本发明提供适合作为治疗剂的光学活性形式的化合物1-(3-(3-n,n-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-n,n'-双(伸乙基)胺基磷酸酯、这些化合物的医药组合物及治疗癌症的方法，以及用于自化合物(r,s)-1-(3-(3-n,n-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-n,n'-双(伸乙基)胺基磷酸酯的外消旋混合物解析这些光学活性形式或增浓其对映异构体之一，或立体选择性合成光学纯(r)及(s)-1-(3-(3-n,n-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-n,n'-双(伸乙基)胺基磷酸酯的方法。
背景技术：
癌症是造成人类发病及死亡的主要原因之一。因为难以在不损害或杀死正常细胞的情况下杀死癌细胞，所以癌症治疗具有挑战性。在癌症治疗期间损害或杀死正常细胞会在患者体内引起不良副作用且可限制投与癌症患者的抗癌药物的量。
醛-酮还原酶家族1的成员c3(akr1c3)是人体中由akr1c3基因编码的一种酶。此基因编码由超过40种已知酶及蛋白质组成的醛/酮还原酶超家族的成员。这些酶通过利用nadh及/或nadph作为辅因子，催化醛及酮转化成其对应醇。
相对于正常细胞，许多癌细胞过度表现akr1c3还原酶(参见例如，cancerres2010；70:1573-1584,cancerres2010；66:2815-2825)。经展示，pr104
为akr1c3的较弱底物且在临床试验中进行测试。此化合物并非选择性akr1c3活化前药，因为其亦可在低氧条件下活化。prl04在临床试验中无效。
因此，仍需要适于治疗癌症患者的化合物，包括用于治疗癌症患者的选择性akr1c3还原酶活化前药。本发明满足此需要。
技术实现要素：
在一个方面中，本文提供式ia及ib的化合物：
或其同位素变体、溶剂合物或水合物。
本文中所提供的化合物包括个别对映异构体以及富对映异构体的混合物。
在另一方面中，本文中提供一种医药组合物，其包含本文中所提供的化合物及至少一种医药学上可接受的赋形剂。在另一方式中，本文中提供单位剂量的本文中所提供的医药组合物。
在另一方面中，本文中提供一种用于治疗患者的癌症的方法，该方法包含向患者投与治疗有效量的如本文中所提供的化合物或医药学上可接受的组合物。在一个实施例中，癌症为这样一种癌症，其中在此类癌症中，akr1c3还原酶含量较高或高于常见含量。在一个实施例中，癌症为肝癌，且更特定言之为肝细胞癌(hcc)。在一个实施例中，癌症为非小细胞肺癌或黑素瘤。在一个实施例中，癌症为前列腺癌。在一个实施例中，癌症为乳癌。在一个实施例中，癌症为白血病。在一个实施例中，癌症为食道癌。在一个实施例中，癌症为肾癌、胃癌、结肠癌、脑癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、头颈癌、子宫内膜癌、胰脏癌、肉瘤癌或直肠癌。在另一方面中，该方法包含通过使用akr1c3抗体的方法测定癌症的akr1c3还原酶含量，及若该含量等于或大于预定值，则向该患者投与治疗有效量的本文中所提供的化合物或医药学上可接受的组合物。在一个方面中，该方法包含在投与之前，测定自该患者分离的样品中的肿瘤内akr1c3还原酶含量，及若该含量等于或大于预定含量，则选择该患者进行治疗。在一些实施例中，若该含量不超过或小于该预定值，则投与治疗有效量的癌症治疗剂，而非包含投与本文中所提供的化合物或医药学上可接受的组合物的治疗剂。本领域技术人员在阅读本发明后且基于其所知的其他方法将对确定本文中所提供的化合物及组合物的治疗有效量、适当投与模式的方法显而易知。akr1c3含量遵循本领域技术人员熟知的常规方法测量。
附图说明
图1描绘用于在用65/35co2/甲醇洗脱的chiralpakoz-h6×250mm，5um(daicel)手性管柱上通过手性高压液相层析法分离1-(3-(3-n,n-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-n,n'-双(伸乙基)胺基磷酸酯的两种对映异构体的lc层析图。
图2说明与孕酮比较通过醛酮还原酶akr1c3活化th2870。
图3说明肝癌细胞株中的akr1c3表达。
图4说明前列腺癌细胞株中的akr1c3表达。
图5说明各组中的平均体重。
图6说明各组中的肿瘤负荷的典型荧光影像。
图7说明各组中的肿瘤生长曲线。
图8说明各组中的肿瘤负荷的荧光影像。
图9说明不同组中的平均肿瘤重量。
图10说明不同组中的体重变化。
图11说明末梢血液中的肿瘤负荷生长曲线。
图12说明不同组中的终止点处的血液、脾及骨髓中的人类cd45抗体阳性百分比。
实施方式
定义
提供以下定义以辅助读者。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语、符号以及其他科学或医学术语或术语集意欲具有化学及医学领域中的技术人员通常所理解的含义。在一些情况下，为了清楚起见及/或为便于参考，本文中对具有通常所理解的含义的术语进行定义，且本文中纳入该等定义不应解释为表示与此项技术中一般理解的该术语的定义存在相当大差异。
所有数值名称，例如ph、温度、时间、浓度及重量(包括其各自的范围)为通常可适当地以(+)或(-)0.1、1.0或10.0的增量变化的近似值。所有数值名称可理解为在之前加有术语“约”。本文所描述的试剂为示例性的且其等效物可为此项技术中已知的。
除非上下文另外清楚地规定，否则“一种(a/an)”及“该(该等)”包括复数种参考物。因此，举例而言，提及一种化合物是指一或多种化合物或至少一种化合物。因此，术语“一个(种)”、“一或多个(种)”及“至少一个(种)”在本文中可互换地使用。
术语“约(about)”或“大约(approximately)”意味由本领域技术人员测定的可接受特定值误差，其部分视所述值如何测量或测定而定。在某些实施例中，术语“约”或“大约”意味在1、2、3或4个标准偏差内。在某些实施例中，术语“约”或“大约”意味在给定值或范围的50％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％内。
如本文中所使用，术语“包含”欲意味组合物及方法包括所述要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物及方法时，“主要由…组成”应意味排除对于该组合物或方法具有稍许重要意义的其他要素。“由…组成”应意味所主张的组合物及大致方法步骤不包括超过痕量的其他成分要素。由此等过渡术语中的每一者限定的实施例在本发明的范畴内。因此，预期该等方法及组合物可包括额外步骤及组分(包含)，或替代地包括不重要的步骤及组合物(主要由…组成)，或替代地仅预期所陈述的方法步骤或组合物(由…组成)。
“离去基”是指可在本领域熟知的亲核置换条件下经置换的部分。离去基团包括(但不限于)卤基及-oso2-r20，其中r20为视情况经取代的烷基、芳基、环烷基、杂环基或杂芳基。
向患者“投与(administering)”药物或药物向患者“的投与(administrationof)”(及此词组的文法等效物)是指直接投与，此可为由医学专业人员向患者投与或可为自投药；及/或间接投与，此可为开具药物处方的操作。举例而言，指导患者自行投与药物及/或向患者提供药物处方的医师将向患者投与药物。
“癌症”是指可通过侵袭局部扩大且通过转移全身性地扩大来潜在地无限生长的白血病、淋巴瘤、癌瘤及其他恶性肿瘤，包括实体肿瘤。癌症的实例包括(但不限于)肾上腺癌、骨癌、脑癌、乳癌、支气管癌、结肠癌及/或直肠癌、胆囊癌、头颈癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、神经组织癌症、胰脏癌、前列腺癌、副甲状腺癌、皮肤癌、胃癌及甲状腺癌。癌症的某些其他实例包括急性及慢性淋巴细胞及颗粒细胞瘤、腺癌、腺瘤、基底细胞癌、子宫颈异常增生及原位癌、尤文氏肉瘤(ewing'ssarcoma)、表皮样癌、巨细胞瘤、多形性神经胶母细胞瘤、毛细胞肿瘤、肠神经节细胞瘤、增生性角膜神经肿瘤、胰岛细胞癌、卡波西氏肉瘤(kaposi'ssarcoma)、平滑肌瘤、白血病、淋巴瘤、恶性类癌、恶性黑色素瘤、恶性高钙血症、马方氏症体型肿瘤(marfanoidhabitustumor)、髓性癌、转移性皮肤癌、黏膜神经瘤、骨髓瘤、蕈样真菌病、神经母细胞瘤、骨肉瘤、成骨肉瘤及其他肉瘤、卵巢肿瘤、嗜铬细胞瘤、真性红血球过多症、原发性脑肿瘤、小细胞肺肿瘤、溃疡型及乳头型鳞状细胞癌、增生、精原细胞瘤、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾细胞肿瘤、局部皮肤病变、骨网状细胞肉瘤及威尔姆氏肿瘤(wilm'stumor)。
术语“接触(contacting/contact)”意指使治疗剂与细胞或组织在一起，使得作为此类接触的结果而产生生理学及/或化学作用。接触可活体外、离体或活体内进行。在一个实施例中，治疗剂与细胞培养物(活体外)中的细胞接触以测定治疗剂对细胞的作用。在另一实施例中，治疗剂与细胞或组织的接触包括向具有待接触的细胞或组织的个体投与治疗剂。
术语“光学活性”及“对映异构性活性”是指分子的集合，其具有不低于约10％、不低于约20％、不低于约30％、不低于约40％、不低于约50％、不低于约60％、不低于约70％、不低于约80％、不低于约90％、不低于约91％、不低于约92％、不低于约93％、不低于约94％、不低于约95％、不低于约96％、不低于约97％、不低于约98％、不低于约99％、不低于约99.5％、不低于约99.8％或不低于约99.9％的对映异构体过量。在某些实施例中，光学或对映异构性活性化合物的对映异构体过量不低于约90％、不低于约95％、不低于约98％或不低于约99％。
在描述光学活性化合物时，使用前缀r及s来表示分子围绕其手性中心的绝对构型。(+)及(-)用于表示化合物的旋光性，亦即偏光平面由光学活性化合物旋转的方向。(-)前缀指示化合物为左旋性，亦即化合物向左或逆时针旋转偏光平面。(+)前缀指示化合物为右旋性，亦即化合物向右或顺时针旋转偏光平面。然而，旋光性的符号(+)及(-)与分子的绝对构型r及s无关。
术语“光学纯”及“对映异构性纯”是指分子的集合，其具有不低于约80％、不低于约90％、不低于约91％、不低于约92％、不低于约93％、不低于约94％、不低于约95％、不低于约96％、不低于约97％、不低于约98％、不低于约99％、不低于约99.5％、不低于约99.8％或不低于约99.9％的对映异构过量(ee)。在某些实施例中，光学或对映异构性纯化合物的对映异构体过量不低于约90％、不低于约95％、不低于约98％或不低于约99％。化合物的对映异构体过量可由供本领域技术人员使用的任何标准方法判定，该等方法包括(但不限于)使用光学活性固定相的手性层析法(气相层析法、高效液相层析法及薄层层析法)、同位素稀释法、电泳法、量热法、旋光测定法、通过手性衍生作用的nmr分离方法及通过手性溶剂化剂或手性位移试剂的nmr方法。
术语“大体上纯”及“大体上均质”意味足够均质以呈现不含如通过供本领域技术人员使用的标准分析方法所测定的可易于检测的杂质，该等方法包括(但不限于)薄层层析法(tlc)、凝胶电泳、高效液相层析法(hplc)、气相层析法(gc)、核磁共振(nmr)及质谱法(ms)；或足够纯以使得进一步纯化将不会可检测地改变物理属性、化学属性、生物属性及/或药理学属性，诸如物质的酶及生物活性。在某些实施例中，“大体上纯”或“大体上均质”指代分子的集合，其中分子的按重量计至少约50％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、或至少约99.5％为化合物的单一立体异构体，如通过标准分析方法所测定。
术语“同位素变体”是指在组成此类化合物的原子中的一或多者处含有非天然比例的同位素的化合物。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一或多种同位素，包括(但不限于)氢(1h)、氘(2h)、氚(3h)、碳-11(11c)、碳-12(12c)、碳-13(13c)、碳-14(14c)、氮-13(13n)、氮-14(14n)、氮-15(15n)、氧-14(14o)、氧-15(15o)、氧-16(16o)、氧-17(17o)、氧-18(18o)、氟-17(17f)、氟-18(18f)、磷-31(31p)、磷-32(32p)、磷-33(33p)、硫-32(32s)、硫-33(33s)、硫-34(34s)、硫-35(35s)、硫-36(36s)、氯-35(35cl)、氯-36(36cl)、氯-37(37cl)、溴-79(79br)、溴-81(81br)、碘-123(123i)、碘-125(125i)、碘-127(127i)、碘-129(129i)及碘-131(131i)。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”呈稳定形式，亦即非放射性。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一或多种同位素，包括(但不限于)氢(1h)、氘(2h)、碳-12(12c)、碳-13(13c)、氮-14(14n)、氮-15(15n)、氧-16(16o)、氧-17(17o)、氧-18(18o)、氟-17(17f)、磷-31(31p)、硫-32(32s)、硫-33(33s)、硫-34(34s)、硫-36(36s)、氯-35(35cl)、氯-37(37cl)、溴-79(79br)、溴-81(81br)及碘-127(127i)。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”呈不稳定形式，亦即放射性。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一或多种同位素，包括(但不限于)氚(3h)、碳-11(11c)、碳-14(14c)、氮-13(13n)、氧-14(14o)、氧-15(15o)、氟-18(18f)、磷-32(32p)、磷-33(33p)、硫-35(35s)、氯-36(36cl)、碘-123(123i)、碘-125(125i)、碘-129(129i)及碘-131(131i)。应理解，在如本文中提供的化合物中，在根据本领域技术人员的判断为可行时，任何氢可为例如2h，或任何碳可为例如13c，或任何氮可为例如15n，及任何氧可为18o。在某些实施例中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的氘。
词组“其同位素变体；或其医药上可接受的盐、溶剂合物、水合物或前药”具有与词组“其中所提及的化合物的同位素变体；或其中所提及化合物的医药上可接受的盐、溶剂合物或前药或其中所提及化合物的同位素变体”相同的含义。
“患者”与“个体”可互换地使用，以指代需要癌症治疗的哺乳动物。通常，患者为人类。通常，患者为经诊断具有癌症的人类。在某些实施例中，“患者”或“个体”可指代用于筛选、表征及评价药物及疗法的非人类哺乳动物，诸如非人类灵长类动物、犬、猫、兔、猪、小鼠或大鼠。
术语“医药学上可接受的载剂”、“医药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载剂”或“生理学上可接受的赋形剂”是指医药学上可接受的材料、组合物或媒剂，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或囊封材料。在一个实施例中，各组分在与医药调配物的其他成分兼容的意义上为“医药学上可接受的”，且适用于与人类及动物的组织或器官接触而无过度毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或与合理益处/风险比相匹配的其他问题或并发症。参见remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第21版；lippincottwilliams&wilkins:philadelphia,pa.,2005；handbookofpharmaceuticalexcipients，第6版；rowe等人编；thepharmaceuticalpressandtheamericanpharmaceuticalassociation:2009；handbookofpharmaceuticaladditives,第3版；ash及ash编；gowerpublishingcompany:2007；及pharmaceuticalpreformulationandformulation,第2版；gibson编；crcpressllc:bocaraton,fla,2009。
“前药”是指一种化合物，其在投与之后代谢或以其他方式转化为关于至少一种特性的生物活性或更具活性的化合物(或药物)。相对于药物，前药以一定方式经化学修饰，该方式使其相对于药物活性较低或无活性，但化学修饰使得在投与该前药之后，通过代谢或其他生物方法产生相应药物。相对于活性药物，前药可具有改变的代谢稳定性或转运特征、更少副作用或更低毒性，或改良的香味(例如，参见参考文献nogrady,1985,medicinalchemistryabiochemicalapproach,oxforduniversitypress,newyork，第388页至392页，其以引用的方式并入本文中)。前药可使用除相应药物外的反应物合成。
“实体肿瘤”是指包括(但不限于)骨骼、脑、肝、肺、淋巴结、胰脏、前列腺、皮肤及软组织(肉瘤)中的转移性肿瘤的实体肿瘤。
术语“溶剂合物”是指由溶质(例如，本文中所提供的化合物)之一或多个分子及溶剂(其以化学计量或非化学计量的量存在)的一或多个分子形成的复合物或聚集物。适合的溶剂包括(但不限于)水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇及乙酸。在某些实施例中，溶剂为医药学上可接受的。在一个实施例中，复合物或聚集物呈结晶形式。在另一实施例中，复合物或聚集物呈非结晶形式。当溶剂为水时，溶剂合物为水合物。水合物的实例包括(但不限于)半水合物、单水合物、二水合物、三水合物、四水合物及五水合物。
药物的“治疗有效量”是指当投与癌症患者时，经具有预期治疗效果(例如缓解、改善、缓和或消除在患者体内的癌症的一或多种表现)的药物的量。治疗作用在投与一次剂量时未必会发生，且可能仅在投与一系列剂量之后发生。因此，可在一或多次投与中投与治疗有效量。
“治疗”病况或患者、病况或患者“的治疗”或“的疗法”是指采取步骤以获得有益的或所需的结果，包括临床结果。出于本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括(但不限于)癌症的一或多种症状的缓解或改善；疾病程度的减轻；疾病进展的延迟或减缓；疾病病况的改善、缓和或稳定；或其他有益的结果。在一些情况下，癌症的治疗可引起部分反应或稳定疾病。
“肿瘤细胞”是指任何适当物种(例如哺乳动物，诸如鼠类、犬类、猫类、马类或人类)的肿瘤细胞。
描述性实施例
本文中提供式ia及ib的化合物：
或其同位素变体、溶剂合物或水合物。
在另一方面中，本文中提供制备式i化合物的方法：
其包含使式ii化合物
与pocl3及h2nch2ch2l2或其盐接触，以提供式iii化合物，
其中l1及l2分别为离去基，且接着采用式iii化合物以提供式i化合物。
用于合成本文中所提供的化合物的某些方法提供于本文中。本领域技术人员基于对其熟知的合成方法的改编以及其中试剂及反应物的替代将显而易知用于合成该等及其他本文中所提供的化合物的其他方法。参见(例如)hay等人，j.med.chem.2003,46,2456-2466及hu等人，bioorganic&medicinalchemistryletters21(2011)3986-3991。可用于制备本文中所提供的化合物的起始材料为可商购的或可遵循常规方法制备。反应通常在惰性溶剂中进行且必要时进行加热。本领域技术人员将易于理解，某些反应可能需要使用保护基。保护基为本领域技术人员所熟知的且描述(例如)于greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis.peterg.m.wuts及theodoraw.greene，第4版或后续版本，johnwiley&sons,inc.,2007中。反应产物可遵循诸如结晶、沉淀、蒸馏及/或层析法的常规方法进行分离。化合物或中间物的纯度可使用诸如1h-nmr、hplc、tlc及类似的熟知方法确定。
在另一实施例中，本发明关于用于光学分离式i化合物的方法。鉴于本发明的式ia及ib化合物的医药学重要性，使用有效的工业工艺且尤其以较佳产率及通过极佳化学及对映异构体纯度分离式i化合物为必不可少的。
本申请人研发出用于光学分离式i化合物的方法，该方法使得有可能获得具有较佳特征的产率及化学制品及对映异构体纯度的式ia及ib化合物。本发明的方法使得有可能以具有较高生产率的极佳的对映异构体过量及以极佳的产率获得式i化合物的任一对映异构体，同时节省所使用的溶剂。更具体言之，本发明关于用于光学分离式i化合物的方法：
以得到绝对构型(r)及(s)的其对映异构体，分别为式(ia)及(ib)：
其中通过手性层析法将式i化合物的外消旋或富对映异构物的混合物分离成其两种对映异构体，式(ia)的(r)-1-(3-(3-n,n-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-n,n'-双(伸乙基)胺基磷酸酯及式(ib)的(s)-1-(3-(3-n,n-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-n,n'-双(伸乙基)胺基磷酸酯。
光学分离应理解为意指分离外消旋混合物或彼等两种对映异构体的任何混合物的两种对映异构体。
外消旋混合物应理解为意指两种对映异构体依55:45至45:55的比率，较佳地依50:50的比率的混合物。
富对映异构物的混合物应理解为意指两种对映异构体依55:45至90:10之间变化的比率含有显着更多其中一种对映异构体的混合物。
手性层析法应理解为意指可以利用手性固定相及由溶剂或溶剂与气体的混合物组成的流动相来分离混合物的对映异构体的过程。
根据本发明的实施例中之一，用于手性层析法的固定相包含以官能化多糖浸渍的硅胶。
在一个实施例中，用于手性层析法的流动相包含醇及有机气体的混合物。在可用于手性层析法的醇中，可提及(但不意味限于)异丙醇、乙醇及甲醇。在一个实施例中，用于手性层析法的醇为甲醇。
在可用于手性层析法的有机气体中，可提及(但不意味限于)可在高压下使用的有机气体。较佳地使用的有机气体为co2。在一个实施例中，用于手性层析法的流动相包含甲醇及co2的混合物。在本发明的一个实施例中，用于手性层析法的流动相包含比率自50:50至2:98变化的甲醇及co2的混合物。
在本发明的一个实施例中，再循环用于手性层析法的流动相。在本发明的一个实施例中，在15℃至40℃(包含端点)的温度下进行手性层析法。在本发明的一个实施例中，对式(i)的1:1的外消旋混合物进行光学分离。在本发明的实施例中之一中，使用1-(3-(3-n,n-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-n,n'-双(伸乙基)胺基磷酸酯的(r)-对映异构体。根据本发明的实施例中之一，使用1-(3-(3-n,n-二甲基胺基羰基)苯氧基-4-硝苯基)-1-乙基-n,n'-双(伸乙基)胺基磷酸酯的(s)-对映异构体。
根据本发明的一个实施例，使用连续性多管柱分离方法。
根据本发明的另一实施例，使用模拟移动床层析法方法。模拟移动床层析法应理解为意指连续性层析法，该方法使得有可能模拟固定相在与流动相的移动的相反方向上移动。此方法使得有可能分离难以或不可能通过常规的层析法技术分离的化合物。当使用手性固定相时，此方法尤其适用于分离对映异构体。使用模拟移动床层析法使得有可能进行具有较高生产率的对映异构体的混合物的连续性分离，同时减少与非连续性层析法相比较所使用的固定及流动相的量。
所使用的缩写清单
dmf：二甲基甲酰胺
tea：三乙胺
rt：室温
ipm：异磷酰胺氮芥
thf：四氢呋喃
diad：偶氮二甲酸二异丙酯
下文中的实例说明本发明。
实例
实例1.化合物th2870的制备
如下文所描述合成化合物2至6。
a.化合物3的合成：
在具有dmf(3滴)的socl2(10ml)中回流化合物1(3g，16.2mmol)3h且接着在真空下移除socl2。用甲苯(5ml)稀释残余物且不将其经进一步纯化即用于后续步骤。
在rt下搅拌mgcl2(930mg，9.8mmol)、tea(4.7ml，33.4mmol)及丙二酸二甲酯(1.9ml，16.6mmol)1.5h，继而添加上文所提及的化合物2的甲苯溶液。在rt下再搅拌所得混合物1.5h，接着所添加浓hcl(4ml)且搅拌5分钟。用etoac(30ml×3)萃取混合物，干燥(na2so4)，过滤且在减压下浓缩。向残余物添加6nhcl(30ml)且将混合物回流隔夜。用etoac(30ml×3)萃取混合物，干燥(na2so4)，过滤且在减压下浓缩。经由fcc(硅胶，etoac/己烷)纯化残余物以得到呈淡黄色固体状的化合物3(1.9g，63％产率)。
1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.16(d,j＝8.0hz,1h)、7.86(t,d＝9.2hz,2h)、2.68(s,3h)ppm。
b.化合物4的合成
在-10℃下向化合物3(1.9g，10.4mmol)于meoh(20ml)中的混合物逐份添加nabh4(418mg，11mmol)。在-10℃与0℃之间搅拌混合物20分钟，用etoac(300ml)稀释，用饱和nh4cl水性溶液、盐水洗涤，干燥(na2so4)。过滤且在减压下浓缩。经由fcc(硅胶，etoac/己烷)纯化残余物以得到呈淡黄色油状的化合物4(1.44g，75％产率)。
1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.06(t,j＝8.4hz,1h)、7.35(d,j＝11.6hz,1h)、7.30(d,j＝11.6hz,1h)、5.01-4.99(m,1h)、1.52(d,j＝6.4hz,3h)ppm。
c.化合物5的合成
在0℃下向化合物4(1.44g，7.78mmol)、br-ipm(2.88g，9.34mmol)、pph3(3.06g，11.67mmol)于thf(60ml)中的混合物添加diad(2.34g，11.67mmol)。在0℃下搅拌混合物1.5h，在减压下浓缩且经由fcc(硅胶，etoac/己烷)纯化以得到呈淡黄色油状的化合物5(1.0g，27％产率)。
1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.09(t,j＝8.0hz,1h)、8.31(dd,j＝2.4,13.6hz,2h)、5.52-5.60(m,1h)、3.54-3.19(m,8h)、1.63(d,j＝6.4hz,3h)ppm。
d.化合物6的合成
在65℃下搅拌化合物5(1g，2.1mmol)及ag2o(3g)于thf(50ml)中的混合物3h。过滤且在减压下浓缩。经由fcc(硅胶，丙酮/己烷)纯化残余物以得到呈黄色固体状的化合物6(0.6g，90％产率)。
1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.08(t,j＝8.0hz,1h)、7.36(d,j＝11.6hz,1h)、7.31(d,j＝8.4hz,1h)、5.70-5.67(m,1h)、2.25-2.08(m,8h)、1.64(d,j＝6.4hz,3h)ppm。
e.化合物7的制备
化合物7-2的制备
在0℃下逐滴向化合物7-1(150g，1.08mol)于吡啶(700ml)中的溶液添加ac2o(562ml，1.5eq)，在室温下搅拌6小时。蒸发，倒入冰水中，过滤后，干燥滤饼以得到呈白色固体状的化合物7-2(150g，74％产率)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)：δppm8.00～7.98(d,j＝7.6hz,1h)、8.03(s,1h)、7.83(s,1h)、7.51～7.47(t,j＝8.0hz,1h)、7.36～7.34(dd,j＝8.0hz1.2hz,1h)、2.34(s,3h)。
化合物7-3的制备
向化合物7-2(150g，833mmol)于dcm(1500ml)中的溶液添加dmf(15ml)，冷却至0℃，继而添加草酰氯(225ml，2.50mol)，在室温下搅拌4小时。蒸发后，将残余物溶解于dcm(1000ml)中，冷却至0℃，继而添加二甲胺于thf(900ml，1.8mol)中的2m溶液，在室温下搅拌20小时。用h2o(1500ml)淬灭，用dcm(2000ml×3)萃取，蒸发以得到呈淡黄色液态的粗化合物7-3(137g，80％产率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)：δppm7.43～7.39(t,j＝8.0hz,1h)、7.29～7.28(d,j＝7.6hz,1h)、7.17～7.13(m,2h)、3.00(s,6h),2.32(s,3h)。
化合物7的制备
向化合物7-3(137g，661mmol)于meoh(1000ml)中的溶液添加k2co3(276g，2mol)，在室温下搅拌5小时。过滤后，蒸发滤过物。将残余物溶解于h2o(1000ml)中，用4nhcl将其酸化至ph6.0，过滤后，干燥滤饼以得到呈白色固体状的化合物7(60g，55％产率)。
1hnmr(400mhz,cdcl3)：δppm8.25(s,1h)、7.19～7.15(d,j＝8.0hz,1h)、6.96～6.95(t,j＝2.0hz,1h)、6.84～6.81(s,2h)、3.11(s,3h)、2.96(s,3h)。
f.th2870的合成
在0℃下向化合物7于dmf(60ml)中的混合物逐份添加nah(60％，0.508g，12.7mmol)。在0℃下搅拌混合物0.5h，随后添加化合物6(2g，6.35mmol)且接着在0℃下搅拌2.5h。用etoac(500ml)稀释混合物，用盐水(50ml×3)洗涤，经na2so4干燥，过滤，在减压下浓缩且经由fcc(硅胶，丙酮/己烷)纯化以得到呈黄色油状物的th2870。
th2870的最终纯化：
经由半制备型hplc(c18管柱，乙腈/水)纯化如上文所提及的th2870。在减压下浓缩经合并集合以得到作为最终产物的淡黄色油状物。将乙腈添加至作为共沸剂的蒸发物以移除水。
1hnmr(400mhz,cdcl3)：δppm7.98～7.96(d,j＝8.4hz,1h)、7.43～7.39(m,1h)、7.27～7.21(m,2h)、7.10～7.06(m,3h)、5.62～5.55(m,1h)、3.09(s,3h)、2.97(s,3h)、2.19～2.00(m,8h)、1.58～1.57(d,j＝6.4hz,3h)。ms：m/z460.8[m+1]+。plc：254nm：94.8％。
实例2.化合物th2870的替代性制备。
a.化合物3的制备
在具有dmf(10ml)的socl2(700ml)中回流化合物1(200g，1.08mol)3小时且接着在真空下移除socl2。用甲苯(400ml)稀释残余物且不将其经进一步纯化即用于后续步骤。
在rt下搅拌mgcl2(103g，1.08mol)、tea(500ml，3.60mol)及丙二酸二甲酯(145g，1.1mol)的混合物1.5小时，随后逐滴添加上文所提及的化合物2的甲苯溶液。在rt下再搅拌所得混合物1.5小时。用h2o(2l)洗涤，用etoac(2l×5)萃取，蒸发后，添加4nhcl直至ph6.0且搅拌5分钟。用etoac(2l×5)萃取混合物，蒸发。
向残余物添加6nhcl(1500ml)且将混合物回流隔夜。
用etoac(2l×5)萃取混合物，浓缩，通过硅胶管柱(石油醚：etoac＝20:1)纯化以得到呈黄色固体状的化合物3(80g，41％产率)。
b.化合物4的制备
在-10℃下向化合物3(150g，824mol)于meoh(2l)中的混合物逐份添加nabh4(31.2g，824mmol)。在-10℃与0℃之间搅拌混合物20分钟，用etoac(5l)稀释，用饱和nh4cl水性溶液、盐水洗涤，经na2so4干燥，浓缩。通过硅胶管柱(石油醚：etoac＝5:1)纯化残余物以得到呈黄色油状物的化合物4(90g，60％产率)。
c.化合物5的制备
向pocl3(2ml，21.6mmol)于dcm(20ml)中的溶液添加化合物4(2g，10.8mmol)，接着在-40℃，在n2下添加含tea(3.6ml，27mmol)的dcm(10ml)，在-40℃下搅拌5小时。接着添加2-溴乙胺氢溴酸盐(17.6g，86.8mmol)，在-40℃下将含tea(12ml，86.8mmol)的dcm(40ml)缓慢添加至上述溶液中，搅拌0.5h。添加k2co3(10％，10.4g，100ml)，在室温下搅拌5分钟。用dcm(300ml×3)萃取，蒸发，通过硅胶管柱(etoac)纯化以得到呈黄色油状物的化合物5(2.3g，43％产率)。
d.化合物6的制备
在65℃下搅拌化合物5(4g，8.42mmol)及ag2o(5.85g，25.26mmol)于thf(40ml)中的混合物3小时，过滤及浓缩。通过硅胶管柱(etoac)纯化残余物以得到呈黄色油状物的化合物6(2.3g，87％产率)。
e.化合物th2870的制备
在0℃下向化合物7(1.81g，10.95mmol)于dmf(10ml)中的溶液添加nah(60％，438mg，1095mmol)，搅拌10分钟，接着添加含化合物6(2.3g，7.3mol)的dmf(10ml)，在0℃下搅拌30分钟。
用h2o淬灭，用etoac(100ml×5)萃取，用h2o(150ml)、盐水洗涤，蒸发，通过硅胶管柱(dcm：meoh＝40:1)纯化以得到呈黄色油状物的化合物th2870(2.3g，69％产率)。
实例3.通过制备型手性层析法分离th2870的对映异构体
将983mg的式(i)化合物溶解于36ml的甲醇中，在35℃至40℃的管柱温度下以3.0ml/min的流速及120巴的背压将1ml注入至sfc-80methodstation(thar,waters)中的chiralpakoz-h4.6×250mm，5μm(daicel)上，且在co2/甲醇(65-60/35-40)的混合物中以该流速洗脱。以86.5％的产率及100％的对映异构体纯度获得式(ia)(构型(r))的对映异构体。以83.8％的产率及100％的对映异构体纯度获得式(ib)(构型(s))的对映异构体。图1展示在通过lcms手性分离之后的th2870对映异构体1(th3423)及th2870对映异构体2(th3424或ast106)的纯度检查。
th3423及3424的手性合成
化合物2
在具有dmf(2.5ml)的socl2(150ml)中回流化合物1(65g)5h以获得澄清溶液且接着在真空下移除socl2。用甲苯(30ml)稀释残余物且再次移除溶剂。将残余物不经进一步纯化即用于后续步骤。
化合物3
在rt下用机械搅拌来搅拌mgcl2(21.0g，221mmol)、tea(100.0ml，717mmol)及丙二酸二甲酯(41.0ml，359mmol)的混合物2小时，随后添加含化合物2的thf(80ml)。在rt下搅拌所得混合物4小时，随后添加浓hcl(90ml)且搅拌30分钟。用etoac(300ml×3)萃取混合物，在减压下浓缩。向残余物添加6nhcl(300ml)且将混合物回流隔夜。用etoac(300ml×3)萃取混合物，用nahco3(aq.)洗涤有机层且干燥(na2so4)，过滤并在减压下浓缩。通过acoet/hex＝1/3(v/v)再结晶残余物以得到呈淡黄色固体状的化合物3(46g)。1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.16(d,1h)、7.86(t,2h)、2.68(s,3h)。
化合物5：
在氩气下，于0℃下将bh3.thf(1m，11ml)添加至化合物4于1m甲苯(3ml，3mmol)中的溶液中。将溶液搅拌30min，接着冷却至-40℃。在-40℃下，历经4小时缓慢添加化合物3(1.83g，10mmol)于thf(40ml)中的溶液。在-40℃下搅拌系统2小时(tlc展示sm消失)。在-40℃下将meoh(20ml)添加至上述溶液中且搅拌该溶液30min。在rt下移除溶剂之后，通过管柱(hex/acoet＝3/1(v/v))纯化残余物以获得化合物5(1.6g)。
1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.05(t,1h)、7.34(d,1h)、7.27(d,1h)、4.99(m,1h)、1.51(d,3h)。
化合物6
在氩气下，于-40℃下向pocl3(1.6ml，17.25mmol)于的dcm(10ml)的溶液中添加化合物5(1.6g，8.65mmol)，接着添加含tea(2.9ml，22.9mmol)的10mldcm。在-40℃下搅拌混合物6小时且接着添加2-溴乙胺氢溴酸盐(14.2g，69.3mmol)，逐滴加入含tea(9.6ml)的dcm(10ml)。将反应混合物自-40℃搅拌至室温隔夜。添加k2co3(8.3g于80ml水中)且搅拌混合物5min。用dcm萃取混合物，经na2so4干燥。过滤、浓缩且接着进行硅胶快速层析法(用丙酮/己烷＝0％至100％洗脱)以得到呈黄色油状物的化合物6(2.68g，产率：65％)。
1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.08(t,1h)、7.32(d,1h)、7.29(d,1h)、5.56(m,1h)、3.34-3.56(m,2h)、3.32-3.42(m,4h)、3.08-3.26(m,4h)、1.62(d,3h)。31pnmr：14.44。
替代地，可通过下列程序合成th3424：
在氮气下将甲苯(11ml/g)添加至四个玻璃颈瓶中。开始搅动，在氮气下将pocl3添加(1.025eq)至容器1。将容器1的内容物冷却至-2℃至2℃。添加(1.0eq)化合物1的溶液且在-2℃至2℃下逐滴加入含tea(1.435eq)的甲苯(11ml/g)。在-2℃至2℃下搅动容器1的内容物1小时至2小时。取样内容物供hplc分析以得信息。将2-溴乙胺氢溴酸盐(3eq)添加至容器1中。在-2℃至2℃下将tea(6eq)逐滴添加至容器1中。在0℃至rt下搅动容器1的内容物隔夜。取样内容物以供hplc分析。处理程序如下：将h2o(19ml/g)添加至容器1中且搅拌5min至10min。用ea(19ml/g)萃取混合物三次。有机相经无水na2so4干燥且过滤。在40℃至50℃浓缩母液。通过硅胶的层析法纯化粗产物以获得纯化产物。
替代地，可藉由下列程序合成th3424：
在氮气下将甲苯(11ml/g)添加至四个玻璃颈瓶中。开始搅动且在氮气下将化合物1(1.0eq)及tea(1.435eq)添加至容器1中。将容器1的内容物冷却至-2℃至2℃。在-2℃至2℃下，在氮气下将pocl3(1.025eq)逐滴添加至容器1中。在-2℃至2℃下搅动容器1的内容物1小时至2小时。取样内容物供hplc分析以得信息。将2-溴乙胺氢溴酸盐(3eq)添加至容器1中。在-2℃至2℃下将tea(6eq)逐滴添加至容器1中。在0℃至rt下搅动容器1的内容物隔夜。取样内容物以供hplc分析。处理程序与上述相同。
替代地，可藉由下列程序合成th3424：
在氮气下将dcm(2.2ml/g)及pocl3(1.91eq)添加至四个玻璃颈瓶中。开始搅动且在氮气下将容器1的内容物冷却至-35℃至-40℃。在-35℃至-40℃下，在氮气下将化合物1(1.0eq)/dcm(4.5g/ml)溶液逐滴添加至容器1中。在-35℃至-40℃下，在氮气下将tea(4.0eq)/dcm(4.5g/ml)溶液逐滴添加至容器1中。在-35℃至-40℃下搅动容器1的内容物4小时至6小时。取样内容物供hplc分析以得信息。在-30℃至-40℃下将2-溴乙胺氢溴酸盐(8eq)添加至容器1中。在-30℃至-40℃下将tea(12eq)逐滴添加至容器1中。在-30℃至-40℃下搅动容器1的内容物1h至2h。取样内容物以供hplc分析。处理程序：将h2o(15ml/g)添加至容器1中并搅拌5min至10min。用dcm(12.5ml/g)萃取水相一次。有机相经无水na2so4干燥且过滤。在20℃至30℃下浓缩滤过物。通过层析法纯化粗产物以获得纯化产物。
化合物7
在55℃下搅拌化合物6(2.68g)、ag2o(3.92g)于thf(30ml)中的混合物隔夜。在于真空下移除溶剂之后，通过硅胶快速层析法分离残余物以得到化合物7的浅色液体1.0g。
1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.05(t,1h)、7.34(d,1h)、7.29(d,1h)、5.66(m,1h)、2.02-2.24(m,8h)、1.61(d,3h)。31pnmr：31.55。
th3424(th2870对映异构体2)
在室温下搅拌化合物7(1.0g)、化合物8(785mg)、k2co3(880mg)于dmf(8ml)中的混合物隔夜。用水稀释混合物，用dcm萃取，经na2so4干燥。过滤，浓缩且接着进行快速层析法以得到呈黄色油状物的化合物9(1.1g)。
1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：7.97(d,1h)、7.41(t,1h)、718-7.27(m,4h)、7.02-7.12(m,3h)、5.59(m,1h)、3.08(s,3h)、2.97(s,3h)、2.01-2.21(m,8h)、1.66(d,3h)。31pnmr：31.27。
化合物11
与化合物5的程序相同。使用化合物8代替化合物3。产率：50％。
1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.05(t,1h)、7.34(dd,1h)、7.27(d,1h)、4.99(m,1h)、1.51(d,3h)。
化合物12
与化合物6的程序相同(产率：35％)。
1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.08(t,1h)、7.32(d,1h)、7.29(d,1h)、5.56(m,1h)、3.34-3.56(m,2h)、3.32-3.42(m,4h)、3.08-3.26(m,4h)、1.62(d,3h)。31pnmr：14.47。
化合物13
与化合物7的程序相同(产率：36％)。1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：8.06(t,1h)、7.34(d,1h)、7.30(d,1h)、5.67(m,1h)、2.02-2.25(m,8h)、1.62(d,3h)。31pnmr：31.56。
th3423(th2870对映异构体1)
与化合物9的程序相同(产率：68％)。1hnmr(cdcl3,400mhz)δ：7.97(d,1h)、7.41(t,1h)、718-7.27(m,4h)、7.02-7.12(m,3h)、5.59(m,1h)、3.08(s,3h)、2.97(s,3h)、2.01-2.21(m,8h)、1.66(d,3h)。31pnmr：31.25。
实例4.活体外人类肿瘤细胞株细胞毒性分析
关于h460非细胞肺癌人类肿瘤细胞株的活体外增殖数据报导于以上化合物图表中。ic50数值以微摩尔为单位报导且由以下引起：将化合物暴露于各种浓度2小时，随后进行洗涤步骤且添加新鲜培养基，随后生长及细胞活力染色且与仅培养基处理的对照比较。
特定言之，将按指数规律生长的细胞以4×103个细胞/孔的密度接种于96孔培养盘中且以37℃、5％co2、95％空气及100％相对湿度培育24小时，随后添加测试化合物。将化合物以200倍所需最终测试浓度溶解于100％dmso中。在添加药物时，用完全培养基将化合物进一步稀释至4倍所需最终浓度。将50μl指定浓度的化合物的等分试样添加至已含有150μl培养基的微量滴定孔中，产生所报导的最终药物浓度。在添加药物之后，以37℃、5％co2、95％空气及100％相对湿度将培养盘再培育2小时，随后洗去药物且添加新鲜培养基，且以37℃、5％co2、95％空气及100％相对湿度中将培养盘再培育70小时。此培育结束时，使用阿尔玛蓝分析法(alamarblueassay)对活细胞进行定量。使用prism软件(irvine，ca)计算导致50％(ic50)的生长抑制的药物浓度，且结果列于表中。
其对h460肺癌细胞的抗增殖功效亦列表如下。
以上h460数据表明显着抗肿瘤效果，且各种化合物在低至较低纳摩尔浓度量下仅2小时暴露时具有抑制作用。
实例5.通过醛酮还原酶akr1c3活化th2870
用含有2mmnadph的磷酸盐缓冲生理食盐水(pbs)，ph7.4(37℃)将重组型人类akr1c3稀释至25μg/ml。将含th2870或孕酮(阳性对照)的30％甲醇/70％水以5μm的最终浓度添加至反应混合物中且在37℃下培育120分钟。在达到120min的各个不同时间点采集50μl的反应混合物，且添加含有作为内标的普萘洛尔(propranolol)的200μl乙腈，涡流混合及离心10min。将所得上清液(5μl)注入至lc/ms/ms中以供定量th2870及孕酮的残留％。以一式两份测试化合物。
图2中的数据显示在akr1c3的存在下th2870的快速消失，而已知底物孕酮则缓慢地减少。含有nadph但无酶的缓冲剂对照组显示不与任一化合物反应(资料未示出)。
实例6.活体外人类肿瘤细胞株细胞毒性分析
亦使用如下材料及程序在不同癌细胞株中测试th2870、th3423及th3424。使用10*溶胞物缓冲液(cellsignalingtechnology，目录号9803)；用于哺乳动物组织的蛋白酶抑制剂混合物(sigma，目录号p8340)；用于丝氨酸/苏氨酸磷酸酶及碱性磷酸酶的l-同工酶的磷酸酶抑制剂混合物(sigma，目录号p0044)；用于酪氨酸蛋白质磷酸酶、酸及碱性磷酸酶的磷酸酶抑制剂混合物(sigma，目录号p5726)；bca套组(thermo，目录号23225)；初级抗体，小鼠单克隆akr1c3抗体(纯系np6.g6.a6；sigma-aldrich)；初级抗体，α-微管蛋白(纯系b-5-1-2；sigma-aldrich)；二级抗体，山羊抗小鼠igghrp结合物(a4416；sigma-aldrich)。细胞在良好条件下传代两代且经消解。在6cm细胞培养皿中接种合适数量的细胞，并在37℃、5％co2下培育隔夜。当细胞生长至80％密度时，自培育箱取出培养皿。抽吸培养基，用冰冷的pbs洗涤两次，且移除残余pbs。添加合适体积的冰冷的1*溶胞物且在冰上培育10分钟。将溶胞物转移至于冰中冷却的微量离心试管中，在4℃，12,000rpm下离心15分钟。将上清液转移至另一微量离心管中。通过10*溶胞物稀释溶胞物，且添加用于哺乳动物组织的蛋白酶抑制剂混合物(sigma，#p8340)、用于丝氨酸/苏氨酸磷酸酶及碱性磷酸酶的l-同工酶的磷酸酶抑制剂混合物、用于酪氨酸蛋白质磷酸酶、酸及碱性磷酸酶的磷酸酶抑制剂混合物。将用于蛋白质定量的bca蛋白质定量套组与1*溶胞物一起使用以将溶胞物稀释至相同浓度。对5*sds加样缓冲液添加相应样品，加热至85℃保持10分钟，且短暂离心。样品在-20℃下保存或直接地用于蛋白质电泳。彼等样品根据标准实践进行电泳，转印至膜上，根据制造商的说明书依序施加初级抗体及二级抗体。使用奥德赛(odyssey)红外镭射成像系统扫描信号。
结果展示于以下图3及图4中且列于下表中：
表：在肝癌、前列腺癌、食道癌及白血病细胞株中th2870、th3423及th3424的敏感度
实例7.活体内人类肿瘤异种移植模型及抗肿瘤活性
利用非小细胞肺h460、非小细胞肺a549及黑素瘤a375模型的三个人类异种移植抗肿瘤模型用于显示本文所提供的化合物的功效。
使用特定无病原体同型接合雌性裸小鼠(nu/nu，charlesriverlaboratories)。任意给与小鼠食物及水且圈养在微小隔离盒笼具中。在实验时通过微芯片(locustechnology，manchester,md,usa)识别四至六周龄动物。所有动物研究是经thresholdpharmaceuticals,inc的机构动物护理及使用委员会批准(institutionalanimalcareandusecommittee)。
所有细胞株来自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(atcc,rockville,md,usa)。在具有10％胎牛血清的经推荐的培养基中培养细胞且在37℃下维持在5％co2潮湿环境中。
将细胞与基质胶(30％于h460中)混合且每一小鼠0.2ml皮下植入至动物的侧腹领域。当肿瘤大小达到100mm3至150mm3时，将小鼠随机分入至具有10只小鼠/群组的实验或媒剂群组且开始治疗(第1天)。在含5％dmso的d5w中调配经测试化合物。通过ip给与所有化合物，qdx5/周(5天给与，2天不给与)作为一个周期，持续总共2个周期。一周两次测量肿瘤生长及体重。根据(长度×宽度2)/2计算肿瘤体积。将药物功效评定为肿瘤生长抑制(tgi)及肿瘤生长延迟(tgd)。tgi经定义为(1-δt/δc)×100，其中δt/δc呈现在治疗组及对照组的平均(或中间，若组内的变化相对地较大)肿瘤体积中变化的比率。tgd经计算为用于治疗肿瘤以达到与对照组相比的500mm3的额外天数。当组中的单一肿瘤大小达到2000mm3或平均肿瘤体积超出1000mm3时剔除动物。数据表示为平均值±sem。通过杜奈特(dunnett)比较后测试(graphpadprism4)的单因子变异数分析或双尾斯图登氏t检验以供分析。将p值<0.05视为在统计上显着的。
实例8.活体内功效结果：
此研究采用a375黑素瘤人类肿瘤异种移植模型且将本文所提供的化合物与塞替派及经批准的抗黑素瘤药物凯素(abraxane)比较。抗肿瘤效果及投药的安全性在下文以图解说明。mpk是指mg/kg。
综合而言，此等研究显示相对于标准化学治疗剂的3个不同肿瘤细胞株中的显着抗肿瘤功效。
实例9.人类肝癌的小鼠模型中的th3424
雌性无胸腺裸小鼠(6周龄)用于此研究。动物购自beijinghfkbioscience,co.,ltd且维持在高效粒子空气过滤器(highefficiencyparticulateairfilter，hepa)过滤的环境中，其中通过照射或高压处理将笼具、食物及垫料除菌。总共32只裸小鼠用于该研究。将hepg2-gfp人类肝细胞癌细胞(anticancer,inc.,sandiego,ca)与含有10％fbs的rpmi-1640(gibco-brl,lifetechnologies,inc.)一起培育。在保持37℃及5％co2/95％空气氛围的co2水夹套培育箱(formascientific)中培养细胞。通过锥虫蓝排除分析法测定细胞活力。五只雌性无胸腺裸小鼠皮下注射有单次剂量的5×106hepg2-gfp细胞。当其大小达到1cm3采集肿瘤并将肿瘤组织切割成1mm3的较小碎片。四十只雌性裸小鼠正位地植入有单片的肿瘤片段，该肿瘤片段是自hepg2-gfp人类肝细胞癌的皮下肿瘤模型导出。通过soi(手术原位植入)将肿瘤组织正位地植入于各小鼠中的肝的右叶中。简言之，在麻醉下进行1cm的上部腹切开。暴露肝额右叶且通过剪刀机械地使肝表面的一部分受伤。接着将一片肿瘤片段固定在肝组织内，使肝返回至腹膜空腔并最后闭合腹壁。在特定无病原体条件下使小鼠保持在层状流动柜中。
当所植入肿瘤达到约1mm2的平均大小时，在肿瘤植入的三天之后开始治疗。将32只负载肿瘤小鼠任意划分成每组8只小鼠的四个实验组。清楚地标记用于其组的各笼子，其中每笼四只小鼠。各小鼠具有用于辨识的耳标。下表展示该研究设计。表.组及治疗方案
注意：治疗在肿瘤植入3天后开始。
在该研究周期期间，每天一次检查所有实验小鼠死亡率或发病迹象。观测动物直至肿瘤植入后的第38天。在该研究周期期间每周两次测量小鼠的体重。通过fluorvivo成像系统，模型300/mag(美国，ca，indec)在该研究周期期间一周两次获得肿瘤生长及发展的影像。通过注射剂量内的戊巴比妥钠在肿瘤植入后的第38天将所有实验动物安乐死。暴露肝以获得影像，在此之后移除肿瘤且通过电子天平(德国，sartoriusbs124s)称重。将肿瘤组织保持在福尔马林中以供进一步分析。使用α＝0.05的斯图登氏t检验(双面)分析不同组中的体重及肿瘤负荷的比较。在经静脉内注射测试试剂之后，小鼠并未倒下，自主活动未减少。实验动物通常情况较佳。各组中的体重变化展示于图5及下表中。
表.研究结束时平均小鼠体重的比较
如图5及在上表中所展示，在研究的第35天，各组中的小鼠的平均体重增加了21％至41％。在th2870-2组及阴性对照组中不存在统计学上显着的差异。此表明通过腹膜内投与较低或较高剂量的th2870-2对实验小鼠无显而易见的急性毒性。然而，在索拉非尼治疗组中，平均体重在统计学上显着低于阴性对照群组。其表明通过投与经测试剂量下的索拉非尼对实验小鼠存在某一程度的毒性。
各组中的肿瘤进展。
通过实时成像监测不同组中的原位hepg2-gfp肝细胞癌的进展。一周两次获得影像。使用powerstation软件(indecbiosystems,ca,usa)分析的自肿瘤荧光的信号导出的各组中的在结束时的典型的肿瘤影像及肿瘤生长曲线分别地展示于图6及图7中。
表.各组中的平均肿瘤大小(mm2)
如图6、图7及上表中所展示，阳性对照组中的平均肿瘤大小比阴性对照组中的小约39％，但在该2个控件组之间不存在统计学上显着的差异(p＝0.0577)。
在th3424(2.5mg/kg)组及th3424(5mg/kg)中，平均荧光成像读取面积明显地显着小于阴性对照组中的平均荧光成像读取面积，其展示较强抑制性效应及显而易见的剂量-效果关系。其中，荧光成像读取面积在th3424(5mg/kg)组中为0。在此组中，在3个周期的治疗之后停止给药，肿瘤荧光成像读取仍然为0直到实验结束。然而，在th3424(2.5mg/kg)组中，在3个周期治疗的1周之后停止药物投与且接着重新开始另外3个周期的治疗。第35天的平均荧光成像读取面积为1.2±1.1，其约为阴性对照组中的8％且其为在第49天治疗后的阴性对照组中的2.0±2.2(约8％)。图8展示在研究结束时的所有肿瘤且图9展示实验组中的每一者中的肿瘤重量的平均值。
表.各组中的平均肿瘤重量
如图8、图9及在上表中所示，阳性对照组的平均肿瘤权数小于阴性对照组的平均肿瘤权数(p＝0.0159)，其展示阳性对照药物(索拉非尼)对经测试剂量下的原位hepg2-gfp人类肝细胞癌小鼠模型具有抑制性效果。
th3424(2.5mg/kg)及th3424(5mg/kg)的组中的平均肿瘤重量分别为0.0081g及0g。所有平均肿瘤重量在统计学上显着小于阴性对照组中的平均肿瘤重量。其中，平均重量在较高剂量组中为0g，且其在较低剂量组中仅为0.0081±0.0088g，其在阴性对照组中分别为0％及5.2％。此表明th3424在经测试剂量下对原位hepg2-gfp人类肝细胞癌小鼠模型具有非常强抑制性效果且其亦展示明显的剂量-效果关系。
根据下式基于最终平均肿瘤重量计算肿瘤ir：
ir(％)＝(1-治疗组(t)/对照组(c)×100
用于各治疗组的ir：
ir(％)＝(1-pc/nc)×100＝(1-0.0637/0.1543)×100≈58.7％
ir(％)＝(1-th2870-2lt/nc)×100＝(1-0.0081/0.1543)×100≈94.8％
ir(％)＝(1-th2870-2ht/nc)×100＝(1-0.0000/0.1543)×100≈100％
注意：
nc表示阴性对照组
pc阳性对照组
肿瘤抑制速率在索拉非尼治疗组中为58.7％(相对于控件组p＝0.0159)，其展示在经测试剂量下对原位hepg2-gfp人类肝细胞癌小鼠模型的较强抑制性效果。然而，在此组中，实验小鼠的平均体重在统计学上显着低于阴性对照组中的平均体重。其表明通过投与经测试剂量下的索拉非尼对实验小鼠存在某一程度的毒性。th3424(2.5mg/kg)及th3424(5mg/kg)的肿瘤抑制率分别为94.8％及100％，其展示对原位hepg2-gfp人类肝细胞癌小鼠模型的非常强的肿瘤抑制性效果及明显的剂量-效果关系。在th3424的经测试剂量下对实验小鼠并不存在显而易见的毒性。
实例10.t细胞白血病动物模型中的th3424
通过自ln2(约2至3小瓶)解冻出约150×106个al7473细胞且快速地将其置放至37℃水浴中来制备白血病细胞。将所有细胞转移至具有40ml预温热完全介质的50ml法尔康试管中。以1200rpm离心细胞5min。用40mlrpmi1640再悬浮细胞。接着计数细胞。以1200rpm离心细胞5min且用冰冷的pbs再悬浮至每100ulpbs2百万细胞。上文所制备的含有2×106细胞的100ul生理食盐水用于通过iv注入至各小鼠中。在实验周期期间通过将样品转移至facs试管中针对血液每周进行facs分析，将人类cd45fitc及同种型添加至用于所有样品的相应试管中并在暗处在冰上培育细胞30min。将2ml的红血球裂解缓冲剂添加至各试管中并在暗处在冰上再培育30min。在此程序期间将所有样品涡流多次并在4℃下以1500rpm离心样品5min。舍弃上清液并将2ml的冰冷洗涤缓冲剂添加至试管中。在4℃下以1500rpm离心样品5min并重复此等步骤。将细胞再悬浮至150μl的洗涤缓冲剂/pbs中以供facs收购。通过使用细胞探索(cellquest)或flowjo在bdcalibur上分析样品并通过使用棱镜5.0分析结果。
在细胞接种预分组后第26天、第33天、第42天收集用于facs的血液样本。在分组样品之后，每周进行facs直到成研究(细胞接种后第50天、第57天、第64天)。针对各小鼠收集10μl血浆样品且在细胞接种后第57天自各组(第1组：#7、#43、#52；第2组：#11、#15、#23；第3组：#5、#9、#48；第4组：#25、#28、#36)进行3次血液抹片。样品清单概括于以下。
表：在终止点处为所有动物取样。
小鼠中的体重变化的结果展示于图10中。自在细胞接种后第43天开始治疗后，每周收集末梢血液以获得在治疗期间检测到的人类cd45抗体facs。在细胞接种后第43天、第50天、第57天及第64天(仅对第1组及第2组给药)分别地给药小鼠。分组之后的肿瘤负荷生长曲线展示于图11中。各组的末梢血液中的人类cd45+白血病细胞的百分比随着疾病发展而增加，且在除第2组外的第一给药之后7天百分比曲线下降(p>0.05)。在第二次给药之后，治疗组(第2组至第4组)显着地低于媒剂群组(第1组)(p<0.001)。在第四次给药后第6天处死所有小鼠(总共4组，每组中10只小鼠)。收集所有小鼠的血液、脾及骨髓以用于检测人类cd45facs。收集各组中的3只小鼠的脾及骨以供ffpe。终止点处的细节数据及样品列表概括于附件10.3中。研究终止点处的小鼠的末梢血液、脾及骨髓中的肿瘤负荷展示于图12中。分别地与第1组的血液、脾及骨髓相比，除第2组中的骨髓展示略微显着差异(p<0.05)外，所有治疗组(第2组至第4组)展示显着差异(p<0.01)。
实例10.非幼猴中的药代动力学及急性毒性研究
在通过30min静脉内灌注的非幼猴(一只雄性及一只雌性，2mg/kg的每种化合物)中测试th3423及th3424，tk取样：在第1天及第15天：灌注初始化后0.25小时、0.5小时、0.75小时、1小时及2小时。血清化学试剂及血液病：给药前(第1天)、第5天、第8天(给药前)、第15天(给药前)、第22天及第28天。临床观测：在研究期间每天一次，总共35天。食物消耗：在研究期间每天一次，总共35天。体重量测：每周两次，持续五周。
tk参数列于下表中：
应理解，尽管已通过某些方面、实施例及视情况选用的特征具体地揭示本发明，但本领域技术人员可对该等方面、实施例及视情况选用的特征作出修改、改进及变化，且该等修改、改进及变化被认为在本发明的范畴内。
本发明已大致上且一般性地描述于本文中。处于通用揭示内容内的较狭义类型及亚属组中的每一者亦形成本发明的一部分。此外，在本发明的特征或方面以马库什组(markushgroup)的方式进行描述的情况下，本领域技术人员将认识到本发明亦因此以马库什组的任何个别成员或成员子组的形式进行描述。