本发明属于实验动物的病毒检测领域，尤其涉及一种快速区分ECT、MAD、MCMV、POLY的多重荧光基因检测方法。
背景技术：
鼠痘病毒（Mousepox virus），又称脱脚病病毒（Ectromelia virus，ECT），可引起实验小鼠的烈性传染，分为急性和慢性两型，大部分为隐性感染。本病多呈爆发性流行，致死率极高，常造成全群淘汰，给科研、生产带来极大的危害，是清洁级小鼠必须检测的项目。小鼠腺病毒（Murine Adenovirus，MAD）是20世纪60年代从小鼠体内分离出来的一种最新的一种具双链DNA的动物病毒，分布十分广泛，容易导致呼吸道感染，如急性发热性咽喉炎、咽结膜热和肺炎等，是SPF级小鼠必要时需要排除的病原体。小鼠巨细胞病毒 ( Murine Cytomegalovirus，MCMV) 可导致小鼠肺炎，感觉神经性耳聋，眼内感染，心脏感染 ，脑炎，肝炎等。MCMV 其致病性与机体免疫状态关系密切。在免疫抑制个体感染后可导致疾病甚至死亡，而免疫正常个体感染后一般为潜伏感染。目前我国标准对小鼠巨细胞病毒检测无要求，但是其感染应得到重视。小鼠巨细胞病毒感染对免疫学、肿瘤学、药理学、毒理学等试验结果会产生影响，因此有学者建议将 MCMV作为 SPF 级动物应排除感染的病毒检测项目。小鼠多瘤病毒( Murine Polyomavirus，POLY）可使小鼠等动物产生各种组织肿瘤，隐性感染对实验动物本身造成危害，对科研工作造成潜在干扰，是SPF 级小鼠必要时需排除的病原。鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒及小鼠多瘤病毒可混合感染，给病原的诊断和防治造成了困难，同时这四种病毒均对科研工作造成潜在干扰。
目前ECT、MAD、MCMV、POLY的感染诊断方法主要是免疫学检测方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫酶试验（IEA）和免疫荧光试验（IFA）等，但是这些方法中不能应用于免疫功能低下或免疫缺陷动物如SCID小鼠、裸小鼠和裸大鼠等的检测，因为它们不能产生正常的抗体反应，此外，抗体检测方法不适用于病毒早期感染的诊断。抗原检测方面常规病毒分离鉴定方法复杂费时，不利于日常检测。普通PCR方法具有快速、简便、灵敏、特异等优点，已成为实验动物病毒感染诊断的重要手段，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。荧光定量PCR技术融合了PCR的多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机率降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但实时荧光PCR技术受到荧光种类及仪器自身的限制，最多只能对5个靶标进行检测。
多重荧光基因检测方法是继平面芯片之后的一种新型芯片技术，有机整合了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术、计算机运算法则等多项最新科技成果，具有自由组合、高通量、高速度、低成本、准确性高、重复性好、灵敏度高、线性范围广、无需洗涤、操作简便、在同一平台上即可完成蛋白质和核酸的检测等优点，实现了1个样品100种不同目的的分子进行检测，并能在30分钟内检测96份样品。被国际业界专家评价为临床诊断的趋势性技术之一。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种快速区分鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒的多重荧光基因检测方法及引物。
本发明所采取的技术方案是：一种快速区分鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒的多重荧光基因检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：
ECT引物E1：5’-TACGGTGTATATGGCTACTCA-3’（SEQ ID NO：1）；
ECT引物E2：5’-ACTGCTGCTTCCTATACTCG-3’（SEQ ID NO：2）；
MAD引物A1：5’-AGACTCACACTGCGTATAGTCC-3’（SEQ ID NO：3）；
MAD引物A2：5’-CCAGAACTCGGTTATCCCCA-3’（SEQ ID NO：4）；
MCMV引物C1：5’-GCCCTCTTCATCCCTTACCT-3’（SEQ ID NO：5）；
MCMV引物C2：5’-GACCTCCATGTCCTTCATGC-3’（SEQ ID NO：6）；。
POLY引物P1：5’-CCATGCTCCCTTCTATGCGAT-3’（SEQ ID NO：7）；
POLY引物P2：5’-TCAGTCAGCCATAGATGCAA-3’（SEQ ID NO：8）。
优选的，引物E1、A1、C1和P1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列。
优选的，引物E1的tag序列为：5’-CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-3’（SEQ ID NO：9）；
优选的，引物A1的tag序列为：5’-TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-3’（SEQ ID NO：10）；
优选的，引物C1的tag序列为：5’-CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-3’（SEQ ID NO：11）；
优选的，引物P1的tag序列为：5’-ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-3’（SEQ ID NO：12）。
优选的，引物E2、A2、C2和P2的5’端还添加有生物素标记。
一种快速区分鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒的多重荧光基因检测方法，包括如下步骤：
1）从样品中提取病毒DNA，以DNA为模板，加入上述引物进行PCR扩增；
2）将扩增产物、包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定其病毒的类型。
优选的，荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列能相应地与tag序列互补配对。
优选的，步骤2）中扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交的体系为：
荧光编码微球20μL，链霉亲和素-藻红蛋白75μL，扩增产物5μL，总体积100μL。
42℃反应30min。
本发明的有益效果在于：可以同时对鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒进行检测，分辩不同类型的病毒，并且可以有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。
附图说明
图1是四种病毒质粒PCR的电泳图；
图2是四种病毒质粒多重荧光基因检测方法检测实验结果图；
图3是四种病毒质粒多重荧光基因检测方法检测灵敏度实验结果图；
图4是四种病毒质粒多重荧光基因检测方法检测特异性实验结果图；
图5是四种病毒样品多重荧光基因检测方法检测实验结果图。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实例1鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒质粒的构建
用试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit分别提取ECT、MAD、MCMV和POLY病毒的DNA，分别以上述对应的引物，进行PCR扩增，扩增引物为：
ECT引物E1：5’-TACGGTGTATATGGCTACTCA-3’（SEQ ID NO：1）；
ECT引物E2：5’-ACTGCTGCTTCCTATACTCG-3’（SEQ ID NO：2）；
MAD引物A1：5’-AGACTCACACTGCGTATAGTCC-3’（SEQ ID NO：3）；
MAD引物A2：5’-CCAGAACTCGGTTATCCCCA-3’（SEQ ID NO：4）；
MCMV引物C1：5’-GCCCTCTTCATCCCTTACCT-3’（SEQ ID NO：5）；
MCMV引物C2：5’-GACCTCCATGTCCTTCATGC-3’（SEQ ID NO：6）。
POLY引物P1：5’-CCATGCTCCCTTCTATGCGAT-3’（SEQ ID NO：7）；
POLY引物P2：5’-TCAGTCAGCCATAGATGCAA-3’（SEQ ID NO：8）。
引物E1、A1、C1和P1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列，
其中，引物E1的tag序列为：5’-CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-3’（SEQ ID NO：9）。
引物A1的tag序列为：5’-TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-3’（SEQ ID NO：10）。
引物C1的tag序列为：5’-CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-3’（SEQ ID NO：11）。
引物P1的tag序列为：5’-ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-3’（SEQ ID NO：12）
扩增体系如下：
2×buffer 10μL
上游引物E1、A1、C1、P1混合液0.25μL
下游引物E2、A2、C2、P2混合液0.25μL
模板1μL
ddH2O 8.5μL
总体积20μL。
扩增的反应程序为：
94℃预变性5min；
94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸30s；循环35次；
72℃终延伸10min。
将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化。
用TaKaRa公司的试剂盒将纯化后的DNA连接至pMD-19T载体中，载体连接反应体系如下（10μL）：
Solution I 5μL
pMD19-T 1μL
目的片段4μL
总体积 10μL
反应条件：16℃，4h以上。
将连接产物转化至DH5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。
实施例2：鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒的多重荧光基因检测方法的建立：
1）质粒PCR扩增
用特异性扩增鼠痘病毒、小鼠腺病毒、小鼠巨细胞病毒和小鼠多瘤病毒引物进行单重、三重、四重PCR扩增。
上游引物混合液的制备：将E1、A1、C1和P1以1:1:1:1比例进行混合；下游引物混合液的制备：将E2、A2、C2和P2以1:1:1:1比例进行混合。利用四种特异性模板，以及三重模板、四重模板对上述四种病毒的特应性区域进行扩增。其中三重模板的制备：将三种质粒以1:1:1的比例进行混合；四重模板的制备：将四种质粒以1:1:1:1的比例进行混合。PCR扩增体系和程序如实施例1中相同。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示。图中，M：DL2000 DNAmarker，1：ECT，2：MCMV，3：MAD，4：POLY，5：ECT+ MCMV+MAD，6：ECT+MCMV+POLY，7：ECT+MAD+POLY，8：MCMV+MAD+POLY，9：ECT+MCMV+MAD+POLY，10：阴性negative PCR 。
从图1中可以看出，ECT的扩增产物大小约为183bp，MCMV的扩增产物大小约为132bp，MAD的扩增产物大小约为121bp，POLY的扩增产物大小约为164bp，由于ECT与POLY扩增产物大小相近，MCMV与MAD扩增产物大小相近，所以部分扩增产物的电泳条带难以分辨。
2）PCR产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白（SA-PE）工作液杂交
分别包被有特异的anti-tag序列的4种微球，其中anti-tag序列能相应地与ECT、MAD、MCMV和POLY四种病毒引物上的tag序列互补配对。四种微球均购自Luminex公司，具体的ECT、MAD、MCMV和POLY分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A028、MTAG-A046、MTAG-056和MTAG-034。
荧光编码微球工作液的制备：将2500个/ul荧光编码微球用1.1×Tm Hybrdization Buffer稀释到1uL约含有125个/种荧光编码微球。
SA-PE工作液制备：将1mg/mLSA-PE用1×Tm Hybrdization Buffer稀释到10ug/ul。
充分重悬荧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入微球工作液20ul，样品孔中加入5ul PCR产物，背景孔中加入5ul 阴性PCR产物，再加入75ul的SA-PE工作液，充分混匀，于金属加热器中42℃孵育30min。
依照检测仪Luminex200仪器的说明将杂交后的50ul上述反应液进行检测，结果如图2所示，难以用电泳分辨三重、四重模板的扩增产物，但当用检测仪Luminex200仪器读取MFI值时，能明显分辩不同类型的病毒。
）最低检测阈值（cutoff值）的确定
选取10只SPF鼠脾脏或肝脏样品（每个样品平行重复3次），分别读取MFI值并计算其平均值和标准差。以平均值加3倍标准差的MIF值设定其为cutoff值。本发明所获得cutoff值为487.3，因此将本发明的cutoff值定为500。只有检测样品的MFI值高于500时，该实验数据才能进行有效分析。
待测样本的分析判断：1）当待测样本的MFI值＞500时，判断为阳性样本；2）待测样本的MFI值≤500时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。
实施例3：ECT、MAD、MCMV、POLY的多重荧光基因检测灵敏性实验
将制备的质粒进行定量，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至10 copies/μL，用上述建立的多重荧光基因检测方法进行检测。ECT、MAD、MCMV、POLY的多重荧光基因检测灵敏性实验结果如图3所示，实验结果表明，ECT、MAD、MCMV、POLY的灵敏度较高，检出限均为1000copies/μL。
实施例4：ECT、MAD、MCMV、POLY的多重荧光基因检测特异性实验
分别用以下DNA或cDNA作为模板进行多重荧光基因检测：鼠痘病毒（ECT）、小鼠腺病毒（MAD）、小鼠巨细胞病毒（MCMV）、小鼠多瘤病毒（POLY）、小鼠细小病毒（MPV）、仙台病毒（SV）、呼肠孤病毒III型（REO3）、小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠诺如病毒（MNV）、SPF小鼠脾脏（negative）。实验结果如图4所示，只有鼠痘病毒（ECT）、小鼠腺病毒（MAD）、小鼠巨细胞病毒（MCMV）、小鼠多瘤病毒（POLY）为阳性，其他的均为阴性，说明检测体系特异性良好。
实施例5：ECT、MAD、MCMV、POLY的多重荧光基因检测重复性实验
四种病毒分别做了批内和批间实验，结果表明批内实验的变异系数均在3.1%以下，批间实验的变异系数均在4.27%以下，表明该方法的检测性能稳定，结果可靠，具有可重复性。
实施例6：样品的检测
取PCR鉴定为阳性的小鼠样本及实验室培养的病毒液，采用上述ECT、MAD、MCMV、POLY的多重荧光基因检测方法进行检测，同时设阴性对照negative，结果如图5所示。
阳性样本PCR检测实验结果如下：3个为鼠痘病毒样品；2个为小鼠腺病毒，1个为鼠痘病毒与小鼠腺病毒混合样本；1个为鼠痘病毒与小鼠多瘤病毒混合样本；1为鼠痘病毒与小鼠腺病毒、小鼠多瘤病毒混合样本。通过分析，结果和图5中多重荧光基因检测结果一致。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省实验动物监测所
<120> 一种快速区分ECT、MAD、MCMV、POLY的多重荧光基因检测方法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tacggtgtat atggctactc a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
actgctgctt cctatactcg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agactcacac tgcgtatagt cc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccagaactcg gttatcccca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gccctcttca tcccttacct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gacctccatg tccttcatgc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccatgctccc ttctatgcga t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcagtcagcc atagatgcaa 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cacttaattc attctaaatc tatc 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttaaacaatc tactattcaa tcac 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cttaaactct acttacttct aatt 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
acttatttct tcactactat atca 24