棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用的制作方法

本申请属于棉花抗性育种技术领域，具体涉及棉花gbabr1基因在棉花抗黄萎病中的应用的专利申请。

背景技术：

棉花是世界及中国最重要的经济作物之一，对棉花种植影响非常严重的一种生物胁迫是黄萎病。棉花黄萎病严重影响棉花的产量和品质，深入研究棉花与黄萎病菌之间的互作机制，弄清棉花抗黄萎病病相关基因的生物学功能，是当前棉花抗黄萎病研究的重要课题。

由于植物对生物胁迫（如黄萎病病害等）和非生物胁迫（干旱胁迫、高盐胁迫和低温胁迫等）等的防御机制涉及多个途径（基因）参与，分析研究作物抵抗逆境胁迫的机制，进而运用该调控机制来增加作物的产量是现代育种常用的方法之一。植物中存在大量抗逆相关的转录因子，许多转录因子通过和靶基因启动子上的作用元件互相结合使之发挥作用，调节下游多种植物抗逆相关的功能基因发挥作用，从而调控植物的对逆境的适应性；因而植物转录因子的调控研究成为植物的重点研究内容之一。

ap2/erebp(apetala2/ethylene-responsiveelementbindingprotein)是一个转录因子的超家族，它是在植物中特有的转录因子。转录因子(transcriptionfactor)，即反式作用因子(trans-actingfactor)是指定位于真核细胞核内，通过与被调控基因5’端启动子区的顺式元件(cis-actingelement)发生特异性结合和互作，达到对该基因转录过程的激活或抑制的一类dna结合蛋白。当植物受到外界的干旱、高温等非生物胁迫时，植物会通过一系列的信号传递激发转录因子。被激发的转录因子会与相应的顺式作用元件相结合启动特定基因的表达，从而对非生物胁迫进行应答。转录因子在高等植物的生长发育以及对生物和非生物的胁迫应答中起着十分重要的调控作用。

ap2这类基因家族成员的共同特点是：都具有一个ap2的dna结合域。在植物拟南芥，因为结构域的区别可以分为ap2、rav、erf、dreb和一个孤独基因，只有一个ap2结构域的是dreb亚组和erf亚组；ap2亚组有两个ap2结构域。rav亚组含有ap2和b3两个结构域。

在1995年的时候，在烟草中，有4个erf1/2/3/4转录因子可以与gcc-box结合的erf类转录因子，它们是通过乙烯应答元件为探针找到的的蛋白，命名为乙烯响应因子(erf)。erf类亚组有一个ap2的结构域，每个ap2结合域里都包含着2个保守元件yrg元件、rady元件，yrg元件中用一个由19~22个氨基酸残基组成的碱性亲水区作为它的保守氨基酸基序；rayd的保守序列是由42~43个氨基酸所组成的。对erf蛋白质的三维结构分析，发现在β-折叠中的第14位的丙氨酸和第19位的天冬氨酸，它们可以和gcc-box顺式作用元件特异的结合。sakuma等把erf亚组又划分成6个亚组，b1-b6。他的划分是通过它翻译的蛋白中有哪些氨基酸。同时它根据保守区域的特点对erf转录因子基因的功能进行了功能分析。

转录调控和转录后调控在植物细胞适应外界环境变化方面均起到了重要作用。golldack等指出，调控过程的灵活性和转录后修饰决定了环境适应中转录因子的功能特异性。erf转录因子通过与病程相关基因启动子中的gcc-box(gccgcc)的结合直接调控病程相关基因，诸如prb-1b(pr1)，β-1,3-葡聚糖酶(pr2)，几丁质酶(pr3)和osmotin(pr5)的表达。erf族转录因子的的特征，所以基因erf在某个方面能调节棉花抗病抗逆，基因有dna的结合域，能使一些pr基因表达，使棉花防御能力提高。

pr基因的启动子中有gcc-box作用元件，在抗逆、抗病等上都有很重要的作用，因为这类基因常常可以因为乙烯处理然后被诱导，也被叫做乙烯应答元件。

研究发现erf的结构域与gcc-box元件结合的必要条件是在结构域的n端的保守氨基酸，他们研究了很多蛋白的erf结构域，实验表明gcc-box中有11个关键碱基就可以稳定的和erf结构域互作且erf结构域中保守的n端起着与gcc-box稳定结合的作用，不相同的c端，而能辨别不相同的特异结合。

综上所述erf蛋白能够和不同的顺式元件的结合，从而调节一些环境胁迫的应答。另外研究发现erf结构域中如果能有一些磷酸化位点，那么它们对erf抗逆境胁迫的功能会发挥作用。

基于erf类转录因子功能的多样性，因此gbabr1与黄萎病间的作用机制也有必要加以研究，从而为黄萎病的预防和控制提供一定的借鉴和参考。

技术实现要素：

在前期棉花抗黄萎病基因筛选基础上，本发明主要目的是提供了具有一定抗黄萎病应用前景的gbabr1基因，从而为新的抗黄萎病棉花品种的培育奠定一定应用基础。

本申请所采取的详细技术方案如下。

棉花gbabr1基因在抗黄萎病中的应用，所述gbabr1基因，genbank编号为kp259809，其orf有1113bp，蛋白序列分析表明，其含有一个典型的高度保守的ap2/erebp结构域；该基因属于erf类b4成员，属海岛棉中ap2家族成员；

亚细胞定位结果表明，该基因定位于细胞核中；

基因表达检测结果表明，该基因在棉花的根、茎、叶中均有表达，当棉花受到黄萎病菌的侵染后，该基因表达量有明显提高，此结果表明该基因在在棉花黄萎病生物胁迫信号转导途径中具有重要作用。

进一步vigs技术应用结果表明，将gbabr1基因沉默后，植株黄萎病发病率及病情指数提升，而将该基因超表达后，植株黄萎病发病率及病情指数下降，因此，gbabr1基因是棉花抗黄萎病的正调控因子。

在前期对棉花黄萎病诱导相关基因研究基础上，发明人对其中表达量差异明显的est序列进行了测序，即本申请中所述的gbabr1基因。进一步地，通过电子克隆技术，在海岛棉中成功克隆获得了这个基因，并对其生物学信息进行了详细分析。更进一步应用实验表明，在将这个基因进行沉默，植株的抗病性降低，而进行超表达后，植株对黄萎病侵染表现出抗病的性状特征，从而表明这个基因与黄萎病的抗性高度相关。基于此研究结果，可为黄萎病抗性的分子机制研究、新的抗黄萎病植物新品种培育奠定一定应用基础，同时也为新的抗病基因筛选及抗性植物培育提供了新的借鉴和参考。

附图说明

图1为pcr产物电泳检测，其中m:4500bpladdermarker；1-2：pcr产物；

图2为gbabr1蛋白的三维结构预测；

图3为abr1蛋白ap2/erebp结构域的氨基酸序列比对分析；

图4为棉花ap2转录因子的进化树分析；

图5为棉花gbabr1转录因子的亚族进化树分析；

图6为融合表达载体p35s-gfp::gbabr1转入农杆菌gv3101后菌液pcr检测；其中2k：2000bpladdermarker；1-13：菌液pcr检测n:阴性对照p:阳性对照；

图7为农杆菌介导的烟草叶片瞬时转48h后观察gfp::gbabr1融合蛋白表达情况；

图8为gbabr1在不同棉花组织（根、茎、叶）中表达量的qrt-pcr结果；

图9为海岛棉海15根系在黄萎病菌v991侵染后，gbabr1基因表达模式的rt-pcr分析结果；其中以gbub7为内参基因；

图10为对照(trv:00)和gbabr1(ptrv:gbabr1)棉花材料对黄萎病菌的抗性分析，(a)冀棉11的trv:00和ptrv:gbabr1用蘸根法接种黄萎病菌v991孢子液(10⁷conidia/ml)16天的发病情况，冀棉11接种黄萎病菌16天后病指的统计；(b)新海15的trv:00和ptrv:gbabr1用蘸根法接种黄萎病菌v991孢子液(10⁷conidia/ml)16天的发病情况，新海15接种黄萎病菌16天后病指的统计；图中gbcla为棉花cla基因（cloroplastosalterados）转基因沉默后植株表型，以便于直观比较相关表型变化情况；

图11为gbabr1转基因拟南芥载体构建，纯合体检验，拟南芥表型(a)gbabr1的lr反应后菌液pcr检测；2k:2000bpladdermarker；13~17：菌液pcr检测情况；n:阴性对照，p:阳性对照；(b)转基因拟南芥中gbabr1rna转录水平的检测；图中11、3、6、4、8和9分别代表不同的gbabr1超表达转基因株系和野生型拟南芥；(c)转基因拟南芥的生长状况；

图12为转基因拟南芥接种黄萎病菌v991抗病鉴定，其中(a)转基因拟南芥接种黄萎病菌"v991”后的表型；(b)转基因拟南芥接种黄妻病菌“v991”后病指统计情况；

图13为在萌发期与萌发后期gbabr1转基因拟南芥对盐胁迫、甘露醇、aba敏感情况，其中图(a)为gbabr1转基因拟南芥种子分别在盐胁迫、甘露醇、aba、1%ms处理条件下与wt野生型种子的萌发率对比情况；图（b）为gbabr1转基因拟南芥种子与wt野生型分别在ms、aba、甘露醇、盐胁迫处理条件下生长表型对比情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分物料情况简要介绍说明如下。

棉花材料包括：陆地棉感黄萎病品种冀棉11，由中国农业科学院棉花研究所朱荷琴研究员提供；

抗黄萎病海岛棉新海15，由中国农业科学院棉花研究所杜雄明研究员提供；

黄萎病菌株：棉花黄萎病强致病力菌系v991，由中国农业科学院植物保护研究所简桂良研究员提供；

拟南芥材料：野生型拟南芥种子(columbia-0)，由河南大学植物逆境实验室安国勇课题组提供，培养条件为：21℃，16h光照、8h黑暗；

引物序列：均由华大科技合成提供；

其他生物材料包括：

大肠杆菌菌种dh5α、农杆菌菌种gv3101、ta克隆载体pmd18-tvector，bp反应入门载体pdonor221、基因超表达载体pk7wg2.0、基因亚细胞定位载体pk7fwg2.0、vigs干涉技术载体trv1和trv2；均为商品化菌种或质粒，不再一一说明；

实验试剂：

质粒提取试剂盒、oligo(dt)18、rnaase抑制剂、dntp、pmd18-tvector、t4-dna连接酶、内切酶bamhi和kpni、extaq酶、pcr产物回收试剂盒、荧光定量pcr试剂盒等均为takara公司产品；

荧光定量pcr专用板为labwares公司产品；

rna提取试剂盒购自aidlabbiotech（beijing，china）公司；

反转录酶m-mlv为promega公司产品；

所用培养基及溶液有：lb液体（固体）培养基、yep液体（固体）培养基、0.6ms培养基（ms0.443g，蔗糖3g，水100ml，琼脂粉0.6g，ph5.8~6.0）、察氏（czapek）培养基、pda培养基、50×taebuffer（na2edta∙2h2o37.2g，冰乙酸57.1ml，naoh调ph=8.3，加水定容至1l）等，均按本领域常规制备方法制备即可；

其他未描述的抗生素、激素类等试剂均为本领域常用试剂，不再赘述。

实施例1

前期研究基础上，发明人发现在受黄萎病侵染后，棉花gbabr1基因的表达量发生了明显变化，因而，发明人以海岛棉（新海15）为基础，对gbabr1基因进行了详细分析，具体过程简要介绍如下。

一、海岛棉gbabr1基因的获得

首先，种植棉花，提取幼苗棉花的rna，并进行反转录获得cdna；

rna提取步骤参考easyspinplus植物rna快速提取试剂盒，反转录步骤如下：

totalrna，1000/rna浓度；

oligodt18(10μm)，1μl；

随机引物，1μl；

ddh2o(rnase-free)补齐至13μl；

pcr仪中，65℃运行5min，迅速放在冰上2min；

在上述反应体系中加入如下试剂：

5×rtbuffer，4μl；

50u/μlrnasin，1μl；

10mmdntps，1μl；

200u/lm-mlv，1μl；

pcr仪中运行此程序：42℃，60min；85℃，5min。

以cdna为模板，设计引物并进行基因的扩增，引物设计如下：

gbabr1f:5’-cgccaaggatcattgatgtatc-3’，

gbabr1r:5’-cggtgactttatttagtggttgg-3’；

pcr扩增体系：

taq酶(2.5u/µl），10μl；

primerf（gbabr1f），0.2μl；

primerr（gbabr1r），0.2μl；

cdna，1μl；

ddh2o，8.6μl；

pcr扩增程序，95℃，5min；95℃、30s，54℃、30s，72℃、1min20s，30个循环；72℃，10min。

对pcr电泳产物进行电泳检测，结果如图1所示。从图中可以看出，基因gbabr1大小为1113bp，与预期结果一致。

二、gbabr1基因的基础生物信息学信息分析

回收步骤一中的pcr扩增产物，用琼脂糖凝胶试剂盒(天根纯化试剂盒)纯化后，与pmd18-t载体连接，然后进行菌液pcr检测，并对阳性的质粒进一步进行测序。

（1）gbabr1蛋白的三级结构预测与分析

初步分析认为，本申请中的gbabr1基因与拟南芥aterf1基因的dna结合域较为相似，因此以aterf1(pdbid：1gcca)作为对照模型，通过http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgiid=index对gbabr1的蛋白质空间结构进行分析，结果如图2所示。

对图2进行分析可以看出，aterf1、gbabr1的组成基本相同，均由1个α螺旋和3个β折叠组成。

（2）对推测gbabr1所编码氨基酸的序列分析

对gbabr1基因推导的氨基酸序列进行blastp同源性检索，并利用dnaman软件进行序列比对，结果如图3所示。

分析表明：gbabr1与拟南芥一些同源蛋白的氨基酸序列在某区段序列极为相似，都含ap2结构域。含有ap2/erebpdomain含有两个保守的序列元件:yrg和rayd，还有wlg保守的序列元件，而且氨基酸序列符合典型的ap2/erf转录因子的特征。

（3）基因gbabr1的序列比对和进化树分析

由于拟南芥和水稻中的ap2/erf家族研究的比较完整，所以选取了拟南芥和水稻中典型的ap2/erf类转录因子进行同源进化比对，对基因gbabr1构建了同源进化树。结果如5所示。

利用mega5.0软件对这个基因的蛋白和其它物种的ap2蛋白进行进化树分析，分析表明：

由进化树中可以看出，基因gbabr1在进化关系上属于ap2/erf转录因子中的erf类(图4)；

将gbabr1同拟南芥中ap2转录因子中erf类b1～b6家族进行进化树分析，结果显示，基因gbabr1属于erf类b4亚族(图5)；gbabr1与同源率最近的拟南芥at5g64750的氨基酸相似率为31.62%。

gbabr1基因启动子序列分析

用plantcare在线网站，预测顺式作用元件，结果如下表所示。

表1，预测的gbabr1启动子顺式元件：

。

对上述启动子顺式元件进行分析，可以看出，在gbabr1基因的上游均含有tc-richrepeats，该元件在响应抗逆、抗病等方面起重要的作用。同时，gbabr1基因启动子顺式元件中均含有响应和调节低氧或无氧条件的aremotif。此外，该类基因均含有与光、植物激素响应相关元件。这些结果表明，gbabr1的表达模式可能受到多种因素调控，参与棉花对生物逆境、非生物逆境的响应和激素信号路径的调控。

三、gbabr1蛋白在细胞中的亚细胞定位

首先，通过同源重组的gateway技术，参考现有载体构建及鉴定的方法，将gbabr1的orf区段(不含终止密码子)的pcr产物连接到目标载体pk7wgf2.0中，获得融合表达载体p35s-gfp::gbabr1。

其次，将上述鉴定正确载体转化农杆菌，用菌液pcr验证阳性克隆（验证结果如图6所示）。

最后，参考现有农杆菌转染方法，将上述鉴定正确的农杆菌渗透注射烟草叶片；2-3天后，剪一部分叶片，压片后用激光共聚焦显微镜检测gfp绿色荧光。结果如图7所示。

检测结果表明，p35s-gfp载体转化的gfp蛋白在烟草细胞各个部位均有较强的表达；gfp::gbabr1在细胞核上表达，这一结果初步说明gbabr1可能定位在细胞核。

实施例2

在前述实施例1中对于基因gbabr1基本特性了解基础上，发明人进一步对这个基因在棉花组织中的自然情况下的组织表达模式、及受胁迫后组织表达情况进行了具体分析，相关实验简要介绍如下。

一、自然情况下(野生型)基因gbabr1的组织表达模式

分别取新海15的根、茎、叶的组织，提取rna，并使用反转录试剂盒获得cdna，采用如下定量pcr引物进行qpcr扩增：

qrt-pcr-gbabr1f:5’-tccttatcgtcgtcatcgcctg-3’，

qrt-pcr-gbabr1r:5’-ctccaataccgccaccttgactac-3’；

内参基因选用泛素蛋白7(ubiquitin7，ub7)，引物序列如下：

ubq7f:5’-gaaggcattccacctgaccaac-3’，

ubq7r:5’-cttgaccttcttcttcttgtgcttg-3’。

qrt-pcr是在abi7500real-timepcr序列检测系统和软件(appliedbiosystems，usa)上进行的。10µl反应体系设计如下：

cdna（可以适当稀释），4.4µl；

10×sybrgreenpcrmastermix，5µl；

引物，0.2µl（正、反引物分别为0.1µl）；

roxⅱ，0.2µl；

pcr程序为：95℃变性1min，然后40个循环(95℃变性5s，60℃复性延伸40s)。

40个循环后扩增产物的特异性用溶解曲线分析检测。每个反应都包括了至少三个重复。用单一模板稀释至不同浓度，通过模板稀释倍数的log值对每个稀释样品的ct值作图检测引物扩增效率。

检测结果如图8所示。分析表明：gbabr1表达量在根中比较高，在叶中相对较低。这一结果表明gbabr1的表达具有一定的组织差异性。

二、生物胁迫(黄萎病菌侵染)情况下gbabr1的表达模式

发明人在前期基础研究中发现，gbabr1在棉花接种黄萎病菌前后表达量发生了显著变化，为了进一步分析该基因在棉花中受黄萎病菌侵染后的表达模式，发明人进一步利用rt-pcr和qrt-pcr技术对该基因进行了分析，具体过程如下。

选取两叶一心的抗病品种海岛棉新海15进行伤根接种，接种所用的黄萎病菌v991分生孢子液浓度为1×10⁷spores/ml，以水处理做为对照。分别在接种1小时、12小时、24小时、48小时、120小时等时间点选取棉花根系，并分别在0h、1h、4h、8h、12h、24h、36h、48h和72h等时间点取样品叶片，提取rna后并反转录出cdna进行表达模式分析。

rt-pcr分析时，分析gbabr1基因时引物设计如下：

f:5’-tccttatcgtcgtcatcgcctg-3’，

r:5’-ctccaataccgccaccttgactac-3’；

反应体系设计如下：

taq酶(2.5u/µl），10μl；

primerf，0.2μl；

primerr，0.2μl；

cdna，5.0μl；

ddh2o，4.6μl；

pcr扩增程序：95℃，5min；94℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃，10min。

以泛素蛋白7(ubiquitin7，ub7)作为内参基因，设计引物进行平行pcr反应（相关实验过程参考前述“自然情况下(野生型)基因gbabr1的组织表达模式”部分内容）。

对样品进行均一性分析后，pcr扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶上电泳分离检测。

实验结果如图9所示，对其进行分析可以看出：rt-pcr的结果表明，v991分生孢子液和水处理后，gbabr1的表达量在棉花根系接种病原菌后的1小时、12小时、24小时、48小时、120小时都表现为上调。

上述结果表明，在新海15被黄萎病菌侵染后，基因gbabr1的表达量有所变化，说明gbabr1参与此生物胁迫过程。

实施例3

进一步地，发明人利用vigs技术构建了vigs干涉载体，以对基因gbabr1进行沉默。通过观察基因沉默后棉花对黄萎病菌侵染时的表型变化情况，结果进一步证明，基因gbabr1与黄萎病抗性高度相关，相关实验情况简要介绍如下。

（1）构建vigs干涉载体ptrv::gbabr1

在基因gbabr1的非保守区段设计引物：

f:5’-cgcggatcccccaatcattcacc-3’，

r:5’-cggggtaccggcgatgacgac-3’；

设计设计原则为：上游引物加上酶kpni的酶切位点和保护碱基，下游引物加上酶bamhi的酶切位点和保护碱基；

pcr扩增目标序列(约200bp)；

然后将pcr的产物回收后和空载体ptrv2，分别用酶bamhi和酶kpni在37°c水浴的条件下进行双酶切；

酶切体系为：

10×kbuffer，5μl；

bamhi和kpni，各2.5μl；

dna片段，30μl（双酶切ptrv2质粒时，用量为20μl)；

ddh2o，10μl（双酶切ptrv2质粒时，ddh2o加20μl)，，

酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳；回收目的序列，并利用t4dna连接酶进行连接，构建vigs干涉载体ptrv::gbabr1。

（2）冀棉11和新海15中基因gbabr1沉默后，棉花对黄萎病菌响应情况

将ptrv1、ptrv2和ptrv2::gbabr1分别转化农杆菌中，分别摇瓶培养至od600达到0.6~0.8左右；

将ptrv1侵染液分别与ptrv2、ptrv2::gbabr1的侵染液按照体积比1:1的比例均匀混合（制备侵染液时，首先离心获得菌体，然后重悬浮，重悬浮时，悬浮液配方为：as，100mmol/l、200μl；mes，1mol/l、1000μl；mgcl2，1mol/l、1000μl；ddh2o加至100ml）。

注射菌液（侵染液）时，采用2ml注射器进行注射，具体过程为：

在子叶平展，还没有长出真叶的时候，在棉花幼苗子叶的背面轻轻划个斜面，把菌液慢慢打入子叶中，尽量使子叶都被注满；

之后避光24小时，待棉花幼苗生长至两叶一心时，取叶片提取rna(最好是新长的真叶)，然后进行rt-pcr，检测目标基因是否被降低表达。

侵染棉花的方法是采用伤根接种的方法，用黄萎病菌v991孢子液(1×10⁷conidia/ml)侵染棉花。到真叶开始出现变黄、萎蔫的时候统计棉花黄萎病发病的情况。

参照《棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定》中方法，统计棉花的病情指数(标准号:gb/t28084-2011)：

病情指数=∑(病级株数×代表数值)×100/调查总株数×发病最重级的代表数值。

结果表明，基因沉默的棉花植株的病指比对照组棉花植株要高20%左右(图10a、b)。

形态观察表明，基因沉默组棉花植株的叶片黄化、掉落的叶片都比对照组的棉花严重(图10a、b)。

综合上述结果可以看出，无论是在感病品种冀棉11还是抗病品种新海15中，沉默gbabr1基因后，棉花在受到黄萎病菌侵染时，棉花的发病率和病指明显提高，说明gbabr1基因的沉默降低了棉花对黄萎病的抗性，即，棉花更易感病。

实施例4

更进一步地，在上述对gbabr1基因功能初步了解基础上，发明人将其转化拟南芥构建了超表达植株，并对超表达植株的黄萎病抗性及其他抗性进行了初步评价，具体实验过程简要介绍如下。

（一）构建gbabr1超表达载体

在基因gbabr1的orf两端，设计加上接头引物attbl和attb2，引物序列具体设计如下：

f:5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcatgtatcagttgatgatg-3’，

r:5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctttagtggttggaat-3’；

pcr扩增，先将pcr产物进行bp反应以重组到载体pdonr221上，然后进行lr反应以同源重组到载体pk2gw7.0上；

bp反应过程中，2.5µl反应体系设计如下：

te8.0，1.0μl；

bp酶，0.5μl；

pdonr221，0.5μl；

pcr产物，0.5μl；

25℃水浴下反应2~3个小时；

lr反应过程中，2.5µl反应体系设计如下：

te8.0，1.0μl；

lr酶，0.5μl；

pk2gw7.0，0.5μl；

中间质粒（即前述bp反应产物），0.5μl；

25℃水浴下反应2~3个小时。

通过上述同源重组gateway技术，将基因gbabr1的orf区段的pcr产物连接到目标载体pk7wg2.0中，最终构建获得超表达载体pk7wg2.0-gbabr1(鉴定结果如图11a所示)。

（二）转基因拟南芥纯合子的筛选与获得

取200μl农杆菌感受态细胞，把感受态细胞置于冰上自然溶化后，加入4~5μl上述步骤(一)中所构建的超表达载体pk7wg2.0-gbabr1，轻轻混匀后，冰上静置30分钟；

然后于液氮中速冻70s，再迅速放于37℃水浴锅5~6分钟，再于冰上放置2分钟；

加入1mlyep液体培养液，28℃、180rpm振荡培养4~5小时；

室温下4000rpm离心4-5分钟，弃去部分yep液体培养液，将菌液转至yep抗性平板上均匀涂布，晾干后，培养箱中28℃倒置培养2~3天。

挑取阳性菌斑加入到5ml含利福平和spe（大观霉素）的yep液体培养液中，28℃、220rpm振荡培养后，取1~2ml菌液加至200ml抗性（含利福平和spe）yep液体培养液中，过夜培养至od600为1.2~1.6；

将菌液转移至50ml集菌管中，于4000rpm离心20分钟，收集菌体并向其中加入侵染液(5%蔗糖，0.5%ms)，吹打混匀，调节od600值，使其在0.8~1.0之间，计算加入的侵染液的体积。最后加入拟南芥转化辅助试剂l-77，300μl/l。

将上述所制备含超表达载体pk7wg2.0-gbabr1的侵染液倒入一个宽口径的容器中，然后将已开花的、并剪去其它未成熟果荚的拟南芥花穗浸入上述侵染液中，30秒后拿出；

全部侵染后，将拟南芥的苗平放，用保鲜膜覆盖避光放置，24小时后恢复正常培养。

为提高侵染转化效率，七天后，可进行二次转化。

植株成熟后，收取t1代的拟南芥种子。

将干燥处理过的t1代种子，用0.1%升汞浸泡消毒4到5分钟，然后用无菌水冲洗4到5次，前两次需要快速冲洗。用灭过菌的大枪头将消毒清洗后的种子点播在含有卡那霉素和头孢霉素的0.6%ms固体培养基上，待种子表面水分吹干后封板。将培养皿放于冰箱中，4℃春化2到3天。再将培养皿置于培养室(光照强度150mmol·m^-2s^-1，光/暗为16h/8h，温度18~-22℃，相对湿度约为80%)中培养。继续培养1-2周后，挑选能正常长根、生长的阳性幼苗进行单株培养收种；培养成熟收种子。直至筛选至t3代获得纯合植株。

（三）拟南芥转基因植株中gbabr1基因表达情况

在gbabr1超表达的拟南芥t1代植株没有抽薹前，提取3-4片拟南芥的叶片组织的rna。

qrt-pcr的结果表明：超表达株系中l3、l9、l11（l3、l9、l11为株系编号，无特殊含义）的表达量较高(图11b)。因此后续实验以l9、l11两个株系的第三代种子来进行了一些相关研究。

将这两个纯系的拟南芥和野生型拟南芥移栽到小钵中，观察植株表型，发现超表达拟南芥比野生型拟南芥在植株的高低、抽薹早晚、开花结实等多方面都有一些差异，转基因拟南芥比野生型拟南芥有抽薹早、开花早、植株矮小、早熟等特点(图11c)。说明在拟南芥中超表达基因gbabr1在正常生长情况下，对拟南芥的发育有一定的作用。

（四）转基因拟南芥植株的黄萎病抗性鉴定

将生长8-12天的幼苗从培养皿中移出，根尖去掉约1mm，尽量做到相同的伤害根。幼苗的根浸泡到1×10⁶conidia/ml的v991菌液中处理5-6分钟，处理之后把幼苗种回钵子中。接菌后两周左右调查拟南芥发病情况。

对比野生型的拟南芥，gbabr1超表达拟南芥更抗黄萎病菌v991，超表达拟南芥株系的叶片变黄的少、长势好。野生型拟南芥植株死亡较多。具体结果如图12所示。

综合上述结果可以看出，gbabr1基因超表达后，转基因植株比野生型植株的病指明显要低，即，gbabr1基因超表达后，可明显提升拟南芥对黄萎病菌抗性。

（五）转基因拟南芥植株对非生物因素盐的抗性

将野生型拟南芥的种子和l11、l9株系的种子，分别点播在不加nacl和加有120mmnacl的1%ms的固体培养基上，4℃春化处理2-3天后，放入培养室中生长，统计萌发率。

结果如图13所示，分析表明：

在1%ms的固体培养基上，l11、l9株系与野生型拟南芥相比，在萌发率上没有太大的差别，全部萌发只需要1-2天；

有nacl的1%ms的固体培养基上，超表达株系l11、l9在种子的萌发率明显比野生型快；在萌发生长至第2、3、4天时均能观察到萌发率之间的差异，其中在生长到第3天时各种材料萌发率的差异最为显著。超表达株系l11的萌发率约为30-50%，野生型的萌发率10%；

有nacl的1%ms的固体培养基上，萌发生长10左右，超表达株系l11、l9表现为冠部较大，根部较长，侧根较多，子叶变绿的多，整体长势比野生型好。

综合上述表型结果和萌发率统计结果，可以认为，过表达材料对高盐胁迫不敏感；即，gbabr1基因超表达后，可提高植株的耐盐抗性。

（六）转基因拟南芥植株对非生物因素干旱（渗透胁迫）的抗性

将野生型拟南芥的种子和l11、l9株系的种子，分别点播在不加甘露醇和加有240mm甘露醇的1%ms的固体培养基,4℃春化处理2-3天后，放入培养室中生长，统计萌发率。

结果如图13所示，分析表明：

在1%ms的固体培养基上，l11、l9株系与野生型拟南芥相比，在萌发率上没有太大的差别，全部萌发只需要1-2天。但是在含有甘露醇的1%ms的固体培养基上，超表达株系l11、l9在种子的萌发率明显比野生型快；在萌发生长至第3、4、6天时均能观察到萌发率之间的差异，其中在生长到第4天时各种材料萌发率的差异最为显著。超表达株系l11的萌发率约为55%，野生型的萌发率20%。

在含有甘露醇的1%ms的固体培养基上，萌发生长10左右，超表达株系l11、l9表现为冠部较大，根较长，长势比野生型好，比野生型更能耐受高渗胁迫。

（七）转基因拟南芥植株对aba信号途径依赖性

将野生型拟南芥的种子和超表达株系l11、l9的种子，分别点播在1%ms和加有1μmaba的1%ms的固体培养基，4℃春化处理2-3天后，放入培养室中生长，统计萌发率。结果如图13所示，分析表明：

在正常的1%ms的固体培养基上，l11、l9株系与野生型拟南芥相比，在萌发率上没有太大的差别，全部萌发只需要1-2天。但是在含有1umaba的1%ms的固体培养基上,超表达株系l11、1l9在种子的萌发率明显比野生型快；在萌发生长至第2、3天时均能观察到萌发率之间的差异，其中在生长到第3天时各种材料萌发率的差异最为显著。超表达株系l11的萌发率约为40%，野生型的萌发率20%；

在正常ms上生长10天，不同材料的表型没有区别；但是在含有1umaba的1%ms的固体培养基上，超表达株系l11、l9的长势明显优于野生型，表现为主根较长，冠部较大，子叶变绿的多；这一结果说明在种子的萌发和早期幼苗生长过程中，超表达材料对aba不敏感。

因此可以判断：gbabr1在种子萌发和早期幼苗生生长过程中参与植物对外源aba的应答，在这一生理过程中具有负向调控的作用。