本发明是在国家科学基金会(National Science Foundation，NSF)化学、生物工程、环境和运输系统(Chemical,Bioengineering,Environmental,and Transport Systems，CBET)部门授予的基金号为NSF-1264508的政府资助下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术：
本发明涉及生物传感器，特别涉及镁锌氧化物(MZO)纳米结构-修饰的生物传感器和生物传感器的应用，包括监测细胞群对试剂的响应。
根据世界卫生组织，抗微生物药物耐受性(AMR)已经成为全球健康问题的主要威胁，它有可能成为下一个“流行病”。迫切需要灵敏的诊断监视工具。例如，约有3.5％的新的和20.5％的以前治疗过的结核病(TB)病例涉及多重耐药(MDR)TB。由于缺乏有效的药敏试验(DST)，只有20％的MDR-TB病例得到了适当的治疗，这助长了MDR-TB的继续传播和不必要的痛苦和死亡。由于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)细菌生长缓慢，标准的琼脂/液体方法通常需要4-8周才能获得结果。较新的DST技术已经提高了测试的可靠性和速度，但仍然存在明显缺点而限制了广泛应用。表型检测方法平均需要四周，程序必须由训练有素的技术人员进行。分子方法(如聚合酶链反应(PCR)检测耐药突变)可以减少检测时间，但它们是病原体特异性的，并且不能可靠地检测到所有存在的突变或新的机制。而且，它们不适用于DST。迫切需要新技术来快速经济地检测AMR并确定用于治疗的适当抗生素。
据统计，随着发展中国家人口老龄化和生活方式的变化，癌症已成为全球性流行病。根据世界卫生组织(WHO)，2012年全世界有1410万新癌症病例和820万癌症相关死亡病例。到2035年，新的癌症病例数量预计将增加到2400万。癌症死亡率高在很大程度上是因为对药物治疗的响应率低。越来越多的人认识到，即使在相同类型的肿瘤中，人类癌症在遗传和表观遗传方面都具有高度变异性，这限制了成功的药物治疗。限制治疗功效的分子事件的实例包括药物转运、药物结合位点突变、存活机制的激活、以及激活治疗靶标的替代和反馈途径。由于这些不同的机制，相同类型的个体肿瘤通常对特定的药物治疗具有非常不同的响应。即使对于靶向抗癌药物，如肺癌中的小分子表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，其替代生物标志物可用于预测治疗结果，但其它可变因素可限制治疗结果。因此，一般癌症患者群体中给定抗癌药物的典型响应率低于20％。迫切需要开发适当的新筛选方法来预测个体化响应。
新一代测序技术的最新进展已经导致使用癌症基因组信息来指导治疗计划的精确药物主动性，这已经取得了一些成功。然而，肿瘤，特别是晚期癌症常累积突变和表观遗传改变的巨大负担，使得很难确定主要的癌症驱动事件并设计成功的疗法。因此，迫切需要新的补充技术来指导临床医生为个体癌症患者确定最合适的治疗计划。多年来已开发出许多技术来促进抗癌药物响应的体外测试。公认的方法包括在免疫缺陷小鼠中建立癌细胞系、癌症类器官/球状体和患者衍生的异种移植(PDX)肿瘤。这些新资源极大地增强了解药物敏感性和耐受性分子机制的能力。然而，这些肿瘤模型需要很长的时间才能建立，通常数月甚至长达一年，之后才能适用于分析治疗响应。而且，需要大的肿瘤样本。目前，它们仍主要用于药物发现和研究目的。因此，非常需要可以用原发性肿瘤的小新鲜活检组织直接确定治疗结果的新技术。我们的生物传感器可以在几分钟至几小时内分析抗癌药物的活性，使其成为预测个体癌症患者治疗结果的实用解决方案。
该文件描述了可解决上述中的至少一些问题和/或其它问题的装置、系统和方法。
技术实现要素：
将镁掺杂的(magnesium-doped)氧化锌(MZO)纳米结构(MZOnano)的优点与体声波(BAW)装置(如石英晶体微天平(QCM))的动态阻抗谱(dynamic impedance spectrum)能力结合，使MZOnano-QCM成为高灵敏度的生物传感器，非常适合监测细胞群对试剂响应的动态检测，包括抗微生物耐受(AMR)作用。MZO纳米结构修饰的石英晶体微天平(MZOnano-QCM)利用MZO基纳米结构的独特传感能力和生物相容性，并将其与包括QCM在内的体声波(BAW)装置的动态阻抗谱能力相结合，形成实时、非侵入性和无标记的细胞监测生物传感器，它特别适用于分别检测细菌和真菌株以及癌细胞对各种抗生素和抗真菌药物以及抗癌药物的易感性和耐受性。
MZO膜(film)和纳米结构的多功能性质，作为细胞界面和灵敏度增强材料，可用于形成MZOnano-QCM细菌、真菌和癌细胞监测传感器。除了MZO纳米结构所提供的增强的有效传感表面之外，通过控制和优化(i)表面形态、(ii)MZO纳米结构的表面润湿性和(iii)MZO纳米结构的毒性谱，大大提高了生物传感器的灵敏度。这种增强的灵敏度允许在单次测量中同时输出多个参数，并且能够非侵入性地测量细胞群响应试剂时的生物物理性质变化。通过特定的时间演变传感器谱特征(即谱形状、Nyquist图旋转性质和频率峰值迁移)，可以实时连续监测生物物理性质，主要是与细胞活性(生长和活力)相关的粘弹性转变和质量累积(质量负载(mass-loading))。沉积在BAW装置顶部电极表面上的MZO纳米结构不会改变BAW装置的整体尺寸，由此产生便携且成本有效的设计。
在一个实施方案中，用于监测细胞群生长的MZO-BAW传感器装置包含夹在顶部和底部电极之间的压电层，其中顶部电极和底部电极可以是金属、合金或透明导电氧化物，并且在压电层上沉积并形成图式(patterned)。传感器装置还包括在传感器装置的顶部电极上沉积并图式化的MgxZn1-xO(MZO)基纳米结构。MZO中Mg组成x(MZO中Mg的组成百分比)在0<x<0.2的范围内。Mg组成x也可以在0.01和0.05之间(0.01<x<0.05)。或者，和/或额外地，MZO中的Mg组分x在0.04至0.05(4-5％)的范围内，或者是0.03(3％)。
MZO基纳米结构包括表面形态，其可选自基本上平坦的表面、粗糙表面、具有尖锐尖端的纳米尖(tip)或棒(rod)阵列、以及圆顶(rounded top)的纳米尖或棒阵列。
MZO-BAW传感器装置可以是石英晶体微天平(QCM)传感器或薄膜体声波谐振(TFBAR)传感器。在一个实例中，MZO-BAW传感器基于QCM(MZOnano-QCM)，其中压电层包括QCM并且MZO纳米结构沉积在传感器装置的顶部电极的表面上。在另一个实例中，MZO-BAW传感器基于TFBAR(MZOnano-TFBAR)，其中压电层包括TFBAR并且MZO纳米结构沉积在顶部电极的表面上。TFBAR传感器能够以比QCM传感器更高的频率(多GHz)运行；从而提供更高的灵敏度。
在一个实施方案中，监测细胞群体对试剂的响应的方法包括：提供如本文件中公开的MZO-BAW传感器装置。在MZO-BAW传感器装置中，在顶部电极上沉积并图式化的MgxZn1-xO(MZO)基纳米结构，MZO中Mg组成x在0<x<0.2的范围内。Mg组成x也可以在0.01和0.05之间(0.01<x<0.05)。或者，和/或额外地，MZO中的Mg组分x在0.04至0.05(即4-5％)的范围内，或者是0.03(3％)。
该方法还包括培养与纳米结构接触的细胞群体；在传感器装置中产生时频信号；接收对应于MZOnano-BAW传感器装置频率响应谱的输出信号；将细胞群与试剂接触；继续培养细胞群，产生时频信号并接收对应于频率响应谱的输出信号；通过测量频率响应谱，动态连续地监测输出信号的变化；并从输出信号提取数据，并分析数据以确定细胞群对试剂的响应。
在提取数据时，该方法可以从时频输出信号中提取数据，例如谱形状演变数据、峰值频率迁移数据、运动电阻(motional resistance)数据、运动感应数据和/或Nyquist图旋转数据。响应和提取的数据指示细胞在纳米结构上的粘弹性质和/或质量负载的变化。提取数据的方法可以基于巴特沃斯-范-戴克(BVD)集总参数模型和多层传输线信号传播模型，使用数据模拟和建模技术。
细胞对试剂的响应反映了细胞在纳米结构上粘弹性质和/或质量负载变化。并且该方法还可以包括将提取的数据与参考进行比较，以确定试剂的抗微生物效果和/或细胞对试剂的抗生耐受性。该方法还可以替代地和/或额外包括将数据与参考进行比较，以确定试剂对细胞的抗癌作用。
在MZO基纳米结构表面上培养的细胞可以是在MZO基纳米结构表面上直接培养的细菌细胞、真菌细胞、寄生虫细胞或新鲜分离的癌细胞。例如，细胞是一种病原性细菌细胞，而试剂是一种抗病原体细菌试剂。在另一个实例中，细胞是真菌细胞，试剂是抗真菌试剂。真菌细胞的实例包括白色念珠菌(Candida albicans)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)。在另一个实例中，细胞是寄生虫细胞，试剂是抗寄生虫试剂。在另一个实例中，细胞是癌细胞，试剂是抗癌试剂。该方法可以将要培养的细胞设置为与MZO传感表面间接接触。
MZO基纳米结构可以与BAW装置的顶部电极直接或间接接触。当间接接触时，可以在顶部电极上沉积薄的非导电层(例如SiO2)或薄导电层(例如Ga掺杂的ZnO-GZO)，并且将MZO纳米结构沉积在SiO2或GZO薄层的顶部。
BAW装置的顶部和底部电极可以是金属(Au、Cu等)、合金、透明导电氧化物(TCO)例如Ga掺杂的ZnO(GZO)、Al掺杂的ZnO(AZO)或其组合。当使用TCO电极时，整个装置变成透明BAW传感器装置。纳米结构的表面形态受到控制，并且选自基本上平坦的表面、粗糙表面、或者具有尖锐尖端的纳米尖阵列的纳米结构化表面、或具有圆端的纳米棒阵列的纳米结构化表面。
在一个实施方案中，监测细胞群生长的方法包括提供本文中各种实施方案中公开的MZO-BAW传感器装置，其中MgxZn1-xO(MZO)基纳米结构在BAW装置顶部电极上沉积并图式化，其中0<x<0.2。该方法还包括培养与所述纳米结构接触的细胞群；接收对应于所述MZOnano-BAW传感器装置的频率响应谱的输出信号；从输出信号中提取数据，所述输出信号指示细胞群中细胞的粘弹性质和/或质量负载的变化，并且使用模拟和建模来分析数据。
该方法还包括从疑似携带细菌病原体的受试者收集样本。例如，样本是从食品、农产品、水源和环境污染物中收集的。
在一个实施方案中，制造MZO纳米结构修饰的体声波(MZOnano-BAW)传感器装置的方法包括提供体声波(BAW)装置。BAW是QCM或TFBAR。该方法进一步将MgxZn1-xO(MZO)基纳米结构沉积在BAW装置的顶部电极的表面上，其中MZO中Mg的百分比组成(x)在0<x<0.2的范围内。
该方法还包括在适当的范围内选择MZO中Mg的百分比组成(x)，从而满足某些性质。例如，选择百分比组成(x)以提供适当的表面形态以增强与所选生物物种的结合。在另一个实例中，选择MZO中Mg的百分比组成(x)以提供适当的润湿性以增强与所选生物物种的结合并减少传感所需生物物种的量。在另一个实例中，选择MZO中Mg的百分比组成(x)以降低毒性。在另一个实例中，选择MZO中Mg的百分比组成(x)以扩大传感过程期间可以维持纳米结构的pH范围。
润湿性范围从超疏水性到超亲水性。通过在生长期间或生长后调节MZO表面处的氧空位密度以控制MZO的表面润湿性，可以在两个方向上控制润湿性状态。Mg组成x可以在0.01<x<0.05的范围内。
选择MgxZn1-xO(MZO)中Mg的百分比组成(x)以提供适当的润湿性以增强对用于生物传感的生物样本的附着和非毒性，并且扩大传感过程中MZO纳米结构的稳定性pH范围。
传感器装置还可以经配置从而以双模式操作进行操作：同时或单独地，生成声导纳中的声信号和荧光中的光信号，以用于生物传感。生物传感也可用于监测抗微生物耐受性(AMR)。
MZOnano-BAW传感器也可以内部配置多个细胞生长孔。传感器可以进一步包含能够将传感器连接到移动和无线装置的界面以进行数据传输、存储、处理和/或显示。
附图简要说明
图1A说明根据一个实施方案的镁锌氧化物(MZO)纳米结构修饰的石英晶体微天平(MZOnano-QCM)生物传感器。
图1B说明根据一个实施方案，沉积在Au电极表面顶部上的MZO纳米结构。
图2A和2B说明，与ZnO相比，在根据一个实施方案的MZO(x＝0.03)上大肠杆菌(E.coli)的细胞死亡减少，由此增加了MZO基生物传感器的灵敏度和生物相容性。
图2C说明，通过细胞培养介质中低5×浓度的Zn2+离子的实证，验证了MZO对细菌培养物增加的生物相容性，其中Zn2+离子是对细菌培养物造成毒性的主要离子物质。
图3说明，根据一个实施方案，监测细胞群对试剂响应的方法的图。
图4A-3D说明，根据各种实施方案，使用常规QCM、ZnOnano-QCM和MZOnano-QCM进行的大肠杆菌的抗生功效的传感器响应。图4A和4C显示氨苄青霉素和四环素对大肠杆菌的抗生功效，而图4B和4D显示大肠杆菌耐受性株对氨苄青霉素和四环素的抗微生物耐受性(AMR)检测。
图5A-4D说明通过分光光度法(OD600)验证对大肠杆菌的抗生功效的检测，分光光度法是目前使用的AMR检测技术。
图6A-5C说明，根据各种实施方案，使用ZnOnano-QCM和MZOnano-QCM进行的抗真菌药物对酿酒酵母(S.cerevisiae)(酵母)的作用的检测。图6A和6B显示根据一些实施方案对两性霉素的杀真菌响应和对咪康唑的真菌抑制响应的检测。图6C显示根据一些实施方案酵母正常(无药物)生长条件的检测。图6D说明使用分光光度法(OD600)对酿酒酵母(S.cerevisiae)(酵母)抗真菌药物作用的检测。
图7说明，根据一个实施方案，药物敏感性急性淋巴细胞白血病(ALL)(CEM)细胞对有无药物(VP16)治疗情况下在整个48小时监测期内的传感器时间依赖性频率迁移。
图8说明在一个实施例中没有药物治疗时药物敏感的ALL(CEM)细胞的总细胞计数和细胞活力。
图9说明在一个实施例中有药物治疗时药物敏感的ALL(CEM)细胞的总细胞计数和细胞活力。
图10说明在一个实施例中药物耐受性ALL(CEM-V1)细胞在有无药物(VP16)治疗情况下在整个48小时监测期内的传感器时间依赖性频率迁移。
图11说明在一个实施例中没有药物治疗时药物耐受性ALL(CEM-V1)细胞的总细胞计数和细胞活力。
图12说明在一个实施例中有药物治疗时药物耐受性ALL(CEM-V1)细胞的总细胞计数和细胞活力。
具体实施方式
本发明的各种实施方案涉及镁锌氧化物(MZO)纳米结构修饰的生物传感器的设计、制造，以及使用MZO纳米结构修饰的生物传感器来检测和监测细胞。具体而言，通过测量并分析来自MZOnano-QCM的声频响应，监测MZOnano传感表面上培养的细菌和真菌细胞的粘弹性质和质量的变化，而提供系统和检测方法以自动且连续地检测AMR作用。通过检测细菌和真菌细胞的生理学变化(如生长状态和活力)，这些生物物理测量提供关于微生物和抗微生物功效以及由药物作用引起的耐受性的信息。
本专利文件中的各种实施方案的一些优点包括：(1)高灵敏度(例如：MZOnano-QCM约0.3ug/kHz，而对于MZOnano-TFBAR，5ng/kHz)；(2)与使用常规技术相比，用于监测AMR作用的检测速度快(例如，在大肠杆菌中相较于1.5天仅需30分钟(70倍)，对于酵母而言相较于2.5天仅需60分钟(60倍))；(3)无标记，且连续监测正常生理条件下的AMR作用；(4)实时自动化定量数据收集；(5)小样本量(纳至微升量级)；(6)通过表征细胞生物物理学性质特定的体声波(BAW)谱特征(spectral signature)，动态连续检测AMR作用；(7)通过手机等移动装置在同一频率范围内进行无线数据采集；(8)当装置使用薄膜体声波谐振器(TFBAR)配置时，使用多路(multiplexing)高含量阵列的高通量；(9)尺寸小，特别是对于使用TFBAR配置的装置，这对于便携式和移动应用特别有用；以及(10)成本低。
这些特征使得本专利文件中公开的系统和方法适用于广泛的应用，例如AMR，为监测抗生耐受性和筛选针对耐受性株的药物提供诊断工具，为新型抗微生物药物发现提供研究工具，以及为个性化癌症治疗和癌症药物发现检测抗癌药物响应提供诊断工具。这些应用可以用在医生办公室、患者床边、移动应用程序或研究中心
在整个专利文件中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中，以更全面地描述所公开的内容所属领域的状态。虽然下面的内容可引用或示例装置的特定组成或使用该装置的方法，但是并不意图将本发明的范围限制于这些特定的参考或实例。鉴于实际和经济考虑，例如纳米结构的组成和形态以及培养介质的条件，本领域技术人员可以做出各种修改。
除非另有说明，否则本文所用的冠词“一”和“一个”是指“一个或多个”或“至少一个”。也就是说，通过不定冠词“一”或“一个”提及本发明的任何元件或组成并不排除存在多于一个元件或组成的可能性。
本文所用术语“约”是指所引用的数字指示加上或减去引用的数字指示的10％。
如本文所用的术语“细胞”是指可在合适条件下增殖的任何类型的活有机体。非限制性实例包括哺乳动物细胞、细菌、真菌、酵母和其它寄生病原体。感兴趣的细胞的其它实例包括通过细胞分裂而增殖的那些以及以非分裂方式生长的那些，如分化细胞、衰老细胞。
如本文所用的术语“试剂”是指任何可能对细胞生长具有影响的物质。实例包括化合物、蛋白或天然产物提取物、药物化合物。
如本文所用的术语“响应”是指由于细胞生长或溶解而导致的细胞或细胞群一种或更多种生物物理性质的变化，如质量、粘度、弹性等。
除非另有说明，否则本文使用的术语“生物传感器”或“生物传感器装置”是指MZO纳米结构修饰的体声波装置(MZOnano-BAW)装置。MZOnano-BAW是MZO纳米结构修饰的QCM(MZOnano-QCM)；MZOnano-BAW是MZO纳米结构修饰的薄膜体声波谐振器(MZOnano-TFBAR)。
在所示的实施方案中，参考图1A，MZO纳米结构修饰的体声波(BAW)传感器装置(MZOnano-BAW)可以包括顶部电极110和底部电极111以及夹在顶部电极和底部电极之间的压电层121。传感器装置还包括纳米结构122(示意图如所示)，如在顶部电极上沉积并图式化的MgxZn1-xO(MZO)基纳米结构。百分比组成(x)在0<x<0.2的范围内，选择x以提供至少一种预确定的特征，所述特征选自MZO纳米结构的润湿性、非毒性以及pH稳定性。在非限制性实例中，参考图1B，MZO纳米结构130(扫描电子显微镜(SEM)图如所示)沉积在Au电极表面的顶部。
回到图1A，底部电极111可以包括在压电层121下方沉积并图式化的导电膜；顶部电极110可以包括在压电层121上沉积并图式化的金属电极；以及在顶部电极的顶表面上沉积并图式化的MgxZn1-xO基纳米结构122，其中0<x<0.20。
可以通过调节生长期间或生长后的MZO表面处的氧空位密度来控制MZO纳米结构122的润湿性状态(从超级疏水性到超级亲水性，反之亦然)。例如，可以将润湿性从亲水性增强到超亲水性，特别是对于尖端型尖锐表面形态的MZO纳米结构。MZO基纳米结构的亲水性可以减少传感器的液体样本消耗量，并显著提高灵敏度。润湿性的优化导致与特定生物物种或细胞的结合增强。
在所示的实施方案中，MZO中Mg的百分比组成(即，在MgxZn1-xO中的x)的范围在0与20％之间(0<x<0.2)。然而，应该注意的是，这样的范围仅仅是为了说明实现期望的性能。通过控制MZO纳米结构沉积期间的Mg组成，确切的x值对于获得MZOnano-BAW传感器的高灵敏度和选择性是关键的。
与纯ZnO(x＝0)相比，在MgxZn1-xO基纳米结构中加入少量Mg(例如5％)能够增加纳米结构可承受的样本pH值范围，并且因此在测量和制造过程中改善MZOnano-BAW传感器的稳定性和耐用性。
MZO中的Mg量直接影响纳米结构的重要特征，包括润湿性、表面形态以及MZO-纳米结构在各种pH条件下的稳定性和生物相容性。此外，合适的Mg范围也导致MZO纳米结构的低水平毒性或无毒性；因此增强MZOnano-BAW传感器的生物相容性。在一个实例中，x的范围可以是大于0且小于0.2的任何值的分组，然而一些优选范围是约0.01至约0.05或甚至0.02至约0.04或约0.03或约0.04至0.05。因此，根据样本的属性、性质、大小、细胞培养的pH值、温度、稳定性和期望的毒性(或非毒性)水平等因素，MgxZn1-xO(MZO)中的Mg组成需要进行调整和优化。
通过金属有机化学气相沉积(MOCVD)和其它化学或物理沉积技术，公开并显示于图1A中的MZO基纳米结构可以在基底上生长，然后通过光刻和蚀刻工艺进行图式化。未掺杂的ZnO及其纳米结构显示出n型半导体行为。可以在ZnO生长过程中原位引入镁(Mg)以形成三元化合物MgxZn1-xO(0<x<0.2)，即MZO，以改变ZnO基纳米结构的物理和化学性质。
与纯二元ZnO一样，可以通过掺杂来实现MZO的多功能，以适用于各种传感应用。例如，III族供体的掺杂剂如Al和Ga显著增强导电性；过渡金属(TM)掺杂剂如Fe和Mn使其具有铁磁性；补偿掺杂剂如Cu和Ni使其具有压电性。
MZO可以在包含绝缘体(如玻璃、石英和Al2O3)；半导体(如Si、GaAs、GaN和SiC)；电极(如金属和透明导电氧化物(TCO))的大量基底上以及还可以在柔性基底(如聚合物)上以各种形态(例如薄膜和纳米尖和纳米棒)生长。在一个实例中，具有合适表面形态的MZO直接沉积在QCM和TFBAR的Au顶部电极上。
如本文所用，关于纳米结构MZO的表面形态，短语“基本上平坦的”被定义为具有约1.5nm的表面粗糙度(rms)的MZO膜。“粗糙”被定义为表面粗糙度(rms)约为7.5nm的MZO膜，其特征在于不规则性、突起和/或褶皱(ridges)。“非常不均匀”被定义为具有紧密堆积的纳米尖/纳米棒阵列的MZO膜，并且尖端顶部的直径在5-100nm的范围。
控制MZO基纳米结构表面的形态(例如薄膜或基本上平坦、粗糙的表面和尖锐尖端)可以增强纳米结构与某些生物细胞的结合(例如用于AMR测试的细菌和真菌细胞)，其允许监测细菌和真菌株对各种抗生素和抗真菌药物的易感性和耐受性。例如，当被监测的细胞是哺乳动物的细胞时，可以使用具有基本上平坦的纳米尖结构的BAW传感器装置。当被监测的细胞是真菌细胞时，具有粗糙纳米尖结构的BAW传感器装置是合适的。当被监测的细胞是细菌或病毒时，具有粗糙纳米尖结构的BAW传感器装置提供可描述的灵敏度。纳米结构的MZO也可用于与细菌和病毒培养物结合从而与酶和抗体反应以用于免疫传感。操纵MZO纳米颗粒的形态也可以使特定细胞和分析物的灵敏度最大化。
ZnO(x＝0)纳米结构修饰的BAW装置(ZnOnano-BAW)和MZO(0<x<0.2)纳米结构修饰的BAW装置(MZOnano-BAW)比没有整合纳米结构的常规BAW装置具有优势。例如，QCM装置的一些优点包括：(i)纳米结构修饰的QCM装置具有更大的有效传感表面积；(ii)可控制润湿性和表面形态以增强与适当细胞的结合；和(iii)可以通过掺杂来控制其它化学和物理性质，如电导率。这些优点使得ZnOnano-QCM和MZOnano-QCM具有比常规QCM装置更高的灵敏度以及消耗更少的液体生物样本量。
在比较MZOnano-QCM与ZnOnano-QCM时，MZOnano-QCM显示出比ZnOnano-QCM更高的灵敏度(例如在大肠杆菌中，5倍高)。MZOnano-QCM也显示出显著更低的检测限。例如，检测限为0.1-0.9ng(100-900个大肠杆菌细胞)，比ZnOnano-QCM(大肠杆菌的平均质量为约1pg)的1-9ng检测限低10倍。基于MZO纳米结构的生物传感器装置优于其基于ZnO纳米结构的对应物的一些原因在于(i)在宽pH值范围和不同温度下MZO比纯ZnO更稳定；因此，MZO装置在不同的工作条件下提供更长的保存期限和更好的功能；(ii)MZO纳米结构的毒性水平远低于ZnO基对应物的毒性水平，这是由于MZO释放的Zn离子显著减少，如图2C所示。
在另一所示实施方案中，用于制造MZO-BAW传感器装置的方法可使用美国专利第8,377,683号中所公开的程序，其全部公开内容以引用的方式并入本文中。此外，在制造中，如上所述，MZO中的Mg的百分比组成(即，在MgxZn1-xO中的x)可以发生变化(0<x<0.2)，这取决于生物检测的特定需求(例如生物分子的大小)和传感条件(如pH和温度)。
用于BAW的压电材料可以是但不限于石英、LiNbO3、LiTaO3、ZnO等。使用标准的微电子处理技术沉积并图式化金属电极。MZO基纳米结构修饰的BAW(MZOnano-BAW)传感器的操作类似于BAW谐振器装置。BAW谐振器将以压电材料性质和厚度所确定的特定频率进行谐振。当在MZO基纳米结构上发生靶的结合时，质量负载导致BAW装置的共振频率发生迁移，与结合到MZO基纳米结构的靶材料的量直接成比例。
MZO纳米结构可以并入BAW装置中，包括常规QCM以形成MZOnano-QCM。MZO基纳米结构也可以并入薄膜体声波谐振器中以形成MZOnano-TFBAR。TFBAR由夹在顶部和底部电极之间的压电膜组成。TFBAR可以在更高的频率时操作。其具有很多优势，比如尺寸小、插入损耗低以及能耗低。此外，TFBAR传感器可以轻易地整合至阵列当中。TFBAR传感器可以同其它Si基电子元件整合在相同的基底上，并与小尺寸微波天线兼容，因此可用于无线距离探测(distance probing)。
在另一所示实施方案中，监测系统可包括图1A公开的传感器装置。系统还可包括通过采用常规方式在BAW传感器装置压电层中诱导震荡而产生时频信号的源、以及与传感器装置可通讯方式关联的实时信号分析仪系统。实时信号分析仪系统经配置以测量时频信号的谱响应(例如，幅度、相和谱形等)。监测系统还可包括带有CO2流的孵育器；温度控制器；和一个配置在孵育器内部的细胞生长孔。
在监测系统中，MZOnano-BAW传感器可以是MZOnano-QCM和MZOnano-TFBAR。监测系统可另外包括孵育器和配置在孵育器内部的多个细胞生长孔。两个或更多个细胞生长孔可以各自具有配置在其中的MZOnano-BAW传感器。这种配置进一步扩大了检测的范围。例如，针对相同的细胞或靶可以平行研究多种化合物。或者，相同的化合物可以同时针对多个靶进行筛选。此外，多个MZOnano-TFBAR传感器模块可以排列并整合在同一芯片上，实现不同抗微生物药物的平行检测。
因为来自MZOnano-BAW传感器的输出信号处于频率范围中，所以监测系统可以另外包括界面用以将传感器可通讯地连接到无线移动装置(例如，iPhone、iPad)，所述无线移动装置接收和处理信号并将数据远程传输到处理或储存设施，如医院和保健中心。
监测系统还可以被配置双模式操作进行操作：同时或单独产生声导纳中的声信号和荧光中的光信号以监测抗微生物耐受性(AMR)。
MZOnano-BAW传感器可以被生物功能化以直接且选择性地检测患者样本、供水、食物和农产品、污染物和环境来源中的细菌或真菌病原体的存在和/或生长。因此，传感器、方法和监测系统在各个领域得到应用，包括食物和农产品安全以及环境监测。生物功能化的MZOnano-BAW生物传感器也可以用于直接且选择性地检测患者样本中的癌细胞和抗癌药物响应，以用于化疗期间的临床应用和个人健康。
在另一个所示实施方案中，参考图3，提供了一种使用MZOnano-BAW传感器和监测系统的方法，用于通过测量和分析声频响应来动态监测MZO nano传感表面上培养的细胞的粘弹性质和质量的变化。该方法可以包括：提供图1A实施方案中公开的镁掺杂的氧化锌(MZO)纳米结构(MZOnano)修饰的体声波(BAW)传感器装置(MZOnano-BAW)301，其中MZO中的Mg组成x在0<x<0.2的范围。该方法还包括培养与MZO纳米结构302接触的细胞群；在传感器装置303中产生时频信号，接收对应于MZOnano-BAW传感器装置304的频率响应谱的输出信号；使细胞群体与试剂305接触；继续培养细胞群，产生时频信号并接收对应于频率响应谱306的输出信号；通过测量频率响应谱307动态地和连续地监测输出信号的变化；以及从输出信号提取数据并分析数据以确定所述细胞群对所述试剂308的响应。
在从输出信号308提取数据时，该方法可以提取数据，如谱形状演变数据、峰值频率迁移数据、Nyquist图旋转数据、运动电阻数据和/或运动感应数据。基于巴特沃斯-范-戴克(Butterworth-Van-Dyke)(BVD)集总参数模型和多层声波传输线模拟的数据分析将BAW频率响应与细胞响应相关联，例如粘弹性质和/或细胞质量的变化。因此数据分析可以提供抗微生物功效和耐受性(AMR)信息。也可以实现动态和连续的监测和分析。
该方法可以进一步包括将提取的数据与参考比较，以确定例如试剂的抗癌作用或抗微生物作用和/或细胞对试剂的抗生耐受性。该参考可以是来自未经试剂处理的细胞或任何相关统计数据的对照数据。多个传感器可以集成在一个平台中进行高通量监测和诊断。因此，本专利文件中的各种所示实施方案中公开的方法和监测系统允许有效检测抗癌或抗病原性真菌/细菌试剂的耐受性，其可用作药物发现和开发中的快速高通量方法或测定。
待监测的细胞的非限制性实例包括细菌、真菌和寄生虫病原体。另外的实例包括哺乳动物细胞例如癌症患者的原发性癌细胞分离物。细胞可以收集自患者样本、供水、食物和农产品以及环境来源。
为了最大化检测过程的灵敏度和效率，上述不同的表面形态可以用于不同的靶。例如，粗糙的膜用于细菌，基本上更平坦的纳米结构用于哺乳动物细胞。
可以在MZO基纳米结构的表面上直接或间接培养细胞群。例如，细胞在MZO基纳米结构的表面上培养并与MZO传感表面直接接触。在另一个实例中，细胞通过合适的介质如抗体与MZO传感表面间接接触。
TB的AMR是一个重大的全球健康问题，并且由于它们生长缓慢，这些生物体中的AMR检测特别具有挑战性。使用本文中公开的各种实施方案中描述的监测系统的方法可用于检测对化合物或药物(例如甲氧西林、两性霉素等)的AMR。这些方法允许对TB株(如H37Rv和MDR衍生物)进行快速和准确的监测和AMR检测。在一个实例中，在细菌和真菌细胞培养物上监测抗生素和抗真菌药物功效或耐受性(AMR)的方法可包括，在细菌和真菌细胞培养物存在下，在本文所述监测系统中产生实时声波阻抗和透射谱信号，包括将抗生素或抗真菌药物引入培养物的时间点。
该方法还可以包括基于巴特沃斯-范-戴克(BVD)集总参数模型和多层声波传输线模拟方法使用数据模拟和建模技术，从时频信号中提取谱形状演变数据、峰值频率迁移数据、运动电阻数据和/或运动感应数据。
该方法还可以将提取的数据(在此统称为“生物传感器谱特征”)与对应于对照培养株的生物传感器谱特征对照组进行比较。可以用数据分析软件包进行比较。
提供了本专利文件中公开的各种所示实施方案中描述的方法和监测系统，其可用于研究药物功效和药物耐受性。例如，被监测的细胞是药物敏感性和药物耐受病原性细菌株，例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)和/或多药耐受性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，MRSA)，并且引入细胞培养物中的药物是抗病原性细菌药物如抗TB药物或甲氧西林。
在另一个实例中，监测系统可以为检测抗TB和抗病原体药物的耐受性提供诊断工具，从而用于旨在减轻药物耐受性TB病原性传播的快速高通量方法或用于药物发现和开发的分析。在另一个实例中，细菌培养物包含大肠杆菌，并且使用本专利文件中公开的所示实施方案中的方法可以容易地确定各种试剂(例如氨苄青霉素和四环素)的抑菌作用和杀菌作用。
本专利文件中公开的各种所示实施方案中描述的方法和监测系统可用于研究各种真菌株和抗真菌试剂(例如咪康唑和两性霉素)对真菌抑制作用和/或杀真菌作用的响应。例如，被监测的细胞可以是病原性真菌如白色念珠菌(Candida albicans)的药物敏感性和耐受性株，并且被引入细胞培养物的药物是抗真菌剂如两性霉素。类似地，被监测的细胞可以是新鲜分离的癌细胞，并且被引入细胞培养物中的试剂是抗癌试剂或药物。各种实施方案中描述的方法也可以应用于其它细菌和真菌株，特别是病原性株，并涉及其它药物化合物。
为了检测细胞或病原体的AMR，在培养细胞或病原体之前或期间，将化合物或药物添加到细胞生长孔中。与参考相比，耐受性株将继续增殖并且敏感株表现出减少的质量积累。参考可以是不受化合物干扰的平行测试的细胞生长。该参考也可以是已知的数据和记录在数据库中的统计数据。在本专利文件中公开的各种所示实施方案中描述的方法和监测系统能够在引入试剂之后快速连续地检测AMR作用。例如，试剂(如特定的药物)引入细胞培养孔后，可在30分钟内在大肠杆菌中实现准确的AMR检测，对于酵母是60分钟内。
除了AMR检测，本文所述方法还可以用于检测哺乳动物细胞的生长。例如，使用基于MZOnano-QCM的装置可以监测新鲜分离的癌细胞和来自已建立的癌细胞系的细胞的生长。此外，无需大量的细胞培养就可以检测化合物抑制癌细胞生长的功效。
上述MZOnano-BAW传感器和相关系统可用于动态监测收集自疑似携带细菌病原体的受试者的样本。受试者是人或动物。样本还可收集自包括食物、农产品、供水和环境污染物在内的源。
在所示的实施方案中，提供药物化合物(作为非限制性实例，抗生素、抗真菌或化疗试剂)的高通量筛选方法，以确定其在治疗各种疾病中的功效。例如，通过在多个样本孔中安装多个MZOnano-BAW传感器(这种情况时，MZOnano-QCM)筛选多种化合物。在另一实例中，通过在芯片上排列单元传感器然后置于样本孔中来筛选大量化合物(这种情况时，MZOnano-TFBAR)。细胞靶的实例包括细菌、真菌、寄生虫和癌细胞。例如，细胞群可包括急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)或淋巴瘤。
本文所述方法还可用于个性化疾病诊断、监测和治疗的设计和开发。例如，对新鲜分离的癌细胞筛选各种化合物或药物以鉴定最有效的试剂。此外，可以测试不同化合物或药物的组合以开发新型治疗方案。
实施例
前两个实例使用镁掺杂的氧化锌(MZO)纳米结构(MZOnano)修饰的体声波(BAW)传感器装置(MZOnano-BAW)，其中MZO中Mg组成x在0.04≤x≤0.05的范围，并且还提供了监测细胞群对试剂响应的方法。
第一个实施例说明本文件公开的镁锌氧化物(MZO)纳米结构修饰的石英晶体微天平(MZOnano-QCM)生物传感器用于动态监测敏感性和耐受性大肠杆菌细胞的抗生作用的应用，参考图1A和1B。使用金属有机化学气相沉积在标准QCM顶部电极上生长MZO纳米结构。根据其多功能性和生物相容性选择ZnO和MZO纳米结构膜。可以控制其表面润湿性和形态，从而针对各种生物/生化种类提供高灵敏度。MZO比ZnO可承受更大的pH范围。将MZO纳米结构的优势和QCM的动态阻抗谱能力相组合，使得MZOnano-QCM成为高度灵敏的动态生物传感器，非常适合AMR检测。通过90分钟的孵育，来确定大肠杆菌在ZnO和MZO纳米结构上的生长。结果显示，相较于ZnO(图2A)，在MZO上显著更有利细菌生长(图2B)。
图4A-4D显示使用常规QCM、ZnOnano-QCM和MZOnano-QCM进行的对大肠杆菌抗生作用的检测。由于灵敏度低，常规QCM不能检测，而ZnOnano-和MZOnano-QCM通过频率迁移(Δf)能够准确检测活性生长期间的细菌计数。MZOnano-QCM比ZnOnano-QCM提供高四倍的灵敏度。通过用杀细菌的氨苄青霉素(256μg/mL)和抑制细菌的四环素(8μg/mL)处理成对的抗生素敏感性和耐受性大肠杆菌进行抗生素易感性和耐受性检测。对于氨苄青霉素敏感性细胞(图4A)，Δf在5分钟内停止增加，并在氨苄青霉素处理后10分钟内下滑，而氨苄青霉素耐受性细胞中Δf继续增加(图4B)。抗生素处理后，通过平坦的信号输出在四环素敏感细胞上显示细菌抑制作用，但是没有在四环素耐受性细胞上(图4C-4D)。这些结果通过分光光度法(OD600)的结果得到验证(图5A-D)，其显示和MZOnano-QCM相同的趋势(图4A-4D)。然而，分光光度法需要将样本分到多个小瓶中，置于仪器内。这还涉及耗时的样本提取和测量，以及更大的样本大小。使用图4A-4D所示实施方案的AMR和药物功效检测不需要对样本进行分装，也不涉及培养干扰，并显示出快速、灵敏且实时的AMR检测，有望用于微生物病原体的诊断。
第二个实施例说明应用相同的MZOnano-QCM生物传感器来监测两性霉素和咪康唑对酵母细胞的作用。参考图6A-6D，使用该专利文件中公开的各种实施方案的检测结果与分光光度法进行比较，分光光度法显示OD600方法不能检测细胞的杀伤作用，并且错误地将两性霉素鉴定为真菌抑制药物，而不是杀真菌剂。使用本专利文件中的各种实施方案的结果以快速的方式精确检测了两种药物效果。
特别是，图6A显示使用ZnOnano-QCM和MZOnano-QCM检测两性霉素的细胞杀伤作用和咪康唑(图6B)对酵母的生长抑制作用。图6C显示没有药物作为对照的酵母生长曲线。在初始生长接种后330分钟，两性霉素和咪康唑都被引入到细胞培养物中，在药物处理1小时内MZOnano-QCM显示出细胞杀伤和生长抑制作用。与ZnOnano-QCM相比，MZOnano-QCM还显示出高4倍的信号灵敏度。将这些结果与酵母细胞培养物的OD600光谱监测进行比较。图6D显示两性霉素和咪康唑抗真菌作用以及无药物条件的OD600图。应注意的是，光谱法未能区分两性霉素的细胞杀伤作用和咪康唑对酵母的生长抑制作用。这是由于光谱方法依赖于悬浮细胞的光吸收，并且死酵母细胞保持悬浮状态，因此也产生吸收。
使用大肠杆菌和酵母来证明本专利文件中公开的用于检测药物作用的各种实施方案中描述的方法和系统的有效性，是由于大肠杆菌和酵母都是用于开发抗生素和抗真菌药物的常见细菌和真菌模型。而且，两种物种都是引起人类感染的最普遍的病原体之一。
第三个实施例，使用MZOnano-QCM传感器装置，使用药物VP16(也称为依托泊苷，一种抗癌试剂)、VP16敏感性ALL细胞系(CEM)及其VP16耐受性衍生细胞系(CEM-V1)作为用于监测抗癌试剂对癌细胞生长作用的模型，其中MZO中的Mg组成x为0.03。
对于本实施例中的所有实验，使用2mL介质中4×105个细胞的初始接种密度，使用MZOnano-QCM动态监测白血病细胞生长48小时。在初始接种后4小时后将药物(VP16)引入细胞培养物中。参考图7，显示了药物敏感性CEM细胞在整个48小时监测期中传感器时间依赖性频率迁移。在无药物情况下，频率迁移从0-40小时呈指数增加(表明细胞在传感区指数积累)，然后频率迁移速率降低，表明细胞生长饱和。在药物被引入装置中细胞培养物中的情况下，观察到在药物引入后(初始接种后4小时)细胞继续生长，但是可以看到药物在药物引入后16小时开始起作用。此时，细胞开始死亡(或停止增殖)，如所示在20小时至48小时发生频率迁移的降低。
使用标准细胞活力分析仪(Beckman Coulter，Vi-cell XR)确定传感器的测量，以确定48小时后的最终细胞计数和细胞活力。平行地，将标准细胞孔中的相同量的细胞与该装置一起培养。在监测周期结束时(48小时)，从细胞孔以及装置中提取0.5mL细胞培养物。活力分析仪可用于对装置中生长的对照和细胞进行细胞计数。图8(无药物)和图9(含药物)显示总细胞计数和细胞活力与最终信号趋势相符。然而，活力分析仪不能显示药物处理对白血病细胞的实时作用。
在图8中，该实施例中使用的各种配置包括：Con1、con2和con3是标准孔中的对照细胞培养物，一式三份；MS是标准孔中的对照细胞培养物，其中MZO在底部的玻璃样本(光滑形态)上；MR是标准孔中的对照细胞培养物，其中MZO在底部的玻璃样本(粗糙形态)上；MN是标准孔中的对照细胞培养物，其中MZO在底部的玻璃样本(纳米形态)上；并且传感器是来自真正的MZOnano-QCM传感器+细胞孔的细胞培养物。
在图9中，该实施例中使用的各种配置包括：CEM DMSO是含有DMSO的标准孔中的对照细胞培养物(DMSO用作药物溶剂)；CEM VP16是标准孔中的细胞培养物，其中在初始接种4小时后引入VP16药物；CEM是标准孔中的对照细胞培养物；MS是标准孔中的对照细胞培养物，其中MZO在底部的玻璃样本(光滑形态)上；MR是标准孔中的对照细胞培养物，其中MZO在底部的玻璃样本(粗糙形态)上；MN是标准孔中的对照细胞培养物，其中MZO在底部的玻璃样本(纳米形态)上；并且传感器是来自真正的MZOnano-QCM传感器+细胞孔的细胞培养物。
使用MZOnano-QCM传感器和活力分析仪对药物耐受性CEM白血病细胞(CEM-V1)重复相同的实验，并且可以进行48小时的监测。图10显示在存在和不存在药物(VP16)处理的情况下，传感器的时间依赖性频率迁移。在初始接种4×105个细胞后4小时，将药物加入到细胞培养物中。观察到，在没有药物处理的细胞培养的情况下，时间依赖性频率迁移显示与敏感细胞实验中无药物情况下相同的趋势。尽管在初始接种后19小时(加药后约15小时)，与无药物对照中所观察到的相比，时间依赖性频率迁移开始下降，但药物存在时持续增加的趋势表明连续的细胞生长。这种趋势也由图11和图12所示的细胞活力分析仪结果所证实。在图11实施例中使用的各种配置和图8所述的那些相同，并且图12实施例中使用的各种配置和图9所述的那些相同。
上述公开的系统、方法和特征以及替代方案，可以被组合成许多其它不同的系统、方法或应用。本领域技术人员可以做出各种目前无法预料的或未预料到的替代、修改、变化或改进，其中的每一个也旨在包括在所公开的实施方案内。