本发明涉及一种定量监测根据所附权利要求的前序部分的造纸厂或制板厂的含水环境中的内生孢子的方法。
细菌细胞通常存在于造纸厂和制板厂的含水环境中。通常通过使用各种措施例如将杀生物剂注入到工艺中来监测和限制工艺中的细菌生长。然而，某些细菌细胞形成内生孢子，其高度耐受诸如加热、消毒剂、化学杀生物剂、干燥剂、紫外光和电离辐射的通常的细菌破坏方法。内生孢子能够在长时间甚至数年保持成活和休眠直到外部条件变得有利，此后发生细菌内生孢子的转化，即萌发。
尤其是在纸巾和食品和/或饮料包装纸板的生产中，最终产品的卫生级别是特别重要的。最终产品不应包含高水平的细菌内生孢子，因为内生孢子可能污染与最终产品接触的物质，例如包装在食品或液体包装纸板中的食品。例如，对于用于比萨盒、咖啡杯等的食品包装纸板，最大内生孢子含量通常<1000cfu/g干纸板，并且存在最大允许内生孢子含量<250cfu/g干纸板的最终用途。
传统上，通过使用常规培养方法来检测细菌内生孢子，这是耗时的。通常，培养方法仅在取样48-72小时后才能提供结果。应当理解，在纸或纸板的连续生产中，该延迟不是最佳的。例如，及时调整孢子控制杀生物剂程序朝向变化的工艺条件是不可能，因为后续培养结果仅在上述指出的延迟之后才能获得。这使得杀生物剂的进料不必要地复杂并且难以优化。因此，极需快速监测造纸厂或制板厂的含水工艺中的细菌内生孢子。
本发明的一个目的是最小化或甚至可以消除现有技术中存在的缺点。
本发明的另一个目的是提供一种用于定量监测造纸厂或制板厂的含水环境中的细菌内生孢子的快速和有成本有效的方法。
通过具有以下给出的在独立权利要求书的特征部分中的特征的本发明来实现这些目的。
本发明的一些优选实施方案在从属权利要求中给出。
根据本发明的用于定量监测造纸厂或制板厂的含水环境中的细菌内生孢子的通常方法包括至少以下步骤：
-获得来自含水环境的至少第一含水样品，
-通过适当处理，优选通过将第一样品加热至所期望的高温来破坏第一样品中的细菌繁殖体，
-向经处理的第一样品加入插入剂，并允许其与被破坏的细菌进行相互作用，和
-通过使用定量聚合酶链反应(qpcr)来测定第一样品中的内生孢子水平。
现在已经令人惊奇地发现，通过使用包括破坏细菌繁殖体，与插入剂的相互作用和实时定量聚合酶链反应(qpcr)的步骤的方法，能够获得对于源自造纸或制板的样品中细菌内生孢子水平的快速测定。监测方法为造纸厂或制板厂的含水环境中的内生孢子水平提供了可靠的测定结果。因此，根据本发明的方法提供了快速检测由诸如ph或氧化还原波动等工艺条件的意外变化引起的内生孢子爆发的可能性。以这种方式可将质量差的例如包装级纸或纸板产品的生产最小化。此外，能够避免向工艺进料错误的杀生物剂，即避免非杀死剂量的杀生物剂的进料(其可引发由于例如氧化应激的内生孢子形成)。
在本发明的上下文中，术语“内生孢子”被理解为由细菌形成的休眠和非生殖结构体。内生孢子包含细菌的dna及其一部分由保护性外覆盖物包裹的细胞质。在有利条件下，内生孢子可萌发至代谢活性状态，即繁殖态。
根据本发明，从造纸厂或制板厂的含水环境中获得或采集至少第一含水样品。样品量通常在10-100ml，优选20-30ml的范围内，且通常样品的可用性不是限制因素。作为实例，可以给出在某些纸和纸板的制造过程中，在期望通过使用高的杀生物剂剂量将总的内生孢子含量保持在非常低的水平，例如<1000cfu/ml的情况下，可使用100ml的样品量。另一方面，在其中细菌细胞含量可能处于高水平，即约108cfu/ml的水平的工艺水中，可认为25ml的样品量更实用。
样品可包含纤维素纤维和/或原纤维，并且具有高达2至8重量％的固体含量。样品通常还包含用于纸或纸板制造的各种化学品和/或化合物，例如淀粉；无机填料颗粒；合成聚合物，例如聚丙烯酰胺。
在本发明的方法开始时，通过使用合适的处理来破坏细菌繁殖体。合适的处理可以是物理处理，其中样品经受例如辐射，例如uv或加热，或化学处理，其中样品经受合适剂量水平的杀生物剂，该剂量水平破坏细菌繁殖体，但在随后的方法步骤期间不干扰插入剂的性能。根据一个优选实施方案，将第一样品加热至至少60℃，优选至少70℃，更优选至少75℃的所期望的高温。使用的最高温度通常为100℃，优选80℃。将样品保持在高温下至少10分钟，优选至少15分钟，更优选至少20分钟。换言之，破坏细菌繁殖体的一种优选方法是将样品加热到75-80℃的温度，并将样品保持在该高温下15-60分钟，优选20-40分钟。各种在标准大气压下和在升高压力下的热处理方法都是本领域已知的。在优选的实施方案中，热处理步骤在现场和/或工业条件下是容易、快速和实用的，其中它可通过使用常压下的水浴来进行。将第一样品加热至上述定义的高温导致样品的巴氏杀菌并破坏存在于样品中的细菌繁殖体细胞。加热后，样品包含破裂的，即被杀死和破坏的细菌繁殖体细胞，和通常未受影响的细菌内生孢子。
在破坏步骤之前，优选通过加热，可任选但优选将第一样品过滤以从样品的液相中分离出不需要的固体颗粒物质，例如固体颗粒、纤维、原纤维等。这种用于分离不需要的固体颗粒物质的初步过滤通常是快速的并且例如通过布氏漏斗，通过使用具有约3mm开口的过滤器进行。
根据本发明的一个实施方案，在破坏步骤之后过滤第一样品，以从样品的液相中分离经破坏的细菌繁殖体细胞以及内生孢子。可通过使用具有例如0.4μm开口的过滤器进行过滤。收集细菌细胞和内生孢子和/或附着在过滤器上，这简化了经处理的第一样品的进一步处理。
优选在上述过滤步骤之后，向经处理的第一样品加入插入剂，并使试剂与被破坏的细菌细胞进行相互作用。根据本发明的一个实施方案，插入剂选自叠氮溴化丙锭(pma)、叠氮溴化乙锭(ema)、溴化乙锭、小檗碱、普罗黄素、柔红霉素、阿霉素和沙利度胺。优选的插入剂是叠氮溴化丙锭(pma)。优选以使得来自经破坏的细菌细胞的所有dna都与插入剂发生相互作用的量将插入剂加入到经处理的第一样品中。因此，能够保证在后续的qpcr步骤中没有来自细菌繁殖体细胞的dna被倍增，并且它们在qpcr步骤中不产生信号。然而，优选避免不必要的夸张过量的插入剂的添加，因为它可能产生插入剂扩散至内生孢子中并开始与内生孢子dna相互作用的风险。通常以提供<100μm，优选10-90μm，更优选25-75μm，甚至更优选40-60μm的插入剂浓度的量将插入剂加入到样品中。
在加入插入剂后，允许第一样品避光孵育。孵育时间为1-30分钟，优选2-10分钟，更优选4-6分钟。当在室温下暴露于优选具有约400-500nm的波长的强烈蓝光时，插入剂能够共价交联来自经破坏的细菌细胞的dna双链。可例如通过使用发光二极管led来产生蓝光。暴露时间可为1-30分钟，优选2-10分钟，更优选4-6分钟。
在添加插入剂之前，样品优选不进行干燥。这意味着该方法优选不含将样品干燥的步骤。优选地，破坏步骤和插入剂的添加之间的时间延迟在实际操作中是尽可能短。
在允许第一样品与插入剂相互作用后，通过使用定量聚合酶链反应qpcr测定第一样品中的内生孢子水平。通过使用qpcr来提取和倍增来自内生孢子的dna。以下文献描述了用于从该物质分离的细胞的合适的dna提取的实例：
根据本发明的一个实施方案，从相同的含水环境中获得或采集至少第二含水样品。优选地，同时采集第一和第二样品，更优选地，第一和第二样品都源自一个单一的原始样品，其被分为第一、第二和可能的连续样品以用于测定含水环境中的内生孢子水平。
通过使用定量聚合酶链反应qpcr，优选地在预过滤步骤之后从第二样品中直接测定细菌繁殖体即细菌繁殖体细胞的量。第二样品不经受任何例如通过热处理或与插入剂的相互作用的破坏步骤。
然后，将来自第一样品的经测定的内生孢子水平与第二样品中经测定的细菌繁殖体细胞的量进行比较。以这种方式，能够获得关于造纸厂或制板厂的含水环境中的细菌繁殖体细胞的总量及在相同环境中其与内生孢子水平的比例的信息。
根据本发明的一个优选实施方案，获得的关于细菌繁殖体细胞的总量和内生孢子的量的信息用于在造纸或制板生产中快速及时地调节用于内生孢子控制的杀生物剂进料方案。该信息能够提供关于造纸厂或制板厂的含水环境的细菌条件的有价值的知识和见解，并且该知识可用于例如确定正确的杀生物剂进料方案，以识别该过程的问题区域和/或检测高和/或波动的孢子水平。换言之，根据本发明的优选实施方案，将至少一种杀生物剂进料到含水环境中，并且基于测定的内生孢子水平确定进料的杀生物剂的量。
本发明能实现有效的杀生物剂的使用，否则其对于连续使用可能太贵，因为可基于关于该方法中的细菌孢子和细菌繁殖体细胞的量的信息来准确地测定杀生物剂的剂量和时间。杀生物剂可以是例如氧化或非氧化的杀生物剂。基于获得的测定结果，将一个或几个关键过程位置中的杀生物剂剂量调整到一定水平，其使生产的纸/纸板中的内生孢子水平降低至<1000cfu/g干的纸/纸板，或者<250cfu/g干的纸/纸板。
从破坏步骤开始到qpcr步骤结束的总时间可以为小于24小时，优选6-24小时，更优选7-9小时。这意味着通过使用本方法追踪杀生物剂功效可以每天进行，或甚至每天进行几次。根据本发明的方法优选在现场进行。
根据本发明的一个实施方案，该方法用于监测例如来自已知在造纸或制板机的工艺条件下生长的芽孢杆菌(bacillus)、短芽胞杆菌(brevibacillus)和/或类芽孢杆菌(paenibacillus)的内生孢子。这些属能够生产耐热内生孢子，其耐受造纸或制板机的干燥器部的热量。因此，本发明提供了监测这些属的内生孢子水平并启动具体和正确的杀生物剂进料的良好可能性。
根据本发明的一个优选实施方案，该方法用于生产食品和/或液体包装级纸或纸板。通常，包装级纸板的克重可以为150-400g/m2，优选200-360g/m2，更优选240-300g/m2。用于食品和/或液体包装的纸和纸板级别通常是聚合物涂覆的或箔层压的以用于阻隔性能。用于涂覆的合适的聚合物是例如聚烯烃，例如聚乙烯或聚丙烯；聚乙烯醇；聚乙烯胺；聚对苯二甲酸乙二醇酯；聚对苯二甲酸丁二醇酯。
实施例
在以下非限制性实施例中描述本发明的一些实施方案。
实施例1
该现场试验在碱法造纸机上进行，其产生3层的食品包装纸板，以追踪孢子控制杀生物剂程序的性能。在三个工艺位置；在破坏塔、桦木浆塔和松木浆塔的出口中进行两轮取样，一次在上午且一次在下午。
首先通过使用具有3mm孔径的布氏漏斗过滤第一1升的各个工艺样品，以从样品中除去纤维和固体。此后，将得到的滤液分成六个50ml的falcon管；将3个平行样品在80℃下热处理15分钟，以杀死细菌繁殖体细胞，并将3个平行样品保持未处理。此后，通过0.4μm的滤纸过滤所有6个平行样品。在避光中用pma(50μm，1ml)染色经过滤的热处理的样品，接触时间为5分钟，然后暴露于蓝色led光5分钟。之后，如下通过使用dna提取和qpcr方法分析经处理的样品以及未处理的样品二者的dna。
简言之，将裂解试剂加入到具有玻璃珠的管中，并以6.5m/s的速度使用fastprep珠磨器3次，时间为1分钟。将管在65℃下孵育20分钟，每隔2分钟用恒温混匀仪进行涡流。加入800μl的苯酚-氯仿-异戊醇(24:23:1)，混合并以10000g离心5分钟。将600μl的液相转移到新管中，并用氯仿:异戊醇(24:1)萃取。270μl的100％异丙醇用于沉淀dna，并在+4℃下以20000g离心15分钟，之后除去液体。用1ml(-20℃)的70％的etoh将颗粒洗涤两次，并在+4℃下以20000g离心5分钟。离心后，将颗粒在真空激发器中在+45℃下干燥20分钟，并在+55℃下溶解于45μl的tris-edta缓冲液中1.5至2小时。用qpcr分析dna。通过使用sybrgreeni(rochediagnostics，germany)作为荧光报告物，用abisds7000(appliedbiosystems，uk)测量16srrna基因拷贝的量。总共16srrna基因代表总的细菌，且芽孢杆菌16srrna基因内生孢子形成细菌。作为参考，在外部实验室通过使用常规培养方法(平板计数琼脂，+45℃/+37℃，孵育2天)测量总需氧菌和细菌孢子数。在细菌孢子测定前，将样品在+80℃下巴氏杀菌20分钟。结果示于表1中。
表1实施例1的结果
从培养方法获得的结果表明，取样日期间该方法的微生物状态处于良好水平，因为总需氧菌(<100cfu/ml)和内生孢子(<10cfu/ml)二者都低于检测限。此外，在热处理和染色的样品中没有发现芽孢杆菌16srrna基因，因此本发明的方法的结果表明，在取样日期间在本方法中不存在内生孢子。该方法中的这个良好的微生物情况也在最终的纸板上观察到；最终纸板中的有氧孢子数低于250cfu/g生产的纸板(结果未示出)。有趣的是，从进入的浆塔获得的结果显示了一些(2×103-5×103)芽孢杆菌16srrna基因，因此这两个浆塔都包含芽孢杆菌细菌，其可在不利的生长条件例如在突然的ph或氧化还原冲击情况下产生内生孢子。因此，所描述的本发明的方法可有效地用于监测关键过程点的微生物质量，并且快速地，即在一个工作日内，检测潜在的孢子形成。这使得能够以实现经济上可行的方法来调整孢子控制杀生物剂程序，并最终最大限度地减少孢子污染的纸板的生产，以及最后减少纸板制造商的召回。
实施例2
在生产3层折叠盒纸板的碱法造纸机上进行微生物现场追踪试验，以追踪目前杀生物剂程序对破坏塔中孢子形成细菌的性能。从破坏塔的出口进行总共六轮取样。
如实施例1所述处理和加工工艺样品。结果示于表2中。
从表2获得的结果表明破坏塔包含很多细菌；在所有三个取样日期间，总的需氧细菌数在5×106–1×107cfu/ml之间变化，总的16srrna基因在5×107–3×108之间变化且芽孢杆菌16srrna基因在1×106–4×107之间变化。因此，结果表明，为了有效地控制破坏塔中的总细菌和芽孢杆菌种群，需要额外的杀生物剂。有趣的是，在所有未处理的样品中，芽孢杆菌16srrna基因的数量较高(1×106–4×107)，这表明许多繁殖性细胞存在于破坏塔中。然而，在热处理和染色的样品中，芽孢杆菌16srrna基因在低(2×102)至高(2×106)之间显著变化，这表明成熟的孢子水平在破坏塔中有波动。已知作为新孢子形成的芽孢杆菌种群的孢子形成趋势被高度调节，并且取决于工艺条件。从传统培养结果获得的结果没有显示出这样的孢子形成潜力，因为检测到的孢子数在<10至300个孢子/ml之间变化。通过使用所描述的本发明的方法，能够在关键过程点追踪微生物状态，并快速检测(即在一个工作日内)在该过程中的新孢子形成。这能在该过程中实现有效和经济上可行的孢子控制，使孢子污染的纸板的生产最小化，并最终减少纸板制造商的召回。
表2实施例2的结果
实施例3
进行该实验室测试，以评价孢子控制杀生物剂对从生产3层食品包装纸板的碱法造纸机采集的破碎样品中的真实细菌种群的效力。如此储存第一破坏样品和具有150ppm剂量的测试孢子控制杀生物剂的第二破坏样品。储存在+45℃且在不混合下进行。在测试(未处理的)开始时和在接触3天(经处理的和未处理的样品)后，通过使用常规培养方法(平板计数琼脂，+45℃/+37℃，孵育2天)测定总的需氧菌和需氧孢子数，以及ph和氧化还原测量。
结果示于表3中。
表3实施例3的结果
获得的结果表明，在3天的接触时间期间，未处理的破坏样品中发生强烈腐败；总需氧菌数高(3×107cfu/ml)，且需氧孢子水平增加至高达5×103cfu/ml。此外，ph(8.2→6.5)和氧化还原(134mv→-107mv)显著下降。与之相比，150ppm剂量的测试孢子控制杀生物剂，有效地保持破坏的样品；总需氧菌(<100cfu/ml)和细菌孢子(<10cfu/ml)保持低于检测限，且ph(7.3)以及氧化还原(83mv)值保持在良好水平。因此，结果表明，测试的孢子控制杀生物剂(例如150ppm剂量)可用于控制破坏样品中的新孢子形成。基于文献和自己的实验室结果(数据未示出)，已知这种处理在杀死成熟细菌孢子方面是无效的。因此，对于在造纸过程中有效的孢子控制，与尝试杀死成熟孢子相比，经济上更可行的是控制过程中新孢子的形成。
即使参照目前看来最实用和优选的实施方案描述了本发明，但应当理解，本发明不局限于上述实施方案，并且本发明旨在包括落入所附权利要求范围内的不同修改和等同技术方案。