₃VVSWLNX₁₄NSNGL VFLLWGSYAQ KKGSAIDRKR HHVLQTAHPSPLSVYRGFFG CRHFSKTNEL LQKSGKKPID WX₁₅EL，

其中，X₀为T或P，X₂为G或D，X₃为T或A，X₄为T或S，X₅为G或S，X₁₀为Q或L，X₁₃为A或V，X₁₄为H或E，X₁₅为T或S。

在具体的实施方式中，所述UNG酶的序列如SEQ ID NO:2-11所示。

在第二个方面，本发明提供编码所述UNG酶的核酸分子。

在第三个方面，本发明提供包含所述UNG酶的组合物。

在第四个方面，本发明提供制备所述UNG酶的方法，包括通过化学合成法或利用基因表达法。

在第五个方面，本发明提供所述UNG酶用于扩增RNA的应用。

在第六个方面，本发明提供一种PCR扩增试剂盒，用于扩增RNA，其包括本发明的UNG酶。进一步地，所述试剂盒还包括Taq酶、MMLV酶、dUTP、dATP、dGTP、dCTP、KCl、Tris、MgCl₂。

在第七个方面，本发明提供一种扩增RNA的方法，包括在扩增体系中使用本发明的UNG酶。优选地，所述方法的扩增程序为：45℃20min，55℃20min，95℃15min；94℃15s，60℃35s，40个循环。

本发明提供的UNG酶，经序列改造后，彻底灭活的反应条件，由95℃10min，降低到55℃20min，与反转录酶的热稳定性区分(如一些AMV最高反应温度可达60℃)，配合使用时，可以实现一步扩增RNA。操作方便、节省人力物力。

附图说明

图1为使用和不使用UNG/dUTP扩增沙氏门菌DNA和HCV RNA的扩增曲线图；

图2为实施例2的对比扩增曲线图。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式说明本发明，但本发明的内容不限于此。如无具体说明，在以下实施例中使用的试剂和仪器均为本领域常规试剂和仪器，可以通过常规商购的方式获得；所使用的方法为本领域常规方法，本领域技术人员根据现有技术内容可以毫无疑问地实施所述方法并获得相应的结果。

实施例1：改造的UNG酶的制备

合成编码UNG酶的核苷酸序列10种(见SEQ ID NO:12-21所示)，分别连接至pet28(+)质粒，转化进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，筛选转化菌株并培养，经测序，BL21(DE3)菌液相应序列与合成的序列一致。进行原核表达后，利用镍柱纯化所得到的蛋白，经测序，与SEQ ID NO:2-11所示的氨基酸序列一一对应。

实施例2：UNG酶性能比较

使用改造的UNG酶和未经改造的UNG酶，以及不使用UNG酶的反应体系同时检测HCV病毒(德国Qiagen公司，货号1061093)进行对比。改造的UNG酶的序列如SEQ ID NO:3所示。

扩增HCV所用的上游引物为AGCGTCTAGCCATGGCGT，下游引物为GGTGTACTCACCGGTTCCG，荧光探针为5‘-6Fam-MCYCCCCCTYCCGGGAGAGCCAT-3’BHQ1。

所述不使用UNG酶/dUTP的扩增反应液为：Tris 10mM，KCl 50mM，MgCl₂ 3mM，dNTP200μM，上游引物和下游引物各2μM，探针1.2μM，热启动taq酶1U，AMV酶1U。

所述使用未改造的UNG酶/dUTP的扩增反应液为：Tris 10mM，KCl50mM，MgCl₂ 3mM，dUTP mix 200μM(dATP、dGTP、dCTP浓度为200μM，dUTP浓度为400μM)，上游引物和下游引物各2μM，探针1.2μM，热启动taq酶1U，AMV酶1U，UNG酶1U。

所述使用改造的UNG酶/dUTP的扩增反应液为：Tris 10mM，KCl50mM，MgCl₂ 3mM，dUTP mix 200μM(dATP、dGTP、dCTP浓度为200μM，dUTP浓度为400μM)，上游引物和下游引物各2μM，探针1.2μM，热启动taq酶1U，AMV酶1U，经过改造的UNG酶1U。

所述扩增程序为：45℃20min，55℃20min，95℃15min；94℃15s，60℃35s，40个循环。

所述扩增在ABI 7500荧光定量PCR仪上完成。

扩增结果如图2。图中2-1组扩增曲线为不使用UNG酶/dUTP的扩增反应液的扩增曲线，2-2组为使用改造的UNG酶/dUTP的扩增反应液的扩增曲线，2-3组的扩增曲线为使用野生UNG酶/dUTP的扩增反应液的扩增曲线。由图可知，这种经过改造的UNG酶，热稳定性由95℃10min，降低到55℃20min，配合热稳定的反转录酶(如AMV最高反应温度可达60℃)，可实现UNG酶在RNA一步法扩增中的应用。