健康标志的制作方法

文档序号:13985099
健康标志的制作方法

本发明涉及基于miRNA表达谱的测定来诊断对象的健康状况变化的方法、用途、试剂盒。

发明背景

现在,生物标志物在各种疾病的诊断、风险分层和治疗管理中发挥关键作用。微RNA(miRNA)为一类新的生物标志物。它们代表一组小的非编码RNA,其通过降解或阻断信使RNA(mRNA)靶标的翻译来调节翻译后水平的基因表达。已经发现,miRNA以高度组织特异性的方式表达,而且,miRNA也存在于体液样品,包括血液中。然而,尚不清楚miRNA存在于血液特别是血细胞中的机制,或其在这些血液级分(fraction)中的功能。特别期望的是非侵入性生物标志物,其允许快速、便利和成本有效的诊断/预后,从而免于对手术介入的需要。特别地,尚未系统地评价miRNA作为非侵入性生物标志物用于大体诊断对象的健康状况变化的潜在作用。因此,仍需要非侵入性诊断对象的健康状况变化的有效方法和试剂盒。

本发明的发明人首次评估了宽范围的健康对象(n=158)或诊断有多种疾病的对象(n=883)中全基因组水平上的miRNA表达,所述疾病包括:癌症(即肺癌、结肠癌、肾癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、黑素瘤)、神经退行性疾病(即多发性硬化、帕金森氏病)、心血管病(急性心肌梗死、心力衰竭)、自身免疫病(即肉状瘤病、银屑病)或炎性疾病(即COPD、BPH)。他们惊奇地发现,在血液样品,优选在全血样品或包含红细胞、白细胞和/或血小板的血细胞级分中,某些miRNA(疾病调节的miRNA,图1)在健康对照与患病对象之间显著失调,然而某些其它miRNA(疾病维持的miRNA,图2)在健康对照和患病对象的之间未显著失调。因此,所述疾病调节的miRNA与所述疾病维持的miRNA的组合,为用于诊断对象的健康状况变化的适当的非侵入性生物标志物。具体地,疾病维持的miRNA可以用作疾病调节的miRNA的内部标准化物(normalizer),当旨在为市场带来可靠且稳健的诊断测试时,其是非常有利的,由于使用的是一组仅几个miRNA生物标志物,这样的测试不能依赖于整体归一化方法。因此,根据本发明的测试可以依赖于将相对表达水平与参考进行比较。此外,本发明的发明人探究了来自包含红细胞、白细胞和/或血小板的各个血细胞级分的血细胞(其获自收集的全血样品)的miRNA的用途。因此,分析了代表外周免疫系统成分的所有血细胞的miRNA。因此,通过该方法评估的诊断内容,是指外周免疫系统的miRNA-生物标志物信息的评估,其不同于基于来自细胞外血液级分(血清、血浆)的miRNA的方法,其直接与患病器官或组织相关。此外,依赖于来自细胞外血液级分(血清、血浆)的miRNA的方法,在收集和/或预分析处理时高度倾向于受到从血细胞漏到细胞外基质中的miRNA的污染,当采用来自血细胞或血细胞级分的miRNA生物标志物时,情况并非如此。

因此,来自包含红细胞、白细胞和/或血小板的血细胞或血细胞级分的所述疾病调节的miRNA联合所述疾病维持的miRNA,为分析上稳健的且可靠适当的非侵入性生物标志物,其使用源于外周免疫系统的正交诊断信息对于诊断对象的健康状况变化具有内部归一化能力。

发明概述

在第一方面,本发明提供用于诊断对象的健康状况的方法,其包括以下步骤:

(a)测定来自对象的血液样品中的第一预定组的一种或多种miRNA的表达谱,其中所述第一预定组的miRNA中包含的miRNA选自图1和/或图3中列出的miRNA,

(b)测定来自所述对象的所述血液样品中的第二预定组的一种或多种miRNA的表达谱,其中所述第二预定组的miRNA中包含的miRNA选自图2和/或图4中列出的miRNA,

(c)将所述第一预定组的miRNA的表达谱归一化至所述第二预定组的miRNA,

(d)将步骤(c)中的归一化表达谱与参考进行比较,

(e)当与所述参考的比较改变时,诊断出所述对象的健康状况的变化。

在第二方面,本发明提供诊断对象的健康状况的方法,其包括以下步骤:

(a)测定来自对象的血液样品中的第一预定组的miRNA的表达谱,

(b)测定来自所述对象的所述血液样品中的第二预定组的miRNA的表达谱,

(c)将步骤(a)的所述表达谱和步骤(b)的所述表达谱与参考表达谱进行比较,

(d)当与第一参考表达谱的比较改变并且与第二参考表达谱的比较未改变时,诊断出所述对象的健康状况的变化。

在第三方面,本发明提供如本发明的第一方面和第二方面所述的方法用于以下的用途:

(i)比较一个或多个对象之间的健康状况,

(ii)监测对象的健康状况,

(iii)监测对象的免疫系统的状态,

(iv)监测对象对治疗性处理,优选药物处理的反应。

在本发明的另一方面,发明人发现在血液样品,优选在全血样品或包含红细胞、白细胞和/或血小板的血细胞级分中,某些miRNA(癌症调节的miRNA,图3)在健康对照与癌症对象之间显著失调,然而某些其它miRNA(癌症维持的miRNA,图4)在健康对照与癌症对象之间未显著失调。

在其它方面,本发明提供监测对象的健康状况的方法,其包括以下步骤:

(a)通过实施根据第一方面或第二方面所述的方法来诊断对象在第一时间点时的健康状况,

(b)通过实施根据第一方面或第二方面所述的方法来诊断所述对象在一个或多个稍后时间点时的健康状况,和

(c)将步骤(a)中诊断的健康状况与步骤(b)中诊断的健康状况进行比较,从而监测所述对象的健康状况。

本发明的概述不一定描述本发明的所有特征。从随后详述的综述中其它实施方案将变得显而易见。

发明详述

定义

在下文详述本发明之前,应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂,因为这些可以变化。还应理解,本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的,并且不旨在限定本发明的范围,本发明的范围仅由所附权利要求限定。除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

在下文中,将描述本发明的要素。这些要素与具体实施方案一起列出,然而,应理解它们可以以任何方式和任何数目组合以产生另外的实施方案。不同描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并涵盖这样的实施方案,其将明确描述的实施方案与任何数目的公开的和/或优选的要素组合。此外,本申请中所有描述的要素的任何排列和组合应被认为由本申请的说明书公开,除非上下文另外指明。

优选地,如“A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.Eds.,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)中所述,定义本文使用的术语。

为了实践本发明,除非另有指出,否则采用常规的化学、生物化学方法和重组DNA技术,其在本领域的文献中有说明(参见,例如,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook等人.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。

在本说明书的整个文本中引用了数个文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明等),不管在上文中还是在下文中,据此通过引用整体并入。不得将本文中的任何内容解释为承认本发明无权先于之前的发明公开本文内容。

在整个说明书和所附权利要求书中,除非上下文另有要求,词语“包含(comprise)”和诸如“包含(comprises/comprising)”的变型,应被理解为意指包含所列举的整数或步骤或整数或步骤的组但不排除任何其它整数或步骤或整数或步骤的组。

如本说明书和所附权利要求中所用,单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物,除非上下文另有明确指示。例如,术语“测试化合物”也包括“多种测试化合物”。

术语“微RNA”或“miRNA”是指共价连接在一起的至少10个核苷酸且不超过35个核苷酸的单链RNA分子。优选地,本发明的多核苷酸是长度为10至33个核苷酸或15至30个核苷酸,更优选长度为17至27个核苷酸或18至26个核苷酸,即长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个核苷酸的分子。术语“微RNA*”或“miRNA*”是指在加工时来自过客链的miRNA分子。在本发明的上下文中,术语“miRNA”和“miRNA*”可交换使用。miRBase(www.mirbase.org)为公开的miRNA序列和注释的良好建立的储库和可搜索的数据库。

本发明的上下文中使用的术语“全血样品”是指源于对象的血液样品,其包含所有血液级分,包括细胞级分(红细胞、白细胞、血小板)和细胞外血液级分(血清、血浆)。全血样品可以通过常规血液收集技术从对象中取出血液而得到,但也可以通过使用先前分离和/或储存的血液样品来提供。优选地,来自对象(如人或动物)的全血样品的体积为:0.1至20ml,更优选为0.5至15ml,更优选为1至10ml,最优选为2至7.5ml,即0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20ml。优选地,通过采血管收集全血样品,优选地,将其收集在PAXgene血液RNA管中、Tempus血液RNA管中、EDTA管(例如K2-EDTA Monovette管)中、柠檬酸钠(Na-citrate)管、肝素-管(Heparin-tube)或ACD(柠檬酸葡萄糖)管中。优选地,当收集全血样品时,可以保护(protected/guarded)RNA级分,特别是miRNA级分以防止降解。为此目的,可以采用特定收集管(例如来自Preanalytix的PAXgene血液RNA管,来自Applied Biosystems的Tempus血液RNA管)或使RNA级分和/或miRNA级分稳定的添加剂(例如来自Ambion的RNAlater,来自Promega的RNAsin)。

本发明的上下文中使用的术语“血细胞样品”,是指包含或基本上包含血细胞(红细胞、白细胞、血小板)的全血样品的制备物,更优选地,血细胞样品包含红细胞、白细胞和血小板。优选地,血细胞样品不含有源于全血的细胞外级分(例如血浆、血清)的miRNA或其含有少量源于细胞外级分(例如血浆、血清)的miRNA,使得这些不会或基本上不会贡献根据本发明的血细胞样品中的一种或多种miRNA的组的表达谱。包含红细胞、白细胞和/或血小板的血细胞样品或含有红细胞、白细胞和血小板的血细胞样品,获自收集于PAXgene血液RNA管、Tempus血液RNA管、EDTA-管(例如K2-EDTA Monovette管)、柠檬酸钠管或肝素管中的全血样品的加工,保持或基本上保持全血样品的最初细胞分布(血细胞组成)。从血细胞样品中分离总RNA(包含短的RNA级分,其包括miRNA级分),并将其用于测定对象的样品中的至少一种,优选至少两种miRNA的组的表达谱。

本文使用的术语“血细胞级分”涉及来自血液样品的细胞级分,即血细胞级分。血细胞级分包括红细胞、白细胞、血小板或前述血细胞类型的亚级分(即T细胞、B细胞、NK细胞、中性粒细胞、粒细胞、网状细胞等)或来自前述实体的组合。优选地,血细胞级分不含有源于全血的细胞外级分(例如血浆、血清)的miRNA或其含有少量源于细胞外级分(例如血浆、血清)的miRNA,使得这些不会或基本上不会贡献根据本发明的血细胞级分中的一种或多种miRNA的组的表达谱。在本发明的上下文中,术语“血细胞样品”和“血细胞级分的样品”可交换使用。

本文使用的术语“总RNA”涉及分离的RNA,其包含在来自全血样品的各个血细胞样品中存在的miRNA级分。优选地,根据本发明的总RNA含有miRNA级分或含有所述总RNA的富含miRNA的级分。总RNA(包含miRNA级分或富含miRNA的级分)通过以下获得:裂解(例如Trizol)血细胞样品中血细胞,随后进行RNA纯化,例如通过苯酚/氯仿提取和/或基于分离的技术(例如玻璃纤维过滤柱、二氧化硅膜柱)。用于RNA分离和纯化的试剂盒的实例包括:miRNeasy试剂盒(Qiagen)、PAXgene血液miRNA试剂盒(Qiagen)、mirVana PARIS试剂盒(Life Technologies)、PARIS试剂盒(Life Technologies)、Tempus Spin RNA分离试剂盒(Life Technologies)。

本文使用的术语“疾病调节的miRNA”,是指已知在健康对象与患病对象之间有差别的(调节的)组中包含的至少一种固定限定的miRNA。优选的疾病调节的miRNA选自图1中列出的miRNA,即具有SEQ ID NO:1至26的miRNA。

本文使用的术语“疾病维持的miRNA”,是指已知在健康对象与患病对象之间无差别的(未调节的)组中包含的至少一种固定限定的miRNA。优选的疾病维持的miRNA选自图2中列出的miRNA,即具有SEQ ID NO:27至59的miRNA。

本文使用的术语“癌症调节的miRNA”,是指已知在健康对象与罹患癌症的对象之间有差别的(调节的)组中包含的至少一种固定限定的miRNA。优选的癌症调节的miRNA选自图3中列出的miRNA。

本文使用的术语“癌症维持的miRNA”,是指已知在健康对象与罹患癌症的对象之间无差别的(未调节的)组中包含的至少一种固定限定的miRNA。优选的癌症维持的miRNA选自图4中列出的miRNA。

本发明的上下文中使用的术语“表达谱”,是指miRNA表达谱的测定,或是指与样品(例如来自全血样品的血细胞样品或血细胞级分)中miRNA的表达相关的量度。通过测定miRNA表达谱,各miRNA由数值表示。单独miRNA的值越高,所述miRNA的表达水平越高,或单独miRNA的值越低,所述miRNA的表达水平越低。可以通过允许分析对象中的miRNA表达谱以及在样品之间进行比较的任何方便的手段产生表达谱,例如核酸杂交(例如,至微阵列)、核酸扩增(PCR、RT-PCR、qRT-PCR、高通量RT-PCR)、用于定量的ELISA、下一代测序(例如ABI SOLID、Illumina基因组分析仪、Roche/454GS FLX)、流式细胞术(例如LUMINEX、Milipore Guava)等。通过前述手段测量的样品材料来自血细胞样品,并且可以为总RNA、标记的总RNA、扩增的总RNA、cDNA、标记的cDNA、扩增的cDNA、miRNA、标记的miRNA、扩增的miRNA,或可以由前述RNA/DNA物质产生的任何衍生物。本文使用的“表达谱”涉及一种或多种miRNA,优选至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38,39,40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、51、53、54、55、56、57、58、59种或更多种miRNA,优选选自具有SEQ ID NO:1至77的miRNA,更优选来自具有SEQ ID NO:1至59的miRNA的表达谱的集合。

本文使用的术语“测定(来自)血细胞样品中的表达谱”,涉及来自所述血细胞样品中存在的miRNA的表达谱的测定,因此其为与所述血细胞样品中存在的miRNA相关的量度。在此,包括使血细胞样品成为允许通过任何方便的手段(例如核酸杂交、核酸扩增、聚合酶延伸、质谱、流式细胞术、测序、下一代测序)来记录表达谱的形式所需的且为本领域技术人员已知的所有步骤和转化,例如细胞裂解、RNA分离、RNA标记、RNA的聚合酶延伸、将RNA逆转录连接到cDNA、cDNA的扩增、cDNA的标记等。

本发明的上下文中使用的术语“诊断”,是指测定或监测可能的疾病或病症的过程,因此为试图定义或监测对象的健康状况的过程。选自疾病调节的(图1;SEQ ID NO:1至26)和一种或多种疾病维持的miRNA(图2,SEQ ID NO:27至59)的列表的一种或多种miRNA的表达谱的测定与对象的健康状况相关。可以使用阵列/生物芯片或原位杂交,进行核酸杂交。可以使用实时聚合酶链式反应(RT-PCR),如实时定量聚合酶链式反应(RT qPCR),进行核酸扩增。前述实时聚合酶链式反应(RT-PCR)可以包括下述步骤:(i)从来自对象的全血样品的血细胞样品中提取总RNA,(ii)使用通用或miRNA特异性RT(逆转录)引物(例如茎环RT引物),通过RNA逆转录(RT)反应获得cDNA样品;(iii)任选地扩增获得的cDNA(例如通过PCR,如特异性靶向扩增(STA),(iv)借助于步骤(ii)或(iii)的cDNA(实时)定量,例如通过实时聚合酶链式反应来检测样品中miRNA的水平,其中添加荧光染料(例如SYBR Green)或荧光探针(例如Taqman探针)。在步骤(i)中,在直接由含miRNA的样品进行RT-PCR的情况下,可以省略RNA的分离和/或提取。用于通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)来测定miRNA表达谱的试剂盒,来自例如Life Technologies、Applied Biosystems、Ambion、Roche、Qiagen、Invitrogen、SABiosciences、Exiqon。在步骤(ii)中,通用或miRNA特异性RT引物可以为连接到miRNA的3’-端的单链(dna)寡核苷酸,从而产生非天然存在的miRNA-dna嵌合体分子,其通过逆转录酶而被转录成dna。

可以通过常规的Sanger测序或通过所谓的“下一代测序(NGS)”进行核酸测序,其包括但不限于:边合成边测序、边连接边测序、单分子测序、纳米孔测序或相似的技术。NGS可以包括下述步骤:(i)从来自对象的全血样品的血细胞样品中提取总RNA,(ii)使用通用或miRNA特异性RT(逆转录)引物(例如茎环RT引物)通过RNA逆转录(RT)反应获得cDNA样品,(iii)任选地扩增获得的cDNA-转录本(例如通过PCR),(iv)使miRNA的cDNA-转录本进行前述测序技术,如边合成边测序、边连接边测序。在步骤(ii)中,将单链寡核苷酸连接到包含通用或miRNA特异性逆转录酶(RT)引物的3’-端。在步骤(iii)中应扩增cDNA的情况下,连接到3’-端的寡核苷酸(oligo)还包含PCT-引物序列,单链寡核苷酸也被连接到5’-端,其也包含PCR引物序列。然后在步骤(iii)中,利用步骤(ii)中在3’和5’-端引入的引物序列扩增cDNA。

本发明的上下文中使用的术语“健康状况”,涉及对象的整体健康状况的量度,包括但不限于评估所述对象中存在或不存在病或疾病。根据本发明,通过测定来自所述对象的血液样品,优选来自血细胞样品或来自血细胞级分中的一种或多种疾病调节的miRNA的组并联合一种或多种疾病维持的miRNA的组,可以评估对象的健康状况。健康状况可以为在对象中存在或不存在疾病,和/或在对象中存在或不存在癌症。利用本发明的方法,诊断健康状况的变化。所述健康状况的变化可以为健康状况的改善或恶化,例如,疾病的改善或恶化,和/或癌症的改善或恶化。

本文使用的术语“疾病”是指影响对象身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和病征相关的医学病况。疾病可以由来自外部来源的因素,如传染病引起,或者其可以由内部功能障碍,如自身免疫病引起。在人类中,“疾病”通常更广泛地用于指引起受折磨对象的疼痛、功能障碍、悲痛、社会问题或死亡,或者与对象接触的人出现相似问题的任何病况。在更广泛的意义上,它有时包括损伤、残疾、病症、综合征、传染病、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化,然而在其它背景中以及出于其它目的,这些可以被认为是可区分的类别。疾病通常不仅在身体上影响对象,而且在情感上也会影响对象,因为感染许多疾病并携带其生活可改变一个人对生活的看法和一个人的个性。本文使用的术语“疾病”也涵盖癌症。

本文使用的术语“传染病”是指可以从对象传播至对象并且由微生物剂(例如感冒)引起的任何疾病。传染病为本领域已知的,并且包括,例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生虫病,所述疾病分别由病毒、细菌和寄生虫引起。在这方面,传染病可以为例如肝炎、性传播疾病(例如衣原体感染或淋病)、结核病、HIV/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸综合症(SARS)、禽流感和流感。

本文使用的术语“自身免疫病”,是指身体对其自身组织的某些成分产生免疫原性(即免疫系统)应答的任何疾病。换言之,免疫系统失去了将身体内的一些组织或系统识别为自我的能力,并且靶向并攻击所述组织或系统,如同其为外源的。自身免疫病可以被分类为:主要地一种器官受影响的疾病(例如溶血性贫血和抗免疫性甲状腺炎),以及自身免疫病过程通过许多组织扩散的疾病(例如全身性红斑狼疮)。例如,多发性硬化被认为是由T细胞攻击围绕脑和脊髓的神经纤维的鞘引起的。这导致失去协调性、虚弱和视力模糊。自身免疫病为本领域已知的,并且包括例如桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、狼疮、多发性硬化、风湿性关节炎、溶血性贫血、抗免疫性甲状腺炎、全身性红斑狼疮、乳糜泻、克罗恩氏病、结肠炎、糖尿病、硬皮病、银屑病等。

本文使用的术语“癌症疾病”或“癌症”,是指或描述对象中通常以失调的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于:癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体地,此类癌症的实例包括:骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌症、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性与生殖器官癌、霍奇金病、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经外胚层癌、脊髓轴肿瘤、胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明,术语“癌症”也包括癌症转移。

本发明的上下文中使用的术语“对象”,意为待评估健康状况的个体,因此对象可以为受疾病和/或癌症折磨或不受其折磨的对象,或者可以为疑似受疾病和/或癌症折磨或疑似不受其折磨的对象。利用本发明的方法,诊断健康状况的变化。所述健康状况的变化可以为健康状况的改善或恶化,例如,疾病的改善或恶化,和/或癌症的改善或恶化。

术语“治疗性处理”涉及改善对象的健康状况和/或延长(增加)寿命的任何处理。所述处理可以消除对象中的疾病、阻止或减缓对象中疾病的发展、抑制或减缓对象中疾病的发展、降低对象中症状的频率或严重性和/或降低在当前患有或先前患有疾病的对象中的复发。

发明的实施方案

现将进一步描述本发明。在下述段落中,更详细地限定本发明的不同方面。除非有明确的相反指示,如此限定的各个方面可以与任何其它方面组合。具体地,除非有明确的相反指示,指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其它特征组合。

在第一方面,本发明涉及诊断对象的健康状况的方法,其包括以下步骤:

(a)测定来自对象的血液样品中的第一预定组的一种或多种(疾病调节的)miRNA的表达谱,其中所述第一预定组的miRNA中包含的miRNA选自图1和/或图3中列出的miRNA,

(b)测定来自所述对象的所述血液样品中的第二预定组的一种或多种(疾病维持的)miRNA的表达谱,其中所述第二预定组的miRNA中包含的miRNA选自图2和/或图4中列出的miRNA,

(c)将所述第一预定组的miRNA的表达谱归一化至所述第二预定组的miRNA,

(d)将步骤(c)中的归一化表达谱与参考进行比较,

(e)当与所述参考的比较改变时,诊断出所述对象的健康状况的变化。

在这里,血液样品选自:全血,血细胞,由红细胞、白细胞和血小板组成的血细胞级分,包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞级分,或包含红细胞、白细胞或血小板的血细胞级分。优选地,血液样品为血细胞样品,更优选地,其为包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞级分。

根据本发明,通过常规的抽血技术从对象收集全血样品。适于收集全血的采血管包括EDTA-管(例如K2-EDTA Monovette管)、柠檬酸钠-管、ACD-管、肝素-管、PAXgene血液RNA-管、Tempus血液RNA-管。根据本发明,处理收集的全血样品(其在使用前可立即储存)以产生全血的血细胞样品。这可以通过将血细胞级分(全血的细胞级分)与血清/血浆级分(全血的细胞外级分)进行分离,例如通过离心技术来实现。优选的是来自全血样品的血细胞样品包含红细胞、白细胞和/或血小板,更优选的是来自全血样品的血细胞样品包含红细胞、白细胞和血小板。

优选地,从血细胞样品内存在的血细胞中分离总RNA,包括miRNA级分,或miRNA级分。用于分离总RNA(包括miRNA级分)的试剂盒或用于分离miRNA级分的试剂盒为本领域技术人员众所周知的,所述试剂盒例如,miRNeasy试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)、Paris试剂盒(Life Technologies,Weiterstadt,Germany)。然后,由从存在于全血的血细胞样品内的血细胞中分离的RNA测定第一组的一种或多种疾病调节的miRNA(选自具有SEQ ID NO:1至26的图1中列出的miRNA)和第二组的一种或多种疾病维持的miRNA(选自具有SEQ ID NO:27至59的图2中列出的miRNA)的miRNA-谱。可以通过用于测定miRNA或miRNA谱的任何方便的手段测定表达谱。多种技术为本领域技术人员众所周知的,例如基于核酸杂交、核酸扩增、测序、质谱、流式细胞术的技术或上述技术的组合。

优选的是,步骤(c)中的归一化产生第一预定组的miRNA中包含的各miRNA的相对表达水平。优选地,所述相对表达水平为这样的比率,其获自来自待诊断的一个或多个对象的第一组的(疾病-和/或癌症-调节的)miRNA中包含的一种或多种miRNA,与第二组的(疾病-和/或癌症-维持的)miRNA中包含的一种或多种miRNA的比率。更优选地,通过所述第一组的(疾病-和/或癌症-调节的)miRNA中包含的一种或多种miRNA的表达水平,除以所述第二组的(疾病-和/或癌症-维持的)miRNA中包含的一种或多种miRNA的水平,获得所述相对表达水平。因此,第二组的(疾病-和/或癌症-维持的)miRNA,用作所述第一组的(疾病-和/或癌症-调节的)miRNA的标准化物。所述相对表达水平的实例为,来自待诊断的一个或多个对象的以下miRNA表达水平的比率:hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-363(SEQ ID NO:24)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-363(SEQ ID NO:24)除以hsa-miR-192(SEQ ID NO:41)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-192(SEQ ID NO:41)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-874(SEQ ID NO:59)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-106a(SEQ ID NO:13)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-106a(SEQ ID NO:13)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-93*(SEQ ID NO:21)除以hsa-miR-27b(SEQ ID NO:34)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-222(SEQ ID NO:15)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-363(SEQ ID NO:24)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-363(SEQ ID NO:24)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-93*(SEQ ID NO:21)除以hsa-miR-99b(SEQ ID NO:54)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-361-3p(SEQ ID NO:55)。

优选地,在步骤(d)中归一化表达谱与之比较的参考为参考表达谱。优选的是,当从待诊断的对象中获得表达谱时,以相当的方式从一个或多个参考对象获得参考表达谱。优选地,所述参考为归一化的参考表达谱,其是通过包括以下的步骤获得的:

(i)测定来自一个或多个参考对象的血液样品中的第一预定组的一种或多种miRNA的表达谱,其中所述第一预定组的miRNA中包含的miRNA选自图1和/或图3中列出的miRNA,

(ii)测定来自一个或多个参考对象的所述血液样品中的第二预定组的一种或多种miRNA的表达谱,其中所述第二预定组的miRNA中包含的miRNA选自图2和/或图4中列出的miRNA,

(iii)将所述一个或多个参考对象中的所述第一预定组的miRNA的表达谱归一化至所述第二预定组的miRNA。

还优选的是,步骤(iii)中的归一化产生第一预定组的miRNA中包含的各miRNA的相对参考表达水平。优选地,所述相对参考表达水平为这样的比率,其获自来自一个或多个参考对象的第一组的(疾病-和/或癌症-调节的)miRNA中包含的一种或多种miRNA,与第二组的(疾病-和/或癌症-维持的)miRNA中包含的一种或多种miRNA的比率。更优选地,通过来自一个或多个参考对象的所述第一组的(疾病-和/或癌症-调节的)miRNA中包含的一种或多种miRNA的表达水平,除以所述第二组的(疾病-和/或癌症-维持的)miRNA中包含的一种或多种miRNA的水平,获得所述相对表达水平。因此,第二组的(疾病-和/或癌症-维持的)miRNA用作所述第一组的(疾病-和/或癌症-调节的)miRNA的标准化物。所述相对参考表达水平的实例为,来自一个或多个参考对象的以下miRNA表达水平的比率:hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-423-5p(SEQ ID NO:1)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-26b(SEQ ID NO:2)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-374a(SEQ ID NO:3)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:31)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-425(SEQ ID NO:32)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-374b(SEQ ID NO:11)除以hsa-miR-25(SEQ ID NO:39),或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-126(SEQ ID NO:9)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-92a(SEQ ID NO:27)、或hsa-miR-363(SEQ ID NO:24)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-363(SEQ ID NO:24)除以hsa-miR-192(SEQ ID NO:41)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-192(SEQ ID NO:41)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-874(SEQ ID NO:59)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-20a(SEQ ID NO:10)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-30b(SEQ ID NO:37)、或hsa-miR-106a(SEQ ID NO:13)除以hsa-miR-16(SEQ ID NO:28)、或hsa-miR-17(SEQ ID NO:8)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-106a(SEQ ID NO:13)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-93*(SEQ ID NO:21)除以hsa-miR-27b(SEQ ID NO:34)、或hsa-miR-144*(SEQ ID NO:7)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-222(SEQ ID NO:15)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-20b(SEQ ID NO:6)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-363(SEQ ID NO:24)除以hsa-miR-22(SEQ ID NO:38)、或hsa-miR-363(SEQ ID NO:24)除以hsa-miR-140-3p(SEQ ID NO:35)、或hsa-miR-93*(SEQ ID NO:21)除以hsa-miR-99b(SEQ ID NO:54)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-19a(SEQ ID NO:29)、或hsa-miR-720(SEQ ID NO:5)除以hsa-miR-361-3p(SEQ ID NO:55)。

根据本发明,使用来自待被诊断的对象的归一化表达水平和来自一个或多个参考对象的归一化参考表达谱进行步骤(d)中的比较,所述归一化参考表达谱通过采用相同的miRNA组合,即相同的疾病调节的miRNA和疾病维持的miRNA的组合,更优选地相同比率的疾病调节的miRNA和疾病维持的miRNA获得的。

优选地,步骤(d)中的比较是通过将来自所述对象的相对表达水平与所述第一预定组的miRNA中包含的各miRNA的相对参考表达水平进行比较。

优选的是,通过计算图1中列出的(疾病调节的)miRNA与图2中列出的(疾病维持的)miRNA的比率,获得相对表达水平。

还优选的是,相对表达水平选自图7中列出的比率。

另外优选的是,在步骤(e)中,当来自所述对象的相对表达水平与相对参考表达水平的比较超过所述组中包含的一种或多种所述预定miRNA的阈值时,诊断出健康状况的变化。

优选地,用于诊断健康状况变化的阈值设定为3个标准差,优选设定为5个标准差,更优选设定为7个标准差。

在第二方面,本发明涉及诊断对象的健康状况的方法。

应理解,根据本发明的第二方面的方法包括和/或包含在根据本发明的第一方面的方法中详细说明的方面。

在所述第二方面,本发明涉及诊断对象的健康状况的方法,其包括以下步骤:

(a)测定来自对象的血液样品中的第一预定组的miRNA的表达谱,

(b)测定来自所述对象的所述血液样品中的第二预定组的miRNA的表达谱,

(c)将步骤(a)的所述表达谱和步骤(b)的所述表达谱与参考表达谱进行比较,

(d)当与第一参考表达谱的比较改变并且与第二参考表达谱的比较未改变时,诊断出所述对象的健康状况的变化。

在此,第一预定组的miRNA中包含的miRNA和所述第一参考表达谱中包含的miRNA选自图1和/或图3中列出的miRNA,以及第二预定组的miRNA中包含的miRNA选自图2和/或图4列出的miRNA。

优选的是,所述血液样品选自全血,血细胞,由红细胞、白细胞和血小板组成的血细胞级分,包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞级分,或包含红细胞、白细胞或血小板的血细胞级分。更优选地,血液样品为包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞级分。

优选的是,根据本发明的第一方面和第二方面的所述参考表达谱来自同一对象的较早时间点。

优选地,根据本发明的第一方面和第二方面的健康状况的变化为健康状况的改善或恶化。

优选地,在根据本发明的第一方面或第二方面的方法中,当测定来自全血样品的血细胞样品中的表达谱时,至少两种miRNA,即(选自具有SEQ ID NO:1至26的图1中列出的miRNA的第一预定组的一种或多种miRNA的)一种疾病调节的miRNA和(选自具有SEQ ID NO:27至59的图2中列出的miRNA的第二预定组的一种或多种miRNA的)一种疾病维持的miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:27,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:28,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:29,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:30,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:31,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:32,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:33,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:34,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:35,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:27,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:28,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:29,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:30,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:31,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:32,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:33,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:34,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:27,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:28,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:29,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:30,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:31,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:32,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:33,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:27,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:28,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:29,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:30,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:31,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:32,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:27,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:28,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:29,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:30,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:31,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:27,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:28,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:29,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:30,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:27,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:28,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:29,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:27,至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:29,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:27,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:28,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:27,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:28,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:28,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:35,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:27,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:28,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:38,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:41,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:41,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:59,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:28,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:35,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:28,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:37,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:28,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:35,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:35,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:35,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:34,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:29,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:35,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:29,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:38,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:35,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:54,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:29,或至少两种miRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:55。

优选的是,所述表达谱通过包括以下的步骤来测定:

(a)提供待诊断健康状况的对象的全血样品,

(b)从所述全血样品中得到血细胞样品,

(c)从所述血细胞样品中提取总RNA,

(d)测定来自提取的总RNA的第一组的一种或多种疾病调节的miRNA(选自具有SEQ ID NO:1至26的图1中列出的miRNA)和第二组的一种或多种疾病维持的miRNA(选自具有SEQ ID NO:27至59的图2中列出的miRNA)的表达谱。

优选地,通过将血细胞与全血样品的剩余级分分离而由全血样品中得到血细胞样品,这可以通过离心实现,其中血细胞(包括红细胞、白细胞和血小板)形成可以被收获的团块(参见实施例1)。本领域技术人员知晓将血细胞与全血样品的剩余级分分离的替代方法(例如尺寸排阻、尺寸分布、双向电泳、阳性或阴性抗体选择等)。

还优选的是,所述表达谱的测定包括将所述组中包含的至少一种miRNA,优选至少两种miRNA的核苷酸序列逆转录成cDNA(互补的DNA)。在此,在测定所述miRNA的表达谱之前,将所述RNA序列逆转录成DNA(例如通过使用逆转录酶)。优选地,当在miRNA表达谱的测定中采用基于核酸扩增(PCR、RT-PCR)、测序(下一代测序、Sanger测序)或杂交的技术时,将所述组中包含的至少一种miRNA,优选地至少两种miRNA的核苷酸序列逆转录成cDNA。此外,优选的是,将总RNA转录成测定表达谱的cDNA。

在根据本发明第一方面和第二方面的本发明另外的实施方案中,所述疾病调节的miRNA为癌症调节的miRNA,其选自图3中列出的miRNA,所述疾病维持的miRNA为癌症维持的miRNA,其选自图4中列出的miRNA。

在第三方面,本发明涉及根据本发明的第一方面和第二方面的方法的用途。

应理解,根据本发明的第三方面的用途包括和/或包含在根据本发明的第一方面和第二方面的方法中详细说明的方面。

所述本发明的第三方面涉及根据本发明的第一方面和第二方面的方法用于以下的用途:

(i)比较一个或多个对象之间的健康状况,

(ii)监测对象的健康状况,

(iii)监测对象的免疫系统的状态,

(iv)监测对象对治疗性处理,优选药物处理的反应。

在第四方面,本发明涉及用于诊断对象的健康状况的试剂盒,其包含:

(i)装置,其用于测定对象的血液样品中的包含选自SEQ ID NO:1至26的至少一种miRNA和选自SEQ ID NO:27至59的至少一种miRNA的组的表达谱,和

(ii)至少一种参考。

应理解,根据本发明的第四方面的试剂盒包括和/或包含根据本发明的第一方面和第二方面的方法中详细说明的方面、根据本发明的第三方面的用途中详细说明的方面。

优选地,用于测定表达谱的装置包括:

(i)至少两种多核苷酸的组,其用于测定对象的血液样品中的包含选自SEQ ID NO:1至26的至少一种miRNA和选自SEQ ID NO:27至59的至少一种miRNA的组,和

(ii)阵列、RT-PCT系统、PCR系统、流式细胞术、基于珠的多重系统或下一代测序系统。

所述试剂盒包含本发明的第一方面所概述的根据本发明的至少一种参考。在优选的实施方案中,所述参考可以包含在试剂盒的数据载体中。在另外优选的实施方案中,所述参考可以为参考样品和/或参考标准,其包含在试剂盒中,并且例如在表达谱的测定中使用所述试剂盒时采用所述参考。

任选地,所述试剂盒包含数据载体。优选地,数据载体为电子或非电子数据载体,更优选地,其为电子数据载体,如存储介质。所述试剂盒任选地包含数据载体,其任选地包含关于在健康状况的诊断中如何应用表达谱和所述参考的参考和/或说明。这个关于如何应用表达谱和所述参考的说明可以包括健康状况的诊断中涉及的医生和/或诊断实验室的说明。优选的是,数据载体还包含用于分析和评价测定的表达谱的工具。这些工具可以是帮助医生和/或诊断实验室诊断健康状况的任何工具。优选的是,包含的说明为算法或软件。优选地,这些工具为帮助分析测定的表达谱和/或帮助随后诊断的软件工具。用于分析和评价的工具可以包括根据本发明的参考。

所述试剂盒任选地包含全血采集管,其优选地选自EDTA-管、柠檬酸钠-管、ACD-管、肝素-管、PAXgene血液RNA-管、Tempus血液RNA-管,并任选地含有用于稳定RNA级分的添加剂。

所述试剂盒任选地包含从全血样品中得到血细胞样品的装置。这些装置优选地用于将各血细胞样品(例如包含白细胞、红细胞或血小板的血细胞样品,包含白细胞、红细胞和血小板的血细胞样品,血小板制备物)与全血样品的剩余级分分开和/或分离。这些装置可以包括用于分离/分开各血细胞级分的试剂或消耗品和/或合适的仪器(例如离心机、专用的收集管)。

在本发明的另一方面,发明人发现在血液样品,优选在全血样品或包含红细胞、白细胞和/或血小板的血细胞级分中,某些miRNA(癌症调节的miRNA,图3)在健康对照与癌症对象之间显著失调,然而某些其它miRNA(癌症维持的miRNA,图4)在健康对照与癌症对象之间未显著失调。应理解,在本发明的另外实施方案中,所述癌症调节的miRNA(图3)和所述癌症维持的miRNA(图4),可以按照根据本发明的第一、第二、第三和第四方面的针对疾病调节的miRNA和疾病维持的miRNA所详细说明的相同方式使用,以用于诊断对象的健康状况,其中健康状况的变化涉及所述对象中不存在或存在癌症。

在其它方面,本发明涉及监测对象的健康状况的方法,其包括以下步骤:

(a)通过实施根据第一方面或第二方面所述的方法来诊断对象在第一时间点时的健康状况,

(b)通过实施根据第一方面或第二方面所述的方法来诊断所述对象在一个或多个稍后时间点时的健康状况,和

(c)将步骤(a)中诊断的健康状况与步骤(b)中诊断的健康状况进行比较,从而监测所述对象的健康状况。

在一个实施方案中,对象的健康状况随时间改善或恶化。

在一个其它实施方案中,所监测对象的健康状况涵盖所述对象的免疫系统的状态。

在一个其它实施方案中,对象在第一时间点与一个或多个稍后时间点之间已经接受治疗性处理。所述处理可以为药物处理,即,其可以包含药物的施用。所述药物可以为治疗对象的疾病和/或癌症的药物。所述处理可以可选地和/或另外地包括手术、化疗、放射疗法和/或免疫疗法。

总之,本发明由下述项组成:

1.诊断对象的健康状况的方法,其包括以下步骤:

(f)测定来自对象的血液样品中的第一预定组的一种或多种miRNA的表达谱,其中所述第一预定组的miRNA中包含的miRNA选自图1和/或图3中列出的miRNA,

(g)测定来自所述对象的所述血液样品中的第二预定组的一种或多种miRNA的表达谱,其中所述第二预定组的miRNA中包含的miRNA选自图2和/或图4中列出的miRNA,

(h)将所述第一预定组的miRNA的表达谱归一化至所述第二预定组的miRNA,

(i)将步骤(c)中的归一化表达谱与参考进行比较,

(j)当与所述参考的比较改变时,诊断出所述对象的健康状况的变化,

其中所述血液样品选自全血,血细胞,由红细胞、白细胞和血小板组成的血细胞级分,包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞级分,或包含红细胞、白细胞或血小板的血细胞级分。

2.如第1项所述的方法,其中步骤(c)中的归一化产生所述第一预定组的miRNA中包含的各miRNA的相对表达水平。

3.如第2项所述的方法,其中所述参考为归一化的参考表达谱,其是通过包括以下的步骤获得的:

(i)测定来自一个或多个参考对象的血液样品中的第一预定组的一种或多种miRNA的表达谱,其中所述第一预定组的miRNA中包含的miRNA选自图1和/或图3中列出的miRNA,

(ii)测定来自一个或多个参考对象的所述血液样品中的第二预定组的一种或多种miRNA的表达谱,其中所述第二预定组的miRNA中包含的miRNA选自图2和/或图4中列出的miRNA,

(iii)将所述一个或多个参考对象中的所述第一预定组的miRNA的表达谱归一化至所述第二预定组的miRNA。

4.如第3项所述的方法,其中步骤(iii)中的归一化产生所述第一预定组的miRNA中包含的各miRNA的相对参考表达水平。

5.如第1至4项中任一项所述的方法,其中步骤(d)中的比较是通过将来自所述对象的相对表达水平与所述第一预定组的miRNA中包含的各miRNA的相对参考表达水平进行比较。

6.如第2、4或5项中任一项所述的方法,其中通过计算图1中列出的(疾病调节的)miRNA与图2中列出的(疾病维持的)miRNA的比率获得所述相对表达水平。

7.如第6项所述的方法,其中所述相对表达水平选自图7中列出的比率。

8.如第1至7项中任一项所述的方法,其中在步骤(e)中,当来自所述对象的相对表达水平与所述相对参考表达水平的比较超过所述组中包含的一种或多种所述预定miRNA的阈值时,诊断出健康状况的变化。

9.如第1至8项中任一项所述的方法,其中所述阈值设定为3个标准差,优选设定为5个标准差,更优选设定为7个标准差。

10.诊断对象的健康状况的方法,其包括以下步骤:

(e)测定来自对象的血液样品中的第一预定组的miRNA的表达谱,

(f)测定来自所述对象的所述血液样品中的第二预定组的miRNA的表达谱,

(g)将步骤(a)的所述表达谱和步骤(b)的所述表达谱与参考表达谱进行比较,

(h)当与第一参考表达谱的比较改变并且与第二参考表达谱的比较未改变时,诊断出所述对象的健康状况的变化,

其中

(i)第一预定组的miRNA中包含的miRNA和所述第一参考表达谱中包含的miRNA选自图1和/或图3中列出的miRNA,和

(ii)第二预定组的miRNA中包含的miRNA选自图2和/或图4中列出的miRNA,和

(iii)其中所述血液样品选自全血,血细胞,由红细胞、白细胞和血小板组成的血细胞级分,包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞级分,或包含红细胞、白细胞或血小板的血细胞级分。

11.如第3至10项中任一项所述的方法,其中所述参考表达谱来自同一对象的较早时间点。

12.如第1至11项中任一项所述的方法,其中健康状况的变化为健康状况的改善或恶化。

13.第1至12项中任一项所述的方法的用于以下的用途:

(i)比较一个或多个对象之间的健康状况,

(ii)监测对象的健康状况,

(iii)监测对象的免疫系统的状态,

(iv)监测对象对治疗性处理,优选药物处理的反应。

14.如第1至13项中任一项所述的方法、用途或试剂盒,其中所述第一组的(疾病调节的)miRNA中的另外的miRNA选自图3中列出的miRNA,并且其中所述第二组的(疾病维持的)miRNA中的另外的miRNA选自图3中列出的miRNA,并且其中健康状况的变化涉及所述对象中不存在或存在癌症。

附图简述

图1:在来自收集于PAXgene血液RNA管中的全血样品的包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞样品中测定的疾病调节的miRNA(SEQ ID NO:1至26)的概观。在此,将血液样品吸入到PAXgene血液RNA管中,通过使用miRNeasy试剂盒(http://www.qiagen.com)分离血细胞(包含血细胞的miRNA级分)的总RNA,以及在代表miRBase 12版的DNA-微阵列(febit biomed)上进行分析(实验详述:SEQ ID NO:序列识别号;miRNA:根据miRBase 12版的miRNA注释;中位数g1(健康对照)=健康对照患者的中位表达水平;中位数g2(患病)=患病对象的中位表达水平(;q中位数=中位数g1(健康对照)与中位数g2(患病)的比率;ttest_adjp=根据T检验计算的Benjamini-Hochberg-校正的p值;AUC=曲线下面积统计。

图2:在来自收集于PAXgene血液RNA管中的全血样品的包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞样品中测定的疾病维持的miRNA(SEQ ID NO:27至59)的概观。在此,将血液样品吸入到PAXgene血液RNA管中,通过使用miRNeasy试剂盒(http://www.qiagen.com)分离血细胞(包含血细胞的miRNA级分)的总RNA以及在代表miRBase 12版的DNA-微阵列(febit biomed)上进行分析(实验详述:SEQ ID NO:序列识别号;miRNA:根据miRBase 12版的miRNA注释;中位数g1(健康对照)=健康对照患者的中位表达水平;中位数g2(患病)=患病对象的中位表达水平(;q中位数=中位数g1(健康对照)与中位数g2(患病)的比率;ttest_adjp=根据T检验计算的Benjamini-Hochberg-校正的p值;AUC=曲线下面积统计。

图3:在来自收集于PAXgene血液RNA管中的全血样品的包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞样品中测定的癌症调节的miRNA的概观。在此,将血液样品吸入到PAXgene血液RNA管中,通过使用miRNeasy试剂盒(http://www.qiagen.com)分离血细胞(包含血细胞的miRNA级分)的总RNA以及在代表miRBase 12版的DNA-微阵列(febit biomed)上进行分析(实验详述:SEQ ID NO:序列识别号;miRNA:根据miRBase 12版的miRNA注释;中位数g1(健康对照)=健康对照患者的中位表达水平;中位数g2(癌症)=患病对象的中位表达水平(;q中位数=中位数g1(健康对照)与中位数g2(癌症)的比率;ttest_adjp=根据T检验计算的Benjamini-Hochberg-校正的p值;AUC=曲线下面积统计。

图4:在来自收集于PAXgene血液RNA管中的全血样品的包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞样品中测定的癌症维持的miRNA的概观。在此,将血液样品吸入到PAXgene血液RNA管中,通过使用miRNeasy试剂盒(http://www.qiagen.com)分离血细胞(包含血细胞的miRNA级分)的总RNA以及在代表miRBase 12版的DNA-微阵列(febit biomed)上进行分析(实验详述:SEQ ID NO:序列识别号;miRNA:根据miRBase 12版的miRNA注释;中位数g1(健康对照)=健康对照患者的中位表达水平;中位数g2(癌症)=患病对象的中位表达水平(;q中位数=中位数g1(健康对照)与中位数g2(癌症)的比率;ttest_adjp=根据T检验计算的Benjamini-Hochberg-校正的p值;AUC=曲线下面积统计。

图5:根据(a)本发明的第二方面和(b)本发明的第一方面的方法的示意性描述。

图6:根据本发明用于监测对象的健康状况的方法的应用的图形描述。

图7:描述获自将第一预定组的一种或多种miRNA(选自图1的疾病调节的miRNA)的表达谱归一化至第二预定组的miRNA(选自图2的疾病维持的miRNA)的相对表达水平的箱形图。在此,左边灰色箱形图代表健康对照对象(n=67)内的相对表达水平,右边白色箱形图代表患病对象(n=713)内的相对表达水平;其中pval=根据T检验计算的Benjamini-Hochberg-校正的p值。在此,采用来自包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞级分的miRNA,根据实施例1-5收集并处理所有样品。

其中:图7-1:hsa-miR-144*/hsa-miR-16;图7-2:hsa-miR-144*/hsa-miR-92a;图7-3:hsa-miR-126/hsa-miR-16;图7-4:hsa-miR-20b/hsa-miR-16;图7-5:hsa-miR-20b/hsa-miR-140-3p;图7-6:hsa-miR-20b/hsa-miR-92a;图7-7:hsa-miR-363/hsa-miR-16;图7-8:hsa-miR-20b/hsa-miR-22;图7-9:hsa-miR-363/hsa-miR-192;图7-10:hsa-miR-20b/hsa-miR-192;图7-11:hsa-miR-720/hsa-miR-874;图7-12:hsa-miR-17/hsa-miR-16;图7-13:hsa-miR-20a/hsa-miR-140-3p;图7-14:hsa-miR-20a/hsa-miR-16;图7-15:hsa-miR-144*/hsa-miR-30b;图7-16:hsa-miR-106a/hsa-miR-16;图7-17:hsa-miR-17/hsa-miR-140-3p;图7-18:hsa-miR-144*/hsa-miR-140-3p;图7-19:hsa-miR-106a/hsa-miR-140-3p;图7-20:hsa-miR-93*/hsa-miR-27b;图7-21:hsa-miR-144*/hsa-miR-19a;图7-22:hsa-miR-222/hsa-miR-140-3p;图7-23:hsa-miR-20b/hsa-miR-19a;图7-24:hsa-miR-363/hsa-miR-22;图7-25:hsa-miR-363/hsa-miR-140-3p;图7-26:hsa-miR-93*/hsa-miR-99b;图7-27:hsa-miR-720/hsa-miR-19a;图7-28:hsa-miR-720/hsa-miR-361-3p。

(在图中,由于可视化的约束,miRNA标识符的注释被截短;在此,相对表达值如上文所列)

图8:获自将第一预定组的一种或多种miRNA(选自图1的疾病调节的miRNA)的表达谱归一化至第二预定组的miRNA(选自图2的疾病维持的miRNA)的相对表达水平的概观。(实验详述:miRNA=根据miRBase 12版的miRNA注释;中位数比率r/p(健康对照)=健康对照组的中位相对表达水平,其中由健康对照组中疾病调节的miRNA(r)和疾病维持的miRNA(p)的表达水平的比率计算中位数;中位数比率r/p(疾病)=疾病组的中位相对表达水平,其中由疾病组中疾病调节的miRNA(r)和疾病维持的miRNA(p)的表达水平的比率计算中位数;倍数变化=健康对照与疾病组之间中位相对表达水平的中位数倍数变化;Wilcoxon Mann Whitney检验校正的p值=根据WMW检验计算的校正的p值;t-检验校正的p值=根据T检验计算的Benjamini-Hochberg-校正的p值;AUC=曲线下面积统计。

图9:获自将第一预定组的一种或多种miRNA(选自图3的癌症调节的miRNA)的表达谱归一化至第二预定组的miRNA(选自图4的癌症维持的miRNA)的相对表达水平的概观。(实验详述:miRNA=根据miRBase 12版的miRNA注释;中位数比率r/p(健康对照)=健康对照组的中位相对表达水平,其中由健康对照组中癌症调节的miRNA(r)和癌症维持的miRNA(p)的表达水平的比率计算中位数;中位数比率r/p(癌症)=癌症组的中位相对表达水平,其中由癌症组中癌症调节的miRNA(r)和癌症维持的miRNA(p)的表达水平的比率计算中位数;倍数变化=健康对照与癌症组之间中位相对表达水平的中位数倍数变化;Wilcoxon Mann Whitney检验校正的p值=根据WMW检验计算的校正的p值;t-检验校正的p值=根据T检验计算的Benjamini-Hochberg-校正的p值;AUC=曲线下面积统计。

图10:用于诊断对象的健康状况的预定组的5种疾病调节的miRNA和5种疾病维持的miRNA的分类性能。由5种归一化表达谱组成的组将健康状况(健康对照相对于疾病)分类,AUC为0.78。利用由hsa-miR-194/hsa-miR-223、hsa-miR-192/hsa-miR-223、hsa-miR-19a/hsa-miR-223、hsa-miR-99b/hsa-miR-484和hsa-miR-99b/hsa-miR-19b计算的5种归一化表达谱进行分类。

实施例

设计实施例以进一步说明本发明并提供更好的理解。不应将其解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例1:从全血样品中得到血细胞样品

将健康对照和患病对象的血液收集于PAXgene血液RNA管(PreAnalytix)中。对于各血液供体,2.5ml血液于PAXgene血液RNA管中。通过离心处理全血样品,得到/获得血细胞制备物。在此,将收集于采血管中的来自全血的血细胞,以5000xg离心10min。收获血细胞团块(包含红细胞、白细胞和血小板的血细胞级分)用于进一步处理,同时弃去上清液(包括细胞外血液级分)。使用miRNeasy微型试剂盒(Qiagen GmbH,Hilden,Germany),从收获的血细胞中提取总RNA,包括小RNA(miRNA级分);详细内容参见实施例2。

实施例2:总RNA(包括微RNA)的分离

通过使用miRNeasy微型试剂盒(Qiagen GmbH,Hilden,Germany),进行总RNA(包括小RNA(miRNA级分)的分离。在此,通过上下吸打将血细胞团块(如实施例1中概述获得的)充分悬浮在700μl QIAzol裂解试剂中,将悬液立即转移至新的1.5ml Eppendorf管中。然后,添加140μl氯仿,充分涡旋并在室温孵育2-3min,随后在4℃以12,000g离心15min。然后,将上层水相小心地转移至新的2ml管中,而不接触其它两相。然后,将1.5倍体积的100%乙醇添加至转移的水相中,并通过吸打完成充分混合。然后,将700μl样品转移至柱中,并在室温以13,000rpm离心15sec,弃去流穿液(flow-through)。然后,将700μl Buffer RWT添加至各柱,在室温以13,000rpm再次离心15sec,弃去流穿液。然后,将500μl Buffer RPE添加至柱中,并在室温以13,000rpm离心15sec,弃去流穿液。然后,将另外的500μl Buffer RPE添加至柱中,并在室温以13,000rpm离心2min,弃去流穿液。然后,将柱置于新的2ml收集管中,并在室温以13,000rpm离心1min以将其干燥。将柱转移至新的1.5ml收集管中。为了洗脱总RNA(包括微RNA),将40μl无RNA酶的水吸取到柱上并孵育1min,在室温以13.000rpm离心1min。然后,将洗出液放回至同一柱中,在室温孵育1min并再次离心1min。使用NanoDrop 1000定量所洗脱的总RNA(包括微RNA),并在用于表达谱实验之前将其储存于-20℃。对于总RNA的质量控制,将1μl总RNA应用于Agilent’s Bioanalyzer,根据由NanoDrop测量来测定的RNA浓度,选择Agilent的nano-或pico-RNA Chip。

实施例3:基于微阵列的表达谱的测定

使用Geniom Biochip miRNA智人(homo sapiens),在Geniom实时分析仪(febit biomed GmbH,Heidelberg,Germany)上,采用微阵列杂交对总RNA-样品包括miRNA级分(通过实施例2的方案获得的)进行分析。各微流体微阵列含有866种Sanger miRBase 12.0中所注释的miRNA和miRNA*(每个由7个重复代表)的互补DNA探针。采用febit的MPEA分析,通过miRNA的酶促芯片上标记来实现标记有生物素的样品。在42℃杂交16小时之后,自动洗涤生物芯片,用Geniom实时分析仪处理用于信号增强的程序。使用Geniom Wizard软件评价所得的检测图像。对于每个阵列,从原始数据文件中提取中位数信号强度,使得对于各miRNA,已经计算了对应于阵列上每个重复拷贝的miRBase的七个强度值。在背景校正后,将各miRNA的七个重复强度值通过其中位数值进行概述。为了使不同阵列之间的数据标准化,应用分位数归一化,使用归一化并减去背景的强度值进行所有进一步的分析。由中位数g1和中位数g2,表达的倍数变化(=q中位数)计算为g1/g2的比率。

实施例4:统计学分析

在已经验证了测量数据的正常分布之后,分别对各miRNA进行参数T检验(未配对的,双尾),以检测在不同血液供体组中显示不同行为的miRNA。通过Benjamini-Hochberg校正(=ttest_adj)来校正所得的原始p值用于多次检验。此外,我们对于各miRNA分别应用limma检验,并根据Benjamini-Hochberg(=limma_adj)进行校正。另外,我们应用接收者操作特征,并计算“曲线下面积”-值(=AUC)。T检验值、limma-检验值和AUC值,允许判断各miRNA在组1(g1对象)与组2(g2对象)之间差异表达的统计学显著性。

实施例5:疾病调节的miRNA和疾病维持的miRNA的测定

本研究的目标为鉴别在不同的疾病和健康对照中显示出显著改变的表达的miRNA,以及相比之下在疾病和在对照中显示出非常低的表达变化性的miRNA。这两组miRNA在下文中被称为“疾病调节的”miRNA或“疾病维持的”miRNA。总共从1,049个血液样品中获得了miRNA谱,使用相同方案将所有所述血液样品收集于PAXgene血液RNA管中。在每种情况下,由通过微阵列分析记录的848种miRNA的表达值生成谱图。为鉴别“疾病调节的”miRNA或“疾病维持的”miRNA,我们使用T检验和AUC值。使用针对p值或AUC值的20个不同的阈值,我们获得了不同组的“疾病调节的”miRNA(图1)或“疾病维持的”miRNA(图2)。

序列表

<110> 蜂鸟诊断有限责任公司(HUMMINGBIRD DIAGNOSTICS GMBH)

<120> 健康标志

<130> 17C82562CN

<160> 77

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

ugaggggcag agagcgagac uuu 23

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

uucaaguaau ucaggauagg u 21

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

uuauaauaca accugauaag ug 22

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

guccaguuuu cccaggaauc ccu 23

<210> 5

<211> 17

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

ucucgcuggg gccucca 17

<210> 6

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

caaagugcuc auagugcagg uag 23

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

ggauaucauc auauacugua ag 22

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

caaagugcuu acagugcagg uag 23

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

ucguaccgug aguaauaaug cg 22

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

uaaagugcuu auagugcagg uag 23

<210> 11

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

auauaauaca accugcuaag ug 22

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

uaaggugcau cuagugcaga uag 23

<210> 13

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

aaaagugcuu acagugcagg uag 23

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

uaaagugcug acagugcaga u 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

agcuacaucu ggcuacuggg u 21

<210> 16

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

ugccuacuga gcugaaacac ag 22

<210> 17

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 17

uucaaguaau ccaggauagg cu 22

<210> 18

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 18

caaagugcug uucgugcagg uag 23

<210> 19

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 19

ugugcaaauc caugcaaaac uga 23

<210> 20

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 20

ugucaguuug ucaaauaccc ca 22

<210> 21

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 21

acugcugagc uagcacuucc cg 22

<210> 22

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 22

gugggcgggg gcaggugugu g 21

<210> 23

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 23

ucaggcucag uccccucccg au 22

<210> 24

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 24

aauugcacgg uauccaucug ua 22

<210> 25

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 25

ucagugcacu acagaacuuu gu 22

<210> 26

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 26

gagcuuauuc auaaaagugc ag 22

<210> 27

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 27

uauugcacuu gucccggccu gu 22

<210> 28

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 28

uagcagcacg uaaauauugg cg 22

<210> 29

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 29

ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23

<210> 30

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 30

caggccauau ugugcugccu ca 22

<210> 31

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 31

cugguacagg ccugggggac ag 22

<210> 32

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 32

caacaccagu cgaugggcug u 21

<210> 33

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 33

aguuuugcau aguugcacua ca 22

<210> 34

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 34

uucacagugg cuaaguucug c 21

<210> 35

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 35

uaccacaggg uagaaccacg g 21

<210> 36

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 36

aaugacacga ucacucccgu uga 23

<210> 37

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 37

uguaaacauc cuacacucag cu 22

<210> 38

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 38

aagcugccag uugaagaacu gu 22

<210> 39

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 39

cauugcacuu gucucggucu ga 22

<210> 40

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 40

uguaacagca acuccaugug ga 22

<210> 41

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 41

cugaccuaug aauugacagc c 21

<210> 42

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 42

ucucacacag aaaucgcacc cgu 23

<210> 43

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 43

uagcagcaca uaaugguuug ug 22

<210> 44

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 44

aaaagcuggg uugagagga 19

<210> 45

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 45

aaaagcuggg uugagagggu 20

<210> 46

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 46

acugccccag gugcugcugg 20

<210> 47

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 47

ugagguagua gauuguauag uu 22

<210> 48

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 48

ucggccugac cacccacccc ac 22

<210> 49

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 49

aaggagcuca cagucuauug ag 22

<210> 50

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 50

cgcauccccu agggcauugg ugu 23

<210> 51

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 51

ucugggcaac aaagugagac cu 22

<210> 52

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 52

cagcagcaau ucauguuuug aa 22

<210> 53

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 53

ugagaugaag cacuguagcu c 21

<210> 54

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 54

cacccguaga accgaccuug cg 22

<210> 55

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 55

ucccccaggu gugauucuga uuu 23

<210> 56

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 56

gcccuccgcc cgugcacccc g 21

<210> 57

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 57

ugugcgcagg gagaccucuc cc 22

<210> 58

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 58

cugcaaaggg aagcccuuuc 20

<210> 59

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 59

cugcccuggc ccgagggacc ga 22

<210> 60

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 60

agcagcauug uacagggcua uca 23

<210> 61

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 61

uggcagggag gcugggaggg g 21

<210> 62

<211> 18

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 62

cgggcguggu gguggggg 18

<210> 63

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 63

agcagcauug uacagggcua uga 23

<210> 64

<211> 20

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 64

uacaguauag augauguacu 20

<210> 65

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 65

uucaccaccu ucuccaccca gc 22

<210> 66

<211> 18

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 66

aucccaccuc ugccacca 18

<210> 67

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 67

agcucggucu gaggccccuc agu 23

<210> 68

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 68

uagugcaaua uugcuuauag ggu 23

<210> 69

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 69

ucagcaaaca uuuauugugu gc 22

<210> 70

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 70

caaaccacac ugugguguua ga 22

<210> 71

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 71

gugcauugua guugcauugc a 21

<210> 72

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 72

cuauacgacc ugcugccuuu cu 22

<210> 73

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 73

aaaagcuggg uugagagggc ga 22

<210> 74

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 74

aaugcaccug ggcaaggauu ca 22

<210> 75

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 75

caacaaauca cagucugcca ua 22

<210> 76

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 76

cucucaccac ugcccuccca cag 23

<210> 77

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 77

cccggagcca ggaugcagcu c 21

再多了解一些
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1