本发明属于生物技术领域，具体来讲涉及到依诺肝素钠生产工艺。
背景技术：
依诺肝素钠是低分子的钠盐，它主要用于血液透析中的预防凝血和深静脉血栓的治疗、不稳定型冠状动脉疾病治疗以及预防与手术有关的血栓形成。肝素(heparin)广泛存在于动物器官和小肠粘膜、肺等组织中的一种葡萄糖胺聚糖，具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调节血脂等多种药理活性。
低分子肝素除具备普通肝素全部药理作用外，作为抗凝药使用，通常短期用药，且治疗指数高。美国FDA已经批准依诺肝素钠作为低位肢体置换术后的预防用药。
目前国内生产低分子肝素类的产品降解的方法主要有亚硝酸钠降解法、过氧化氢降解法、酶降解法等方法。但过氧化氢降解可能引入异物，质量不容易控制；酶降解产品末端有不饱和基团，稳定性差，成本高；在除杂脱色方法上，目前国内主要有在不同pH条件下高锰酸钾和双氧水二次氧化法或过氧化氢氧化法。高锰酸钾和双氧水二次氧化法的缺点是产生的二氧化锰较难滤出，且二氧化锰对部分产品有吸附作用，使产品回收率降低；在产品纯化技术上，国内主要有凝胶层析、超滤等方法，尽管凝胶层析得到的产品质量较高，但难于规模化生产，且成本较高。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种依诺肝素钠生产工艺，以及以此工艺而制备出的依诺肝素及其质量标准，以克服现有技术存在的缺陷。
为实现本发明目的，本发明依诺肝素钠生产工艺包括下列步骤：
1、制备肝素钠溶液
在肝素钠中加入5～7质量倍的纯化水后，在常温下搅拌4～5小时后溶解；
2、制备肝素降解液
用盐酸调节步骤1得到的肝素钠溶液的pH值2～2.5后，加入重量为肝素钠1.0%～2.0%的亚硝酸钠，然后在20～30℃下搅拌反应2～3h，再静置20～24h后得到肝素降解液；
3、制备还原液
用氢氧化钠溶液调节上述肝素降解液的pH值9～10后，加入0.8%～1.2%倍肝素钠重量的的硼氢化钠还原10～12h，然后再用氢氧化钠溶液调节pH值到6.8～7.2，得到还原液；
4、制备还原沉淀物
在上述还原液中加入2～3体积倍量的乙醇，充分搅拌后收集得到还原沉淀物；
5、制备依诺肝素钠粗品
在收集的还原沉淀物中加入纯净水搅拌溶解后，加入0.6%～1.0%体积倍量的双氧水在25～30℃下氧化20～24h，然后再加入2～3体积倍量的乙醇，充分搅拌后收集沉淀物得到依诺肝素钠粗品；
6、制备依诺肝素钠精品
将上述收集的依诺肝素钠粗品沉淀加入纯化水溶解成1%～2%（w/w）的溶液，分别用分子量截留值为3000和8000的超滤膜进行超滤，再经除菌过滤后得到依诺肝素钠精品溶液；
7、冻干
将上述步骤制得的依诺肝素钠溶液在25～30℃下冻干，即得到依诺肝素钠成品。
本发明取得的技术进步：
1、由于采用本发明生产工艺，将膜分离技术应用于分离不同分子量段，改变了落后的溶媒分级沉淀法和昂贵的凝胶分子筛法，得到了抗Xa效价≥135IU /mg，活性比为2.0～3.0，主要组分的分子量分布为5000～6000D的依诺肝素钠产品。
2、本发明生产工艺获得平均分子量为5000～6000D的依诺肝素钠产品可有效防止静脉血栓栓塞，可用于预防普通外科、矫形外科、神经外科的术前和术后的血栓形成，可有效防止缺血性中风患者的静脉血栓栓塞症，可大大降低患中风风险，可有效防止血液体外循环引起的凝固，并能有效防止不稳定性冠心病，能有效解决未分级肝素长期使用后易出现的出血、骨质疏松、诱导血小板减少等，具有广阔的应用前景。
3、本发明与现有依诺肝素钠制备工艺比较，产率高达86%～97%，重均分子量为5000～6000D，峰位分子量为3000～6000，分子量小于3000的组分不大于11%，分子量大于8000的组分不大于13%；抗Xa活性≥135IU/mg，质量达到欧洲药典规定的质量标准。产品化合物还原端的结构为脱水的甘露醇，并具有原料来源丰富、产率高、产品质量稳定可靠，纯度高，成本低，采用亚硝酸钠降解使得工艺简单，操作方便，生产过程容易控制，质量稳定，反应温和，产品色泽较好，无“三废”排放等特点。产品依诺肝素钠具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗炎、抗过敏等作用和调节血脂的功效，疗效显著，使用范围广泛，可作为注射剂、胶囊剂、软膏剂等产品的原料，便于规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
1、分别称取3Kg肝素钠、45g亚硝酸钠、30g硼氢化钠后备用；
2、向15～24L纯化水反应罐中加入3Kg肝素钠后，在常温下搅拌4～5小时后溶解得到肝素钠溶液；
3、用盐酸调节上述肝素钠溶液的pH=2～3后，在搅拌状态下加入所称取的45g亚硝酸钠，然后在20～30℃保温、搅拌下反应2～3h，再静置20～24h后得到得到肝素降解液；
4、用氢氧化钠溶液调节上述肝素降解液的pH值9～10后，加入30g硼氢化钠还原10～12h，反应完毕后再用氢氧化钠溶液调节pH值到6.8～7.2，得到还原液；
5、在上述还原液中加入2～3体积倍量的乙醇，充分搅拌后收集还原沉淀物；
6、在收集的还原沉淀物中加入纯净水搅拌溶解后，加入0.6%～1.0%体积倍的双氧水在25～30℃下氧化20～24h，氧化完毕后再加入2～3体积倍量的乙醇进行沉淀，充分搅拌后收集得到依诺肝素钠沉淀物粗品；
7、将上述依诺肝素钠粗品沉淀加入纯净水150L～200L，溶解成1～2%浓度的溶液后，用分子量截留值分别为3000和8000的超滤膜进行超滤，再经除菌处理后得到依诺肝素钠溶液；
8、将上述步骤制得的依诺肝素钠溶液在25～30℃下冻干后得到依诺肝素钠成品2.7Kg。
实施例2：本实施例与实施例1不同之处为肝素钠为10Kg，亚硝酸钠为150g，硼氢化钠为100g，冻干后得到依诺肝素钠成品9Kg。
实施例3：本实施例与实施例1不同之处为肝素钠为30Kg，亚硝酸钠为450g，硼氢化钠为300g，冻干后得到依诺肝素钠成品27Kg。