本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种新的narmp1突变基因及其在胞内菌感染中的应用。
背景技术：
：nramp1(又名slc11a1)位于晚期溶酶体/内涵体膜上，是一种ph依赖型二价阳离子转运蛋白，分子量约90-110kda。其含有十二个跨膜区，1-8跨膜区具有高度的同源性，在跨膜区5与6之间外膜侧，有2个n型糖基化位点，在跨膜区6与7之间内膜侧有一个进化上高度保守的转运功能域。目前研究认为nramp1蛋白有协助巨噬细胞抵抗细菌感染的功能，其机制在于：巨噬细胞将病菌吞入吞噬体内后，可通过产生活性氧和/或氮的中间体杀伤病菌。有些细菌(例如结核菌)能够通过自身所产生的大量酶类(比如超氧化物歧化酶sod)抵抗巨噬细胞杀伤作用。而这些酶的活性中心大多有金属离子的参与。nramp1的功能是将金属离子从吞噬体内腔转运到细胞质内。由此，吞噬体内金属离子的损耗成了细胞内病原菌合成各类金属酶的限速步骤，从而限制了病菌生产活性酶的能力，阻止了寄生菌的增殖。相反地，一个有缺陷的nramp1转运蛋白可引起吞噬体中金属离子的富集，致使生物体对病原体的敏感性增大。尽管物种之间的nramp1基因具有一定同源性，但一级序列仍存在较大差异，这些差异主要集中在位于吞噬体内的n末端和c末端，这些差异使各物种在抵抗细菌感染方面的能力存在差异。因此，本领域迫切需要开发一种能够提高nramp1抗菌能力的蛋白，用于加强人畜对细菌、尤其是胞内菌的抵抗能力。技术实现要素：本发明提供了一种新的羊nramp1突变蛋白及其编码核酸，以及其在抵抗胞内菌中的应用。本发明第一方面，提供了一种羊天然抗性相关巨噬蛋白1(naturalresistance-associatedmacrophageprotein1，nramp1)的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白第132位氨基酸由异亮氨酸(i)突变为苏氨酸(t)。在另一优选例中，所述突变蛋白的氨基酸序列如seqidno.:1(msgdtgtpnqggtrygsissppspgpqqappggtylsekipipdtesgafslrklwaftgpgflmsiafldpgniesdlqagavagfkllwvllwatvlgllcqrlaarlgvvtgkdlgevchlyypkvprtllwltielaivgsdmqevigtaiafsllsagriplwggvlitivdtffflfldnyglrkleaffgflitimaltfgyeyvvarpaqgallqglflpscpgcgqpellqavgivgaiimphniylhsslvksrevdrsrradireanmyflieatialsvsffinlfvmavfgqafykqtnqaafnicansslhdyatifprdnltvavdiyqggvilgclfgpaalyiwavgllaagqsstmtgtyagqfvmegflklrwsrfarvlltrscailptvllavfrdlqdlsglndllnvlqslllpfavlpiltftsmpalmqefanglvskiitssimvlvcavnlyfvisyvpslphpayfslvallaaaylglttylvwtclitqgathlahsshqrflyglpgedqeegrtsg)所示。在另一优选例中，所述突变蛋白除第132位之外，其它部分与野生型nramp1蛋白相同，其中所述野生型nramp1蛋白如seqidno.:3(msgdtgtpnqggtrygsissppspgpqqappggtylsekipipdtesgafslrklwaftgpgflmsiafldpgniesdlqagavagfkllwvllwatvlgllcqrlaarlgvvtgkdlgevchlyypkvprillwltielaivgsdmqevigtaiafsllsagriplwggvlitivdtffflfldnyglrkleaffgflitimaltfgyeyvvarpaqgallqglflpscpgcgqpellqavgivgaiimphniylhsslvksrevdrsrradireanmyflieatialsvsffinlfvmavfgqafykqtnqaafnicansslhdyatifprdnltvavdiyqggvilgclfgpaalyiwavgllaagqsstmtgtyagqfvmegflklrwsrfarvlltrscailptvllavfrdlqdlsglndllnvlqslllpfavlpiltftsmpalmqefanglvskiitssimvlvcavnlyfvisyvpslphpayfslvallaaaylglttylvwtclitqgathlahsshqrflyglpgedqeegrtsg)所示。本发明第二方面，提供了一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的突变蛋白。在另一优选例中，所述的多核苷酸与seqidno.:4(atgtctggtgacacgggtaccccaaaccagggagggaccagatatggctccatctccagcccacccagtccagggccacagcaagcacctcccggagggacctacctaagtgagaagatccccattccggatacagaatcgggtgcattcagcctgcggaagctgtgggccttcacagggcctggattcctcatgagcatagcattcctggacccaggaaacatcgagtcggatcttcaggctggggctgtggctggattcaaactgctctgggtgctgctgtgggccacagtgttgggcttgctctgccagcgactggctgcccggctgggcgtggtgacaggcaaggacttgggagaggtctgccatctctactaccctaaggtgccccgcattctcctctggctgaccatcgagctagccatcgtgggctcggacatgcaggaagtcattggcacagctattgcattcagtctgctctcagccggacgaatcccactctggggtggtgtcctcatcaccatcgtggacactttcttcttcctcttcctcgataactacgggttgcggaagctggaagccttttttggatttcttattaccataatggccttgaccttcggctatgagtacgtggtggctcggcctgctcagggagcactgcttcagggcctgttcctgccctcgtgcccaggctgtggccagcccgagctgctgcaggccgtgggcatcgttggcgccatcatcatgccccacaacatctacctgcattcctccctagtcaagtctcgagaggtagaccggtcccggcgggcggacatccgagaagccaacatgtacttcctgattgaagccaccatcgccctgtctgtctccttcttcatcaacctctttgtcatggctgtctttgggcaagccttctacaagcaaaccaaccaggctgcgttcaacatctgtgccaacagcagcctccacgactacgcgacgatctttcccagggacaacctgacagtggccgtggacatttaccaaggaggcgtgatcctgggctgcctctttggccctgcagccctgtacatctgggccgtgggtctcctggctgctgggcagagctccaccatgaccggcacctacgcgggacagtttgtgatggagggctttctgaagctgcggtggtcacgcttcgcccgagtcctgctcactcgctcctgcgccatcctgcccactgtgctcctggctgtcttcagggacctgcaggacctgtcaggcctcaacgacctgctcaacgtgctgcagagcctgctgcttccgtttgctgtgctgcccatcctcaccttcaccagcatgcccgccctgatgcaggagtttgccaacggcctggtgagcaaaattatcacttcctccatcatggtgctggtctgtgccgtcaacctttacttcgtgatcagctacgtgcccagcctcccccaccctgcctacttcagccttgtagcactgctggccgcagcctacctgggcctcaccacttacctggtctggacctgtctcatcacccagggagccactcatctggcccacagttcccaccaacgctttctgtatgggcttcctggagaggatcaggaggaggggaggacctcgggatga)相比，具有以下突变：(a)第395位，t→c。在另一优选例中，所述多核苷酸与seqidno.:4相比，还具有以下一个或多个突变：(b)第648位，t→c；(c)第1131位，g→a。在另一优选例中，所述多核苷酸序列如seqidno.:2所示(atgtctggtgacacgggtaccccaaaccagggagggaccagatatggctccatctccagcccacccagtccagggccacagcaagcacctcccggagggacctacctaagtgagaagatccccattccggatacagaatcgggtgcattcagcctgcggaagctgtgggccttcacagggcctggattcctcatgagcatagcattcctggacccaggaaacatcgagtcggatcttcaggctggggctgtggctggattcaaactgctctgggtgctgctgtgggccacagtgttgggcttgctctgccagcgactggctgcccggctgggcgtggtgacaggcaaggacttgggagaggtctgccatctctactaccctaaggtgccccgcactctcctctggctgaccatcgagctagccatcgtgggctcggacatgcaggaagtcattggcacagctattgcattcagtctgctctcagccggacgaatcccactctggggtggtgtcctcatcaccatcgtggacactttcttcttcctcttcctcgataactacgggttgcggaagctggaagccttttttggatttcttattaccataatggccttgaccttcggctatgagtacgtggtggctcggcccgctcagggagcactgcttcagggcctgttcctgccctcgtgcccaggctgtggccagcccgagctgctgcaggccgtgggcatcgttggcgccatcatcatgccccacaacatctacctgcattcctccctagtcaagtctcgagaggtagaccggtcccggcgggcggacatccgagaagccaacatgtacttcctgattgaagccaccatcgccctgtctgtctccttcttcatcaacctctttgtcatggctgtctttgggcaagccttctacaagcaaaccaaccaggctgcgttcaacatctgtgccaacagcagcctccacgactacgcgacgatctttcccagggacaacctgacagtggccgtggacatttaccaaggaggcgtgatcctgggctgcctctttggccctgcagccctgtacatctgggccgtgggtctcctggctgctgggcagagctccaccatgaccggcacctacgcgggacagtttgtgatggagggctttctgaagctgcggtggtcacgcttcgcccgagtcctgctcactcgctcctgcgccatcctgcccactgtgctcctggctgtcttcagggacctgcaggacctgtcaggcctcaacgacctgctcaacgtgctgcagagcctgctgcttccatttgctgtgctgcccatcctcaccttcaccagcatgcccgccctgatgcaggagtttgccaacggcctggtgagcaaaattatcacttcctccatcatggtgctggtctgtgccgtcaacctttacttcgtgatcagctacgtgcccagcctcccccaccctgcctacttcagccttgtagcactgctggccgcagcctacctgggcctcaccacttacctggtctggacctgtctcatcacccagggagccactcatctggcccacagttcccaccaacgctttctgtatgggcttcctggagaggatcaggaggaggggaggacctcgggatga)。在另一优选例中，所述的野生型nramp1蛋白来源于羊，如绵羊或山羊，优选为山羊。本发明第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的表达载体含有巨噬细胞特异性表达启动子。在另一优选例中，所述巨噬细胞特异性表达启动子如seqidno.:5(ctagcgagggcggaccagaaaaggagaagtaggagccaagatttccaaactctgtggttgccttgccaagatttccaaactctgtggttgccttgcagaaaaggagaagtaggagaagcgacttcctctttccagaagcgacttcctctttccagaggaagagggcggaggctcacaaggcaaccacagagtttggaaatcttggaagcgacttcctctttccagcagaaaaggagaagtaggagaagcgacttcctctttccaggtccgccctcg)所示。在另一优选例中，所述巨噬细胞来源于羊、牛或小鼠。本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体或所述宿主细胞整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述宿主细胞表达的nramp1基因是外源性导入的。在另一优选例中，，所述宿主细胞为巨噬细胞。在另一优选例中，所述巨噬细胞比野生型巨噬细胞的吞噬能力显著增强。本发明第五方面，提供了本发明第一方面所述突变蛋白、本发明第二方面所述多核苷酸、本发明第三方面所述表达载体或本发明第四方面所述宿主细胞的用途，用于制备抗胞内菌和/或治疗胞内菌感染的药物组合物。在另一优选例中，所述胞内菌包括沙门氏菌(salmonellosis)、结核杆菌(tuberculosis)、布氏杆菌(brucellosis)、或类结核菌(paratuberculosis)。本发明第六方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有表达本发明第一方面所述突变蛋白的巨噬细胞，和药学上可接受的载体。本发明第七方面，提供了一种体外非治疗性抑制或杀灭胞内菌的方法，包括步骤，在本发明第四方面所述宿主细胞的存在下，共培养胞内菌，从而抑制或杀灭胞内菌，所述宿主细胞为巨噬细胞。在另一优选例中，所述胞内菌的抑制或杀灭包括通过所述的巨噬细胞吞噬和/或裂解所述的胞内菌。本发明第八方面，提供了一种制备抗胞内菌能力增强的巨噬细胞的方法，包括步骤：(a)提供本发明第三方面所述的表达载体；和(b)将(a)中所述的表达载体转染巨噬细胞，从而获得抗胞内菌能力增强的巨噬细胞。在另一优选例中，所述抗胞内菌能力增强指的是与正常巨噬细胞相比，本发明整合巨噬细胞满足一下一个或多个条件：(i)整合巨噬细胞(e1)正常巨噬细胞(e0)胞内菌吞噬活性之比e1/e0≥1.5，优选地，e1/e0≥2.0；(ii)整合巨噬细胞(c1)正常巨噬细胞(c0)胞内菌生长菌落形成单位(cfu)之比c1/c0≤1/2，优选地≤1/3、1/4或1/5。在另一优选例中，所述的巨噬细胞表达本发明第一方面所述的突变蛋白。在另一优选例中，所述的胞内菌包括沙门氏菌、结核杆菌。本发明第九方面，一种巨噬细胞，所述的巨噬细胞含有高表达的本发明第一方面所述的突变蛋白。在另一优选例中，所述的巨噬细胞由本发明第八方面所述的方法制备获得。在另一优选例中，所述的高表达指的是所述巨噬细胞中nramp1突变蛋白的表达量e1与不含所述突变蛋白的巨噬细胞中nramp1表达量e0之比e1/e0≥1.5，优选地≥2.0。在另一优选例中，所述的巨噬细胞对胞内菌的吞噬能力a1与野生型巨噬细胞的吞噬能力a0之比a1/a0≥1.5，优选地，≥2.0。本发明第十方面，一种抑制胞内菌和/或治疗胞内菌感染的方法，包括步骤：向需要的对象施用有效量的本发明整合巨噬细胞或本发明第六方面药物组合物。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1a为质粒psp-n经aseⅰ和saiⅰ双酶切后1％琼脂糖凝胶电泳结果，m为10000bp分子量标准，条带自上至下条带大小分别为10000,8000,6000,5000,4000,3500,3000,2500,2000,1500,1000,750,500,250bp；1为质粒psp-naseⅰ和saiⅰ酶切结果。图1b为图1a中3503bp产物经sacⅱ酶切后1％琼脂糖凝胶电泳结果，m为10000bp分子量标准，条带自上至下条带大小分别为10000,8000,6000,5000,4000,3500,3000,2500,2000,1500,1000,750,500,250bp；2为3503bp产物经sacⅱ酶切结果，回收2296bp片段，该片段包含有nramp1表达框架。图1c为采用rhythm对野生型nramp1蛋白的穿膜螺旋分析；图1d为采用rhythm对本发明nramp1突变蛋白的穿膜螺旋分析。图2为质粒pgh4经saiⅰ酶切后回收目的片段1％琼脂糖凝胶电泳结果，m为10000bp分子量标准，条带自上至下条带大小分别为10000,8000,6000,5000,4000,3500,3000,2500,2000,1500,1000,750,500,250bp；3为saiⅰ酶切后回收pgh4片段结果，该片段包含有neo基因表达框架。图3为山羊nramp1整合克隆细胞株的pcr产物的1％琼脂糖凝胶电泳结果，m为dl2000分子量标准，条带自下而上分别为100、250、500、750、1000、2000bp；1-12分别为nramp1转染后挑取的1#～12#单克隆细胞株。图4为山羊nramp1整合细胞株的rt-pcr琼脂糖凝胶电泳结果，m为dl2000分子量标准，条带自下而上分别为100、250、500、750、1000、2000bp；r为raw264.7野生型细胞；1～12分别为nramp1转染后挑取的1#～12#单克隆细胞株。图5为山羊nramp1整合克隆细胞株western-blot结果；r为raw264.7野生型细胞；1～7分别为1#、3#、4#、5#、8#、11#、12#克隆细胞株。图6为中性红吞噬活性结果；raw264.7为raw264.7野生型细胞；1#整合细胞为1#山羊nramp1克隆细胞株。图7为沙门氏菌增殖抑制检测结果；raw264.7为raw264.7野生型细胞；1#整合细胞、3#整合细胞、11#整合细胞为1#、3#、11#山羊nramp1克隆细胞株。图8显示了全人工合成的含本发明突变基因的psp-n序列(seqidno.:8)。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，将第132位的异亮氨酸突变为苏氨酸(i132t)后，羊nramp1基因不仅能方便、特异性地利用巨噬细胞启动子在巨噬细胞中过表达，并展示出具有更强的抗胞内菌活性，对结合杆菌、沙门氏菌等具有非常显著的杀菌活性。本发明通过对山羊的nramp1氨基酸序列改造，提供了一种具有提高抗胞内菌活性的nramp1突变体，利用现代基因工程技术该蛋白可用于预防和治疗胞内菌引起的感染。在此基础上，完成了本发明。nramp1基因羊天然抗性相关巨噬蛋白1(nramp1)位于晚期溶酶体/内涵体膜上，是一种ph依赖型二价阳离子转运蛋白，分子量约90-110kda。其含有十二个跨膜区，1-8跨膜区具有高度的同源性，在跨膜区5与6之间外膜侧，有2个n型糖基化位点，在跨膜区6与7之间内膜侧有一个进化上高度保守的转运功能域。nramp1基因从细菌到人类具有一定保守性，序列同源性在30％以上。目前研究认为nramp1蛋白有协助巨噬细胞抵抗细菌感染的功能。nramp1基因从细菌到人类具有部分保守性，序列同源性为30％或以上。通过对比nramp家族成员的氨基酸序列，可见这些蛋白具有10个保守性的疏水性穿膜域核心(tm)和1个或2个不保守的疏水tm域。尽管物种之间的nramp1基因具有部分同源性，但一级序列差异非常大，这些差异有的存在于n末端和c末端，使得各物种在抵抗细菌感染方面的能力存在很大差异性。目前，有众多通过点突变的方法进行nramp异构体的结构-功能研究，揭示出存在于各个穿膜片段中潜在的功能性残基(例如保守tm中的带电残基、组氨酸和甘氨酸等)。在tm1和邻近的外部袢中，nramp2的d86、g88、q95被替代后会严重影响甚至完全消除蛋白的金属和质子的吸收。nramp2tm3中的负电荷残基e154被替代后也严重影响或消除转运功能。nramp1tm4中的g169d变异，在近交系小鼠中会引起对数种胞内病原体敏感。nramp2tm4中的g185r突变导致了nramp2的fe2+运输能力丧失，使得mk1-/-小鼠和大鼠产生贫血症状。在多种nramp蛋白的tm6中的两个组氨酸残基(例如，nramp2的h267、h272或mnth的h211和h216)被发现在h+流和金属离子运输的耦合中起着关键作用。本发明突变蛋白及其编码序列如本文所用，术语“本发明突变蛋白”、“本发明多肽”、“本发明蛋白”、“nramp1.1”可互换使用，指的是与seqidno.:3野生型羊nramp1蛋白相比，第132位氨基酸由i异亮氨酸突变为t苏氨酸、且具有高巨噬细胞抗胞内菌活性以及低机体刺激性的突变型nramp1蛋白。在一优选的实施方式中，本发明突变蛋白的序列如seqidno.:1所示。在另一优选的实施方式中，本发明突变蛋白的序列还包括seqidno.:1所示蛋白经一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加形成的序列，且基本具有本发明突变蛋白功能的本发明突变蛋白衍生蛋白。本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见watson等，molecularbiologyofthegene，第四版，1987，thebenjamin/cummingspub.co.p224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。因此，本发明的多肽可以在对应于seqidno:1所示氨基酸序列的第132位的氨基酸残基为苏氨酸的基础上作进一步保守性替换而仍具备本发明突变的功能和活性。例如本发明突变蛋白(a)其氨基酸序列如seqidno:1；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。在本发明中，本发明的突变蛋白的衍生蛋白包括与氨基酸序列如seqidno:1所示的突变蛋白相比，有至多20个、较佳地至多10个，再佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的突变体。这些保守性变异的突变体可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。初始残基代表性的取代残基优选的取代残基ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu本发明突变蛋白可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。此外，本发明突变蛋白还可以是经修饰的蛋白。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。优选地，所述的突变蛋白的衍生蛋白不包括野生nramp1基因，如seqidno.:3所示的羊nramp1基因。优选地，所述衍生蛋白与seqidno.:1所述的蛋白的同源性(或相同性)≥85％、≥88％、≥90％、≥95％、≥98％、或≥99％。优选地，本发明所述突变蛋白的衍生蛋白还包括在其n端或c端含有信号蛋白、分泌信号蛋白或标签蛋白的衍生蛋白。本发明还提供了编码本发明突变蛋白的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括：dna、基因组dna或人工合成的dna，dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码蛋白肽的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。此外，本发明多核苷酸还可以是编码seqidno.:1所示多肽的多核苷酸的简并的变异体。如本文所用，以核心序列为例，“简并的变异体”指的是编码具有seqidno.:1所示序列的多肽，但与seqidno.:2中相应编码区序列有差别的核酸序列。一种优选的编码本发明蛋白的多核苷酸的，与seqidno.:4相比，具有以下突变：(a)第395位，t→c。更优选地，所述多核苷酸与seqidno.:4相比，还具有以下一个或多个突变：(b)第648位，t→c；(c)第1131位，g→a。在一优选方式中，编码所述突变蛋白的多核苷酸如seqidno.:2所示，在seqidno.:2中，t395c，t648c，g1131a。核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的dna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明还提供包括本发明的基因的重组载体及其应用。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。启动子及表达载体由于非特异性启动子启动巨噬细胞的表达可能对转基因动物其他部位存在副作用，因此需要巨噬细胞特异性启动子启动巨噬细胞的高表达。有研究报道cd68、清道夫受体a和sp启动子特异启动巨噬细胞表达，但cd68、清道夫受体a特异性低，也不适合长片段基因的表达。本发明人经过对启动子的筛选，发现本发明seqidno.:5所示的启动子能够使本发明突变蛋白在巨噬细胞中特异性高表达。用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。优选地，可用于本发明的启动子为巨噬细胞特异性启动子，序列如seqidno.:5所示。如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。宿主细胞本文所用的术语“宿主细胞”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够产生本发明突变蛋白的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的突变蛋白能在该宿主细胞中表达。优选地，为了加强巨噬细胞在机体内的胞内菌吞噬活性，通常将表达本发明突变蛋白的表达盒转染巨噬细胞，从而使巨噬细胞过表达本发明突变蛋白。因此，优选的宿主细胞为巨噬细胞，其中，所述的巨噬细胞来源于小鼠、大鼠、山羊、绵羊或人，优选为小鼠。本发明的宿主细胞中包含的本发明突变蛋白或其衍生蛋白的编码基因不仅可以是重组载体或质粒，还有可能是基因组上整合有所述酶的编码基因，即，在基因组整合上的酶的编码基因可能是通过转入质粒进行同源重组得到，也有可能在基因组上定点突变相应的位点而得到。可采用本领域常规技术对宿主细胞进行制备，例如磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。药物组合物本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物中含有表达本发明突变蛋白或其衍生蛋白的巨噬细胞作为活性成分，以及药学上可接受的载体。其中，将所述药物组合物适用于有需要的对象后，可以对胞内菌感染进行治疗或抑制。其中，所述药物组合物的处理，如灭菌等为本领域技术人员常规所知。通常，可以向所述对象施用有效量的本发明组合物(或其活性成分)。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0.001-99wt％；较佳的0.01-95wt％；更佳的，0.1-90wt％。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的peg化的突变型尿酸酶以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂通常为注射剂。胞内菌胞内菌是指侵入宿主细胞并能在宿主细胞中繁殖的病原细菌。比较常见的有：分枝杆菌(如结核杆菌和麻风杆菌等)、化脓性链球菌、化脓性葡萄球菌、沙门氏菌(如伤寒杆菌等)、嗜肺军团菌、李斯特菌、布鲁氏杆菌等。胞内菌会引起人类和动物的慢性持续性感染，给机体健康和生命带来了极大地威胁。这些病原体潜入细胞内，可以逃避机体的免疫防御的一系列机制，在细胞内长期存在，并可在动物和人群中传播，在适当时机如机体的免疫力下降时，就会出现临床症状，严重时可危及生命。胞内菌在大多时可以与宿主细胞共存，如世界上有1/3的人接触过结核杆菌，其中只有10％的人具有活性的结核杆菌，余下是潜伏感染，即携带有病菌但并不发病。由于胞内寄生菌能寄生在宿主细胞内，机体无法通过体液免疫进行有效抵御，而是通过细胞免疫使宿主细胞裂解使其失去藏身之所，再通过抗体与病原体结合，最后被吞噬细胞消灭。本发明突变蛋白及其应用本发明还提供了所述突变蛋白的应用。可将本发明突变蛋白的编码序列导入到巨噬细胞中，从而使巨噬细胞过表达本发明突变蛋白。表达本发明突变蛋白的巨噬细胞可以与胞内菌共培养，从而抑制胞内菌的增殖、吞噬胞内菌甚至杀灭胞内菌。此外，利用本发明巨噬细胞作为活性成分的药物组合物，还可以施用于需要的对象，从而杀灭机体内部的感染胞内菌，从而达到治疗胞内菌感染。本发明有益效果本发明突变蛋白的抗原性低、特异性高表达于巨噬细胞中，具有更强的抗胞内菌活性，尤其适用于治疗胞内菌引起的感染。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例1山羊nramp1蛋白的结构性分析使用在线rhythm程序进行穿膜螺旋(transmembranehelices)分析(http://proteinformatics.charite.de/rhythm/index.php？site＝home)，结果表明山羊天然nramp1蛋白有12个穿膜螺旋(tm1-12)(见图1c)，其n端和c端均位于膜内侧，第1，3，5，7，9和11袢位于膜外侧，第2，4，6，8，10袢位于膜内侧。虽然nramp1的各个跨膜区及膜内和膜外的具体功能还未能完全揭示，但膜内区对于激发囊泡内的生物学功能具有潜在功能。本实验经大量生物信息学分析以及对区段和位点的筛选发现，山羊nramp1的tm2和tm3间的膜内袢(袢2)上有一个潜在的蛋白激酶c(pkc)磷酸化位点tgk(114-116)和一个潜在的酪蛋白激酶ii(ck2)的磷酸化位点tgkd(114-117)。蛋白激酶c活化了na+-k+交换系统、使细胞内h+减少、提高细胞质中的ph，还提高了na+/k+泵的运转。在神经传导过程中，ck2通过磷酸化突触结合蛋白、突触融合蛋白和发动蛋白21调节了突触小泡的跨膜运输，形成了一种调节突触效率的突触前作用机制。突触结合蛋白的跨膜域涉及突触小泡与突触前质膜间相互作用的调节。突触融合蛋白具有调节突触结合蛋白与n2型ca2+通道间相互作用的功能。发动蛋白21在复极化时,pkc磷酸化可诱导除去ca2+；而在去极化时,去磷酸化则可诱导ca2+内流，同时伴随着突触小泡的再生。ck2能磷酸化突触结合蛋白的磷脂识别位点,而且ck2磷酸化发动蛋白21可以阻止由pkc介导的磷酸化作用。鉴于巨噬细胞中的吞噬小体也是一种胞内囊泡，而吞噬小体膜上的nramp1是一种二价金属离子转运蛋白，其袢2中的pkc与ck2的重叠磷酸化位点很可能涉及了二价离子转运的调节。实施例2巨噬细胞特异启动nramp1.1基因表达框架(psp-n)的构建本实验改造了山羊野生型nramp1基因(geneid:xm_005676540.1)，进行了i132t的单氨基酸替换(命名为nramp1.1，seqidno.:1)，由此通过缩短tm3，延长了袢2的长度。具体地，人工合成一段含有巨噬细胞特异性表达启动子sp(seqidno.:5)、本发明羊nramp1突变基因(seqidno.:2)及bgh-pa的序列，在其两端加入sacⅱ、sali位点，命名为psp-n。psp-n送由苏州金维智生物科技有限公司人工合成。合成后的载体待用，并且再次使用在线rhythm程序分析野生型和突变型的两种nramp1均有12个穿膜螺旋，主要差别是i132t变异导致了nramp1.1的第二个袢(第一个膜内袢)较野生型多了一个氨基酸，tm3减少了一个氨基酸(图1d)。正是由于这样的构造，改善了袢2的柔性和其在囊泡内的自由度。实施例3nramp1.1特异表达框架及pgh4片段回收1、nramp1.1特异表达框架片段回收psp-n质粒转化于e.coli(dh5α)感受态中，冰浴20min、42℃热激90s、冰浴2min，37℃、200rpm震荡培养1h后涂于a+固体lb培养基过夜，16h后挑取单克隆扩大培养，提取质粒，使用saiⅰ和sacii双酶切psp-n质粒，37℃下水浴1h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，图1a显示在3503bp和1235bp左右处有条带，回收3503bp条带；对回收3503bp目的片段使用限制性内切酶sacii酶酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶，在2296bp处有条带(图1b)，与预期相符，目的片段回收成功。2、pgh4片段回收pgh4质粒于-20℃保存。使用saiⅰ限制性内切酶大量酶切，成功获得了线性化的neo表达框架片段(图2)。实施例4psp-n和pgh4片段共转染raw264.7细胞1、小鼠巨噬细胞raw264.7的培养小鼠巨噬细胞raw264.7(购自北京中原合聚经贸有限公司，atcctib-71)使用含有10％胎牛血清及1％青链霉素的gmem培养液，在37℃的co2培养箱中培养，在显微镜下观察，可见细胞形态为圆形，贴壁。2、g418筛选raw264.7浓度的确定(1)将g418加入到细胞完全培养液中，制备g418浓度从1000μg/ml稀释至100μg/ml的培养液；(2)利用细胞计数，将细胞浓度调整到103-104个/ml加入到96孔板中，每个样品3个重复；(3)在96孔板中每孔加100ul的含g418的细胞完全培养液，并放入37℃细胞培养箱中培养，每隔三天换液一次；(4)在第7天，毎孔加mtt溶液20ul，37℃孵育4h，吸去上清，毎孔加150ul的dmso，震荡10min，使结晶物充分溶解。490nm波长比色，活细胞数与吸光值成正比关系；(5)确定g418杀死所有细胞的最低浓度。结果发现在筛选第3d时1000ug/ml浓度下，细胞已全部死亡，第10天，600ug/mlg418可以杀死全部细胞，故选用此浓度的g418作为筛选浓度。3、脂质体法转染raw264.7细胞(1)细胞培养：在转染前一天，向6孔板内接种106个细胞，使得细胞在转染时融合率达到90-95％；(2)准备复合物：按常规脂质体转染方法，将实施例2中回收的psp-n和pgh4片段分别与lip2000按比例混合；(3)细胞融合：向含有细胞和培养液的板子中每孔加入500ul的复合物，通过敲打板子和来回晃动使其混合均匀，6小时后换dmem完全培养基培养；(4)24h后胰酶消化细胞，1:6铺于6孔板；48小时后600ug/mlg418的gmem完全培养液进行细胞筛选，每隔三天换液一次。实施例5整合细胞克隆的挑选与表达检测1、克隆环法挑取细胞克隆并扩大培养巨噬细胞转染前细胞形态良好，生长旺盛，融合度达到90％左右。加入转染6h，观察有少部分细胞出现死亡。进行筛选7d时，培养皿已出现细胞克隆，细胞形态良好，围绕中心生长。挑取单克隆21株，经96、48、24、12和6孔板进行扩大培养，其中12株细胞生长旺盛，1周可以铺满10cm板。2、整合细胞克隆pcr鉴定本实验利用天根血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(货号dp302)提取细胞dna，进行细胞基因组提取，调整浓度约为50ng/ul。根据nramp1.1序列设计一对扩增引物，上游引物f5’-acagtgttgggcttgctc-3’(1120)(seqidno.:6)；下游引物r5’-cacgcctccttggtaaat-3’(1872)(seqidno.:7)；预计扩增片段长度为753bp。引物由维智生物科技有限公司合成。利用这对引物对细胞基因组进行pcr检测，pcr反应程序：95℃，5min；95℃30s，58℃30s，72℃45s，共30个循环；72℃延伸7min；4℃保存。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，在753bp出现清晰条带(图3)，说明1#、3#、4#、5#、7#、8#、10#、11#和12#细胞株中稳定整合了nramp1.1基因，可用于进一步实验。3、mrna水平表达情况检测取12孔板内细胞，去除培养液后，按照trizol试剂说明提取总rna，按照反转录试剂盒说明书将总rna反转录成cdna，然后以cdna为模板，用nramp1特异性引物进行扩增。电泳结果显检测到了示nramp1.1基因的转录产物(图4)，说明1#、3#、4#、5#、8#、11#和12#细胞株中nramp1.1进行成功转录，说明整合的nramp1.1基因表达框架转录元件完整，可用于进一步实验。4、蛋白水平表达情况检测(1)培养正常巨噬细胞raw264.7、整合克隆细胞株1#、3#、4#、5#、8#、11#和12#，按照100:1比例添加沙门杆菌，感染2h后，pbs洗3遍，添加32ug/mlg418gmem培养液；(2)培养18h后，pbs洗3遍，按比例添加200ulripa裂解液(碧云天)，充分裂解30min(置于冰上)，1200rpm，5min离心取上清，于-80℃保存；(3)样品处理：按4:1加蛋白上样buffer，70℃煮5-10min；(4)sds-page：配制5％电泳浓缩胶和12％的分离胶，在垂直电泳系统中电泳至溴酚蓝刚泳出胶面；(5)转膜：将凝胶按照顺序(从下到上：3张滤纸-nc膜-凝胶-3张滤纸)置于bio-radsemi-drytransfercell系统中(nc膜在正极侧，凝胶在负极侧)转印，30mv，75min。转印结束后，pbst洗涤3次，5％脱脂奶封闭过夜；pbst洗涤3次，加入nramp1抗体，作用1h；pbst洗涤3次，加入moarbigg/hrp二抗，作用1h，pbst洗涤3次，最后用dab显色(蛋白大小约58kd)。图5westernblot结果显示正常巨噬细胞raw294.7对照组在58kd处无杂交条带，1#、3#、4#和11#细胞株中有杂交条带，说明nramp1.1可在这些细胞株内稳定表达，这些细胞株可用于进一步实验。实施例6整合细胞吞噬活性及抑菌效果评价1、整合细胞吞噬活性的检测(1)制备细胞悬液，调整细胞密度至5×105个/ml，接种于96孔板，200μl/孔，每个浓度重复5孔。(2)培养24h后，加入0.1％中性红溶液100μl/孔，37℃，5％co2孵育1h，去中性红溶液，用pbs洗板3遍，甩干、在吸水纸上拍干。加入醋酸-乙醇(1:1)细胞裂解液200μl/孔，4℃过夜，酶标仪检测od540nm值。图6显示了未转染的巨噬细胞raw264.7(对照组)和稳定转染nramp1的1#整合细胞(实验组)添加0.1％的中性红后其吞噬活性结果。与对照组相比整合细胞株吞噬活性显著提高(p＜0.05)，说明nramp1.1基因的表达能显著地增加巨噬细胞的吞噬能力。2、整合细胞抑制沙门氏菌增殖实验(1)细胞培养：正常细胞raw264.7和整合细胞株在无抗的gmem培养液中复苏并在细胞密度达70％时传代，将每种细胞按1×105个细胞接种于12孔板；(2)细菌培养：感染细胞前一天将沙门氏菌在液体培养基中37℃培养过夜；(3)细胞吞噬：按一定稀释倍数(100:1)接种细菌到细胞的培养液中，培养2h以完成吞噬作用。然后换成加入含有32μg/mlg418的培养液中，37℃培养1h从而杀死细胞外的细菌(其中3个重复在处理1h后收集样品(t1)，另外12孔用pbs清洗3次以洗掉悬浮的细菌，更换含有32μg/mlg418的培养液以防止细胞外细菌的增殖，37℃培养，于18h后收集样品(t18)。(4)细菌存活率(以1h为例)：将处理1h巨噬细胞用pbs清洗3次，然后加入0.4ml的0.01％bsa(用水配制)，渗透裂解巨噬细胞5-10min。上下吹打10次后，连续稀释(1/10；1/100；1/1000；1/10000)，然后分别取20μl稀释后的菌液，涂于固体培养皿上并观察记录菌落形成单位(colony-formingunit，cfu)数目。图7显示了沙门氏菌感染未转染的巨噬细胞raw264.7(对照组)和稳定转染nramp1.1的整合巨噬细胞株(实验组)抗菌试验结果。与未转染的对照组相比，1#、3#和11#整合细胞株抗菌效果类似，都能够在一定程度上抑制沙门菌的生长，表明sp启动的nramp1.1基因在巨噬细胞中能够抑制沙门氏菌的增殖。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海杰隆生物工程股份有限公司上海转基因研究中心<120>一种突变的nramp1基因及其应用<130>p2016-1044<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>548<212>prt<213>人工序列<220><223>羊天然抗性相关巨噬蛋白1突变蛋白<400>1metserglyaspthrglythrproasnglnglyglythrargtyrgly151015serileserserproproserproglyproglnglnalaproprogly202530glythrtyrleuserglulysileproileproaspthrglusergly354045alapheserleuarglysleutrpalaphethrglyproglypheleu505560metserilealapheleuaspproglyasnilegluseraspleugln65707580alaglyalavalalaglyphelysleuleutrpvalleuleutrpala859095thrvalleuglyleuleucysglnargleualaalaargleuglyval100105110valthrglylysaspleuglygluvalcyshisleutyrtyrprolys115120125valproargthrleuleutrpleuthrilegluleualailevalgly130135140seraspmetglngluvalileglythralailealapheserleuleu145150155160seralaglyargileproleutrpglyglyvalleuilethrileval165170175aspthrphepheph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