鉴定西瓜种皮颜色的InDel分子标记及其引物和应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种鉴定西瓜种皮颜色的InDel分子标记及其引物和应用。

背景技术：

除了品质和抗性性状，西瓜种子性状也是育种家新品种选育的目标之一。西瓜种皮颜色变异丰富，却没有统一的描述标准，不同的研究很难进行比较。马双武主编的《西瓜种质资源描述规范和数据标准》将种皮底色(第一颜色)分为白、黄白、灰黄、黄、红黄、浅红、红、红褐、灰褐、黑、绿和灰绿12种，种皮覆纹(第二颜色)特征分为灰褐色斑点、灰褐色斑纹、黄白色斑块、黄红色斑块、黄褐色斑块和黑色斑块六种。

西瓜种子存在一些已知的基因突变体，遗传学分析已经发现控制种皮颜色的3个基因，包括r(Poole et al.,1941)控制红色种子，t(McKay,1936)控制棕褐色(tan)种皮，w(Poole et al.,1941)控制白色种皮。r、t和w相互作用产生六种不同的种皮颜色：黑色(RR TT WW)、土色(RR TT ww)、棕褐色(RR tt WW)、白色带棕褐色种尖(RR tt ww)、红色(rr tt WW)、白色带粉红色种尖(rr tt ww)(Kanda 1951)。还发现一个控制种皮颜色的修饰基因d(Poole et al.,1941)，当r、t、w为显性时产生黑色(RR TT WW DD)或黑色带斑点种皮(RR TT WW dd)，但对其他种皮颜色没有影响。并且这四个基因对绿色种皮颜色没有作用。传统的遗传学采用数理统计的方法，只能将控制种皮颜色的一个或多个基因作为一个整体进行研究，不能确定单个基因在染色体上的位置及效应(徐云碧，1992)。

技术实现要素：

针对以上问题，本发明通过QTL定位首次在8号连锁群定位到了种皮颜色的主效QTL(数量性状位点)，并结合亲本重测序制备到与西瓜种皮颜色紧密连锁的InDel分子标记，设计了其引物，并在西瓜种皮颜色育种中进行了应用，可为鉴定西瓜种皮颜色提供新手段，加速西瓜种皮颜色的改良进程，提高育种的准确性和选择效率。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

设计一种鉴定西瓜种皮颜色的InDel分子标记，其核苷酸序列为：ATATGAGCCCGTAGAGG。

上述InDel分子标记的PCR扩增引物，包括以下的引物对：

InDel6_sc8F：AAATCACAGTAATAGAATGCTT；

InDel6_sc8R：TTAGAAGCTACACTCGTCCT。

上述InDel分子标记的筛选方法，包括以下步骤：

(1)利用种皮颜色分别为黄麻和黑色的母本和父本杂交的F₂群体构建高密度的遗传连锁图谱，并对父母本、F₁和F₂群体的93个单瓜种子进行种皮颜色的表型鉴定；

(2)结合遗传连锁图谱和种皮颜色表型鉴定结果，利用专门针对质量性状定位的Rqtl-IM-binary方法进行QTL初定位，在LG8鉴定到一个种皮颜色的主效QTL(sc8)，其LOD峰值为17，解释90％的表型变异，对应的置信区间(2-LOD)为119-191cM，对应的物理位置为8号染色体的19.9-25.9Mb；

(3)结合两个亲本的重测序，在QTL峰值附近区域发现20个插入缺失片段大于20bp的InDels，共设计了16对InDel引物；

(4)利用对应的InDel引物在父母本、F₁进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel引物在F₂群体中进行基因型鉴定；

(5)将种皮颜色表型归为一个形态学标记SC8，加上InDel分子标记的基因型鉴定结果与LG8上的其它SNP标记利用JoinMap4.0进行图谱构建，发现SC8位于主效QTL sc8的置信区间，并且其中一对新开发的引物InDel6_sc8与SC8的连锁程度很紧密，两者的遗传距离仅为1cM。

利用上述技术措施，发明人最终获得了与西瓜种皮颜色紧密连锁的插入缺失分子标记InDel6_sc8，其对应的西瓜参考基因组物理图谱的位置为8号染色体的22640623bp，序列为ATATGAGCCCGTAGAGG，其特异的扩增引物序列为，

InDel6_sc8F：AAATCACAGTAATAGAATGCTT；

InDel6_sc8R：TTAGAAGCTACACTCGTCCT。

利用上述InDel分子标记鉴定西瓜种皮颜色的方法，包括以下步骤：

(1)引物设计：设计并筛选，得到所述扩增引物；

(2)DNA提取：利用CTAB法提取西瓜植株总DNA；

(3)PCR扩增：

反应体系：100ng/μl西瓜植株总DNA 1μl、正向引物(10μmol/l)1μl、反向引物(10μmol/l)1μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μl、ddH₂O 9.5μl；

反应程序：94℃5分钟，35个循环的94℃20秒钟、55℃1分钟、72℃30秒、72℃5分钟；

(4)电泳图谱分析：对所得扩增产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读，找到目标条带，根据扩增产物的条带大小及位置关系确定所属基因型(197bp的条带代表黄麻种皮基因型，180bp的条带代表非黄麻种皮基因型)。

本发明具有以下积极有益效果：

本发明InDel分子标记变异稳定、检测容易，并且成本低廉，提高了西瓜种皮颜色育种的选择效率和准确率，从而能加快育种进程。此外，此标记与目标QTL紧密连锁，遗传距离仅为1cM，在群体中检测效率达到100％，加快了西瓜种皮颜色基因的克隆和功能验证。

附图说明

图1种皮颜色全基因组的QTL扫描图谱。

图2开发InDel标记加入图谱前后分析；A：LG8种皮颜色QTL扫描；B加上分子标记InDel6_sc8后的连锁分析。

图3利用分子标记InDel6_sc8的引物在部分F₂群体基因组DNA中的扩增结果；父母本方框中条带为目的条带，名称皆为品种名称\代号的后两/三位。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所涉及的原料，如无特别说明均为市售，所涉及检测方法如无特别说明，则均为常规方法。

实施例1

鉴定西瓜种皮颜色的InDel分子标记的开发方法，具体步骤如下：

(1)西瓜种皮颜色全基因组QTL定位

利用母本“ZXG01478”(黄麻：种皮底色为黄，覆纹为灰褐色斑点)和父本“14CB11”(黑：种皮底色为黑，无覆纹)杂交获得的F₂群体已经构建了高密度的遗传连锁图谱(Shang et al.,2016)，并对父母本、F₁和F₂群体的93个单瓜种子进行种皮颜色的直观鉴定；结合遗传连锁图谱和F₂群体表型鉴定结果，利用Rqtl-IM-binary方法(Yandel et al.,2007)进行QTL初定位(图1)，仅在LG8鉴定到一个种皮颜色的主效QTL(sc8)，其LOD峰值为17，解释90％的表型变异，对应的置信区间(2-LOD)为119-191cM，对应的物理位置为8号染色体的19.9～25.96Mb。

(2)父母本的重测序

利用母本和父本进行了22×深度的高通量重测序。两个亲本共检测到45134个小的InDel。

(3)QTL区域InDel标记的开发

在QTL定位的峰值附近区间发现20个插入缺失片段大于20bp的InDels。利用Perl自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，共设计16对对应的InDel引物。

实施例2

西瓜F₂群体分子标记分析，包括以下步骤：

(1)利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：

①取1g新鲜叶片放入研钵，加入液氮研成粉末状，随即转入加有1mlCTAB抽取液的离心管中，使二者充分混匀，然后置于65℃恒温水浴60min，其间颠倒混合2-3次；

②从水浴锅取出后，8000rpm离心1min；

③取上清液置于另一离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇(24：1，V/V)，轻轻颠倒使其充分混匀；

④10000rpm离心5min，取上清液(尽量不取到中层沉淀)；

⑤加入0.7倍体积的异丙醇(需提前预冷30min)，混匀后置于-20℃冷冻不超过30min让DNA析出；取出后10000rpm离心5min，留沉淀弃上清液；

⑥用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，打开离心管盖子晾干；

⑦加入200μl的蒸馏水溶解DNA；用紫外分光光度计测定DNA的浓度，于-20℃冰箱中保存备用。

(2)PCR反应体系和程序

反应体系如下：西瓜叶片总DNA(100ng/μl)1μl、Forward primer(10μmol/L)1μl、Reverse primer(10μmol/L)1μl、2×Power Taq PCR MasterMix12.5μl、ddH₂O 9.5μl。

PCR反应程序为：94℃5分钟，35个循环的94℃20秒钟、55℃1分钟、72℃30秒、72℃5分钟。

(3)对PCR产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。

①试剂配制：

A.5×TBE：

Tris-base 53.9克

EDTA 3.72克

硼酸 27.5克

用蒸馏水定容至1升。

B.40％聚丙烯酰胺溶液：

聚丙烯酰胺 193.34克

甲叉双丙烯酰胺 6.66克

用蒸馏水定容至 500毫升。

C.8％聚丙烯酰胺凝胶(现配现用)：

D.银染液：

硝酸银 1克

冰醋酸 5毫升

无水乙醇 50毫升

用去离子水定容至500毫升。

E.显影液：

氢氧化钠 15克

甲醛(37％) 2.5毫升

用去离子水定容至 500毫升。

②凝胶板准备：

玻璃板用蒸馏水洗净、晾干后，用浸泡过无水乙醇的脱脂棉球擦拭，晾干。将凹板和平板叠合紧密后放入制胶器中压紧并扣好其两边的夹子(一个制胶器可制作两板凝胶)。在洗瓶内配置8％聚丙烯酰胺凝胶溶液(两份)，混匀后快速注入两板中间的缝隙内，注满后插入有齿的梳子(不要让梳子齿的下方产生气泡)；若此时液面有所下降，可用移液器吸取未凝固的溶液来补充。等待溶液充分凝固。

③电泳：

将制胶器支架从底座上取下，直接放入配套的电泳槽中，在电泳槽底部及支架上两块玻璃板中间倒入适量的1×TBE缓冲液。在PCR产物中加入0.2倍体积的6×DNA Loading Buffer，混匀后取0.8微升加入点样孔内，260伏电泳35分钟。

④染色和显影：

电泳完成后，从电泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝胶会贴附于平板上，凝胶面向上将平板放入银染液中，置于脱色摇床上轻摇15分钟，凝胶会自动脱落下来；银染完毕，将凝胶取出放入去离子水中清洗10秒；清洗完毕后将凝胶转入显影液中，轻摇摇床，待条带清晰后取出凝胶，放置在阅片器上肉眼观察条带的位置差异，并拍照保存。

⑤带型判读：

将显影后自然干燥好的玻璃板置于阅片台上，肉眼观察两亲本条带的位置差异。

实施例3

F₂群体遗传连锁图谱重新构建，其步骤如下：首先利用种皮颜色形态标记(SC8)、新开发的InDel标记和LG8上其它的SNP标记利用Joinmap4.0软件进行连锁分析，发现SC8位于主效QTL sc8的置信区间，并且是比较接近QTL峰值的位置，新开发的标记之一InDel6_sc8与SC8的遗传距离很近，仅为1cM(图2)。至此，我们开发了与种皮颜色QTL(sc8)最为紧密连锁的共显性分子标记InDel6_sc8，对应于8号染色体22640623bp的一个17bp的插入缺失，其序列为ATATGAGCCCGTAGAGG，其引物序列为，InDel6_sc8F：AAATCACAGTAATAGAATGCTT；InDel6_sc8R：TTAGAAGCTACACTCGTCCT。该引物在母本(黄麻)中的扩增产物为197bp，在父本(黑色)中的扩增产物为180bp，该标记与SC8的遗传距离仅为1cM，与种皮颜色QTL(sc8)的连锁程度很紧密。

实施例4

一种实施例3所筛选InDel分子标记在育种中的应用，其应用步骤如下：

(1)如实施例2进行InDel6_sc8分子标记在F₂群体中的基因型鉴定(图3)。

(2)检查InDel6_sc8分子标记的两种基因型(A代表母本带型，B代表父本带型，H代表杂合基因型)在93个F₂群体中的分布情况(表1)。

结果表明，分子标记InDel6_sc8的基因型在20份黄麻种皮株系中都为A(197bp)。而在73份非黄麻(黑或褐)株系中，有23份为B(180bp)，50份为H。

分子标记InDel6_sc8的基因型为A的20个株系都是黄麻，而在基因型为B的23个株系都是非黄麻(黑或褐)，其基因型鉴定的准确率达到100％。

以上的结果足以说明通过分子标记InDel6_sc8来预测西瓜种皮颜色(特别是隐性黄麻种色)，可以提高西瓜种皮颜色育种的选择效率，从而加速育种进程。

表1 InDel6_sc8在F₂群体中的鉴定和验证

SEQUENCE LISTING

<110> 河南牧业经济学院

<120> 鉴定西瓜种皮颜色的InDel分子标记及其引物和应用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atatgagccc gtagagg 17

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttagaagcta cactcgtcct 20