本申请要求2015年10月21日提交的美国临时申请no.62/244,594的权益，该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。本公开涉及经密码子优化的atp7a核酸及其在治疗atp7a相关的铜转运障碍中的用途。
背景技术：
：作为关键代谢酶(例如，多巴胺β羟化酶、赖氨酰氧化酶、cu/zn超氧化物歧化酶和细胞色素c氧化酶)的辅因子，铜在代谢中起关键作用。人p型atp酶铜转运atp酶1(atp7a)将铜从肠上皮细胞(在此从膳食铜中摄取铜)转运到血液中。atp7a还介导铜通过血脑脊液(csf)屏障和血脑屏障。在门克斯病和枕角综合征(ohs)中，atp7a活性降低或消失，且从肠细胞的铜输出受损(kaler，nat.rev.neurol.7：15-29,2011)。结果，铜在肠细胞中累积，且较少的铜被运送到血液中，从而导致向其他组织、特别是大脑的铜供应受到限制。最近还鉴定出了与atp7a突变相关的遗传性远端运动神经病(atp7a相关的远端运动神经病；也称为脊髓性肌萎缩、远端、x连锁3(smax3))(kennerson等，j.hum.genet，86：343-352，2009)。与门克斯病和ohs不同，这种成体发病性(adult-onset)疾病与血清铜水平降低无关。技术实现要素：本文提供了经密码子优化的atp7a核酸分子，尤其是编码尺寸减小的atp7a蛋白的经密码子优化的核酸，以及包含所述经密码子优化的atp7a核酸的载体和重组病毒。这些核酸可用于治疗铜转运障碍的方法，所述铜转运障碍例如门克斯病、枕角综合征或atp7a相关的远端运动神经病。在一些实施方案中，本文公开了编码尺寸减小的atp7a蛋白的分离的经密码子优化的核酸分子。在一些实施例中，所述核酸分子包括与seqidno：1的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核酸。在一些特定实施例中，所述核酸分子具有seqidno：1的序列或编码seqidno：2的氨基酸的序列。本文还公开了载体，例如腺相关病毒(aav)载体，其包括编码所公开的尺寸减小的人apt7a的经密码子优化的核酸分子。在一些实施例中，所述载体还包含启动子，例如β-肌动蛋白启动子。在另一些实施例中，所述载体还包含增强子，例如巨细胞病毒增强子。本文还公开了包含编码尺寸减小的人atp7a的经密码子优化的核酸分子的重组病毒(例如，重组aav(raav))。还提供了包含本文所公开的核酸分子或载体的分离的宿主细胞。例如，所述分离的宿主细胞可以是适于raav繁殖的细胞。包含所公开的核酸分子、载体和病毒的组合物也公开于本文中。本文公开了治疗被诊断为患有atp7a相关的铜转运障碍(例如，门克斯病、ohs或atp7a相关的远端运动神经病)的对象的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向对象施用有效量的所公开的载体或重组病毒或者包含所述载体或病毒的组合物，所述载体或重组病毒包含编码尺寸减小的人atp7a的经密码子优化的核酸分子。在一些实施例中，所述方法进一步包括向对象施用铜疗法(例如，铜-组氨酸、氯化铜、硫酸铜或葡萄糖酸铜)。在另一些实施方案中，所述方法包括通过向对象施用有效量的载体和向对象施用铜来治疗患有门克斯病的对象，所述载体包含编码与启动子可操作地连接的尺寸减小的atp7a蛋白的分离的经密码子优化的核酸分子。在一些实施例中，将所述载体或病毒经肠道或肠胃外、鞘内或颅内进入脑脊液或脑中而施用于对象。根据下文中参照附图进行的详细描述，本公开的前述及其他特征将变得更加明显。附图说明图1是人atp7a蛋白的示意图，示出了被去除的部分(框中的部分)以产生尺寸减小的人atp7a蛋白。改编自donsante等,mol.ther,19：2114-2123,2011，其全部内容通过引用并入本文。图2a-2d示出经密码子优化的尺寸减小的人atp7a核酸序列(co_rsatp7a；seqidno:1)与天然的尺寸减小的人atp7a核酸序列(nat_rsatp7a；seqidno:3)的序列比对。图3是包含经密码子优化的尺寸减小的atp7a(co-rsatp7a)cdna的示例性重组腺相关病毒(raav)构建体的示意图。itr：反向末端重复序列；cmv：巨细胞病毒增强子；cba：鸡β-肌动蛋白启动子；polya：聚腺苷酸化信号。图4是在转染的hek293t细胞中尺寸减小的atp7a(rs-atp7a)和co-rsatp7a的表达的数字图像。泳道1：模拟转染的；泳道2：ptr-cag-rsatp7a(25μg)；泳道3：ptr-cag-co-rsatp7a(1.25μg)；泳道4：ptr-cag-co-rsatp7a(25μg)；β-肌动蛋白：蛋白质加样对照。图5是示出用raav9-co-rsatp7a(aav9)和铜-组氨酸处理、未作处理(ut)、单独用aav9co处理或单独用铜-组氨酸处理的mo-br小鼠的存活的图。图6是示出未经处理(ut)小鼠、用aav5-rsatp7a和铜-组氨酸(aav5+cu)处理的小鼠、用aavrh10-rsatp7a和铜-组氨酸(aavrh10+铜)处理的小鼠、用aav9-rsatp7a和铜(aav9+铜)处理的小鼠以及用aav9co-rsatp7a和铜(aav9co+铜)处理的小鼠的断奶存活(暗灰色条)或延长的存活(浅灰色条)。rsatp7a是尺寸减小的atp7acdna(天然序列(未经密码子优化的))。序列表本文或附随的序列表中提供的任何核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写示出，如在37c.f.r.§1.822中限定的那样。至少在一些情况下，只示出每个核酸序列的一条链，但应当理解互补链包含在对所示出的链的任何引用中。seqidno:1是示例性的经密码子优化的尺寸减小的atp7a核酸序列。seqidno:2是示例性的尺寸减小的atp7a蛋白的氨基酸序列。seqidno:3是示例性的天然的尺寸减小的atp7a核酸序列。具体实施方式i.术语除非另有说明，否则技术术语根据常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可在以下中找到：lewin'sgenesx,编著,krebs等,jonesandbartlettpublishers,2009(isbn0763766321)；kendrew等(编著),theencyclopediaofmolecularbiology,由blackwellpublishers出版,1994(isbn0632021829)；roberta.meyers(编著),molecularbiologyandbiotechnology：acomprehensivedeskreference,由wiley,john&sons,inc.出版,1995(isbn0471186341)；和georgep.rédei,encyclopedicdictionaryofgenetics.genomics,proteomicsandinformatices,第3版,springer,2008(isbn：1402067534)。提供了对术语和方法的如下解释以更好地描述本公开并引导那些本领域的普通技术人员实践本公开。单数形式“一”、“一个/种”和“所述”是指一或多于一，上下文另有明确规定除外。例如，术语“包含核酸分子”包括单个或多个核酸分子，并且被认为等同于短语“包含至少一个核酸分子”。如本文所用，“包含”意指“包括”。因此，“包含a或b”意指“包括a、b、或者a和b”，且不排除其他要素。出于所有目的，本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献的全部内容通过引用并入本文。与本文提及的genbank登录号相关的所有序列(如2015年10月21日所呈现的)均通过引用整体并入。在产生矛盾的情况下，将以本说明书(包括术语的解释)为准。尽管可使用与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料来实践或测试所公开的技术，但是下文描述了合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅是说明性的而无意于限制。为了便于回顾本公开的各种实施方案，提供了对特定术语的以下解释：腺相关病毒(aav)：感染人和其他一些灵长类物种的小型复制缺陷型无包膜病毒。已知aav不导致疾病并引发非常轻微的免疫反应。利用aav的基因治疗载体可感染分裂细胞和静止细胞两者，并且可保持在染色体外状态而不整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使aav成为基因治疗的有吸引力的病毒载体。目前有11种公认的aav血清型(aav1-11)。atp7a：atp酶，cu++转运，α多肽。也称为p型atp酶铜转运atp酶1。其是参与跨膜转运铜的跨膜蛋白。在人中存在两种铜转运的atp酶(atp7a和atp7b)，它们是金属转运的p型atp酶家族的成员(参见，例如，lutsenko等,physiol.rev.87：1011-1046,2007)。atp7a蛋白具有八个跨膜区段。氨基末端片段含有六个铜结合位点。atp7a还含有催化循环的磷酸酶步骤所需的a结构域和由p结构域和n结构域组成的atp结合结构域(参见图1)。atp7a序列是公众可获得的。例如，genbank登录号nc_000023.11(区域77910656..78050395)和nc_000086.7(区域106027276..106128160)分别公开了示例性的人和小鼠atp7a基因组核酸序列。genbank登录号nm_000052、nm_001282224和nr_104109公开了示例性的人atp7acdna序列，和np_000043和np_001269153公开了示例性的人atp7a蛋白序列。genbank登录号nm_009726和nm_001109757公开了示例性的小鼠atp7acdna序列，且np_033856和np_001103227公开了示例性的小鼠atp7a蛋白质序列。本文所述的全部genbank登录号如2015年10月21日在genbank中所示通过引用并入。本领域的普通技术人员可鉴定与本文所述的那些不同的atp7a核酸和蛋白质分子，例如具有一个或更多个替代、缺失、插入或其组合的atp7a序列，同时仍保留atp7a生物学活性(例如，铜-转运活性)。另外，atp7a分子包括保留atp7a生物学活性的可变剪接同种异形体(isoform)和片段。与atp7a相关的远端运动神经病：与atp7a突变相关的成体发病性远端运动神经病。所述障碍的特征是进行性远端运动神经病和深部肌腱反射丧失。足部和手部畸形是典型的，例如高弓足。患有atp7a相关的远端运动神经病的对象不具有低血清铜水平，并且没有与门克斯病或ohs相关的毛发、皮肤或关节异常。经密码子优化的：“经密码子优化的”核酸是指为使密码子对于在特定系统(例如，特定物种或物种组)中的表达为最佳而被改变的核酸序列。例如，核酸序列可被优化以用于在哺乳动物细胞或在特定哺乳动物物种(例如，人细胞)中表达。密码子优化不改变编码蛋白质的氨基酸序列。铜转运障碍：由铜代谢缺陷、特别是铜转运(例如，细胞摄取和/或移动铜)缺陷引起的障碍。铜通过两种铜转运atp酶在人体内转运(atp7a和atp7b)。与atp7a突变有关的铜转运障碍(与atp7a有关的铜转运障碍)包括门克斯病、枕角综合征、与atp7a相关的远端运动神经病。wilson病与atp7b的突变相关。有效量：单独或与可药用载体或者一种或更多种其它药剂一起诱导期望的响应的药剂或组合物的量。治疗剂或制剂例如化合物、分离的核酸、载体或含有核酸或载体的组合物以治疗有效量施用。治疗剂的有效量可以许多不同方式确定，例如测定患有障碍(例如，铜转运障碍)的对象的症状减轻或生理状况改善。有效量也可通过各种体外、体内或原位测定来确定。分离的：“分离的”生物组分(例如，核酸分子、蛋白质或病毒)已与其它生物组分(例如，其他染色体和染色体外dna和rna、蛋白质和/或细胞器)分离或从所述其它生物组分中纯化出来。已经被“分离的”核酸、蛋白质和/或病毒包括通过标准纯化方法纯化的核酸、蛋白质和病毒。所述术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、蛋白质和病毒，以及化学合成的核酸或蛋白质。术语“分离的”(或纯化的)不需要绝对的纯度；相反，其意在作为相对术语。因此，例如，分离的或纯化的核酸、蛋白质、病毒或其他活性化合物为从相关的核酸、蛋白质和其他污染物中全部或部分分离的。在某些实施方案中，术语“基本上纯化的”是指已经从细胞、细胞培养基或其他粗制品中分离并且进行了分级分离以除去初始制备物的各种组分例如蛋白质、细胞碎片和其他组分的核酸、蛋白质、病毒或其他活性化合物。门克斯病(也称为卷发病或钢发病)：由铜转运atpaseatp7a(omim309400)的缺乏或功能障碍引起的婴儿发病性x连锁隐性神经退行性障碍。作为一种x连锁疾病，门克斯病通常发生于出生时看似正常的男性，但在2至3个月龄时呈现出先前获得的发育里程碑的丢失并且发生张力减退、癫痫且未能茁壮成长。头发和面部的特征性生理变化结合典型的神经学的表现常常提示诊断。患有经典的门克斯病的婴儿的头皮毛发短、稀疏、粗糙和扭曲。患者头发的光学显微镜术显示出特异病征性的扭曲发(例如，毛干180°扭曲)，并且毛发倾向于轻微色素沉着，并且可能表现出不寻常的颜色，例如白色、银色或灰色。患有门克斯病的个体的面部有显著的下颚、下垂的脸颊和往往显得大的耳朵。上鄂倾向于是高弓形的，并且牙齿萌出延迟。皮肤经常显得松弛和冗余，特别是在脖颈和躯干。在神经学上，几乎不可避免地存在头部控制不佳的躯干张力低下。大多数患者的技能发展局限于偶尔的微笑和咿呀声。生长失败在神经退行发作后不久开始并且是不对称的，与体重和头围相比线性生长相对保持不变。门克斯病中的生化表型包括：(1)由于铜的肠吸收受损，血浆、肝脏和脑中的铜水平低；(2)许多铜依赖性酶的活性降低；以及(3)铜在某些组织(例如十二指肠、肾、脾、胰腺、骨骼肌和/或胎盘)中的反常的积累。在培养的成纤维细胞和淋巴母细胞中，铜保留表型也是明显的，其中，可在脉冲追踪实验中证明放射性标记的铜减少的输出。门克斯病的小鼠模型是可获得的并且包括杂色的小鼠(mercer，am.j.clin.nutr.76：1022s-1028s，1998；例如，斑色的(mo-br)、龟样的、有活力的-斑色的和/或斑点的(mo-blo)小鼠)和黄斑小鼠(例如，kodama等，j.histochem.cytochem.41：1529-1535,1993)。枕角综合征(ohs)：门克斯病的一种温和的等位基因变体(omim304150)。在ohs患者中，血清铜水平通常略低于正常水平。ohs的特征是在斜方肌和胸锁乳突肌与枕骨(“枕角”)的附着部位形成的楔形钙化，其可能在临床上可触及和/或在放射线照相术中可见。ohs的表型包括轻微的全身肌肉无力和自主神经机能异常(晕厥、直立性低血压和慢性腹泻)。患ohs的对象通常也有松弛的皮肤和关节、膀胱憩室、腹股沟疝和血管扭曲。智力通常正常或略有下降。可药用载体：用于本公开的可药用载体(运载体)是常规的。remington:thescienceandpracticeofpharmacy,theuniversityofthesciencesinphiladelphia,编者,lippincott,williams,&wilkins，philadelphia,pa，第21版(2005)描述了适于药物递送一种或更多种治疗性化合物、分子或药剂的组合物和制剂。一般来说，载体的性质将取决于所采用的特定施用模式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射的流体，其包括药学和生理学可接受的流体作为载体，所述流体为例如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水右旋糖、甘油等。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性的载体外，待施用的药物组合物可包含少量的无毒辅助物质，例如，润湿剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如，乙酸钠或山梨糖醇酐单月桂酸酯。肠胃外施用：通过除胃肠道之外的途径施用物质(例如，组合物或治疗性化合物)。肠胃外施用的示例性途径包括静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内(例如进入脑室中)、鞘内(例如，进入椎管或脑脊液中)、局部、透皮或通过吸入。有经验的临床医生可根据所治疗的病症和正在施用的治疗来选择合适的施用途径。启动子：指导/启动核酸(例如，基因)转录的dna区域。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列。通常，启动子位于它们转录的基因附近。启动子还任选地包含远端增强子或阻遏子元件，其可位于距转录起始位点几千个碱基对处。在一些特定实施例中，启动子与核酸“可操作地连接”，使得启动子和核酸(例如，本文公开的经密码子优化的rsatp7a核酸)处于功能性关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的dna序列是连续的，并且在必要时将两个蛋白质编码区连接在相同的阅读框中。重组：重组核酸分子包含非天然发生的序列(例如，经密码子优化的序列)或具有通过人工组合两个分开的区段的序列而制备的序列。这种人工组合可通过化学合成或通过人工操纵核酸分子的分离的区段来完成，例如通过遗传工程技术来完成。类似地，重组病毒是具有非天然发生(例如，不来自病毒的异源序列)的核酸序列或通过人工组合至少两个不同来源的序列而制成的核酸序列的病毒。术语“重组”还包括仅通过添加、替代或缺失天然核酸分子、蛋白质或病毒的一部分而改变的核酸、蛋白质和病毒。如本文所用，“重组aav”(raav)是指其中包装有异源核酸分子(例如，编码经密码子优化的atp7a蛋白的核酸分子)的aav颗粒。载体：允许插入外来核酸而不破坏载体在宿主细胞中的复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可包含一个或更多个选择标记基因及其他遗传元件。表达载体是含有必需的调控序列以允许插入的一个或多个基因转录和翻译的载体。在一些非限制性实施例中，载体是aav。ii.经密码子优化的atp7、载体和重组腺相关病毒本文公开了编码尺寸减小的atp7a蛋白质的核酸，其已经为在人细胞中表达进行了密码子优化。在一些实施方案中，编码尺寸减小的atp7a蛋白的经密码子优化的核酸包括长度小于约5kb(例如，小于约4.5kb、小于约4kb、小于约3.5kb或小于约3kb)的编码atp7a蛋白的核酸，其中，编码的蛋白质保留天然atp7a蛋白质的至少一种活性，包括铜结合、铜转运和/或atp酶活性。在一些实施例中，编码的atp7a蛋白缺少六个n-端铜结合位点中的一个或更多个(例如，缺少1、2、3、4或5个铜结合位点)。在一些特定的实施例中，编码的atp7a蛋白具有两个n-端铜结合位点(例如，在第四个n-端铜结合位点后开始)。在一些实施例中，尺寸减小的apt7a蛋白以存在于天然(全长)蛋白质中的甲硫氨酸残基开始，而在另一些实施例中，编码尺寸减小的atp7a蛋白的核酸包含外源翻译起始位点。在一个特定实施例中，经密码子优化的尺寸减小的atp7a核酸编码起始于天然atp7a蛋白质的第461号氨基酸(甲硫氨酸)的蛋白质。在一个特定实施例中，编码尺寸减小的atp7a蛋白质的核酸长度为约3.1kb。示例性的经密码子优化的尺寸减小的atp7a核酸如seqidno:1所示。在一些实施例中，经密码子优化的核酸编码具有如seqidno:2所示的氨基酸序列的尺寸减小的atp7a蛋白。在另一些实施例中，经密码子优化的核酸具有与seqidno:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少98％或至少99％的同一性的核酸序列。所公开的经密码子优化的核酸编码与seqidno:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列，其中，所述编码的蛋白质保留天然atp7a蛋白质的至少一种活性，包括铜结合、铜转运和/或atp酶活性。编码本文公开的尺寸减小的atp7a蛋白的核酸序列针对待在其中表达的细胞进行密码子优化。密码子使用偏好性——以不同的频率使用同义密码子——在遗传系统中普遍存在(ikemura,j.mol.biol.146:1-21,1981；ikemura,j.mol.biol.158:573-97,1982)。密码子使用偏好性的强度和方向与基因组g+c含量和不同的同工trna的相对丰度有关(akashi,curr.opin.genet.dev.11:660-666,2001；duret，curr.opin.genetdev.12：640-9,2002；osawa等,microbiol.rev.56：229-264,1992)。密码子使用可影响基因表达的效率。密码子优化是指用生物体中更常用(优选)的同义密码子(编码相同氨基酸的密码子)取代核酸序列中的至少一个密码子(例如，至少5个密码子、至少10个密码子、至少25个密码子、至少50个密码子、至少75个密码子、至少100个密码子或更多)。每个生物体对于每种氨基酸具有特定的密码子使用偏好性，其可由公开可获得的密码子使用表(例如，参见nakamura等,nucleicacidsres.28:292,2000和其中引用的参考文献)确定。例如，密码子使用数据库可在万维网上的kazusa.or.jp/codon上获得。本领域技术人员可修饰编码特定氨基酸序列的核酸，使得其编码相同的氨基酸序列，同时针对在特定细胞类型(例如，人细胞)中的表达进行优化。在一些实施例中，使用软件来生成经密码子优化的atp7a序列，所述软件是例如可从integrateddnatechnologies(coralville,ia,可在万维网上的idtdna.com/codonopt获得)、genscript(piscataway,nj)或entelechon(eurofinsgenomics,ebersberg,德国,可从万维网的entelechon.com/2008/10/backtranslation-tool/获得)获得的密码子优化工具。本文还公开了包含编码尺寸减小的apt7a蛋白的经密码子优化的核酸的载体。在一些实施例中，载体包括可操作地连接至启动子的经密码子优化的尺寸减小的atp7a核酸。在一个非限制性实施例中，启动子是β-肌动蛋白启动子，例如鸡β-肌动蛋白启动子。在其他非限制性实施例中，启动子是atp7a启动子(例如，人atp7a启动子)、来自hsv-1的潜伏相关转录物(lat)启动子、神经元特异性烯醇酶启动子或β-葡糖醛酸糖苷酶启动子(参见,例如husain等,genether.16：927-932.2009)。本领域技术人员可选择可用于所公开的载体的其他启动子。在另一些实施例中，atp7a核酸还与增强子元件(例如，cmv增强子)和/或聚腺苷酸化信号(例如，β-珠蛋白聚腺苷酸化信号或sv40聚腺苷酸化信号)可操作地连接。在一些实施方案中，载体是腺相关病毒(aav)载体、腺病毒载体、α病毒载体、疱疹病毒载体、慢病毒载体或疫苗病毒载体。本领域技术人员可选择合适的载体，例如用于本文描述的方法中。在一些特定的实施方案中，载体是aav载体。aav血清型可以是用于将转基因递送至对象的任何合适的血清型。在一些实施例中，aav载体是血清型9aav(aav9)。在另一些实施例中，aav载体是血清型5aav(aav5)。在另一些实施例中，aav载体是血清型1、2、3、4、6、7、8、10、11或12载体(即，aav1、aav2、aav3、aav4、aav6、aav7、aav8、aav10、aav11或aav12)。在另一些实施例中，aav载体是两种或更多种aav血清型(例如但不限于aav2/1、aav2/7、aav2/8或aav2/9)的杂合体。aav血清型的选择将部分地取决于基因治疗靶向的细胞类型。为了治疗atp7a相关的铜转运障碍，神经元(例如，中枢神经系统神经元或运动神经元)是相关靶细胞的例子。在另一些实施例中，肾小管上皮细胞、肠细胞、皮肤细胞和/或肌细胞也是相关的靶细胞。aav是分类在细小病毒科的dependoparvovirus属中的小型的、无包膜的辅助-依赖性细小病毒。aav具有约4.7kb的线性单链dna基因组。基因组的侧翼是侧接两个开放阅读框(orf)－rep和cap的反向末端重复序列(itr)。reporf编码四种复制蛋白(rep78、rep68、rep52和rep4)，以及caporf编码三种病毒衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)和装配激活蛋白(aap)。aav需要辅助病毒(例如腺病毒、单纯疱疹病毒或其他病毒)来完成其生命周期。目前，aav正在全球众多的基因治疗临床试验中使用。尽管aav感染人和其他一些灵长类物种，但尚未知其导致疾病和引起非常温和的免疫反应。利用aav的基因治疗载体可感染分裂细胞和静止细胞两者，并且保持染色体外状态而不整合到宿主细胞的基因组中。对于基因治疗载体而言，aav具有数个期望的特征，包括结合和进入靶细胞的能力、进入细胞核的能力、在细胞核中延长表达时间的能力和低毒性。由于aav的有利特征，在一些实施方案中，本公开涵盖将aav用于本文公开的重组核酸分子和方法的用途。itr是在aav衣壳中成功包装异源蛋白质所需的唯一组分。因此，本文公开了包含经密码子优化的核酸的aav载体，所述经密码子优化的核酸编码尺寸减小的atp7a蛋白质(例如，seqidno:1)并与启动子可操作地连接。在一些实施例中，aav载体包括与经密码子优化的核酸侧接的5'和3'itr，所述经密码子优化的核酸编码尺寸减小的atp7a蛋白质(例如，seqidno:1)并与启动子可操作地连接的。在一个特定实施例中，侧翼itr来自aav2。载体还可包含其他元件，例如增强子元件(例如，通过增加启动子活性增加转录速率的核酸序列)和/或聚腺苷酸化信号。在一些特定实施例中，增强子是巨细胞病毒(cmv)增强子或土拨鼠转录后调控元件(wpre)。示例性的启动子包括鸡β-肌动蛋白(cba)启动子、遍在启动子(例如，葡糖醛酸酶β(gusb)启动子)或神经元特异性启动子(例如，血小板衍生的生长因子b链(pdgf-β)启动子或神经元特异性烯醇化酶(nse)启动子)。在另一些实施例中，聚腺苷酸化信号是β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、sv40聚腺苷酸化信号或牛生长激素聚腺苷酸化信号。可任选地包含在载体中的其他元件包括标签(例如，6xhis、ha或用于蛋白质检测的其他标签)。itr、增强子、启动子、聚腺苷酸化信号和/或其他元件的任何组合均可用于本文公开的载体中。在一些实施例中，载体包括(从5'到3')：aav5'itr、增强子、启动子、经密码子优化的尺寸减小的atp7a编码序列、聚腺苷酸化信号和aav3'itr。在一个非限制性实施例中，载体包括(从5'到3')aav25'itr、cmv增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、seqidno:1(或与seqidno:1具有至少80％同一性的序列)、兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号和aav23'itr(例如，图3)。至少有10种不同的aav血清型(aav1至aav10)，它们具有不同的组织或细胞向性。例如，来自aav血清型1、5和6的衣壳蛋白结合n-连接的唾液酸，aav4结合o-连接的唾液酸，aav2、3和6结合硫酸肝素蛋白聚糖，并且aav9结合n-末端半乳糖残基。参见，例如murlidharan等,front.mol.neurosci.7:76,2014。因此，特定的aav血清型可能特别适用于转导特定的细胞类型，例如神经元。在一些非限制性实例中，aav血清型2、aav血清型5或aav血清型9用于本文所述的重组核酸、载体和方法的中枢神经系统(cns)表达。本领域技术人员将会理解，其他aav血清型也可用于本文公开的构建体和方法中。用于产生重组aav(raav)(例如适合于基因治疗的raav)的方法是本领域公知的，并且可与本文公开的重组核酸分子、载体和方法一起使用。在一些实施例中，通过使用具有如下质粒(载体)的三质粒系统产生raav：包含侧接启动子的aavitr、所述启动子与编码目标蛋白质的核酸(例如，经密码子优化的rsatp7a的编码核酸)可操作地连接的质粒；包含与启动子可操作地连接的aavrep和cap基因的质粒；以及编码辅助病毒蛋白质的质粒。细胞用三种质粒共转染并发生病毒装配。得到的raav颗粒被纯化(例如，通过梯度离心或hplc)并且可被施用于对象(例如，患有与atp7a相关的铜转运障碍的对象)或用于转导靶细胞以生产目标蛋白质(例如，rsatp7a)。在另一些实施例中，利用二质粒系统，具有包装质粒(例如，包括rep和/或cap基因)和包含侧接启动子的aavitr的质粒，其中所述启动子与编码目标蛋白质的核酸(例如，经密码子优化的rsatp7a的编码核酸)可操作地连接。在这种情况下，通过感染辅助病毒来提供用于raav产生的其他因子。参见例如美国专利申请公布no.2012/0100606、2012/0135515、2011/0229971和2013/0225666。在一些特定实施例中，raav是血清型aav9或血清型aav5。本文还提供了包含本文公开的核酸分子或载体的分离的宿主细胞。例如，分离的宿主细胞可以是适于产生raav的细胞(或细胞系)。在一些实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞，例如hek-293(或hek293t)、bhk、vero、rd、ht-1080、a549、cos-7、arpe-19或mrc-5细胞。本领域普通技术人员可选择可用本文公开的核酸和/或载体转化的其它细胞。iii.治疗铜转运障碍的方法和组合物本文公开了治疗患有与atp7a相关的铜转运障碍的对象的方法，所述方法包括向对象施用有效量的包含经密码子优化的尺寸减小的atp7a核酸的载体或包含经密码子优化的尺寸减小的atp7a核酸的重组病毒(例如，raav)。在一些特定实施例中，将包含重组病毒的组合物(例如，重组病毒和可药用载体)施用于对象。组合物可以单剂量或多剂量(例如2、3、4或更多剂量)施用。包含本文公开的载体或病毒(例如，raav)和可药用载体的组合物也在本公开中提供。可药用载体部分地由施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法确定。参见例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy,theuniversityofthesciencesinphiladelphia,editor,lippincott,williams,&wilkins,philadelphia,pa,第21版(2005)。因此，存在本公开的药物组合物的多种合适的制剂。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、和可注射的有机酯例如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳液或混悬液，包括山梨糖醇、盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。在一些特定实施例中，本文公开的组合物包含山梨糖醇、聚乙二醇或丙二醇中的一种或更多种(例如，约0.1％至约50％、例如约1至10％、约1至5％、约5％至40％、或约10至30％w/v)。在另一个特定实施例中，本文公开的组合物包含乳酸林格氏液。静脉内载体还可包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如，基于林格氏右旋糖的那些)等。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。所述组合物还可包含洗涤剂，例如tween-20、tween-40、tween-60或tween-80(例如，约0.05-5％、例如约0.1％-1％、约0.5-5％、约0.2-2％、或约1-5％)。在一些实施方案中，组合物被配制用于脑内或静脉内施用。例如，可在美国专利申请公开no.2012/0219528(通过引用并入本文)中找到用于施用raav的合适的药物制剂。将所公开的组合物施用于患有或怀疑患有与atp7a相关的铜转运障碍的对象，所述与atp7a相关的铜转运障碍包括但不限于门克斯病、枕角综合征或x连锁的远端遗传性运动神经病。本领域普通技术人员可基于临床表现、血清铜水平(例如，门克斯病或ohs)和/或遗传诊断(例如，编码atp7a的基因中的一个或更多个突变的存在)来鉴定对象具有与atp7a相关的铜转运障碍。参见例如kaler,naturerev.neurol7:15-29,2011；kaler,handbookclinneurol.113:1745-1754,2013。在一些实施方案中，所公开的组合物(例如，包含载体和/或病毒的组合物)通过任何有效途径施(例如肠胃外或肠内)用于对象。示例性的施用途径包括通过注射(例如，颅内、脑内、鞘内、脑室内、静脉内、腹膜内、皮下或皮内注射)、经口、肠内、舌下、透皮、鼻内或吸入施用途径。在一些实施例中，组合物通过在cns中注射施用，例如脑内、脑室内、鞘内、脑脊液内、硬膜外或脑实质内注射。在一些特定实施例中，组合物通过在csf中注射施用。在另一些实施例中，组合物通过静脉内施用。在一些特定实施例中，可基于所使用的aav载体或raav的血清型来选择施用途径。例如，在静脉内施用aav1、aav6、aav8、aav9、aavrh.8和aavrh10后已经观察到神经元转导(参见例如murlidharan等,front.mol.neurosci.7:76,2014)。如果使用aav2、aav4或aav5，可能需要将组合物直接施用至cns。在一些实施方案中，所公开的raav以约104至约1014个病毒体(病毒颗粒)的剂量施用。在一些实施例中，raav以约105至约1013个病毒体或约108至约1012个病毒体的剂量施用。在一些具体的非限制性实例中，raav以至少约104、至少约105、至少约106、至少约107、至少约108、至少约109、至少约1010、至少约1011、至少约1012、至少约1013或至少约1×1014个病毒体的剂量施用。在另一些非限制性实施例中，raav以不超过约1010、不超过约1011、不超过约1012、不超过约1013或不超过约1014个病毒体的剂量施用。在另一些实施例中，raav以约105至约1014个病毒基因组(vg)(例如约1.6×109vg、约5×109vg、约1.6×1010vg、约5×1010vg、约1.6×1011vg、约5×1011vg、约1.6×1012vg、约5×1012vg、约1.6×1013vg或约5×1013vg或约1.6×1014vg)的剂量施用。在另一些实施方案中，raav以约1×1010至约1×1014个病毒基因组(vg)/kg的剂量施用。在一些实施例中，raav以约1×1010至约1×1015vg/kg的剂量施用。在一些具体的非限制性实例中，raav以至少约1×1010、至少约5×1010、至少约1×1011、至少约5×1011、至少约1×1012、至少约5×1012、至少约1×1013、至少约5×1013或至少约1×1014vg/kg的剂量施用。在另一些非限制性实施例中，raav以不超过约1×1010、不超过约5×1010、不超过约1×1011、不超过约5×1011、不超过约1×1012、不超过约5×1012、不超过约1×1013、不超过约5×1013或不超过约1×1014vg/kg的剂量施用。在一个非限制性实施例中，raav以约1×1012vg/kg、约4×1012vg/kg或约1×1013vg/kg的剂量施用。本领域技术人员可通过例如建立剂量-应答曲线的常规试验确定合适的剂量。raav可按照期望的治疗结果的需要以单剂量或多剂量(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次剂量)施用。在一些患有与atp7a相关的铜转运障碍(特别是门克斯病和ohs)的对象中，治疗还可包括通过肠胃外(例如，皮下)途径施用铜疗法(参见例如kaler等,n.eng.j.med.358：605-614,2008；kalerj.traceelem.med.biol.28:427-430,2014)。由于atp7a缺陷导致肠道铜转运缺陷，并且导致血清铜水平低，因此可能需要该额外的治疗。因此，在一些实施方案中，还用铜疗法治疗用本文公开的组合物治疗的对象(例如具有降低的血清铜水平的对象，例如患门克斯病或ohs的对象)。对于血清铜水平正常或接近正常的对象，例如患有与atp7a相关的远端运动神经病的对象，铜治疗可能不是必需的；然而，临床医生可确定是否应当在患有与atp7a相关的铜转运障碍的患者中施用铜疗法。用于治疗的铜可以是可方便地施用且具有可接受水平的副作用(例如，近端肾小管损伤)的任何形式。在一些实施例中，铜呈铜-组氨酸(copperhistidine)、组氨酸铜(copperhistidinate)、葡萄糖酸铜、氯化铜和/或硫酸铜的形式。在一些实施例中，铜是cgmp等级的铜，例如cgmp等级的组氨酸铜。一般而言，合适的剂量为每天或每隔一天约250μg至约500μg的铜(例如，组氨酸铜、氯化铜或硫酸铜)。然而，例如根据对象的年龄(例如，婴儿、儿童或成人)和体重、施用途径或临床医生所考虑的其它因素等，也可使用其它更高或更低的剂量(或分开剂量)，例如每天或每隔一天约50μg至约1000μg(例如约50μg至200μg、约100μg至500μg、约250μg至750μg或约500μg至1000μg)。在一些实施例中，12个月龄以下的对象以每日两次的剂量施用铜，而12个月龄或以上的对象以每日一次的剂量施用铜。铜疗法通过一种或更多种肠胃外途径施用，包括但不限于皮下、肌内或静脉内施用。在一个特定实施例中，铜疗法(例如，组氨酸铜)通过皮下注射施用。可在施用本文所述的经密码子优化的rsatp7a核酸、载体、重组病毒或组合物之前、同时、基本上同时、依次或其任何组合将铜施用于对象。在一些实施例中，在施用本文所述的经密码子优化的rsatp7a核酸、载体、重组病毒或组合物的24小时内施用至少一剂量的铜。根据临床医生的选择，可在晚些时候施用额外剂量的铜。在一些实施例中，铜疗法每日施用，持续至少3个月、至少6个月、至少1年、至少2年、至少3年或更长时间(例如约3个月至5年、6个月至3年、1至2年、2至6年或1至5年)。铜疗法(例如，铜的每日施用)可在诊断对象患有与atp7a相关的铜转运障碍后立即开始，并且在一些实施例中可在施用本文所述的经密码子优化的rsatp7a核酸、载体、重组病毒或组合物之前发生，并且也在rsatp7a施用后每天继续。本领域普通技术人员还可选择针对患有与atp7a相关的铜转运障碍的对象的额外治疗，例如l-苏糖-二羟苯基丝氨酸(l-dops，也称为屈昔多巴)。在一些实施方案中，所述方法还包括选择用所公开的经密码子优化的尺寸减小的atp7a核酸、包含经密码子优化的尺寸减小的atp7a核酸的载体或病毒或包含这样的核酸、病毒、或载体的组合物来治疗的对象。例如，所公开的方法可包括选择患有与atp7a相关的铜转运障碍例如门克斯病、枕角综合征或与atp7a相关的远端运动神经病的对象。对象的选择可基于临床症状、生化发现、分子诊断(例如，atp7a中存在一个或更多个突变)或其中两种或更多种的组合。因此，在一些实施例中，基于临床症状来选择患有与atp7a相关的铜转运障碍的对象，所述临床症状为例如约2至3个月龄的婴儿毛发粗糙、张力减退、癫痫、大脑和小脑神经变性和/或未能茁壮成长(例如，门克斯病)、皮肤松弛症、松动关节、枕骨的楔形钙沉积物和/或毛发粗糙(例如，ohs)，或进行性远端运动神经病、高弓足、锤趾和/或卷曲的手指(例如，与atp7a相关的远端运动神经病)。在另一些实施例中，根据单独的或与临床症状相结合的生化发现来选择对象，所述生化发现例如低血清铜水平、低血清铜蓝蛋白水平和/或异常血清或csf神经化学水平(例如多巴胺、去甲肾上腺素或其代谢物)。在另一些实例中，在不存在任何其他生化或临床症状的情况下仅基于异常血浆或csf神经化学选择对象。以下描述测定血清铜、血清铜蓝蛋白或血清或csf神经化学水平的示例性方法。在更进一步的实施例中，基于分子诊断选择患有与atp7a相关的铜转运障碍的对象，所述分子诊断例如atp7a中存在一个或更多个突变(例如导致atp7a活性降低或不存在可检测到的atp7a表达的那些突变)。可在不存在任何其他生化或临床异常的情况下仅基于atp7adna序列选择对象，或者可基于atp7a突变和一种或更多种其他生化和/或临床症状的存在来选择对象。atp7a中的示例性突变包括在国际pct公开no.wo2010/042102中描述的那些，例如q197x、r201x、a629p、s637l、g666r、g727r、s833g、g1019d、n1304s、a1362d、ivs8、as、dup5、evs9、ds+6t>g、ivs21、ds、+3a>t、del4246-4260和del4284-4315，该国际pct申请的全部内容通过引用并入本文。其它示例性atp7a突变描述于kaler,j.traceelem.med.biol.28:427-430,2014(其全部内容通过引用并入本文)中，以及在线人类孟德尔遗传(omim)登记号300011(其通过引用并入本文，如在2015年10月21日的omim中呈现的)中。本领域技术人员可鉴定可存在于患有与atp7a相关的铜转运障碍的对象中的其它atp7a突变(包括那些尚未鉴定出来的突变)。鉴定对象中一种或更多种atp7a突变的存在的示例性方法包括测序(例如，基因组或cdna测序)、等位基因特异性pcr或等位基因特异性寡核苷酸杂交、微阵列分析、变性梯度凝胶电泳、变性hplc、酶错配切割或本领域普通技术人员已知的其他方法。在一些实施方案中，用经密码子优化的尺寸减小的atp7acdna(例如，本文公开的含有经密码子优化的尺寸减小的atp7a核酸的raav)治疗对象的效果通过测定来自对象的样品中的铜代谢的一种或更多种生化标志物(例如血清或csf铜水平、血清铜蓝蛋白水平、血浆或csf儿茶酚胺水平或细胞铜输出)来评价。检测铜代谢的这些生化标志物的方法在本领域中是公知的。在一些实施例中，将来自对象的样品中的铜代谢的生化标志物(例如铜水平、血浆铜蓝蛋白水平、儿茶酚胺水平或细胞铜输出)的值与来自对照的相同标志物的值(例如参考值、对照人群或对照个体)进行比较。在一些实施例中，对照是未经治疗的患有与apt7a相关的铜转运障碍(或未经治疗的患有与apt7a相关的铜转运障碍的对照群体或参考值)的对象。在另一些实施例中，对照是健康对象(例如，没有铜转运障碍的对象)或参考值或健康对照群体。在一些实施例中，对照可以是例如在开始治疗之前来自患有与apt7a相关的铜转运障碍的对象的样品或值。在一些实施例中，将来自对象的样品中的铜代谢的生化标志物与从来自单个个体的对照样品获得的值进行比较。在另一些实施例中，将来自对象的样品中的铜代谢的生化标志物与从对照群体(例如来自多于一个个体(例如两个或更多个个体、五个或更多个个体、十个个体或更多个体、或者甚至100个或更多个个体)的对照样品)获得的值进行比较。在对照群体的情况下，来自对象的样品的值可与对照群体值的平均值或来自对照群体的值的范围进行比较。在进一步的实施例中，将来自对象的样品中的铜代谢的生化标志物与参考值进行比较，所述参考值例如从本领域技术人员使用的正常个体的群体获得的标准值。与对照群体相似，可将来自对象的样品的值与平均参考值或参考值范围(例如，参考群组中的高值和低值或95％置信区间)进行比较。铜水平铜代谢的一个生化标志物是来自对象的样品(例如血清、血浆或csf)中铜的水平。在一些实施例中，与正常对照个体或正常对照群体相比，降低的铜水平是门克斯病或ohs的标志物。确定样品(例如，来自对象的血清、血浆或csf)中铜水平的方法对于本领域技术人员而言是公知的。在一些实施例中，用于确定样品中的铜水平的方法包括火焰原子吸收光谱法、阳极溶出伏安法、石墨炉原子吸收法、电热原子吸收分光光度法、电感耦合等离子体原子发射光谱法和电感耦合等离子体质谱法。参见例如evenson和warren,clin.chem.21：619-625,1975；weinstock和uhlemann,clin.chem.27:1438-1440,1981；wo93/017321。血浆铜蓝蛋白水平血浆铜蓝蛋白是血液中主要的携带铜的蛋白质。该蛋白质具有铁氧化酶和胺氧化酶活性并催化对苯二胺(ppd)和fe(ii)的酶促氧化。来自对象的样品(例如血清、血浆或csf)中的血浆铜蓝蛋白水平是铜代谢的生化标志物。在一些实施例中，与正常对照样品或群体或参考值相比，降低的血浆铜蓝蛋白水平是门克斯病或ohs的标志物。测定样品(例如血清、血浆或csf)中血浆铜蓝蛋白水平的方法对于本领域技术人员而言是公知的。在一个实施例中，通过测量血浆铜蓝蛋白氧化酶活性(例如ppd-氧化酶活性或铁氧化酶活性)来确定样品中的血浆铜蓝蛋白水平。参见例如sunderman和nomoto,clin.chem.16:903-910,1970)。氧化产物的形成速率与血清铜蓝蛋白的浓度成比例(对底物的非酶促氧化进行了校正)。在另一个实施例中，通过免疫测定例如elisa、解离增强时间分辨荧光免疫测定或比浊免疫测定(参见例如美国专利no.6,806,044；6,010,903；5,491,066)来测定样品中的血浆铜蓝蛋白水平。在进一步的实施例中，通过纯化血浆铜蓝蛋白并采用电感耦合等离子体质谱法分析铜含量以提供铜离子特异性信号来确定血浆铜蓝蛋白水平；并基于铜离子特异性信号来评价样品的血浆铜蓝蛋白(参见例如美国专利公开no.2007/0161120)。儿茶酚胺水平铜是代谢酶(例如多巴胺β羟化酶、赖氨酰氧化酶和细胞色素c氧化酶)活性所必需的。例如，铜是多巴胺β羟化酶(dbh)活性所必需的，dbh可将多巴胺转化为去甲肾上腺素。在一些实施例中，儿茶酚胺水平(例如血浆或csf儿茶酚胺水平)与dbh活性相关。多巴胺和去甲肾上腺素的代谢途径的一部分如下所示。如果有铜减少(例如，门克斯病或ohs)，则dbh的活性降低，导致去甲肾上腺素水平降低和多巴胺水平增加。多巴胺(da)和去甲肾上腺素(ne)的底物和代谢物也受到影响。儿茶酚胺水平可提供关于铜代谢变化的信息。随着一种或更多种酶(例如dbh)的活性变化，底物代谢物与产物代谢物的比率可指示变化的方向。在一些实施例中，通过一种或更多种底物与其产物的比率的降低反映酶活性的增加。同样地，通过一种或更多种底物与其产物的比率(例如，多巴胺与去甲肾上腺素的比率)的增加来反映酶活性的降低。这些比率可以是两种代谢物的比率或代谢物之间复杂关系的比率。进一步地，代谢物不需要是多种特定酶(或一种特定酶)的直接产物-底物代谢物，但可以是任意两种或更多种代谢物的比率(例如dopac：dhpg或da：ne的比率)。在一些实施例中，一种或更多种儿茶酚胺的量(以绝对或相对浓度或其比率报道)与dbh活性相关。因此，所提供的方法中的一些涉及对来自对象的生物样品中的一种或更多种儿茶酚胺进行定量。儿茶酚胺包括包含儿茶酚基团的化合物(例如经典儿茶酚胺，例如多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素)。在另一些实施例中，儿茶酚胺包括经典儿茶酚胺的代谢物或底物。在一些实施例中，儿茶酚胺包括多巴胺的代谢物(例如dopac、3-甲氧基酪胺和高香草酸)和去甲肾上腺素的代谢物(例如dhpg、甲基去甲福林、3,4-二羟基扁桃酸、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸和3-甲氧基-4-羟基苯基乙二醇)。确定儿茶酚胺水平的方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括荧光测定法、放射性酶测定法、免疫学测定法(例如放射免疫测定法)、电泳法、电化学法(例如快速扫描循环伏安法)和色谱法(例如高压液相色谱法(hplc))或其组合。参见例如raum,am.j.physiol.endocrinol.metab.247:e4-e12,1984；robinson等,clin.chem.,49:1763-1773,2003；holmes等,j.chromatogr.bbiomed.appl.653:131-138,1994；eisenhofer等,clin.chem.32:2030-2033,1986。在一个特定实施例中，通过使用电化学检测的高压液相色谱法测定儿茶酚胺水平。在一些实施例中，儿茶酚胺水平与dbh活性相关。在一些特定实施例中，儿茶酚胺包括多巴胺、去甲肾上腺素、二羟基苯乙酸(dopac)、二羟基苯基乙二醇(dhpg)或其两种或更多种的组合。例如，与健康对象或群体相比，患有与atp7a相关的铜转运障碍的患者的dbh活性降低，其可通过酶的底物(例如，多巴胺)的增加或底物的代谢物(例如dopac、3-甲氧基酪胺和高香草酸)的增加来反映。在另一些实施例中，降低的dbh活性可通过酶的产物(例如去甲肾上腺素)的减少或酶的产物的代谢物(例如dhpg、甲基去甲福林、3,4-二羟基扁桃酸、3-甲氧基-4-羟基扁桃酸和3-甲氧基-4-羟基苯基乙二醇)的减少来反映。在另一些实施例中，儿茶酚胺水平的比例与dbh活性相关。与正常对照样品或群体或参考值相比，dbh活性降低可通过酶的底物(例如多巴胺)与酶的产物(例如去甲肾上腺素)的比率的增加来反映。在另一些实施例中，dbh活性降低与dopac与dhpg的比率增加相关。细胞铜输出atp7a负责将铜从细胞质跨过质膜转运到外部环境。结果，表达具有降低的或不存在的铜转运活性的atp7a的细胞在细胞内积累铜并表现出减少的细胞铜输出。在一些实施例中，减少的细胞铜输出可用作异常铜代谢的生化标志物。用于确定细胞铜输出的方法在本领域中是公知的。通常，在利用分离的细胞(例如分离的成纤维细胞或淋巴母细胞)的脉冲追踪实验中测量放射性标记的铜的输出，所述细胞例如来自患有门克斯病或ohs的个体的细胞。参见例如lafontaine等,j.biol.chem.273:31375-31380,1998；goka等,proc.natl.acad.sci.usa73:604-606,1976。在一些实施例中，用放射性同位素铜(例如64cu或67cu)孵育的细胞(例如成纤维细胞或淋巴母细胞)，并使细胞摄取铜。可通过测量细胞中的放射性同位素(例如通过闪烁计数)来测定细胞对铜的摄取。一旦细胞铜与细胞外铜平衡，就可测量铜输出(例如，在一段时间内从细胞中失去铜)。在另一些实施例中，在标准培养基中培养细胞，并且例如通过原子吸收光谱测量分离的细胞中的总细胞内铜。细胞铜输出也可通过细胞的铜留存(retention)来反映。铜留存是在缺乏放射性同位素铜的培养基中经过一段时间后，细胞(例如用放射性同位素铜标记的细胞)中残留的铜的量。实施例1经密码子优化的尺寸减小的atp7a本实施例描述了经密码子优化的尺寸减小的atp7acdna的构建。使用密码子优化软件(集成dna技术，可在idtdna.com/codonopt获得)从天然的尺寸减小的atp7a序列(seqidno：3)产生经密码子优化的尺寸减小的atp7a序列。用于选择特定序列的标准包括低复杂度、密码子适应性、密码子使用模式和密码子上下文。选择了seqidno：1的序列来构建载体和进行进一步的实验。实施例2经密码子优化的尺寸减小的atp7aaav的生产本实施例描述了含有经密码子优化的尺寸减小的atp7acdna的aav的构建及在hek293t细胞中的表达。合成rs-atp7a(co.rsatp7a；seqidno：1)的经密码子优化形式并将其克隆到含有cmv/cba启动子/增强子元件的aav9载体中(图3)。使用三重转染法产生高滴度的aav9。该方法需要用三种质粒瞬时转染hek293t细胞：一种质粒编码转基因加启动子，侧接内部末端重复序列(itrs)；一种编码aavrep基因和cap基因，以及提供腺病毒蛋白功能的辅助质粒。在进行动物研究之前，对co.rsatp7a在cho细胞和hek293t细胞中的表达进行评定。如图4所示，用ptr-cag-rsatp7a转染hek293t细胞导致低但可检测到的量的rsatp7a蛋白(泳道2，加载了25μg总蛋白)。相比之下，使用经密码子优化形式(ptr-cag-co-rsatp7a)进行的转染导致比用天然的rsatpa构建体转染高约40倍的基因表达(泳道3，加载了1.25μg总蛋白质；泳道4，加载了25μg总蛋白质)(比较泳道2和4)。实施例3co-rsatp7a延长了门克斯病小鼠模型的存活时间本实施例描述了当用aav9co-rsatp7a与铜-组氨酸组合处理时，门克斯病小鼠模型的存活时间。通过脑室内注射向c57bl/6-atp7amo-br小鼠(mo-br小鼠)施用实施例2中描述的aav9co-rsatp7a。小鼠在生命的第二天被双侧注射1.6×109vg在5μl乳酸林格氏溶液中。一些小鼠在生命的第一周期间(5μg，d4-6)也通过皮下注射用铜-组氨酸(15μg)处理。用组合aav9co-rsatp7a和铜-组氨酸处理的小鼠中有约70％存活至少100天(图5)。相比之下，用aav9单独处理的小鼠和未处理的小鼠未存活超过20天，而用铜-组氨酸处理的小鼠未存活超过约28天(图5)。还对不同的aav血清型在mo-br小鼠中的效力进行了测试。与未存活到断乳期的未经处理的小鼠相比，所有小鼠都显示存活时间增加(图6)。aav9co-rsatp7a示出最高的功效，100％的治疗小鼠存活至断乳期，70％示出长期存活(图6)。实施例4评价门克斯病小鼠模型中的经密码子优化的尺寸减小的atp7a本实施例描述了经密码子优化的尺寸减小的atp7aaav在门克斯病小鼠模型中的效率测试。将实施例2中描述的aav通过脑室内注射施用于c57bl/6-atp7amo-br小鼠(mo-br小鼠)。小鼠在生命的第二天被双侧注射特定剂量的病毒颗粒(例如，表1中的那些)在2μl乳酸林格氏溶液中。一些小鼠在生命的第一周期间(15μg总剂量)也通过皮下注射用铜-组氨酸(15μg)处理。大多数情况下，使用野生型小鼠作为对照，原因是未经处理的mo-br小鼠在断奶前死亡。表1.病毒和铜剂量以及时间剂量总剂量(vg)剂量/kgsccu剂量低5.0×109icvd23.3×10125μg,d4-6中1.6×1010icvd21.1×10135μg,d4-6高5.4×1010icvd23.6×10135μg,d4-6vg，病毒基因组；icv，脑室内；sc，皮下，d，生命的天数针对经aav处理的mo-br小鼠、经aav加铜处理的mo-br小鼠和野生型小鼠从约生命的约25天开始进行神经行为测试(线悬挂测试、旋转测试和/或步态分析)。在线悬挂测试中，将小鼠放置在柔软表面上方约50厘米处的线笼架上。将该架倒置，并测量小鼠可以悬挂在该架上的时间长度(最长时间60秒)。如果小鼠没有完成整个60秒，在一次试验中(session)测试可能会重复多至三次(每次测试之间休息一分钟)。在旋转杆测试中，将小鼠置于直径为3.5cm的杆上。杆以每分钟4转的速度旋转。并测量小鼠留在杆上的时间长度(最长时间60秒)。如果鼠标没有完成整个60秒，在一次试验中，测试可能会重复最多三次(每次测试之间休息一分钟)。在测试开始之前，连续四天(从21日龄至24日龄)使小鼠适应杆。使用适当的统计学分析来确定野生型、经aav处理组和模拟处理组在临床生物化学和/或病理学结果方法方面是否存在统计学显著性差异。检验可包括kruskal-wallis非参数单向方差分析。其他检验(例如，学生t检验或wilcoxon符号排序分析)在适当的时候也可用于成对比较。未经处理的mo-br小鼠在断奶后未能存活，因此经处理的小鼠的存活是aav或aav加铜处理的效力的一个指标。预期与野生型小鼠相比，存活的经处理的mo-br小鼠可能至少部分地减少运动或神经功能(例如，平衡和/或协调)。然而，在一些实施例中，与未受影响的同窝仔崽畜相比，存活的经处理的mo-br小鼠几乎没有或没有神经缺陷。实施例5经aav处理的小鼠的神经病理学和生物化学本实施例描述了在门克斯病小鼠模型中用经密码子优化的尺寸减小的atp7aaav处理的小鼠的神经病理学和生物化学。按照实施例3和4中所述处理小鼠。在一些实施例中，使用未处理的mo-br小鼠在早期时间点进行比较。通过苏木精和曙红(h&e)染色、免疫组织化学和/或电子显微镜对脑切片评估神经病理学。在一些实施例中，在h&e染色切片中对海马神经元死亡和/或浦肯野细胞进行评分。处理效力(aav或aav加铜)可以通过与未经处理的mo-br小鼠相比并且在一些实施例中与野生型小鼠相比减少的细胞死亡和/或增加的浦肯野细胞的数目(例如，在生命的第12天)来指示。在另一些实施例中，例如通过luxol快蓝染色来评价髓鞘形成。与野生型小鼠中观察到的类似，经处理的mo-br小鼠中的髓鞘化水平(例如，在胼胝体中)是治疗效率的指标。还在经处理的mo-br小鼠、未经处理的mo-br小鼠和/或野生型小鼠中评价脑神经化学。脑铜水平通过石墨炉原子吸收来测量，并通过电感耦合等离子体质谱确认，例如如lenn等.(mol.genet.metab.91：30-36,2007)中所述。通过高效液相色谱法和在5-10体积的含有0.1％edta的0.4n高氯酸中均化的脑样品的上清液中进行电化学检测来测定脑二羟基苯乙酸(dopac)和二羟基苯基乙二醇(dhpg)的浓度。在一些实施例中，与未处理的mo-br小鼠相比，减少的dopac：dhpg比率和/或野生型的至少约50-75％的脑铜量是治疗有效性的指标。铜依赖性酶例如cu/zn超氧化物歧化酶(sod1)或细胞色素c氧化酶(cco)的活性也可以在经处理的小鼠和野生型小鼠中测定，例如如prohaska(j.nutr.121：355-363，1991)中所述。在一些实施例中，与未处理的mo-br小鼠相比，经处理的mo-br小鼠的cco活性增加。实施例6啮齿类动物的剂量范围毒性研究本实施例描述了在门克斯疾病小鼠模型和成年大鼠中对aav9co-rsatp7a的示例性毒性研究。临床前安全性评估的最初组成部分关注于在剂量范围概念验证(poc)研究中存活至断奶的mo-br小鼠。那些研究采用含有co-rsatp7a而没有其他序列(例如，标签或标志基因)并入的研究级raav9载体。毒理学组分关注于处于1、3和6月龄的每组三只小鼠(经raav处理的突变存活体、经raav处理的野生型和未经处理的野生型)每个剂量的组织病理学评估。通过免疫组织化学评价脑中的炎性反应涉及用抗胶质纤维酸性蛋白(gfap)、cd-4、cd-8和异凝集素b4的抗体进行染色。在脑中以及包括肝、肾、肺、心脏和脾脏在内的外周器官确定病毒基因组拷贝以评定来自cns的病毒逃逸。已知没有门克斯病的大动物模型用于评定raav基因疗法的安全性和效力。因此，在野生型成年雄性大鼠中进行为期12个月的剂量范围毒性研究(因为目标疾病是x连锁隐性性状)。对于安全评估的该组成和后续组成，使用临床级别的raav材料。用于先前研究级别raav中的co-rsatp7a构建体的所有必需组分都被保留，并且任何被报道的基因标签(例如，血凝素)被切除。对新构建体进行整体测序。至少最初从upenn临床载体核心实验室或voyagertherapeuticsaav载体生产设施获得用于raav9-co-rsatp7a的gmp过程可比材料。在放置icv导管后，将指定剂量的raav9co-rsatp7a施用于成年雄性sprague-dawley大鼠的左侧脑室。安全性评价包括临床观察、体重、常规血液工作、免疫反应、器官总体病理学和组织病理学。在基线和载体施用后30、90、180和360天，获得完整的血液计数(cbc)和血清化学物质。使用公认的方法(例如，martino等，methodsmol.biol.807：259-272,1988)对治疗前和治疗后针对aav衣壳和atp7a转基因的血清和csf中和抗体进行定量。csf是通过使用最小化血液污染风险的方法在镇静下通过小脑延髓池取样获得的(pegg等，j.neurosci.methods187：8-12,2010)。在预期的峰值载体检测时间(一周)和较晚的时间点(1、3、6和12个月)处死大鼠以评价载体的组织清除率。分析脑、肝、肾、肺、心、脾和性腺的组织病理学，并使用定量pcr来分析组织的载体序列(每个组织最少三个样品)。作为qpcr的质量控制，每个组织的一个样品将包括具有已知量的载体基因组的对照dna的峰值。每个时间点分析每组六只大鼠(经aav处理、模拟处理、未处理)。在大鼠毒理学研究中，cbc的统计学评估和血清化学结果将使用anova与处理组(经aav处理、模拟处理、未处理)作为因子，时间作为协变量。由于存在>20个因变量，p<0.01将用于建立治疗组和对照组之间统计学显著性差异，以最小化错误地拒绝零假设的机会。实施例7非人灵长类的毒性研究本实施例描述了用于评价aav9co-rsatp7a在非人灵长类动物中的毒性的研究。在雄性非人灵长类(nhp)中评价raav9-co-rsatp7a的安全性、生物分布、免疫原性和潜在遗传毒性。在这个阶段，基于评估的nhp脑部尺寸和csf体积将先前确定的在啮齿动物中安全的最高剂量放大。使用mri引导的方法对脑室内导管放置，将这种调节剂量施用于幼年(<4岁)雄性恒河猴的左侧脑室。(salegio等，adv.drugdeliv.rev.64：598-604,2012)。评估发生在基线(手术前不到2周)和病毒施用后3、7、15、30、60、90、180和360天。安全性终点包括体温、生命体征和体重。分析常规血液学和哺乳动物化学小组，并对针对aav衣壳和atp7a转基因的血清和csf中和抗体以及t细胞应答进行定量。在基线和30、90、180和360个时间点于镇静下进行csf采集的腰椎穿刺。还在基线和治疗后通过录像来评定和量化正常和可识别的异常行为神经行为进行评定。在尸体剖检中，获得来自经载体灌注和模拟处理的对照动物的全部nhp脑以及用于常规组织学的肝、肺、肾、心脏、睾丸、脾和二头肌的样品。合格的神经病理学家在盲条件下特异地评价经raav9co-rsatp7a处理的nhp脑的神经元死亡、轴索退行和异常胶质细胞反应性的证据。通过在glp样条件下，通过定量pcr测定处死时解剖的脑皮质、小脑和脉络丛以及外周组织中的载体dna分布。进行线性扩增介导的(lam)-pcr以评价脑和肝中的病毒宿主基因组整合(nowrouzi等，mol.ther.20：1177-1186,2012)。对于nhp数据(一般评估，cbc，血液化学)的统计学分析，使用混合模型分析，其中时间作为重复量度。对于所有因变量，评估组(经aav处理、模拟处理、未经处理)和时间以及组和时间的相互作用的主要作用。p<0.01的组的主要作用被认为是拒绝零假设，即组间没有差异。与对大鼠的分析(实施例6)一样，由于存在多个因变量，所以使用低于显著性所需的p值。为了评估处理对脑组织病理学的影响，使用卡方检验来比较具有和不具有目标组织病理学特征的每组动物的数目。为了评估处理对非人灵长类动物行为的影响，进行了短期和长期作用的单独分析以增加观察在aav处理组中的作用的可能性。两种分析都使用一般线性模型过程，使用iii型平方和。实施例8对对象中与atp7a相关铜转运障碍的治疗本实施例描述了用于临床使用含有经密码子优化的尺寸减小的atp7acdna的aav载体用于治疗与atp7a相关的铜转运障碍的示例性方法。然而，本领域技术人员将理解，偏离这些特定方法的方法也可用于成功地疗患与ap7a相关的铜转运障碍的对象。诊断为患与tp7a相关铜转运障碍(例如门克斯病或ohs)的患者被选择用于治疗。如本文中公开的，向患者施用治疗有效量的表达来自经密码子优化序列的尺寸减小的atp7a的重组aav(例如，包含seqidno：1的重组aav9)。重组aav可以经脑内(例如，脑部侧脑室)施用、经鞘内(例如，脑脊液)施用或静脉内施用。医疗实施者可以选择适当的治疗剂量。在一些情况下，治疗有效剂量在1×1010至1×1014个病毒基因组(vg)/kg，例如约1×1012至1×1013vg/kg。例如，起始鞘内剂量(低剂量)可以是1.2×1012vg/kg体重，另外的可能剂量包括4.0×1012vg/kg(中等剂量)，代表比低剂量高0.5个对数单位，和1.3×1013vg/kg(高剂量，比中等剂量高0.5个对数单位)，全部鞘内施用于脑脊液。在大多数情况下，向患者施用单剂量，但也可以给予施用多剂量。可以随时间监测对象(例如，2个月至5年，或更长时间)以确定治疗的有效性，例如通过监测对象的血清铜水平、csf神经化学水平、脑髓鞘化(例如通过磁共振成像确定)、和/或神经发育进展(例如粗大运动、语言、精细运动适应和个人-社会神经发育)。鉴于可以应用本公开的原理的许多可能的实施方案，应当认识到，所示出实施方案仅是示例，并且不应被视为限制本发明的范围。而是，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，我们要求保护属于这些权利要求范围和精神范围内的所有发明。序列表<110>美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）<120>经密码子优化的尺寸减小的atp7acdna及用于治疗铜转运障碍的用途<130>4239-94227-02<150>us62/244,594<151>2015-10-21<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>3120<212>dna<213>人工序列<220><223>经密码子优化的大小减小的atp7acdna<400>1atgccacttctcacgagcactaacgagttctacacgaagggaatgacgcccgtgcaggac60aaagaggaaggaaaaaatagctcaaaatgttatattcaggtgaccgggatgacatgcgcg120tcctgcgtcgcaaatatcgagaggaacctgcggcgggaagaagggatctacagtatcctc180gtggcactgatggcaggtaaggccgaagttcgatacaacccagctgttatccaaccccca240atgattgcagagtttatccgagaactggggttcggggcgacggtgatcgagaacgccgac300gaaggcgatggagtcttggaacttgtggtaaggggcatgacatgtgcaagctgtgtacat360aagatcgagagctctcttacaaagcataggggtattctgtattgctctgtggccctggcg420actaacaaggcacacatcaagtacgatcccgagatcattggccccagggacattatacat480actattgaaagcctcggcttcgaggcctctctggtcaagaaggatcgaagcgccagccat540ttggaccataagagagagatccggcagtggagaaggagcttcctggtttctctgtttttc600tgtatccctgtgatgggccttatgacatatatgatggtaatggaccatcactttgccacc660ctccaccataaccagaatatgtcaaaagaggaaatgatcaaccttcactcctccatgttc720ctcgagcgccaaattttgcccggcttgagcgtgatgaacctgctgtcattcctcctgtgc780gtgccagtgcagtttttcggcgggtggtatttctatattcaggcctacaaagctctgaag840cacaagacagcaaatatggacgtgcttatcgtccttgctaccacaattgcattcgcatac900tccctgattattttgttggtcgctatgtacgagagggccaaagttaaccctatcacattc960tttgacaccccccccatgctgttcgtatttatcgcgctcggccgctggttggagcatata1020gcaaagggcaagacatccgaagccctggcaaagctgatttctctccaagcgacagaggct1080accattgtgaccctcgacagcgacaacatcctgctctctgaagagcaagtggacgttgaa1140ctggtgcagaggggggatatcatcaaagtggtccccggcgggaagtttcctgtggatggc1200cgagtgatcgagggtcattctatggtggacgaatcactgattactggcgaagcaatgcct1260gtggcaaaaaaacccgggagcaccgtaattgctgggagtatcaaccagaacggaagcctg1320ttgatttgtgccacgcatgtaggagccgatacaactctcagccagattgtgaagttggtg1380gaggaagcacagactagcaaggctccgatccagcaattcgcagataagcttagtgggtac1440tttgtcccattcatagtgttcgtgtcaattgccaccctgctggtctggattgtcattggc1500ttcctgaacttcgagatcgtggaaacctatttccccgggtacaaccggtctatcagtcgc1560acagaaacaatcattagatttgcctttcaggctagtatcactgtgctttgcatcgcctgc1620ccatgtagcctgggcctggccacccctaccgcagtcatggttgggaccggagttggggcc1680cagaatgggattcttatcaaaggtggcgaaccactggagatggcgcataaagtcaaggtc1740gtggtgtttgacaagaccggtacgattacccatggaacgccggtcgtgaatcaggtgaag1800gtcctgactgagagcaatcgaatttcacatcacaagattttggcaatcgtgggtaccgcc1860gagagcaacagtgagcatccactgggaacagcaataaccaagtattgtaagcaagaactg1920gacacggaaacgctgggaacatgtattgacttccaggtggtccctggatgtggcattagt1980tgcaaggtcacaaacatcgaaggactccttcacaagaataactggaatatcgaggataat2040aatatcaagaacgcatccttggtgcagattgacgcttcaaacgagcagagctctaccagt2100agtagcatgatcattgatgcgcagataagcaacgcccttaacgcacagcaacataaggtc2160ctgatagggaatagagagtggatgatcaggaacggactggtcatcaataacgacgtcaat2220gacttcatgaccgaacacgagcgaaaagggaggacagccgtccttgtcgctgtcgatgac2280gagctgtgtggactgatcgcaatcgccgatacggtaaaaccagaggccgagcttgccata2340cacattctgaagtcaatgggactggaagtggtgctgatgaccggggataacagcaagacc2400gcccgaagtattgcaagccaggtgggcatcaccaaggtcttcgccgaagtgctgccgagc2460cataaagtggccaaggtgaagcagctgcaggaagagggcaagcgggtggcaatggtgggc2520gacggaatcaacgactcacccgcgctggcaatggccaatgtggggatcgccattggaaca2580gggacagatgtggccatcgaagccgccgacgtcgtgctgataaggaatgacttgttggac2640gtagtcgcatccattgatctgtcta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