本发明涉及作为疫苗而言有用的融合蛋白、包含对该融合蛋白进行编码的dna的dna构建物、包含该dna构建物的载体及转化体。
背景技术：
作为防治病害的有效的方法有疫苗的利用，然而有时会有所得的预防效果不充分的情况。对此可以考虑如下的情况等各种理由，即，作为疫苗设计的抗原的免疫原性本来就很弱的情况、由新生儿或老年人那样接种疫苗的个体侧的免疫力引起的情况。已知作为大肠杆菌性腹泻症的原因毒素的st是由18个氨基酸(stp(猪型))或19个氨基酸(sth(人型))构成的分子量约2000的小分子，自古以来免疫原性极低。以st作为低免疫原性分子模型，进行了用于提高免疫原性的研究。
klipstein等人(1985)(非专利文献1)通过制作将sth化学地与ltb融合了的抗原，封入明胶胶囊并进行经口施用，而确认了血清igg和小肠iga的抗体效价升高，为了实用化需要进一步的免疫原性的提高。
clements(1990)(非专利文献2)通过在大肠杆菌中表达ltb-st融合蛋白，对其进行纯化并向小鼠进行腹腔内注射，而在血清中确认了抗st抗体的诱导，然而需要进一步的免疫原性的升高。
zhang等人(2010)(非专利文献3)通过在大肠杆菌中表达在lt全毒素上融合了st的蛋白质，对其进行纯化，与弗氏的不完全佐剂一起向兔子进行肌肉注射，而确认了抗体诱导和对st毒素的中和活性的诱导，由于是包含佐剂的注射施用，因此抗原的进一步的免疫提高很重要。
rosales-mendoza等人(2011)(非专利文献4)通过在烟草中表达ltb与sth的融合蛋白，并向小鼠进行经口施用，而确认了抗lt抗体效价的升高，然而对于抗st抗体效价并没有提及。
另一方面，本发明人等在日本专利5360727(专利文献1)中报告，利用具有特定的氨基酸序列的接头(pg12)，使植物中高产大肠杆菌不耐热毒素b亚基(ltb)、志贺毒素2e的b亚基(stx2eb)，然而对于该融合蛋白的作为疫苗的性能、融合有第三抗原时的该抗原的性能并不清楚。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利5360727号说明书
非专利文献
非专利文献1：klipstein等人，infectionandimmunity(1985)50:328-32
非专利文献2：clements，infectionandimmunity(1990)58:1159-66
非专利文献3：zhang等人，clinicalandvaccineimmunology(2010)17:1223-31
非专利文献4：rosales-mendoza等人，plantcelrep(2011)30:1145-52
技术实现要素：
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，提供一种免疫原性得到增强的疫苗抗原。
用于解决问题的方法
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过制作将抗原肽与选自志贺毒素2e的b亚基(stx2eb)、大肠杆菌不耐热毒素的b亚基(ltb)及霍乱毒素的b亚基(ctb)中的2个以上的毒素蛋白质结合了的融合蛋白并向动物施用，2个以上的毒素蛋白质部分就会作为佐剂发挥作用，在动物体内对抗原肽的免疫原性增强，该融合蛋白可以作为优异的疫苗抗原使用，从而完成了本发明。
即，本发明如下所示。
(1)一种融合蛋白，其包含抗原肽(不包括猪繁殖与呼吸障碍综合症(prrs)病毒的糖蛋白5(glycoprotein5)来源肽)和选自志贺毒素2e的b亚基(stx2eb)、大肠杆菌不耐热毒素的b亚基(ltb)及霍乱毒素的b亚基(ctb)中的2个以上的蛋白质。
(2)一种融合蛋白，是包含抗原肽(不包括猪繁殖与呼吸障碍综合症(prrs)病毒的糖蛋白5来源肽)和佐剂蛋白质的融合蛋白，所述佐剂蛋白质包含选自志贺毒素2e的b亚基(stx2eb)、大肠杆菌不耐热毒素的b亚基(ltb)及霍乱毒素的b亚基(ctb)中的2个以上的蛋白质。
(3)根据(1)或(2)中记载的融合蛋白，其中，所述抗原肽为细菌毒素来源肽。
(4)根据(1)或(2)中记载的融合蛋白，其中，所述抗原肽为大肠杆菌耐热性毒素(st)来源肽。
(5)根据(3)中记载的融合蛋白，其中，所述st肽具有与以序列号16表示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列。
(6)根据(1)或(2)中记载的融合蛋白，其中，所述抗原肽为哺乳类感染性病毒来源肽。
(7)根据(6)中记载的融合蛋白，其中，所述哺乳类感染性病毒来源肽为细小病毒的衣壳蛋白vp2、猫免疫缺陷病毒的包膜蛋白gp120、猪流行性腹泻病毒的突刺蛋白、或轮状病毒的衣壳蛋白vp7的部分序列。
(8)根据(7)中记载的融合蛋白，其中，所述细小病毒的衣壳蛋白vp2的部分序列具有与以序列号33或39表示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列，猫免疫缺陷病毒的包膜蛋白gp120的部分序列具有与以序列号43表示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列，猪流行性腹泻病毒的突刺蛋白的部分序列具有与以序列号50表示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列，或轮状病毒的衣壳蛋白vp7的部分序列具有与以序列号56或63表示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列。
(9)根据(1)～(8)中任一项记载的融合蛋白，其中，所述2个以上的蛋白质包含stx2eb和ltb。
(10)根据(1)～(9)中任一项记载的防治剂，stx2eb的73位的asn残基被取代为ser残基。
(11)根据(1)～(10)中任一项记载的融合蛋白，其中，所述抗原肽与构成所述2个以上的蛋白质的毒素b亚基分别被经由肽接头连结。
(12)根据(11)中记载的融合蛋白，其中，所述肽接头是具有pg12(序列号2)、pg12v2(序列号4)、pg17(序列号25)、或pg22(序列号26)、或与这些序列具有80％以上同源性的氨基酸序列的肽。
(13)根据(1)～(12)中任一项记载的融合蛋白，其以序列号20或22的氨基酸序列或者与序列号20或22的同源性为80％以上的氨基酸序列表示。
(14)一种dna，其对(1)～(13)中任一项记载的融合蛋白进行编码。
(15)一种dna构建物，其包含(14)中记载的dna。
(16)一种重组载体，其包含(15)中记载的dna构建物。
(17)一种转化体，其由(16)中记载的载体进行了转化。
(18)根据(17)中记载的转化体，其中，所述转化体为植物或酵母。
(19)一种疫苗，其包含(1)～(13)中任一项记载的融合蛋白或(17)或(18)中记载的转化体。
(20)一种动物用饲料，其包含(1)～(13)中任一项记载的融合蛋白或(17)或(18)中记载的转化体。
(21)一种非人哺乳动物的免疫增强方法，其特征在于，将(1)～(13)中任一项记载的融合蛋白或(17)或(18)中记载的转化体向非人哺乳动物施用。
发明效果
利用本发明，可以大幅度提高免疫诱导效率，能够提供针对免疫原性低的抗原的疫苗。本发明中，例如可以使生菜(レタス)等可食用植物中蓄积疫苗抗原而向动物进行经口施用，因此可以期待节约成本化、省力化、由家畜的压力减轻带来的生产率的提高。
附图说明
图1是表示导入生菜中的融合蛋白的表达盒的图。
图2是表示疫苗生菜的小鼠经口施用程序的图。
图3是表示生菜中的疫苗蛋白质的表达的图(局部、照片)。(a)是ltb-mstp的western分析，(b)是ltb-stx2eb-mstp及stx2eb-ltb-mstp的western分析，(c)是生菜中的蓄积量。
图4是表示疫苗生菜施用小鼠的抗stpiga抗体效价的图。
图5是表示导入酵母中的融合蛋白的表达盒的图。
图6是表示借助westernblot的酵母中的疫苗蛋白质的表达分析的结果的图(照片)。
图7是表示借助westernblot的在大肠杆菌中表达的疫苗蛋白质(lbvp2)的纯化的结果的图(照片)。
图8是表示借助固相化有lbvp2或vp2的elisa的、用疫苗蛋白质(lbvp2)免疫了的兔子的抗体效价的评价结果(与稀释率的关系)的图。
图9是表示借助固相化有lbvp2或vp2的elisa的、用疫苗蛋白质(lbvp2)免疫了的兔子的抗体效价的评价结果(经时变化)的图。使用了稀释5000倍的血液。
图10是表示生菜中的lbvp2疫苗蛋白质的表达的图(照片)。三角表示lbvp2蛋白质。星号表示非特异性的信号。泳道上的数字表示独立的生菜重组体的系统编号。wt表示来自于非重组体的样品。
具体实施方式
以下，对本发明进行说明。
本发明的融合蛋白是包含抗原肽和佐剂蛋白质的融合蛋白，所述佐剂蛋白质包含选自志贺毒素2e的b亚基(stx2eb)、大肠杆菌不耐热毒素的b亚基(ltb)及霍乱毒素的b亚基(ctb)中的2个以上的蛋白质。
＜抗原肽＞
抗原肽只要是prrs病毒的糖蛋白5来源肽以外的肽、且为可以在所施用的非人哺乳动物中引起抗原抗体反应的肽，就没有特别限制，其序列、长度也没有特别限制。其长度优选为10～100个氨基酸。需要说明的是，在抗原肽中，也不包含stx2eb、ltb、ctb。
作为抗原肽，可以例示出病原体来源的肽，可以举出大肠杆菌、支原体、沙门氏菌等病原性细菌所产生的肽，例如毒素(stx2eb、ltb、ctb以外)或细胞壁构成蛋白质；哺乳类感染性病毒来源肽、例如包膜(外被)来源肽、核衣壳(ヌクレオカプシド)来源肽等。
作为抗原肽的一例，可以举出作为大肠杆菌性腹泻症的原因毒素的耐热性毒素st。st有18氨基酸的stp(猪型)和19氨基酸sth(人型)等，在融合蛋白的施用对象为猪的情况下，使用stp。
作为用作抗原的stp，例如可以使用具有序列号16的氨基酸序列的无毒化变异体(mstp)(sato等人，1994)。但是，只要是可以引起对stp的抗原抗体反应的肽，则以序列号16表示的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸也可以被取代、缺失、插入或附加。作为所述“多个”，例如为2～10个，优选为2～5个，更优选为2～3个。另外，stp也可以是与以序列号16表示的氨基酸序列具有优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的同源性的肽。
作为抗原肽的其他例子，可以举出细小病毒的衣壳蛋白vp2的中和表位、猫免疫缺陷病毒的包膜蛋白gp120的中和表位、猪流行性腹泻病毒的突刺蛋白的中和表位、轮状病毒的衣壳蛋白vp7的中和表位。但是，病毒来源的抗原肽并不限定于这些，可以应用来源于各种病毒的各种肽，其序列也可以从公知的序列的比对等中适当地设定。可以仅利用一种表位，另外也可以对多个表位进行多重连结而利用。
以下，例示出上述病毒蛋白质的中和表位来源的抗原肽的氨基酸序列。
狗细小病毒的衣壳蛋白vp2的中和表位···序列号33
猪细小病毒的衣壳蛋白vp2的中和表位···序列号39
猫免疫缺陷病毒的包膜蛋白gp120的中和表位···序列号43
猪流行性腹泻病毒的突刺蛋白的中和表位···序列号50
轮状病毒a型的衣壳蛋白vp7的中和表位···序列号56
轮状病毒c型的衣壳蛋白vp7的中和表位···序列号63
但是，只要是可以引起对各病毒蛋白质的抗原抗体反应的肽，则以序列号33、39、43、50、56、或63表示的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸也可以被取代、缺失、插入或附加。作为所述“多个”，例如为2～10个，优选为2～5个，更优选为2～3个。另外，抗原肽也可以是与以序列号33、39、43、50、56、或63表示的氨基酸序列具有优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的同源性的肽。
＜佐剂蛋白质＞
佐剂蛋白质包含选自stx2eb、ltb及ctb中的2个以上的蛋白质。作为2个以上，优选为2～5，更优选为2～3，进一步优选为2。需要说明的是，所谓2个以上的蛋白质，可以是包含2个以上的选自stx2eb、ltb及ctb中的任意一种毒素b亚基的方式，也可以是合计包含2个以上选自stx2eb、ltb及ctb中的2种毒素的方式，还可以是合计包含3个以上stx2eb、ltb及ctb的方式。
＜stx2eb＞
志贺毒素(stx)是成为浮肿病的原因的肠道出血性大肠杆菌(ehec，stec)所产生的蛋白质性毒素，分为1型(stx1)及2型(stx2)。stx1被分类为a～d亚型，stx2被分类为a～g亚型。该志贺毒素是由作为毒性主体的1分子a亚基和对于与肠道粘膜的结合发挥作用的5分子b亚基构成的全毒素(ホロ毒素)，具有作用于真核细胞的核糖体、阻碍蛋白质合成的作用。
本发明中所使用的stx2e的b亚基(stx2eb)例如以序列号8的氨基酸序列表示。序列号8表示stx2eb亚基蛋白质(genbankaccessionno.aaq63639)的成熟区域(除去向细胞周质(ペリプラズム)分泌的分泌信号肽以外的、ala19～asn87)的氨基酸序列。
另外，stx2eb例如也可以是asn73(序列号8的氨基酸序列的55位的asn残基)被取代为ser残基的突变型。将序列号8的氨基酸序列的55位的asn残基被取代为ser的氨基酸序列(asn73ser)用序列号10表示。
另外，stx2eb只要是可以作为融合蛋白向猪等动物施用而发挥佐剂效果，则以序列号8或10表示的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸也可以被取代、缺失、插入或附加。作为所述“多个”，例如为2～10个，优选为2～5个，更优选为2～3个。
另外，stx2eb也可以是与以序列号8或10表示的氨基酸序列具有优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的同源性、并且可以作为融合蛋白向猪等动物施用而发挥佐剂效果的氨基酸序列。
＜ltb＞
关于大肠杆菌性腹泻症，其原因在于毒素原性大肠杆菌(etec)所生产的蛋白质性毒素lt，lt也被称作大肠杆菌不耐热毒素。大肠杆菌不耐热毒素(lt)是由作为毒性主体的1分子a亚基和5分子b亚基构成的全毒素。lt的a亚基(lta)侵入细胞质内，使细胞内camp浓度升高，使细胞膜氯离子通道活化，由此引起水向肠道内的漏出，即腹泻的病状。lt的b亚基(ltb)是无毒的，其参与lt毒素与肠道细胞的粘附。
本发明中所使用的ltb例如以序列号12的氨基酸序列表示。ltb只要是可以作为融合蛋白向猪等动物施用而发挥佐剂效果，则以序列号12表示的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸也可以被取代、缺失、插入或附加。作为所述“多个”，例如为2～10个，优选为2～5个，更优选为2～3个。以序列号12表示的氨基酸序列被登记为genbankaccessionno.aal55672。
另外，ltb也可以是与以序列号12表示的氨基酸序列具有85％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上的同源性、并且可以作为融合蛋白向猪等动物施用而发挥佐剂效果的氨基酸序列。
本发明的其他实施方式中，也可以在ltb上附加有糖链。例如，向ltb的90位(即序列号12的90位)的asn残基附加n-结合型的糖链。将序列号12的90位被取代为ser残基的ltb的氨基酸序列用序列号14表示。
＜ctb＞
霍乱毒素(ct)蛋白质由作为毒性主体的1个a亚基(cta)和参与向肠道粘膜的侵入的5个b亚基(ctb)构成。
本发明中所使用的ctb例如以序列号6的氨基酸序列表示。ctb只要是可以作为融合蛋白向猪等动物施用而发挥佐剂效果，则以序列号6表示的氨基酸序列中的1个或多个氨基酸也可以被取代、缺失、插入或附加。作为所述“多个”，例如为2～10个，优选为2～5个，更优选为2～3个。
另外，ctb也可以是与以序列号6表示的氨基酸序列具有85％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上的同源性、并且可以向猪等动物施用而发挥佐剂效果的氨基酸序列。
构成本发明的融合蛋白的佐剂部分的2个以上的毒素肽只要是从stx2eb、ltb、ctb中任意选择的2个以上的毒素b亚基即可，优选为stx2eb与ltb的组合。本发明中，stx2eb与ltb被融合的顺序无论哪个在前都可以。
本发明的优选的实施方式中，st等抗原肽与从stx2eb、ltb、ctb中任意选择的2个以上的毒素b亚基分别被经由肽接头串联连结。
本发明中所用的肽接头的氨基酸的个数例如为5～25个，优选为10～25个，更优选为10～22个，进一步优选为12～22个。另外，本发明中所用的肽接头中，优选脯氨酸的含有率为20～27％，更优选为、20～25％。
肽接头中，脯氨酸优选被每隔2个地配置，或者每隔3个地配置。配置于脯氨酸之间的氨基酸优选选自甘氨酸、丝氨酸、精氨酸。但是，也可以在肽的一方或两方的末端，在5个以内、优选在4个以内的范围中附加脯氨酸以外的氨基酸。此种优选的肽接头例如记载于国际公开wo2009/133882号小册子中。
本发明中，肽接头优选为由以序列号2表示的氨基酸序列构成的肽(pg12)或由以序列号4表示的氨基酸序列构成的肽(pg12v2)。另外，也可以合适地使用由以序列号25表示的氨基酸序列构成的肽(pg17)或由以序列号26表示的氨基酸序列构成的肽(pg22)。
本发明中，肽接头优选为与由以序列号2、4、25或26表示的氨基酸序列构成的肽具有80％以上、更优选为90％以上的同源性的肽。
通过使用如上所述的肽接头，可以提高融合蛋白的稳定性，使之大量蓄积于宿主细胞中。
另外，本发明中所用的融合蛋白也可以还在其c末端附加有所述肽接头。
本发明中所用的融合蛋白例如具有以序列号20或22表示的氨基酸序列。具有以序列号20或22表示的氨基酸序列的融合蛋白将stx2eb、ltb、和mstp经由pg12串联连结。
在植物中表达本发明中所用的融合蛋白等情况下，也可以在其氨基末端附加有植物来源的分泌信号肽或叶绿体转移信号肽。此处，所谓“附加”，是既包括在经由所述肽连结的融合蛋白的氨基末端上直接结合所述分泌信号肽的情况、也包括经由其他的肽结合的情况的概念。
分泌信号肽优选来自属于茄科(solanaceae)、十字花科(brassicaceae)、菊科(asteraceae)的植物，更优选来自属于烟草属(nicotiana)、拟南芥属(arabidopsis)、莴苣属(lactuca)等的植物，进一步优选来自烟草(nicotianatabacum)、拟南芥(arabidopsisthaliana)、生菜(lactucasativa)等。
另外，分泌信号肽优选来自烟草的β-d葡聚糖外切水解酶(β-d葡聚糖外切水解酶)、烟草的38kda过氧化物酶(genbankaccessiond42064)。作为所述分泌信号肽，例如可以举出来自烟草的β-d葡聚糖外切水解酶的具有以序列号28表示的氨基酸序列的肽。编码烟草的β-d葡聚糖外切水解酶的dna的碱基序列例如以序列号27表示。
优选的叶绿体转移信号肽例如记载于国际公开wo2009/004842号小册子及国际公开wo2009/133882号小册子中。
此外，在植物中表达本发明中所用的融合蛋白等情况下，也可以在其羧基末端附加有内质网滞留信号肽、液泡运输信号肽等信号肽。此处，所谓“附加”，是既包括在所述融合蛋白的羧基末端直接结合信号肽的情况、也包括经由其他的肽结合的情况的概念。本说明书中，将在氨基末端附加有分泌信号肽、并且在羧基末端附加有内质网滞留信号肽的杂合蛋白质也称作内质网型(er)的杂合蛋白质，将编码该内质网型的融合蛋白的dna构建物也称作内质网型的dna构建物。内质网型的融合蛋白在真核生物中有效蓄积的报告例有很多。
本发明中所用的融合蛋白在其羧基末端优选附加有内质网滞留信号肽。优选的内质网滞留信号肽例如记载于国际公开wo2009/004842号小册子及国际公开wo2009/133882号小册子中，可以利用hdel序列(序列号29)。
其他的优选的液泡运输信号肽例如记载于国际公开wo2009/004842号小册子及国际公开wo2009/133882号小册子中。
本发明中所用的融合蛋白既可以化学合成，也可以通过基因工程来生产。
在通过基因工程来生产的情况下，使用包含编码融合蛋白的dna的dna构建物。本发明中所用的dna构建物包含将编码st等抗原肽的dna、与编码stx2eb的dna和编码ltb的dna、编码stx2eb的dna和编码ctb的dna或编码ltb的dna和编码ctb的dna经由编码所述接头肽的dna串联地连结的dna。编码所述接头肽的dna例如以序列号1(pg12)或序列号3(pg12v2)等表示。作为编码stx2eb的dna，例如可以举出编码stx2eb(asn73)的dna(序列号7)、编码stx2eb(asn73ser)的dna(序列号9)。作为编码ltb的dna，例如可以举出编码ltb(asn90)的dna(序列号11)、编码ltb(asn90ser)的dna(序列号13)。作为编码ctb的dna，例如可以举出具有序列号5的碱基序列的dna。
编码抗原肽的dna可以基于公知的信息利用pcr等方法获取，例如作为编码mstp的dna，可以举出具有序列号15的碱基序列的dna。
编码所述抗原肽的dna、编码接头肽的dna、毒素b亚基dna被分别去除终止密码子后合并阅读框而连结。
编码stx2eb、ltb、ctb的dna例如可以基于序列号7、9、11、13、5的碱基序列利用一般的基因工程的方法得到。具体而言，由生产各毒素的细菌依照常法制备cdna文库，从该文库中通过使用基于上述碱基序列制备出的探针选择所期望的克隆。另外，也可以利用基于上述碱基序列的化学合成、将上述碱基序列的5’及3’末端的碱基序列作为引物、将基因组dna作为模板的pcr等进行合成。通过将它们利用公知的方法与编码接头的dna连结而可以得到编码融合蛋白的dna。
编码本发明中所用的融合蛋白的dna例如以序列号19或21表示。
另外，编码融合蛋白的dna也可以是与具有序列号19或21的碱基序列的dna在严格的条件下杂交的dna。所谓“严格的条件”，是指形成所谓的特异性杂交且不形成非特异性杂交的条件。例如，可以举出同源性高的两个dna之间、优选具有80％以上、更优选具有90％以上、特别优选具有95％以上的同源性的两个dna杂交、且同源性低于该值的两个dna不杂交的条件。例如可以举出2×ssc(330mmnacl、30mm柠檬酸)、42℃，优选举出0.1×ssc(330mmnacl、30mm柠檬酸)、60℃。
编码融合蛋白的dna也优选根据生产该蛋白质的宿主细胞以使杂合蛋白质的翻译量增大的方式适当地改变表示构成融合蛋白的氨基酸的密码子。
作为改变密码子的方法，例如可以参考kang等人(2004)的方法。另外，可以举出选择宿主细胞中使用频率高的密码子、选择gc含量高的密码子、或选择宿主细胞的管家基因中使用频率高的密码子的方法。
本发明中所用的dna构建物中，优选编码所述融合蛋白的dna可表达地与增强子连结。此处，所谓“可表达”，是指本发明中所用的dna构建物被插入到包含适当的启动子的载体中，在该载体被导入适当的宿主细胞中时，在宿主细胞内生产所述融合蛋白。另外，所谓“连结”，是既包括2个dna直接结合的情况、也包括经由其他的碱基序列结合的情况的概念。
作为增强子，可以举出kozak序列、植物来源的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区。在植物中表达等时，优选编码所述杂合蛋白质的dna与植物来源的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区可表达地连结。
所谓醇脱氢酶基因的5’-非翻译区，是指包含从编码醇脱氢酶的基因的转录起始点到翻译起始点(atg、蛋氨酸)之前的碱基序列的区域。所述区域只要是来源于植物即可，优选来自属于茄科(solanaceae)、十字花科(brassicaceae)、菊科(asteraceae)的植物，更优选来自属于烟草属(nicotiana)、拟南芥属(arabidopsis)、莴苣属(lactuca)等的植物，进一步优选来自烟草(nicotianatabacum)、拟南芥(arabidopsisthaliana)、生菜(lactucasativa)等。
作为所述醇脱氢酶基因的5’-非翻译区，例如可以使用烟草(nicotianatabacum)来源的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区(ntadh5′utr)(序列号30)，通过使用改变了翻译起始点上游3碱基的ntadh5′utr区(ntadhmod5′utr)(序列号31)，可以期待更高的翻译。
获得植物来源的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区的方法例如记载于日本特开2012-19719号公报及国际公开wo2009/133882号小册子中。
本发明中所用的dna构建物可以利用一般的基因工程的方法制作，可以通过将植物来源的醇脱氢酶基因的5’-非翻译区、植物来源的编码分泌信号肽的dna、以及编码融合蛋白的dna、编码内质网滞留信号肽的dna等各dna分别利用适当的限制酶切割、并用适当的连接酶连结来构建。
本发明中所用的重组载体的特征在于，包含所述dna构建物。本发明中所用的重组载体只要是编码所述融合蛋白的dna以在导入有载体的宿主细胞中可表达的方式插入到载体内即可。载体只要是能够在宿主细胞中复制，就没有特别限制，例如可以举出质粒dna、病毒dna等。另外，载体优选包含耐药性基因等选择标记。质粒dna可以由大肠杆菌、农杆菌通过碱提取法(birnboim，h.c.&doly，j.(1979)nucleicacidres7:1513)或碱提取法的变体等来制备。另外，也可以作为市售的质粒，例如使用pbi221、pbi121、pbi101、pig121hm等。作为病毒dna，例如可以使用ptb2(donson等人，1991)等(参照donsonj.，kerneycm.，hilfme.，dawsonwo.systemicexpressionofabacterialgenebyatobaccomosaicvirus-basedvector.proc.natl.acad.sci.(1991)88:7204-7208。)
载体内所用的启动子可以根据导入有载体的宿主细胞适当地选择。例如，优选使用花椰菜花叶病毒35s启动子(odell等人1985nature313：810)、水稻的肌动蛋白启动子(zhang等人1991plantcell3：1155)、玉米的泛素启动子(cornejo等人1993plantmol.biol.23：567)等。另外，载体内所用的终止子也同样地可以根据导入有载体的宿主细胞适当地选择。例如，优选使用胭脂碱合成酶基因转录终止子、花椰菜花叶病毒35s终止子、拟南芥热休克蛋白18.2基因的终止子(hsp-t)等。本发明中所使用的优选的终止子例如为以序列号32表示的hsp-t。
本发明中所用的重组载体例如可以如下所示地制作。
首先，将所述dna构建物用适当的限制酶切割或利用pcr附加限制酶位点，插入到载体的限制酶位点或多克隆位点。
本发明中所用的转化体的特征在于，用所述重组载体进行了转化。转化中所用的宿主细胞可以是真核细胞及原核细胞的任意种。
作为真核细胞，可以是哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞等，优选使用植物细胞，其中优选使用属于莴苣属(lactuca)等的菊科(asteraceae)、茄科、十字花科、藜科的植物的细胞。进一步优选使用属于莴苣属(lactuca)的植物的细胞，其中优选使用生菜(lactucasativa)细胞。在作为宿主细胞使用生菜细胞时，载体可以使用花椰菜花叶病毒35srna启动子等。
作为原核细胞，可以使用大肠杆菌(escherichiacoli)、农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)等。
本发明中所用的转化体可以通过使用一般的基因工程的方法将本发明中所用的载体导入宿主细胞而制作。例如，可以使用利用了农杆菌的导入方法(hood等人，1993，transgenic，res.2：218，hiei等人，1994plantj.6：271)、电穿孔法(tada等人，1990，theor.appl.genet，80：475)、聚乙二醇法(lazzeri等人，1991，theor.appl.genet.81：437)、基因枪法(sanford等人，1987，j.part.sci.tech.5：27)、聚阳离子法(ohtsuki等人，febslett.1998may29；428(3):235-40.)等方法。
将本发明中所用的载体导入宿主细胞后，可以根据选择标记的表现型来筛选所述转化体。另外，可以通过培养筛选出的转化体来生产所述融合蛋白。培养中所用的培养基及条件可以根据转化体的种类适当地选择。
另外，在宿主细胞为植物细胞的情况下，通过依照常法培养筛选出的植物细胞，可以将植物体再生，可以在植物细胞内或植物细胞的细胞膜外蓄积所述融合蛋白。例如，根据植物细胞的种类而不同，如果是马铃薯，则可以举出visser等人(theor.appl.genet78：594(1989))的方法，如果是烟草，则可以举出nagata与takebe(planta99：12(1971))的方法。
在生菜的情况下，例如可以在包含0.1mg/l的naa(萘乙酸)、0.05mg/l的ba(苄基腺嘌呤)及0.5g/l的聚乙烯基吡咯烷酮的ms培养基中使芽再生，并可以通过将再生的芽在包含0.5g/l的聚乙烯基吡咯烷酮的1/2ms培养基中培养而生根。
另外，从如上所述地再生了的植物体中采集种子，将其用适当的方法播种、栽培，由此可以制成生产所述融合蛋白的植物体，此种植物体也包含于所述转化体中。
农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)是通过植物的伤口而感染，运输被称作肿瘤诱发性的ti(tumor-inducing)质粒的大的染色体外因子。在许多研究所中，经过数年深入研究后，通过农杆菌系的开发，能够将各种植物组织按照常规进行转化。作为利用该技术转化了的代表性植物，有烟草、番茄、向日葵、棉、油菜籽、马铃薯、白杨、以及大豆、草莓、水稻等。
对于各种植物，证实了从利用农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)进行了转化的组织再生植物的情况。作为该植物，可以举出向日葵、番茄、白三叶草(シロツメクサ)、油菜(アブラナ)、棉花、烟草、马铃薯、玉米、草莓、水稻、其他许多蔬菜作物。
本发明中，也可以利用农杆菌ti载体转化以上述生菜为首的可食用植物。
本发明的疫苗只要是包含所述融合蛋白的疫苗即可，也可以包含用编码所述融合蛋白的dna进行了转化的转化体。本发明的疫苗可以含有包含所述融合蛋白的转化体的全部，也可以含有一部分。另外，可以直接使用转化体，也可以进行干燥、粉碎等后使用。另外，在本发明的疫苗中，也可以配合进一步提高融合蛋白的免疫原性的佐剂。一般而言，考虑到安全性而将氢氧化铝、大肠杆菌的粘附因子、例如大肠杆菌的鞭毛等作为佐剂使用。
通过施用本发明的疫苗，可以提高对抗原肽的免疫，可以期待对抗原肽所起源的病原体引起的疾病的防治效果。例如，在抗原肽使用st的情况下，可以期待对大肠杆菌性腹泻症的防治效果。
本发明的免疫增强方法的特征在于，将用所述dna构建物进行了转化的植物体等转化体或其干燥物或粉碎物向动物施用。作为施用对象，可以举出猪、牛、鸡、绵羊、山羊、狗、猫等非人哺乳动物、鱼类。另外，作为对象疾病，如果是猪，则可以举出布氏杆菌病、炭疽、破伤风、猪丹毒、猪血痢、沙门氏菌病、大肠杆菌病、萎缩性鼻炎、放线菌病、支原体感染症、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻症、猪流感、日本脑炎、伪狂犬病(オーエスキー病)、口蹄疫、猪水泡病、猪霍乱、猪白血病、猪生殖器/呼吸器官障碍综合症、轮状病毒、蛔虫病、肺虫病、弓浆虫病、球虫病等。作为牛的对象疾病，可以举出牛肺疫、炭疽病、出血性败血症、布氏杆菌病、结核病、沙门氏菌病、破伤风、牛疫、口蹄疫、流行性脑炎、狂犬病、水泡性口炎、裂谷热病、副结核病(ヨーネ病)、蓝舌病、赤羽病、中山病、多囊性皮肤病、牛病毒性腹泻、牛白血病、梨浆虫病(ピロプラズマ病)、微粒孢子虫病(アナプラズマ病)等。作为鸡的对象疾病，可以举出沙门氏菌感染症、支原体病、鸡大肠杆菌症、副鸡嗜血杆菌病(ヘモフィルス)、鸡新城疫、高病原性禽流感、毒鸡传染性支气管炎、鸡痘、鸡脑脊髄炎、球虫病等。作为山羊的对象疾病，可以举出炭疽病、布氏杆菌病、结核病、中山病、口蹄疫、赤羽病等。作为狗的对象疾病，可以举出钩端螺旋体病、细菌性肠炎、狂犬病、细小病毒感染症、犬瘟病毒感染症、犬传染性支气管炎(犬窝咳(ケンネルコフ))、冠状病毒(コロナウイルス)感染、疱疹病毒感染症、巴贝虫病等。作为猫的对象疾病，可以举出猫支原体感染症、立克次氏体感染症、狂犬病、猫白血病病毒感染症、猫疱疹病毒感染症、猫免疫缺陷病毒(fiv)感染症、猫杯状病毒感染症、猫病毒性鼻气管炎(fvr)、猫丝虫病等。作为鱼的对象疾病，可以举出链球菌、弧菌病、虹彩病毒(イリドウイルス)感染症等。
在将本发明的疫苗向猪施用时，例如可以向哺乳期～120日龄的猪施用，优选对哺乳期～90日龄的猪进行施用，另外优选对繁殖期前后的母猪进行施用。作为免疫的方法，可以举出将用所述dna构建物进行了转化的植物体向母猪施用并将母猪所产生的抗体通过乳汁提供给仔猪的方法、将用所述dna构建物进行了转化的植物体向哺乳期～90日龄的仔猪施用并对仔猪进行直接免疫的方法等。
作为将本发明的疫苗向猪等动物施用的方法，可以举出向猪的饲料中混合用所述dna构建物进行了转化的植物体或其干燥物或粉碎物后提供的方法、点鼻的方法等。本发明的疫苗优选隔开一定的间隔地多次施用。例如，可以举出每隔4～7天合计施用2～3次的方法。
以下，对本发明的实施例进行说明，然而本发明并不限定于该实施例。
[实施例]
实施例1
＜大肠杆菌表达用疫苗基因的构建＞
作为疫苗抗原候选，使用了1)毒素原生大肠杆菌所生产的不耐热毒素的无毒b亚基(ltb：序列号12)、2)毒素原生大肠杆菌所生产的stp毒素的无毒化变异体(ntfyccelccnplcagcy(序列号16)、以下记作mstp)(sato等人，1994)、3)肠管出血性大肠杆菌所生产的志贺毒素2e的无毒b亚基(stx2eb)。此时，stx2eb使用了无糖链stx2eb(将从n末端起第73号的天冬氨酸取代为丝氨酸)(序列号10)。对编码mstp的dna使用stpa13l-f(5’-gatccaacaccttctactgctgcgagttgtgctgc-3’：序列号23)和stpa13l-r(5’-gatctgtagcagccggcgcacaaggggttgcagcacaactc：序列号24)进行了扩增。
分别构建将ltb与mstp经由pg12接头(matsui等人，transgenicres，2011，20:735-48：序列号2)进行了融合的ltb-mstp(序列号18)、将ltb与stx2eb依照该次序或相反的次序融合再在它们的c末端融合了mstp的ltb-stx2eb-mstp(序列号20)、stx2eb-ltb-mstp(序列号22)。使用了近傍序列改变型ntadh5’-utr(序列号31)和长链型athsp终止子(matsui等人，plantbiotech.，2014，31:191-194：序列号32)。然后，通过使用烟草来源β-d葡聚糖外切水解酶分泌信号肽编码序列(序列号27)而实现了复合化疫苗抗原候选蛋白质的高蓄积化。将构建出的基因盒导入双元载体pri909(takara)，用于生菜的转化(图1)。
＜利用农杆菌向生菜中导入基因＞
将生菜(lactucasatival.)品种greenwave(takii种苗)无菌播种于ms培养基[1/2×murashige和skoog培养基用混合盐类(ms盐、和光纯药工业)、1×murashige和skoog维生素溶液(ms维生素、sigma-aldrich)、3％蔗糖、0.8％琼脂、ph5.8]中后，将第10～16天的真叶切割为5mm见方左右，将该切片在保持具有载体构建物的双元质粒(pri909)的农杆菌(agrobacteriumtumefacienceeha105)悬浮液中浸渍10分钟后，接种于共存培养基[1×ms盐、1×ms维生素、0.05mg/l6-苄基氨基嘌呤(ba)、0.1mg/l1-萘基乙酸(naa)、0.1m乙酰丁香酮、3％蔗糖、0.8％琼脂、ph5.8]中，在25℃、暗处培养2天。用灭菌水清洗切片后，接种于选择性培养基[1×ms盐、1×ms维生素、0.05mg/lba、0.1mg/lnaa、0.5g/l聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、50mg/l卡那霉素(km)、250mg头孢噻肟(cef)、3％蔗糖、0.8％琼脂、ph5.8]中，在25℃、荧光灯下(2000-3000lux)进行了培养。然后，直到获得不定芽为止，以每3～4天一次(2次/周)的间隔将其移植到新的选择性培养基。将由不定芽形成的再分化个体移植到生根培养基[1/2×ms盐、1×ms维生素、0.5g/lpvp、250mgcef、3％蔗糖、0.8％琼脂、ph5.8]中，在相同条件下进行了培养。然后，以每3～4天一次(2次/周)的间隔将其移植到新的生根培养基。将生根了的再分化个体进行盆栽，在相同条件下进行了栽培。
＜从生菜中提取蛋白质＞
蛋白质提取依照tca-acetone法(shultz等人plantmolbiolrep，2005，23:405)进行，在液氮冷冻后，使用在-80℃保存的基因导入生菜真叶进行。将100～200mg的样品用tissuelyzerii(qiagen)破碎后，添加样品的5倍量的tca-acetone(10％三氯乙酸、90％丙酮、0.07％2-巯基乙醇)并混合，在-20℃静置1小时后，进行16000×g、4℃、30分钟离心操作，除去上清液，得到包含蛋白质的沉淀。继而为了除去夹杂物，添加样品的5倍量的acetone/bme(100％丙酮、0.07％2-巯基乙醇)并混合，进行16000×g、4℃、10分钟离心操作，除去上清液。再进行2次本夹杂物除去操作。沉淀在减压干燥后，悬浮于样品的2倍量的提取i缓冲液[0.5m氯化钠、5mm咪唑、6m尿素、20mm三羟基甲基氨基甲烷(tris)-hcl、ph7.9]中，进行16000×g、4℃、10分钟离心，回收上清液，得到蛋白质溶液。使用proteinassaykitii(bio-rad)进行蛋白质浓度的测定。
＜western分析＞
将适量的所得的蛋白质溶液加入微型管中，加入同量的样品缓冲液(ezapply、atto制)并混合，在沸水中加热5分钟，进行了样品的sds化。作为蛋白质定量时的标准物质使用了纯化ltb+。通过将其用提取i缓冲液反复进行2倍稀释而制成稀释系列，将这些稀释系列作为标准品使用。
蛋白质的电泳(sds-page)使用了电泳槽(miniproteantetracell)及miniproteantgx-gel(biorad)。加入电泳缓冲液(ezrun、atto制)，向孔中加入sds化了的样品5μl，在200v恒电压下进行了40分钟电泳。
对于电泳后的凝胶，使用trans-blot转印包(biorad)，用trans-blotturbo(biorad)进行了印迹(blotting)。
将印迹后的膜浸渍于封闭溶液(tbs系，ph7.2、naclaitesque)中，在室温下振荡1小时或在4℃下静置16小时后，在tbs-t(137mm氯化钠、2.68mm氯化钾、1％聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、25mmtris-hcl、ph7.4)中进行3次室温下的5分钟振荡而清洗。在ltb蛋白质的检测时，将抗血清rabbit-antiserumanti-ltp991109(inactive)(0.1％nan3)ao用tbs-t稀释10000倍后使用。通过将膜浸渍于本稀释液中，在室温下振荡2小时而进行抗原抗体反应，在tbs-t中进行3次室温下的5分钟的振荡而清洗。二次抗体使用了用tbs-t稀释10000倍的anti-rabbitigg、ap-linkedantibody(cellsignalingtechnology)。通过将膜浸渍于本稀释液中、在室温下振荡1小时而进行抗原抗体反应，在tbs-t中进行3次室温下的5分钟的振荡而清洗。利用碱性磷酸酶的显色反应是通过将膜浸渍于显色液(0.1m氯化钠、5mm氯化镁、0.33mg/ml硝基四氮唑蓝、0.33mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸、0.1mtris-hcl、ph9.5)中，在室温下进行7分钟振荡而进行，用蒸馏水清洗膜后，在常温下干燥。
将显色了的膜利用扫描仪(pm-a900、爱普生)以析像度600dpi进行图像化，使用图像分析软件(csanalyzerver.3.0、atto)，进行了ltb蛋白质的定量。
＜重组生菜的小鼠经口免疫＞
引入6周龄的balb/c雌性小鼠，进行驯化、免疫前采血，从8周龄起开始免疫。将包含相当于730μg的ltb的重组生菜末用生理食盐水悬浮后，使用胃探棒进行经口施用。经口施用是每7天进行4次(图2)。肠道清洗液的采集是从小肠回盲部切取5cm，用5ml的pbs清洗。直到使用时以前在-80℃保存，在测定抗体效价时添加蛋白酶抑制剂。
＜抗体效价的测定＞
抗体效价的测定是使用将2.5μg/ml的抗原用100μl/well固相化了的elisa板(maxisorp：nunc)进行。对于抗原，就抗stx2eb抗体而言使用纯化了的无毒化stx2eb，就ltp抗体而言使用纯化了的ltp，就抗mstp抗体而言使用合成stp肽。对于受测血清，用包含牛血清白蛋白(0.1％w/v)的稀释液制作2倍稀释系列，加入elisa板。利用作为2次抗体使用辣根过氧化物酶(hrp)标记抗体、作为底物使用过氧化氢、abts(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonicacid))的显色法进行了检测。将相对于作为阴性对照的稀释液而言的吸光度的平均2倍值以上的吸光度设为抗体效价阳性，将达到阳性的最大稀释率作为该血清的抗体效价。在对免疫前血清检测出抗体效价时，将去除免疫前血清的抗体效价值而得的值作为该血清的抗体效价。
＜结果＞
(1)基因重组植物的制出
使用图1所示的构建物制出基因重组生菜。ltb-mstp导入生菜在推定分子量(约15kda)的位置检测出条带(图3a)。ltb-stx2eb-mstp和stx2eb-ltb-mstp导入生菜在推定分子量(约24kda)的位置检测出条带(图3b)。另外还检测出推定为来自于向ltb的糖链附加的信号。图3c中表示出各复合疫苗抗原的蓄积量。
(2)基因重组疫苗植物的小鼠经口免疫
将(1)中制出的基因重组生菜冷冻干燥并粉碎，向小鼠经口施用。对于施用粉末量以ltb等量统一。在解剖检查时回收小肠清洗液，测定出抗stpiga抗体效价，其结果是，在ltb-mstp施用组中观察到抗体效价升高的个体比例在10只中为3只，而ltb-stx2eb-mstp及stx2eb-ltb-mstp施用组中分别为7只、4只，确认有明确的抗体诱导(图4)。另外抗体效价滴度也是，与ltb-mstp相比在ltb-stx2eb-mstp和stx2eb-ltb-mstp组中显示出高值。
实施例2
＜基因构建＞
将针对以下的各疾病的疫苗抗原融合于ltb-stx2eb中。首先将ltb-stx2eb融合基因导入pyes2(invitrogen)。
作为狗细小病毒中和表位使用了来自于衣壳蛋白vp2的中和表位的序列(sdgavqpdggqpavrne：序列号33)(casal等人，journalofvirology，199569，7274-7277)。本表位是株间的保守性高的序列。例如以5’-tcggacggcgcggtgcagccggacggcggccagccggcggtgcggaacgag-3’(序列号34)表示dna序列。
对cp-f引物(5’-tggttctcctagatcctcggacggcgcggtgcagccggacggcggccagccggcggtg-3’：序列号35)和cp-r引物(5’-ccttagagctcccgggtactatcagtccttctcgttccgcaccgccggctggccgcc-3’：序列号36)进行退火、并用dna聚合酶进行延伸反应而制作出本中和表位区dna。另外，对相当于stx2eb的下游区的片段使用2eb-sal-f引物(5’-ggtcacgatcatctcgtcgacgtgctcgtc-3’：序列号37)和pg-r引物(5’-ggatctaggagaaccaggaccagaaccaggtcc-3’：序列号38)及作为模板的pyes2ltb-stx2eb进行pcr而扩增。将所得的中和表位片段和sts2eb片段通过同源重组使用geneartseamlesspluscloningandassemblykits(invitrogen)导入pyes2ltb-stx2eb而在c末端附加了抗原区(图5)。
作为猪细小病毒中和表位使用了来自于衣壳蛋白vp2的中和表位的序列(veqhnpinagtelsat：序列号39)(kamstrup等人，virusresearch，1998，53，163-173)。本表位是株间的保守性高的序列。例如以5’-gtggagcagcacaaccccatcaacgccggcaccgagctgtccgccacc-3’(序列号40)表示dna序列。
对pp-f引物(5’-tggttctcctagatccgtggagcagcacaaccccatcaacgccggcaccgagctg-3’：序列号41)和pp-r引物(5’-ccttagagctcccgggtactatcagtccttggtggcggacagctcggtgccggcgttgat-3’：序列号42)进行退火、并用dna聚合酶进行延伸反应而制作出本中和表位区dna。将所得的中和表位片段和前述的sts2eb片段通过同源重组使用geneartseamlesspluscloningandassemblykits(invitrogen)导入pyes2ltb-stx2eb而在c末端附加了抗原区。
作为猫免疫缺陷病毒中和表位使用了来自于包膜蛋白gp120的中和表位的序列(gswmraisswrhrnrwewrpdf：序列号43)(lombardi等人，journalofvirology，1993，67，4742-4749)。本表位是株间的保守性高的序列。例如以5’-ggctcctggatgagggccatctcctcctggaggcacaggaacaggtgggagtggaggcccgacttc-3’(序列号44)表示dna序列。
对fiv-f引物(5’-tggttctcctagatccggctcctggatgagggccatctcctcctggagg-3’：序列号45)、fiv-m引物(5’-ctcccacctgttcctgtgcctccaggaggagatggc-3’：序列号46)和fiv-r引物(5’-ccttagagctcccgggtactatcagtccttgaagtcgggcctccactcccacctgttcctgtg-3’：序列号47)进行退火、并用dna聚合酶进行延伸反应而制作出本中和表位区dna。将所得的中和表位片段和前述的sts2eb片段通过同源重组使用geneartseamlesspluscloningandassemblykits(invitrogen)导入pyes2ltb-stx2eb而在c末端附加了抗原区。
作为猪流行性腹泻病毒中和表位使用了将来自于突刺蛋白的中和表位的2种序列(ysnigvck：序列号48)(chen等人，viruses，2013，5，2601-2613)与(rgprlqpye：序列号49)(deu等人，virusresearch2008，132，192-196)融合了的序列(ysnigvckssrgprlqpye：序列号50)。本表位是株间的保守性高的序列。例如以5’-tactccaacatcggcgtctgcaagtcctcccggggcccccggttgcagccctacgag-3’(序列号51)表示dna序列。
对ped-f引物(5’-tggttctcctagatcctactccaacatcggcgtctgcaagtcctcccggggcccccgg-3’：序列号52)和ped-r引物(5’-ccttagagctcccgggtactatcagtccttctcgtagggctgcaaccgggggccccgggaggactt-3’：序列号53)进行退火、并用dna聚合酶进行延伸反应而制作出本中和表位区dna。将所得的中和表位片段和前述的sts2eb片段通过同源重组使用geneartseamlesspluscloningandassemblykits(invitrogen)导入pyes2ltb-stx2eb而在c末端附加了抗原区。
作为猪轮状病毒a型疫苗抗原候选使用了将来自于vp7蛋白质的表位的2种序列(teastqigdtewkn：序列号54)与(ttnpatfeevaknekl：序列号55)(nishikawa等人，virology，1989，171，503-515)融合了的序列(teastqigdtewknsttnpatfeevaknekl：序列号56)。例如以5’-accgaggcctccacccagatcggcgacaccgagtggaagaactccaccaccaaccccgccaccttcgaggaggtggccaagaacgagaagttg-3’(序列号57)表示dna序列。
对roa7-f引物(5’-tggttctcctagatccaccgaggcctccacccagatcggcgacaccgagtggaagaactccaccaccaaccccgcc-3’：序列号58)、roa7-m引物(5’-ggccacctcctcgaaggtggcggggttggtggtgga-3’：序列号59)和roa7-r引物(5’-ccttagagctcccgggtactatcagtccttcaacttctcgttcttggccacctcctcgaaggtggc-3’：序列号60)进行退火、并用dna聚合酶进行延伸反应而制作出本区dna。将所得的中和表位片段和前述的sts2eb片段通过同源重组使用geneartseamlesspluscloningandassemblykits(invitrogen)导入pyes2ltb-stx2eb而在c末端附加了抗原区。
作为猪轮状病毒c型疫苗抗原候选使用了将来自于vp7蛋白质的表位的2种序列(naaigspgpgkadgllndnnyaq：序列号61)与(spastetyevvsndtql：序列号62)融合了的序列(naaigspgpgkadgllndnnyaqsspastetyevvsndtql：序列号63)。例如以5’-aacgccgccatcggctcccccggccccggcaaggccgacggcctgctgaacgacaacaactacgcccagtcctcccccgcctccaccgagacctacgaggtggtgtccaacgacacccagctg-3’(序列号64)表示dna序列。
对roc7-f引物(5’-tggttctcctagatccaacgccgccatcggctcccccggccccggcaaggccgacggcctgctgaacgacaac-3’：序列号65)、roc7-m引物(5’-caccacctcgtaggtctcggtggaggcgggggaggactgggcgtagttgttgtcgttcagcaggccgtc-3’：序列号66)和roc7-r引物(5’-ccttagagctcccgggtactatcagtccttcagctgggtgtcgttggacaccacctcgtaggtctcggt-3’：序列号67)进行退火、并用dna聚合酶进行延伸反应而制作出本区dna。将所得的中和表位片段和前述的sts2eb片段通过同源重组使用geneartseamlesspluscloningandassemblykits(invitrogen)导入pyes2ltb-stx2eb而在c末端附加了抗原区。
＜酵母的转化和蛋白质表达＞
对酵母(saccharomycescerevisiaeinvsc1，invitrogen)如下所示地进行了转化。将酵母在ypd培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖(d-葡萄糖))中在30℃以200rpm振荡一夜而进行了培养。在10ml的ypd中以使od600为0.2-0.4的方式稀释后，在30℃以200rpm振荡培养，直至od600为0.6-1.0。在500xg、室温进行5分钟离心，使细胞为球团，抛弃上清液。悬浮于10ml的溶液i(s.c.easycomptransformationkit，invitrogen)中。在500xg、室温进行5分钟离心，使细胞为球团，抛弃上清液。悬浮于1ml的溶液ii(s.c.easycomptransformationkit，invitrogen)中，每次50μl地进行分注，制成感受态细胞。在使用以前保管于-80℃的冷冻库中(由于会对细胞壁造成损伤，因此不进行液氮中的急速冷冻)。
将所得的感受态细胞解冻而恢复到室温，添加1μg的pyes质粒后，添加500μl的溶液iii(室温)并进行涡旋。在30℃振荡1小时(每15分钟进行涡旋)。添加1ml的ypd培养基，在30℃进行1小时振荡培养。在3000xg、室温进行5分钟离心，使细胞为球团后除去上清液。悬浮于100μl的溶液iii中，铺到包含2％葡萄糖的sc-ura培养基(6.7g/l酵母氮源，0.1g/l腺嘌呤，0.1g/l精氨酸，0.1g/l半胱氨酸，0.1g/l亮氨酸，0.1g/l赖氨酸，0.1g/l苏氨酸，0.1g/l色氨酸，0.05g/l天门冬氨酸，0.05g/l组氨酸，0.05g/l异亮氨酸，0.05g/l蛋氨酸，0.05g/l苯丙氨酸，0.05g/l脯氨酸，0.05g/l丝氨酸，0.05g/l酪氨酸，0.05g/l缬氨酸)。在30℃静置培养2-4天。
如下所示地进行了酵母中的蛋白质表达。将转化酵母的单菌落使用包含2％棉籽糖的sc-ura培养基在30℃以200rpm进行一夜振荡培养。利用离心(1500xg、室温下5分钟)收集为使培养基10ml的od600为0.4所必需的酵母细胞，悬浮于包含2％半乳糖的sc-ura10ml中，进行了表达诱导。在30℃以200rpm进行振荡培养，随时间推移而进行取样。
＜western分析＞
加入所得的酵母培养液200μl、同量的样品缓冲液(ezapply、atto制)并混合，在沸水中加热5分钟，进行了样品的sds化。蛋白质的电泳(sds-page)使用了电泳槽(miniproteantetracell)及miniproteantgx-gel(biorad)。加入电泳缓冲液(ezrun、atto制)，向孔中加入sds化了的样品5μl，在200v恒电压下进行了40分钟电泳。
对于电泳后的凝胶，使用trans-blot转印包(biorad)，用trans-blotturbo(biorad)进行了印迹。
将印迹后的膜浸渍于封闭溶液(tbs系，ph7.2、naclaitesque)中，在室温下振荡1小时或在4℃下静置16小时后，在tbs-t(137mm氯化钠、2.68mm氯化钾、1％聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、25mmtris-hcl、ph7.4)中进行3次室温下的5分钟振荡而清洗。在疫苗蛋白质的检测时，将抗stx2eb单克隆抗体用tbs-t稀释2000倍后使用。通过将膜浸渍于本稀释液中，在室温下振荡2小时而进行抗原抗体反应，在tbs-t中进行3次室温下的5分钟的振荡而清洗。二次抗体使用了用tbs-t稀释2000倍的anti-ratigg，ap-linkedantibody(promega)。通过将膜浸渍于本稀释液中、在室温下振荡1小时而进行抗原抗体反应，在tbs-t中进行3次室温下的5分钟的振荡而清洗。利用碱性磷酸酶的显色反应是通过将膜浸渍于显色液(0.1m氯化钠、5mm氯化镁、0.33mg/ml硝基四氮唑蓝、0.33mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸、0.1mtris-hcl(ph9.5))中，在室温下进行7分钟振荡而进行，用蒸馏水清洗膜后，在常温下干燥。
＜结果＞
将基因重组酵母中的各融合抗原的表达表示于图6中。无论哪个疫苗都确认有蛋白质的蓄积。
实施例3
＜基因构建＞
与实施例2中记载的方法相同地在ltb-stx2eb的c末端作为狗细小病毒中和表位连结来自于衣壳蛋白vp2的中和表位的序列(sdgavqpdggqpavrne：序列号33)(以下表述为vp2)，再作为纯化用的标签融合6×his，制作出用于表达附加有分泌信号肽的融合蛋白(lbvp2)的基因构建物。将该基因构建物插入大肠杆菌用表达载体pet15b。将所得的表达载体转化至大肠杆菌bl21plys株。
＜使用了大肠杆菌的重组蛋白质的表达＞
将具有重组质粒的大肠杆菌的菌落接种到4根加入了包含100mg/l的氨苄青霉素的2×yt培养基5ml的试管中，以180rpm在37℃培养一夜。将该前培养液20ml接种到包含100mg/l的氨苄青霉素的2×yt培养基1l中，以180rpm在37℃培养至o.d.600为0.4左右。添加最终浓度为1mm的iptg，在22℃以120rpm培养4小时。将培养液以8000rpm离心5分钟，将所得的菌体在-80℃保管至使用时。
＜由大肠杆菌制备可溶性蛋白质＞
相对于相当1l培养液的菌体添加100ml的溶解液(10mlbugbuster，90ml平衡缓冲液，500mldnasei)，在室温进行30分钟溶菌后，以8000rpm在4℃进行15分钟离心分离。将上清液转移到新的离心沉降管中，再进行2次相同的离心分离。将所得的上清液用于纯化。
＜利用亲和柱的纯化＞
进行使用了talon(cobalt)(clontech)的纯化。将5ml树脂填充到econo-pac柱(bio-rad)中，通入平衡缓冲液50ml，进行了平衡化。将上述的蛋白质溶液与树脂混合，在室温混合30分钟。将该悬浮液送回econo-pac柱，使蛋白质溶液通过。通入10次5ml的平衡缓冲液，清洗未结合蛋白质。计测o.d.280，确认没有蛋白质的洗脱。添加洗脱缓冲液2ml，将洗脱液回收到2ml管中。再重复进行9次该洗脱操作，得到10个洗脱级分。用平衡缓冲液清洗树脂。如图7所示，可以确认lbvp2的纯化。
＜对兔子的免疫＞
将经过纯化的200mg的抗原与完全佐剂一起向2只兔子的脚垫注射。4周后将100mg的抗原与完全佐剂一起向2只兔子的脚垫注射。在免疫前进行了前采血，在初次免疫的4、5周后进行了途中采血，在6周后进行了全采血。
＜抗体效价测定＞
对各采血进行1000、5000、25000、125000倍稀释后，将免疫抗原(lbvp2)或vp2合成肽(msdgavqpdggqpavrneratg：序列号68)固相化而进行了elisa。其结果是，确认了针对lbvp2及合成vp2肽的抗体效价的升高(图8，9)。
实施例4
＜基因重组生菜的制出＞
将在实施例2中记载的ltb-stx2eb的c末端连结有狗细小病毒中和表位(以下表述为vp2)的dna片段插入实施例1中记载的作为植物表达用载体的pri909。使用所得的质粒，利用实施例1中记载的方法制作出基因重组生菜。进行使用了抗stx2eb抗体的western分析，确认了目标的lbvp2重组蛋白质的蓄积(图10)。另外，还检测出被认为是来自于向ltb的糖链附加的信号。
产业上的可利用性
本发明的融合蛋白在畜牧产业等领域中有用。