用于免疫肿瘤学的组合物和方法与流程

本申请要求2015年12月4日提交的美国临时专利申请号62/263169、2016年4月1日提交的美国临时专利号62/316784和2016年9月14日提交的美国临时专利号62/394290的优先权。这些申请的完整内容通过引用方式并入本文。

背景

CRISPR(成簇规律间隔的短回文重复序列)在细菌中演化为防御对病毒攻击的适应性免疫系统。暴露于病毒时，病毒DNA短片段整合入细菌基因组的CRISPR基因座。RNA从包含病毒序列的CRISPR基因座的部分转录。含有与病毒基因组互补序列的这种RNA介导将Cas9蛋白导引至病毒基因组中的序列。Cas9蛋白切割病毒靶并因而使其沉默。

最近，已经修改CRISPR/Cas系统用于真核细胞中的基因组编辑。位点特异性单链断口(SSB)或双链断口(DSB)的引入允许例如通过非同源末端接合(NHEJ)或同源性指导的修复(HDR)而改变靶序列。

发明简述

本文所述的发明涉及用于免疫肿瘤学的组合物和方法，例如，在其基因组中特定靶序列处受修饰的细胞，包括如通过引入包含导引所述靶序列的gRNA分子的CRISPR系统来修饰，和其产生方法及其用途。例如，本公开涉及可用于细胞(例如，T细胞，例如，进一步经工程化以表达嵌合抗原受体的T细胞)基因组编辑和可用于治疗疾病(如癌症)的gRNA分子、CRISPR系统、细胞和方法。

在第一方面，本发明提供包含tracr和crRNA的gRNA分子，其中crRNA包含导引结构域，所述导引结构域与选自B2M、CD247、CD3D、CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1、TRBC2、HLA-A、HLA-B、HLA-C、DCK、CD52、FKBP1A、CIITA、NLRC5、RFXANK、RFX5、RFXAP或NR3C1的同种异体T细胞靶的靶序列互补。在gRNA分子的实施方案中：

2(a)同种异体T细胞靶是B2M，并且导引结构域包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527中的任一者；

2(b)同种异体T细胞靶是TRAC，并且导引结构域包含SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965中的任一者；

2(c)同种异体T细胞靶是TRBC1，并且导引结构域包含SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097中的任一者；

2(d)同种异体T细胞靶是TRBC2，并且导引结构域包含SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226中的任一者；

2(e)同种异体T细胞靶是CD247，并且导引结构域包含SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392中的任一者；

2(f)同种异体T细胞靶是CD3D，并且导引结构域包含SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532或SEQ ID NO:10780至SEQ ID NO:10794中的任一者；

2(g)同种异体T细胞靶是CD3E，并且导引结构域包含SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839或SEQ ID NO:10677至SEQ ID NO:10764中的任一者；

2(h)同种异体T细胞靶是CD3G，并且导引结构域包含SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968或SEQ ID NO:10765至SEQ ID NO:10779中的任一者；

2(i)同种异体T细胞靶是HLA-A，并且导引结构域包含SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345中的任一者；

2(j)同种异体T细胞靶是HLA-B，并且导引结构域包含SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698中的任一者；

2(k)同种异体T细胞靶是HLA-C，并且导引结构域包含SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068中的任一者；

2(l)同种异体T细胞靶是DCK，并且导引结构域包含SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491中的任一者；

2(m)同种异体T细胞靶是CD52，并且导引结构域包含SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324中的任一者；

2(n)同种异体T细胞靶是FKBP1A，并且导引结构域包含SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583或SEQ ID NO:6662至SEQ ID NO:6749中的任一者；

2(o)同种异体T细胞靶是NR3C1，并且导引结构域包含SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941中的任一者；

2(p)同种异体T细胞靶是CIITA，并且导引结构域包含SEQ ID NO:6750至SEQ ID NO:7716或SEQ ID NO:7717至SEQ ID NO:7804中的任一者；或

2(q)同种异体T细胞靶是NLRC5，并且导引结构域包含SEQ ID NO:8622至SEQ ID NO:10089中的任一者。

在gRNA分子的实施方案中，同种异体T细胞靶是TRAC，并且导引结构域包含SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5585、SEQ ID NO:5587、SEQ ID NO:5592、SEQ ID NO:5601、SEQ ID NO:5589、SEQ ID NO:5600、SEQ ID NO:5594、SEQ ID NO:5571、SEQ ID NO:5593、SEQ ID NO:5574、SEQ ID NO:5598、SEQ ID NO:5586、SEQ ID NO:5599、SEQ ID NO:5591、SEQ ID NO:5610、SEQ ID NO:5608、SEQ ID NO:5617、SEQ ID NO:5619或SEQ ID NO:5620，例如，导引结构域包含SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5586、SEQ ID NO:5587、SEQ ID NO:5592、SEQ ID NO:5599或SEQ ID NO:5600，例如，导引结构域包含SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5587、SEQ ID NO:5592或SEQ ID NO:5586，例如，导引结构域包含SEQ ID NO:5569。

在gRNA分子的实施方案中，同种异体T细胞靶是TRBC2，并且导引结构域包含SEQ ID NO:5719、SEQ ID NO:5694、SEQ ID NO:5706、SEQ ID NO:5696、SEQ ID NO:5711、SEQ ID NO:5708、SEQ ID NO:5709、SEQ ID NO:5712、SEQ ID NO:5703、SEQ ID NO:5707、SEQ ID NO:5687、SEQ ID NO:5705、SEQ ID NO:5713、SEQ ID NO:5715或SEQ ID NO:5710。

在gRNA分子的实施方案中，同种异体T细胞靶是B2M，并且导引结构域包含SEQ ID NO:5519、SEQ ID NO:5497、SEQ ID NO:5499、SEQ ID NO:5498、SEQ ID NO:5503、SEQ ID NO:5496、SEQ ID NO:5507、SEQ ID NO:5515、SEQ ID NO:5493、SEQ ID NO:5506、SEQ ID NO:5509、SEQ ID NO:5517、SEQ ID NO:5521、SEQ ID NO:5520、SEQ ID NO:5500、SEQ ID NO:5494、SEQ ID NO:5508、SEQ ID NO:5514或SEQ ID NO:5492，例如，导引结构域包含SEQ ID NO:5496、SEQ ID NO:5498或SEQ ID NO:5509。

在gRNA分子的实施方案中，同种异体T细胞靶是CIITA，并且导引结构域包含SEQ ID NO:7771、SEQ ID NO:7769、SEQ ID NO:7773、SEQ ID NO:7726、SEQ ID NO:7758、SEQ ID NO:7739、SEQ ID NO:7779、SEQ ID NO:7770、SEQ ID NO:7749、SEQ ID NO:7754、SEQ ID NO:7745、SEQ ID NO:7785、SEQ ID NO:7731、SEQ ID NO:7772、SEQ ID NO:7743或SEQ ID NO:7750，例如，导引结构域包含SEQ ID NO:7769、SEQ ID NO:7771、SEQ ID NO:7739或SEQ ID NO:7785。

在gRNA分子的实施方案中，同种异体T细胞靶是CD3E，并且导引结构域包含SEQ ID NO:10729、SEQ ID NO:10719、SEQ ID NO:10764、SEQ ID NO:10789、SEQ ID NO:10701、SEQ ID NO:10700或SEQ ID NO:10722。

在gRNA分子的实施方案中，同种异体T细胞靶是FKBP1A，并且导引结构域包含SEQ ID NO:6693、SEQ ID NO:6705、SEQ ID NO:6694、SEQ ID NO:6708或SEQ ID NO:6699。

在第二方面，本发明提供包含tracr和crRNA的gRNA分子，其中crRNA包含导引结构域，所述导引结构域与抑制性分子的靶序列或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物互补，所述抑制性分子选自CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PD-L2、CTLA4、CEACAM(例如、CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD113)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD107)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ或PTPN11。

在gRNA分子的实施方案中：

15(a)抑制性分子是CD274(PD-L1)，并且导引结构域包含SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270中的任一者；

15(b)抑制性分子是HAVCR2(TIM3)，并且导引结构域包含SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541中的任一者；

15(c)抑制性分子是LAG3，并且导引结构域包含SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032中的任一者；

15(d)抑制性分子是PDCD1(PD-1)，并且导引结构域包含SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589或SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815中的任一者；或

15(e)借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物是PTPN1，并且导引结构域包含SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277中的任一者。

在gRNA分子的实施方案中，抑制性分子是PDCD1，并且导引结构域包含SEQ ID NO:5743、SEQ ID NO:5798、SEQ ID NO:5748、SEQ ID NO:5722、SEQ ID NO:5800、SEQ ID NO:5735、SEQ ID NO:5724、SEQ ID NO:5731、SEQ ID NO:5725、SEQ ID NO:5775、SEQ ID NO:5766、SEQ ID NO:5727、SEQ ID NO:5744、SEQ ID NO:5751或SEQ ID NO:5734，例如，导引结构域包含SEQ ID NO:5775。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，导引结构域包含任一个所列举的导引结构域序列的17、18、19、20、21个(如果存在于参考序列中)、22个(如果存在于参考序列中)、23个(如果存在于参考序列中)、24个(如果存在于参考序列中)或25个(如果存在于参考序列中)连续核酸。在gRNA分子的其他实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，导引结构域由任一个所列举的导引结构域序列的17、18、19、20、21个(如果存在于参考序列中)、22个(如果存在于参考序列中)、23个(如果存在于参考序列中)或24个(如果存在于参考序列中)或25个(如果存在于参考序列中)连续核酸组成。在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，任一个所列举的导引结构域序列的17、18、19、20、21个(如果存在于参考序列中)、22个(如果存在于参考序列中)、23个(如果存在于参考序列中)、或24个(如果存在于参考序列中)、或25个(如果存在于参考序列中)连续核酸是设置在所列举导引结构域序列的3'端的17、18、19、20、21个(如果存在于参考序列中)、22个(如果存在于参考序列中)、23个(如果存在于参考序列中)、或24个(如果存在于参考序列中)、或25个(如果存在于参考序列中)连续核酸。在gRNA分子的其他实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，任一个所列举的导引结构域序列的17、18、19、20、21个(如果存在于参考序列中)、22个(如果存在于参考序列中)、23个(如果存在于参考序列中)、或24个(如果存在于参考序列中)、或25个(如果存在于参考序列中)连续核酸是设置在所列举导引结构域序列的5'端的17、18、19、20、21个(如果存在于参考序列中)、22个(如果存在于参考序列中)、23个(如果存在于参考序列中)、或24个(如果存在于参考序列中)、或25个(如果存在于参考序列中)连续核酸。在其他实施方案中gRNA分子，包括在前述方面和实施方案的任一者中，任一个所列举的导引结构域序列的17、18、19、20、21个(如果存在于参考序列中)、22个(如果存在于参考序列中)、23个(如果存在于参考序列中)、或24个(如果存在于参考序列中)、或25个(如果存在于参考序列中)连续核酸不包括所列举的导引结构域序列的5’或3’核酸。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，导引结构域由所列举的导引结构域序列组成。

gRNA分子的以下一般方面可以单独或联合地与任何包含本文所述的导引结构域的gRNA组合，该导引结构域例如在前述方面和实施方案的任一者中列举的导引结构域。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，crRNA的一部分和tracr的一部分杂交以形成包含SEQ ID NO:6584或SEQ ID NO:6585的旗杆。在其他实施方案中，旗杆还包括位于旗杆的crRNA部分3’的第一旗杆延长部分，其中所述第一旗杆延长部分包含SEQ ID NO:6586。在其他实施方案中，旗杆还包括位于旗杆的crRNA部分和(如果存在)第一旗杆延长部分3’的第二旗杆延长部分，其中所述第二旗杆延长部分包含SEQ ID NO:6587。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，tracr包含以下序列，例如，由其组成：

(a)SEQ ID NO:7820，任选地在3'端还包含附加的1、2、3、4、5、6或7个尿嘧啶(U)核苷酸；

(b)SEQ ID NO:6660；或

(c)SEQ ID NO:6661。在这类实施方案中，旗杆的crRNA部分包含SEQ ID NO:6607或SEQ ID NO:6608。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，tracr包含SEQ ID NO:6589或SEQ ID NO:6590，并且任选地，如果存在第一旗杆延长部分，设置在SEQ ID NO:6589或SEQ ID NO:6590的5’的第一tracr延长部分，所述第一tracr延长部分包含SEQ ID NO:6591。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，导引结构域和tracr设置在分开的核酸分子上。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，crRNA从5’至3’包含(例如由其组成)[导引结构域]-：

a)SEQ ID NO:6584；

b)SEQ ID NO:6585；

c)SEQ ID NO:6605；

d)SEQ ID NO:6606；

e)SEQ ID NO:6607；

f)SEQ ID NO:6608；或

g)SEQ ID NO:7806。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，tracr从5’至3’包含(例如由其组成)：

a)SEQ ID NO:6589；

b)SEQ ID NO:6590；

c)SEQ ID NO:6609；

d)SEQ ID NO:6610；

e)SEQ ID NO:6660；

f)SEQ ID NO:6661；

g)SEQ ID NO:7820；

h)SEQ ID NO:7807；

i)SEQ ID NO:7808；

j)SEQ ID NO:7809；

k)以上a)至j)的任一项，在3'端还包含至少1、2、3、4、5、6或7个尿嘧啶(U)核苷酸，例如、1、2、3、4、5、6、或7个尿嘧啶(U)核苷酸；

l)以上a)至k)的任一项，在3'端还包含至少1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸；或

m)以上a)至i)的任一项，在5'端(例如，在5'末端)还包含至少1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸。

在优选的实施方案中gRNA分子，包括在前述方面和实施方案的任一者中，导引结构域和tracr设置在分开的核酸分子上，并且包含导引结构域的核酸分子包含任选地紧邻导引结构域的3’设置的SEQ ID NO:6607，并且包含tracr的核酸分子包含SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)。

在其他实施方案中gRNA分子，包括在前述方面和实施方案的任一者中，导引结构域和tracr设置在单个核酸分子上，并且其中tracr在导引结构域的3’设置。在这类实施方案中gRNA分子，包括在前述方面和实施方案的任一者中，gRNA分子还含在导引结构域的3’及在tracr的5’设置的环，例如，包含(例如由其组成)SEQ ID NO:6588的环。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，gRNA分子从5’至3’包含(例如由其组成)[导引结构域]-：

(a)SEQ ID NO:6601；

(b)SEQ ID NO:6602；

(c)SEQ ID NO:6603；

(d)SEQ ID NO:6604；

(e)SEQ ID NO:7811；或

(f)以上(a)至(e)的任一项，在3'端还包含1、2、3、4、5、6或7个尿嘧啶(U)核苷酸。

在优选的实施方案中gRNA分子，包括在前述方面和实施方案的任一者中，导引结构域和tracr设置在单个核酸分子上，并且其中所述核酸分子包含所述导引结构域和任选地紧邻所述导引结构域的3’设置的SEQ ID NO:6601，例如，由其组成。

在优选的实施方案中gRNA分子，包括在前述方面和实施方案的任一者中，导引结构域和tracr设置在单个核酸分子上，并且其中所述核酸分子包含所述导引结构域和任选地紧邻所述导引结构域的3’设置的SEQ ID NO:7811，例如，由其组成。

在实施方案中，gRNA分子由未修饰RNA核苷酸和核酸键组成。在其他实施方案中，gRNA分子含有例如本文所述的一个或多个修饰。在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，gRNA分子的一个或任选地多于一个核酸分子包含：

a)在所述核酸分子或分子的3'端的(例如，三个)硫代磷酸酯修饰；

b)在所述核酸分子或分子的5'端的(例如，三个)硫代磷酸酯修饰；

c)在所述核酸分子或分子的3'端的(例如，三个)2'-O-甲基修饰；

d)在所述核酸分子或分子的5'端的(例如，三个)2'-O-甲基修饰；

e)在所述核酸分子或分子的倒数3’第4末端、倒数第3末端和倒数第2末端的每处的2’O-甲基修饰；或

f)其任意组合。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，将包含(例如本文所述的)gRNA分子的CRISPR系统(例如，本文所述的RNP，例如，包含例如本文所述的Cas9分子的RNP)引入细胞时，在与gRNA分子的导引结构域互补的靶序列处或其附近形成插入/缺失。在实施方案中，插入/缺失是移码突变。在实施方案中，插入/缺失是在图34A、图34B、图36、图38、图41、图44、图48、图49、图50或图53的任一图中列出的插入/缺失。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，将包含(例如本文所述的)gRNA分子的CRISPR系统(例如，本文所述的RNP，例如，包含例如本文所述的Cas9分子的RNP)引入细胞群体时，插入/缺失在至少约40％，例如，至少约50％，例如，至少约60％，例如，至少约70％，例如，至少约80％，例如，至少约90％，例如，至少约95％，例如，至少约96％，例如，至少约97％，例如，至少约98％，例如，至少约99％的细胞群体中在与gRNA分子的导引结构域互补的靶序列处或其附近形成。在实施方案中，作为移码突变的插入/缺失在至少约20％，例如，至少约30％，例如，至少约35％，例如，至少约40％，例如，至少约45％，例如，至少约50％，例如，至少约55％，例如，至少约60％，例如，至少约65％，例如，至少约70％，例如，至少约75％，例如，至少约80％，例如，至少约85％，例如，至少约90％，例如，至少约95％，例如，至少约99％的细胞群体中在与gRNA分子的导引结构域互补的靶序列处或其附近形成。在实施方案中，在至少约30％，例如，至少约40％，例如，至少约50％，例如，至少约60％，例如，至少约70％，例如，至少约80％，例如，至少约90％，例如，至少约95％，例如，至少约96％，例如，至少约97％，例如，至少约98％，例如，至少约99％的细胞群体中，插入/缺失是在图34A、图34B、图36、图38、图41、图44、图48、图49、图50或图53的任一图中列出的插入/缺失。在实施方案中，五个在所述细胞群体中最频繁检测到的插入/缺失包括三个或更多个，例如，四个，例如，五个与图34A、图34B、图36、图38、图41、图44、图48、图49、图50或图53的任一图中列出的任何gRNA相关的插入/缺失。如通过例如下一代测序法(NGS)测量和/或定量插入/缺失或插入/缺失样式。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，将包含(例如本文所述的)gRNA分子的CRISPR系统(例如，本文所述的RNP，例如，包含例如本文所述的Cas9分子的RNP)引入如上所述的细胞(或细胞群体)时，包含与gRNA分子的导引结构域互补的靶序列的基因的表达在所述细胞中减少或消除。在实施方案中，所述基因的表达在群体的至少约40％，例如，至少约50％，例如，至少约60％，例如，至少约70％，例如，至少约80％，例如，至少约90％，例如，至少约95％，例如，至少约96％，例如，至少约97％，例如，至少约98％，例如，至少约99％的细胞中减少或消除。在实施方案中，通过流式细胞术测量表达减少或消除。在其他实施方案中，例如，在FKBP1A的情况下，通过(例如本文所述的)功能测定法测量表达减少或消除。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，将包含(例如本文所述的)gRNA分子的CRISPR系统(例如，本文所述的RNP，例如，包含例如本文所述的Cas9分子的RNP)引入如上所述的细胞时，所述细胞中不形成脱靶插入/缺失，例如，如通过(例如本文所述的)下一代测序法和/或核苷酸插入测定法可检测。

在gRNA分子的实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，将包含(例如本文所述的)gRNA分子的CRISPR系统(例如，本文所述的RNP，例如，包含例如本文所述的Cas9分子的RNP)引入如上所述的细胞(或细胞群体)时，在细胞群体不多于约5％，例如，不多于约1％，例如，不多于约0.1％，例如，不多于约0.01％的细胞中检测到脱靶插入/缺失，例如，如通过下一代测序法和/或核苷酸插入测定法可检测。

在提到细胞的前述方面和实施方案的任一者中，细胞是(或细胞群体包含)哺乳动物细胞、灵长类细胞或人细胞，例如，是人细胞。在提到细胞的前述方面和实施方案的任一者中，细胞是(或细胞群体包含)免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞，例如，是T细胞，例如，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞，或其组合。

在提到细胞的前述方面和实施方案的任一者中，细胞(或细胞群体)已经或将会经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。在实施方案中，CAR是：

(a)CD19 CAR；或

(b)BCMA CAR。在实施方案中：

(a)CAR是包含抗原结合结构域的CD19 CAR，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7883至SEQ ID NO:7898中的任一者；

(b)CAR是包含SEQ ID NO:7909或SEQ ID NO:7920的CD19 CAR；

(c)CAR是包含抗原结合结构域的BCMA CAR，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7939至SEQ ID NO:8112中的任一者，例如，包含SEQ ID NO:7949的抗原结合结构域；或

(d)CAR是包含SEQ ID NO:8549至SEQ ID NO:8621中的任一者，例如，包含SEQ ID NO:8559的BCMA CAR。

在提到细胞的前述方面和实施方案的任一者中，细胞相对于待施用所述细胞的患者是同种异体的。在其他实施方案中，细胞相对于待施用所述细胞的患者是自体的。

在另一个方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含前述方面和实施方案的任一项的第一gRNA分子，还包含Cas9分子。在实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:6611或SEQ ID NO:7821至SEQ ID NO:7831的任一者，例如，由其组成。在实施方案中，Cas9分子是有活性或无活性的化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9。在优选的实施方案中，第一gRNA分子和Cas9分子存在于核糖核蛋白复合体(RNP)中。

在多个方面，组合物可以包含多于一种gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，其各自与本文所述的Cas9分子复合。例如，在实施方案中，组合物还包含第二gRNA分子；第二gRNA分子和第三gRNA分子；或第二gRNA分子、第三gRNA分子和第四gRNA分子，其中第二gRNA分子、第三gRNA分子(如果存在)和第四gRNA分子(如果存在)是如本文所述的gRNA分子，例如，前述方面和实施方案的任一项的gRNA分子，并且其中组合物的每种gRNA分子与不同的靶序列互补(即，包含不同的导引结构域)。在实施方案中，第一gRNA分子、第二gRNA分子、第三gRNA分子(如果存在)和第四gRNA分子(如果存在)与相同基因内部的靶序列互补。在这类实施方案中，第一gRNA分子、第二gRNA分子、第三gRNA分子(如果存在)和第四gRNA分子(如果存在)与相隔不多于20000个核苷酸、不多于10000个核苷酸、不多于6000个、不多于5000个核苷酸、不多于4000，不多于1000个核苷酸、不多于500个核苷酸、不多于400个核苷酸、不多于300个核苷酸、不多于200个核苷酸、不多于100个核苷酸、不多于90个核苷酸、不多于80个核苷酸、不多于70个核苷酸、不多于60个核苷酸、不多于50个核苷酸、不多于40个核苷酸、不多于30个核苷酸、不多于20个核苷酸或不多于10个核苷酸的靶序列互补。在其他实施方案中，第一gRNA分子、第二gRNA分子、第三gRNA分子(如果存在)和第四gRNA分子(如果存在)与不同基因或基因座(例如本文所述的不同基因)内部的靶序列互补。

在实施方案中，第一gRNA分子是2(b)、2(c)、2(d)、2(d)、2(e)、2(f)、2(g)或2(h)中任一项的gRNA分子；并且第二gRNA分子是2(a)、2(i)、2(j)、2(k)或2(q)中任一项的gRNA分子；并且第三gRNA分子是15(a)、15(b)、15(c)、15(d)或15(e)中任一项的gRNA分子。在实施方案中，第一gRNA分子是2(b)、2(c)、2(d)、2(d)、2(e)、2(f)、2(g)或2(h)中任一项的gRNA分子；并且第二gRNA分子是2(l)、2(m)、2(n)或2(o)中任一项的gRNA分子；并且第三gRNA分子是15(a)、15(b)、15(c)、15(d)或15(e)中任一项的gRNA分子。在其他实施方案中，第一gRNA分子是2(b)、2(c)、2(d)、2(d)、2(e)、2(f)、2(g)或2(h)中任一项的gRNA分子；并且第二gRNA分子是2(l)、2(m)、2(n)或2(o)中任一项的gRNA分子。在其他实施方案中，第一gRNA分子是2(b)、2(c)、2(d)、2(d)、2(e)、2(f)、2(g)或2(h)中任一项的gRNA分子；并且第二gRNA分子是2(a)、2(i)、2(j)或2(k)中任一项的gRNA分子。在其他实施方案中，第一gRNA分子是2(b)、2(c)、2(d)、2(d)、2(e)、2(f)、2(g)或2(h)中任一项的gRNA分子；并且第二gRNA分子是15(a)、15(b)、15(c)、15(d)或15(e)中任一项的gRNA分子。在其他实施方案中，第一gRNA分子是15(a)、15(b)、15(c)、15(d)或7(e)中任一项的gRNA分子；并且第二gRNA分子是15(a)、15(b)、15(c)、15(d)或15(e)中任一项的gRNA分子。在任何前述实施方案任一项的实施方案中，第三gRNA存在，并且第三gRNA分子是15(a)、15(b)、15(c)、15(d)或15(e)中任一项的gRNA分子。在实施方案中，组合物由前述gRNA分子方面和实施方案中任一者的二种gRNA分子组成。在实施方案中，组合物由前述gRNA分子方面和实施方案中任一者的三种gRNA分子组成。在实施方案中，组合物由前述方面和实施方案中任一者的第一gRNA分子和前述gRNA分子方面和实施方案中任一者的第二gRNA分子组成；其中所述第一gRNA分子的导引结构域是2(a)、2(i)、2(j)或2(k)中任一项的导引结构域；其中所述第二gRNA分子的导引结构域是2(b)、2(c)、2(d)、2(f)、2(g)、2(h)或2(i)中任一项的导引结构域。

在实施方案中，组合物包含二种gRNA分子，并且所述第一gRNA分子的导引结构域包含SEQ ID NO:5519、SEQ ID NO:5497、SEQ ID NO:5499、SEQ ID NO:5498、SEQ ID NO:5503、SEQ ID NO:5496、SEQ ID NO:5507、SEQ ID NO:5515、SEQ ID NO:5493、SEQ ID NO:5506、SEQ ID NO:5509、SEQ ID NO:5517、SEQ ID NO:5521、SEQ ID NO:5520、SEQ ID NO:5500、SEQ ID NO:5494、SEQ ID NO:5508、SEQ ID NO:5514或SEQ ID NO:5492，例如，由其组成；并且所述第二gRNA分子的导引结构域包括SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5585、SEQ ID NO:5587、SEQ ID NO:5592、SEQ ID NO:5601、SEQ ID NO:5589、SEQ ID NO:5600、SEQ ID NO:5594、SEQ ID NO:5571、SEQ ID NO:5593、SEQ ID NO:5574、SEQ ID NO:5598、SEQ ID NO:5586、SEQ ID NO:5599、SEQ ID NO:5591、SEQ ID NO:5610、SEQ ID NO:5608、SEQ ID NO:5617、SEQ ID NO:5619或SEQ ID NO:5620，例如由其组成。

在实施方案中，组合物包含二种gRNA分子，并且所述第一gRNA分子的导引结构域包含SEQ ID NO:5496、SEQ ID NO:5498或SEQ ID NO:5509，例如，由其组成；并且所述第二gRNA分子的导引结构域包含SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5586、SEQ ID NO:5587、SEQ ID NO:5592、SEQ ID NO:5599或SEQ ID NO:5600，例如由其组成。

在实施方案中，组合物包含二种gRNA分子，并且所述第一gRNA分子的导引结构域包含SEQ ID NO:5496、SEQ ID NO:5498或SEQ ID NO:5509，例如，由其组成；并且所述第二gRNA分子的导引结构域包含SEQ ID NO:5569，例如由其组成。

在实施方案中，组合物包含二种gRNA分子，并且所述第一gRNA分子的导引结构域包含SEQ ID NO:5496、SEQ ID NO:5498或SEQ ID NO:5509，例如，由其组成；并且所述第二gRNA分子的导引结构域包含SEQ ID NO:10729、SEQ ID NO:10719、SEQ ID NO:10764、SEQ ID NO:10789、SEQ ID NO:10701、SEQ ID NO:10700或SEQ ID NO:10722，例如由其组成。

在实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，组合物还包括本文(例如，前述gRNA分子方面和实施方案的任一者中)所述的第三gRNA分子，其中所述第三gRNA分子的导引结构域是2(n)或2(q)中任一项的导引结构域。在实施方案中，所述第三gRNA分子的导引结构域包含SEQ ID NO:7771、SEQ ID NO:7769、SEQ ID NO:7773、SEQ ID NO:7726、SEQ ID NO:7758、SEQ ID NO:7739、SEQ ID NO:7779、SEQ ID NO:7770、SEQ ID NO:7749、SEQ ID NO:7754、SEQ ID NO:7745、SEQ ID NO:7785、SEQ ID NO:7731、SEQ ID NO:7772、SEQ ID NO:7743或SEQ ID NO:7750，例如由其组成；例如包含(例如由其组成)SEQ ID NO:7769、SEQ ID NO:7771、SEQ ID NO:7739或SEQ ID NO:7785。

在实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，组合物还包括本文(例如，前述gRNA分子方面和实施方案的任一者中)所述的第四gRNA分子，其中所述第四gRNA分子的导引结构域与NK抑制性分子(例如，LILRB1)的靶的靶序列互补。在实施方案中，所述第四gRNA分子的导引结构域包含以下者，例如，由其组成：

a)SEQ ID NO:10090至SEQ ID NO:10673中的任一者；

b)SEQ ID NO:10090至SEQ ID NO:10673中任一者的17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸。

c)SEQ ID NO:10090至SEQ ID NO:10673中的任一者的5’17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸，优选地20个核苷酸；或

d)SEQ ID NO:10090至SEQ ID NO:10673中的任一者的3’17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸，优选地20个核苷酸。

在(包括在前述方面和实施方案的任一者中的)组合物的实施方案中，(如本文所述的)第一gRNA分子的导引结构域、(如本文所述的)第二gRNA分子的导引结构域并且(如果存在)，(如本文所述的)第三gRNA分子的导引结构域，包含以下任一项的序列，例如由其组成：

a)表33的组合A1至组合A72；

b)表34的组合B1至组合B84；

c)表35的组合C1至组合C42；

d)表36的组合D1至组合D36；

e)表37的组合E1至组合E30；或

f)表38的组合F1至组合F60。

在前述方面和实施方案的任一者中，每种所述gRNA分子在具有本文所述的Cas9分子的核糖核蛋白复合体(RNP)中。

在实施方案中，gRNA分子或组合物配制在适于电穿孔的培养基中。

在其中每种所述gRNA分子位于具有本文所述的Cas9分子的RNP内的实施方案中，每种所述RNP复合体处于小于约10uM，例如，小于约3uM，例如，小于约1uM，例如，小于约0.5uM，例如，小于约0.3uM，例如，小于约0.1uM的浓度。

在实施方案中，组合物还包含例如本文所述的细胞，例如，细胞群体，例如，免疫效应细胞，例如，表达CAR的免疫效应细胞。

在另一个方面，本发明提供核酸，所述核酸编码前述gRNA分子方面或实施方案的任一项的gRNA分子，或前述组合物方面和实施方案的任一项的组合物的(例如，全部)组分。在实施方案中，核酸包含与编码gRNA分子的序列有效连接的启动子。在实施方案中，启动子是RNA聚合酶II或RNA聚合酶III识别的启动子。在其他实施方案中，启动子是U6启动子或HI启动子。在实施方案中，核酸还编码Cas9分子。在实施方案中，核酸包含与编码Cas9分子的序列有效连接的启动子，例如，EF-1启动子、CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、泛素C启动子或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。

在另一个方面，本发明提供载体，所述载体包含前述核酸方面和实施方案中任一项的核酸。在实施方案中，载体选自慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、质粒、微环、纳米质粒和RNA载体。

在另一个方面，本发明提供组合物，所述组合物包含前述gRNA分子方面和实施方案中任一项的gRNA分子和(例如本文所述的)编码Cas9分子的核酸。

在另一个方面，本发明提供组合物，所述组合物包含了编码前述gRNA分子方面和实施方案中任一项的gRNA分子的核酸和(例如本文所述的)Cas9分子。

在本发明的任何组合物的实施方案中，组合物还包含模板核酸。在实施方案中，模板核酸包含与gRNA分子的靶序列的核苷酸对应的核苷酸。在实施方案中，模板核酸包含编码(例如本文所述的)嵌合抗原受体(CAR)的核酸。在实施方案中，CAR是(a)例如WO2012/079000或WO2014/153270中所述的CD19 CAR，；或(b)例如本文所述的BCMA CAR，例如，包含SEQ ID NO:8559的BCMA CAR。在实施方案中，模板核酸包含编码例如本文所述的NK抑制性分子的核酸。

在另一个方面，本发明提供一种改变细胞，例如，改变其结构，例如，其序列、其靶序列的方法，包括使所述细胞与以下接触：a)前述gRNA分子方面和实施方案中任一项的gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，和(例如本文所述的)Cas9分子；b)前述gRNA分子方面和实施方案中任一项的gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，和编码(例本文所述的)Cas9分子的核酸；c)核酸，所述核算编码前述gRNA分子方面和实施方案中任一项的gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，和(如，如本文所述的)Cas9分子；d)核酸，所述核酸编码前述gRNA分子方面和实施方案中任一项的gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，和编码例如本文所述的Cas9分子的核酸；e)以上a)至d)的任意项和模板核酸；f)以上a)至d)的任意项，和包含编码模板核酸的序列的核酸；g)前述组合物方面和实施方案中任一项那个的组合物；或h)前述载体方面和实施方案中任一项的载体。在实施方案中，gRNA分子或编码gRNA分子的核酸和Cas9分子或编码Cas9分子的核酸配制在单一组合物中。在其他实施方案中，gRNA分子或编码gRNA分子的核酸和Cas9分子或编码Cas9分子的核酸配制在多于一种组合物中。在实施方案中，同时或依次递送多于一种组合物，例如，递送至本文所述的细胞。在实施方案中，细胞是动物细胞，例如，哺乳动物细胞、灵长类细胞或人细胞。在实施方案中，细胞是免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)，例如，T细胞或NK细胞，例如，T细胞，例如，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或其组合。在实施方案中，细胞已经或将要工程化以表达(例如本文所述的)嵌合抗原受体(CAR)。在实施方案中，细胞包含或将要包含(例如本文所述的)嵌合抗原受体(CAR)。在实施方案中，细胞包含或将要包含编码(例如本文所述的)嵌合抗原受体(CAR)的核酸。在实施方案中，CAR是(a)CD19 CAR；或(b)BCMA CAR。在实施方案中，CAR是包含抗原结合结构域的CD19 CAR，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7883至SEQ ID NO:7898中的任一者。在实施方案中，CAR是CD19 CAR并且包含SEQ ID NO:7908至SEQ ID NO:7920中的任一者。在实施方案中，CAR是包含抗原结合结构域的BCMA CAR，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7939至SEQ ID NO:8112中的任一者。在实施方案中，CAR是BCMA CAR并且包括SEQ ID NO:8549至SEQ ID NO:8621中的任一者，例如，包含SEQ ID NO:8559。在实施方案中，细胞相对于待施用所述细胞的患者是同种异体的。在实施方案中，细胞从健康人供体分离。在实施方案中，细胞相对于待施用所述细胞的患者是自体的。

在另一个方面，本发明提供通过前述方法方面和实施方案中任一项的方法改变，例如，通过本文所述的方法改变的细胞。在另一个方面，本发明提供了包含前述gRNA分子方面和实施方案中任一者的第一gRNA分子，或前述组合物方面和实施方案中任一项的组合物、前述核酸方面和实施方案中任一项的核酸，或前述载体方面和实施方案中任一项的载体的细胞。在实施方案中，将gRNA分子、组合物、核酸或载体离体引入所述细胞。在其他实施方案中，将gRNA分子、组合物、核酸或载体在体内引入所述细胞。在实施方案中，细胞是动物细胞，例如，哺乳动物细胞、灵长类细胞或人细胞。在实施方案中，细胞是免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)，例如，T细胞或NK细胞，例如，T细胞，例如，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或其组合。在实施方案中，细胞已经或将要工程化以表达(例如本文所述的)嵌合抗原受体(CAR)。在实施方案中，细胞包含或将要包含(例如本文所述的)嵌合抗原受体(CAR)。在实施方案中，细胞包含或将要包含编码(例如本文所述的)嵌合抗原受体(CAR)的核酸。在实施方案中，CAR是(a)CD19 CAR；或(b)BCMA CAR。在实施方案中，CAR是包含抗原结合结构域的CD19 CAR，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7883至SEQ ID NO:7898中的任一者。在实施方案中，CAR是CD19 CAR并且包含SEQ ID NO:7908至SEQ ID NO:7920中的任一者。在实施方案中，CAR是包含抗原结合结构域的BCMA CAR，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7939至SEQ ID NO:8112中的任一者。在实施方案中，CAR是BCMA CAR并且包括SEQ ID NO:8549至SEQ ID NO:8621中的任一者，例如，包含SEQ ID NO:8559。在实施方案中，细胞相对于待施用所述细胞的患者是同种异体的。在实施方案中，细胞从健康人供体分离。在实施方案中，细胞相对于待施用所述细胞的患者是自体的。在实施方案中，细胞包含、已经包含或将要包含根据权利要求1-60中任一项所述的第二gRNA分子，或编码前述gRNA分子方面和实施方案中任一者的第二gRNA分子的核酸，其中第一gRNA分子并且第二gRNA分子包含不相同的导引结构域。在实施方案中，第一gRNA分子包含与同种异体T细胞靶的靶序列互补的导引结构域(例如，表1、3、4或5中描述的导引结构域)，并且第二gRNA分子包含与抑制性分子的靶序列或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的靶序列互补的导引结构域(例如，包括表2或表6中描述的导引结构域)。在实施方案中，抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物是CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PD-L2、CTLA4、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)，VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD113)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD107)，KIR、A2aR、MHC I类，MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ或PTPN11。在实施方案中，第一gRNA分子包含与TRAC、TRBC1、TRBC2、CD247、CD3D、CD3E或CD3G的靶序列互补的导引结构域，并且第二gRNA分子包含与NLRC5的靶序列互补的导引结构域，例如，包含有包含SEQ ID NO:8622至SEQ ID NO:10089中的任一者(例如，由其组成)的导引结构域。在实施方案中，第一gRNA分子包含与TRAC、TRBC1、TRBC2、CD247、CD3D、CD3E或CD3G的靶序列互补的导引结构域，并且第二gRNA分子包含与B2M、HLA-A、HLA-B或HLA-C的靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，细胞还包含、已经包含或将要包含前述gRNA分子方面和实施方案中任一者的第三gRNA分子，或编码前述gRNA分子方面和实施方案中任一者的第三gRNA分子的核酸，其中第一gRNA分子、第二gRNA分子和第三gRNA分子包含不相同的导引结构域。在实施方案中，第三gRNA分子包含与CIITA、RFXANK、RFX5或RFXAP(例如，CIITA)的靶序列互补的导引结构域，例如，包含有包含SEQ ID NO:7717至SEQ ID NO:7804中任一者(例如，由其组成)的导引结构域，例如，包含有包含SEQ ID NO:7769、SEQ ID NO:7771或SEQ ID NO:7785中任一者(例如，由其组成)的导引结构域。在实施方案中，细胞包含三种gRNA分子，并且第一gRNA分子包含与TRAC的靶序列互补的导引结构域；第二gRNA分子包含与B2M的靶序列互补的导引结构域；并且第三gRNA分子包含与CIITA的靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，细胞包含三种gRNA分子，并且第一gRNA分子包含与TRAC靶序列互补的导引结构域；第二gRNA分子包含与NLRC5的靶序列互补的导引结构域；并且第三gRNA分子包含与CIITA的靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，细胞包含二种gRNA分子，并且第一gRNA分子包含与TRAC、TRBC1、TRBC2、CD247、CD3D、CD3E或CD3G的靶序列互补的导引结构域，并且第二gRNA分子包含与NR3C1、DCK、CD52或FKBP1A的靶序列互补的导引结构域。

在包含gRNA分子(例如，多于一种本文所述的gRNA分子)的细胞的实施方案中：

(1)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；

(2)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；

(3)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；

(4)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；

(5)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；

(6)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；

(7)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；

(8)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；

(9)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；

(10)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；

(11)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；

(12)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；

(13)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；

(14)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；

(15)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；

(16)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；

(17)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；

(18)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；

(19)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；

(20)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；

(21)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；

(22)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；

(23)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；

(24)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；

(25)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；

(26)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；

(27)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；

(28)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；

(29)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；

(30)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；

(31)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；

(32)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；

(33)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；

(34)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；

(35)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；

(36)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；

(37)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；

(38)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；

(39)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；

(40)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；

(41)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；

(42)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；

(43)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；

(44)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；

(45)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；

(46)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；

(47)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；

(48)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；

(49)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；

(50)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；

(51)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；

(52)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；

(53)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；

(54)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；

(55)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；或

(56)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域。

在实施方案中，包括在前述细胞方面和实施方案的任一者中，细胞还包含第三gRNA分子，所述第三gRNA分子包含与抑制性分子或途径抑制性分子的信号传导的下游效应物的靶序列互补的导引结构域，其中抑制性分子或途径抑制性分子的信号传导的下游效应物是CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PD-L2、CTLA4、CEACAM(例如，CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA，BTLA，TIGIT、LAIR1、CD160，2B4、CD80、CD86，B7-H3(CD113)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD107)、KIR，A2aR，MHC I类，MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ或PTPN11，例如，第三gRNA分子是包含15(a)至15(e)中任何项的导引结构域。

在包含gRNA分子(例如，多于一种本文所述的gRNA分子)的细胞的实施方案中：

(1)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；

(2)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；

(3)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；

(4)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；

(5)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；

(6)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；

(7)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；

(8)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；

(9)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；

(10)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；

(11)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；

(12)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；

(13)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；

(14)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；

(15)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；

(16)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；

(17)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；

(18)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；

(19)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；

(20)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；

(21)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；

(22)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；

(23)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；

(24)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；

(25)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；

(26)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；

(27)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；

(28)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；

(29)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；

(30)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；

(31)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；

(32)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；

(33)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；

(34)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；或

(35)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域。

在实施方案中细胞，第一gRNA分子的导引结构域，第二gRNA分子的导引结构域，和(如果存在)第三gRNA分子的导引结构域，包含以下任何项的序列，例如，由其组成：

g)表33的组合A1至组合A72；

h)表34的组合B1至组合B84；

i)表35的组合C1至组合C42；

j)表36的组合D1至组合D36；

k)表37的组合E1至组合E30；或

l)表38的组合F1至组合F60。

在实施方案中细胞，第一gRNA分子包含有包含SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5592或SEQ ID NO:5586的导引结构域，并且第二gRNA分子包含有包含SEQ ID NO:5775的导引结构域。

在前述细胞方面和实施方案的任一者中，已经如此改变包含与第一gRNA分子的导引结构域互补的靶序列的基因，和任选地包含与第二gRNA分子的导引结构域互补的靶序列的基因和/或包含与第三gRNA分子的导引结构域互补的靶序列的基因，从而已经减少或消除包含与第一gRNA分子的导引结构域互补的靶序列的基因的功能性产物表达，和任选地包含与第二gRNA分子的导引结构域互补的靶序列的基因和/或包含与第三gRNA分子的导引结构域互补的靶序列的基因的功能性产物表达。

在另一个方面，本发明提供一种在受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的细胞，例如，前述细胞方面和实施方案中任一项的细胞。

在另一个方面，本发明提供一种治疗受试者中癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的细胞，例如，前述细胞方面和实施方案中任一项的细胞。

在另一个方面，本发明提供一种治疗患有与表达肿瘤抗原相关的疾病，例如，与表达肿瘤抗原相关的增生性疾病、癌前期病状、癌症和非癌症相关适应症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的细胞，例如，前述细胞方面和实施方案中任一项的细胞。在实施方案中，与表达肿瘤抗原相关的疾病是癌症或非癌症相关适应症。在实施方案中，疾病是选自以下的癌症：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊枢椎肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、Kaposi肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境所致癌、所述癌症的组合，以及所述癌症的转移病灶。在实施方案中，癌症是选择下述的血液学癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴样白血病(ALL)、B细胞急性淋巴样白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴样白血病(T-ALL)、慢性髓性白血病(CML)、急性髓样白血病(AML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和白血病前期。

在任何前述方法的实施方案中，该方法还包括施用化疗药，例如，环磷酰胺、氟达拉滨或环磷酰胺和氟达拉滨。在方法的实施方案中，该方法包括施用淋巴细胞清除剂或免疫抑制剂，之后向受试者施用有效量的如本文所述的细胞，例如，前述细胞方面和实施方案中任一项的细胞。

在另一个方面，本发明提供一种制备免疫疗法用细胞(例如，细胞群体)的方法，所述方法包括：(a)通过以下方式调节细胞：减少或消除T细胞受体(TCR)的组分表达，例如，向所述细胞引入(如本文所述的)gRNA分子，例如2b至2h中任一项的多于一种gRNA分子，例如，根据权利要求3、4、5、10、11或12中任一项所述的gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子；(b)通过以下方式调节细胞：减少或消除HLA(例如，HLA-A、HLA-B和/或HLA-C)或B2M的表达，例如，向所述细胞引入2a、2i、2j或2k中任一项的(如本文所述的)gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，例如，根据权利要求6或7中任一项所述的gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子；并且(c)扩充所述细胞。在实施方案中，该方法还包括通过减少或消除CIITA表达调节所述细胞，例如向所述细胞引入2p的(如本文所述的)gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，例如，根据权利要求8或9中任一项所述的gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，其中所述调节任选地发生在扩充所述细胞的步骤之前。

在另一个方面，本发明提供一种制备免疫疗法用细胞(例如，细胞群体)的方法，所述方法包括：(a)通过以下方式调节细胞：减少或消除T细胞受体(TCR)的组分表达，例如，向所述细胞引入2b至2h中任一项的(如本文所述的)gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，例如，根据权利要求3、4、5、10、11或12中任一项所述的(如本文所述的)gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子；(b)通过以下方式调节细胞：减少或消除免疫抑制剂的靶的表达，例如，向所述细胞引入2l、2m、2n或2o中任一项的(如本文所述的)gRNA分子，例如，多于一种(如本文所述的)gRNA分子，例如，根据权利要求13所述的(如本文所述的)gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子；并且(c)扩充所述细胞。

在任何前述制备细胞方法的任一项的实施方案中，所述方法还包括(d)通过以下方式调节细胞：减少或消除第一抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的表达，例如，向所述细胞引入根据权利要求14或15所述的(如本文所述的)gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，其中所述调节任选地发生在扩充所述细胞的步骤之前。

在另一个方面，本发明提供一种制备免疫疗法用细胞(例如，细胞群体)的方法，所述方法包括：(a)通过以下方式调节细胞：减少或消除第一抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的表达，例如，向所述细胞引入根据权利要求14所述的(如本文所述的)gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，例如，根据权利要求15-17中任一项所述的gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子；并且(c)扩充所述细胞。

在前述制备细胞方法的任一项的实施方案中，所述方法还包括(e)通过以下方式调节细胞：减少或消除第二抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的表达，例如，向所述细胞引入根据权利要求14或15所述的gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子，其中第一抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物和第二抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物是不同的。

在前述制备细胞方法的任一项的实施方案中，同时或依次引入每种gRNA分子。在实施方案中，每种gRNA分子的引入是依次的并且分隔至少24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天的时间。

在前述制备细胞方法的任一项的实施方案中，该方法还包括向细胞引入编码(例如，本文所述的)嵌合抗原受体(CAR)的核酸。在实施方案中，编码CAR的核酸设置在模板核酸上。在实施方案中，编码CAR的核酸设置在RNA载体上。在实施方案中，编码CAR的核酸设置在慢病毒载体上。

在前述制备细胞方法的任一项的实施方案中，该方法还包括分离呈TCR表达阴性的细胞。在实施方案中，分离过程产生其中大于约75％，例如，大于约80％、85％、90％、91％、92％、93、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的细胞呈TCR表达阴性的细胞群体。在实施方案中，分离呈TCR表达阴性的细胞的步骤包括使细胞群体与组合物接触，所述组合物包含T细胞受体(TCR)组分特异性、任选地与固相支持物或可检测标记物结合的抗体，并且分离不与所述抗体结合的细胞。在实施方案中，细胞是免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞，例如，T细胞。在实施方案中，细胞相对于待施用它们的受试者是同种异体的，例如细胞分离自健康供体，例如，未患有与肿瘤抗原表达相关的病状的供体。在实施方案中，细胞相对于待施用它们的受试者是自体的。在前述制备细胞方法的任一项的实施方案中，步骤(a)和/或(b)离体进行。在实施方案中，步骤(c)离体进行。在实施方案中，扩充步骤(c)进行至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天、或时间2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、3-10、2-9、3-9、2-8、3-8、2-7、3-7、2-6、3-6、2-5或3-5天的时间。

在前述制备细胞方法的任一项的实施方案中，gRNA分子是本文所述的gRNA分子，并且(例如，联合使用的)每种gRNA分子的导引结构域包含表33、表34、表35、表36、表37或表38表中列出的任何组合的序列，例如由其组成。在实施方案中，每种gRNA分子的导引结构域包含以下任一项的序列，例如由其组成序：

a)表33的组合A1至组合A72，例如，组合A1至A4、组合A5至A8、组合A37至A40或组合A41至A44；

b)表34的组合B1至组合B84；

c)表35的组合C1至组合C42；

d)表36的组合D1至组合D36，例如，组合D2、组合D4、组合D20或组合D22；

e)表37的组合E1至组合E30，例如，组合E2、组合E4、组合E8或组合E10；或

f)表38的组合F1至组合F60，例如，组合F1至F4、组合F5至F8、组合F13至F16或组合F17至F20的任一者。

在另一个方面，本发明提供一种治疗有需求的受试者的方法，包括施用通过本文所述的制备细胞的方法(例如，制备细胞方法的前述方面和实施方案中任一者的方法)制备的细胞(例如，细胞群体)。在实施方案中，特别在包含与免疫抑制剂的靶的靶序列结合的gRNA分子的实施方案中，该方法还包括施用免疫抑制剂，例如，雷帕霉素、雷帕霉素类似物或mTor抑制剂，例如，RAD001。在实施方案中，受试者患有与肿瘤抗原表达相关的疾病，例如，与肿瘤抗原表达相关的增生性疾病、癌前期病状、癌症和非癌症相关适应症，其中所述施用治疗了与肿瘤抗原表达相关的所述疾病。在实施方案中，与肿瘤抗原表达相关的疾病是癌症或非癌症相关适应症。在实施方案中，疾病是选自以下的癌症：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊枢椎肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、Kaposi肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境所致癌、所述癌症的组合，以及所述癌症的转移病灶。在实施方案中，癌症是选择下述的血液学癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴样白血病(ALL)、B细胞急性淋巴样白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴样白血病(T-ALL)、慢性髓性白血病(CML)、急性髓样白血病(AML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和白血病前期。

在另一个方面，本发明提供治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括：

(a)从同种异体供体提供细胞群体；

(b)向细胞引入包含第一gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第一gRNA分子包含与选自CD247、CD3D、CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1和TRBC2的基因中的靶序列互补的导引结构域；

(c)任选地，选择那些其中已经减少或消除有功能TCR表达的细胞；

(d)用编码CAR的核酸转导细胞；并且

(e)施用细胞至有需要的患者，例如，患有与表达CAR识别的抗原相关的疾病的患者。在实施方案中，针对CD247，CD3D、CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1或TRBC2的第一gRNA分子是2(b)-2(h)中任一项的gRNA分子，例如，是权利要求3、4、5、10、11或12中任一项的gRNA分子。

在实施方案中，治疗患有疾病的患者的方法还包括向细胞引入包含第二gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第二gRNA分子包含与选自B2M、HLA-A、HLA-B或HLA-C的基因中的靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，针对B2M、HLA-A、HLA-B或HLA-C的第二gRNA是2(a)或2(i)-2(k)中任一项的gRNA分子，例如，是权利要求6或7中任一项的gRNA分子。在实施方案中，该方法还包括向细胞引入包含第三gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第三gRNA分子包含与选自CIITA、RFXANK、RFXAP、RFX5、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP的基因中的靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，其中第三gRNA分子是2(a)或2(i)-2(k)中任一项的gRNA分子，例如，是权利要求6或7中任一项的gRNA分子。

在其他实施方案中，治疗患有疾病的患者的方法还包括向细胞引入包含第二gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第二gRNA分子包含与选自DCK、CD52、FKBP1A或NR3C1的基因中的靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，针对DCK、CD52、FKBP1A或NR3C1的第二gRNA分子是2(l)-2(o)中任一项的第二gRNA分子，例如，是权利要求13的第二gRNA分子。在其中第二gRNA针对DCK的实施方案中，该方法还包括向所述患者施用基于核苷类似物的药物，例如，基于核苷类似物的药物是阿糖胞苷或吉西他滨。在实施方案中，其中第二gRNA针对CD52，该方法还包括向所述患者施用抗CD52抗体或其抗原结合片段，例如，抗CD52抗体或其抗原结合片段是阿伦珠单抗在其中第二gRNA针对FKBP1A的实施方案中，该方法还包括向所述患者施用FK506、环孢菌素、雷帕霉素或雷帕霉素类似物或者mTor抑制剂如RAD001。在其中第二gRNA针对NR3C1的实施方案中，该方法还包括向所述患者施用皮质类固醇，例如，皮质类固醇是地塞米松。

在前述治疗患有疾病的患者的方法的任一项的实施方案中，gRNA分子是本文所述的gRNA分子，并且(例如，联合使用的)每种gRNA分子的导引结构域包含表33、表34、表35、表36、表37或表38表中列出的任何组合的序列，例如由其组成。在实施方案中，每种gRNA分子的导引结构域包含以下任一项的序列，例如由其组成序：

a)表33的组合A1至组合A72，例如，组合A1至A4、组合A5至A8、组合A37至A40或组合A41至A44；

b)表34的组合B1至组合B84；

c)表35的组合C1至组合C42；

d)表36的组合D1至组合D36，例如，组合D2、组合D4、组合D20或组合D22；

e)表37的组合E1至组合E30，例如，组合E2、组合E4、组合E8或组合E10；或

f)表38的组合F1至组合F60，例如，组合F1至F4、组合F5至F8、组合F13至F16或组合F17至F20的任一者。

在前述治疗患有疾病的患者的方法的任一项的实施方案中，该方法还包括向细胞引入包含第四gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第四gRNA分子包含与选自以下基因中的靶序列互补的导引结构域：CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PD-L2、CTLA4、CEACAM(例如，CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA，BTLA，TIGIT、LAIR1、CD160，2B4、CD80、CD86，B7-H3(CD113)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD107)、KIR，A2aR，MHC I类，MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ或PTPN11，例如，第四gRNA分子针对CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1或PTPN11，例如，15(a)-(e)中任一项的gRNA分子，例如，权利要求16-17中任一项的gRNA分子。

在另一个方面，本发明提供治疗患有疾病的患者的方法，所述方法包括：

(a)提供(如本文所述的)细胞群体，例如，免疫效应细胞；

(b)向细胞群体引入包含第一gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第一gRNA分子包含与选自CD247、CD3D、CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1和TRBC2的基因中的靶序列互补的导引结构域；

(c)向细胞群体引入包含第二gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第二gRNA分子包含与选自B2M、HLA-A、HLA-B和HLA-C的基因中的靶序列互补的导引结构域；

(d)任选地，选择那些其中已经减少或消除功能性TCR、功能性B2M或功能性TCR和B2M二者表达的细胞；

(d)向细胞群体引入编码CAR的核酸；并且

(e)施用细胞群体至有需要的患者，例如，患有与CAR识别的抗原表达相关的疾病的患者。在方法的实施方案中，该方法还包括(f)向细胞群体引入包含第三gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第三gRNA分子包含与选自CIITA、RFXANK、RFX5和RFXAP的基因中的靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，第一gRNA分子包含与选自例如本文所述的TRAC、TRBC1和TRBC2(例如，TRAC)的基因中的靶序列互补的导引结构域，例如，包含(例如，由其组成)选自SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5585、SEQ ID NO:5592、SEQ ID NO:5601、SEQ ID NO:5589、SEQ ID NO:5600、SEQ ID NO:5594、SEQ ID NO:5571、SEQ ID NO:5593、SEQ ID NO:5574、SEQ ID NO:5598、SEQ ID NO:5586、SEQ ID NO:5599、SEQ ID NO:5591、SEQ ID NO:5610、SEQ ID NO:5608、SEQ ID NO:5617、SEQ ID NO:5619，和SEQ ID NO:5620，例如，选自SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5592、SEQ ID NO:5587、SEQ ID NO:5599、SEQ ID NO:5600，和SEQ ID NO:5586，例如，选自SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5586，和SEQ ID NO:5592的导引结构域。在其他实施方案中，第一gRNA分子包含与选自例如本文所述的CD3E、CD3G和CD3D的基因中的靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，第二gRNA分子包含与选自例如本文所述的B2M基因中的靶序列互补的导引结构域，例如，包含(例如，由其组成)选自SEQ ID NO:5519、SEQ ID NO:5497、SEQ ID NO:5499、SEQ ID NO:5498、SEQ ID NO:5503、SEQ ID NO:5496、SEQ ID NO:5507、SEQ ID NO:5515、SEQ ID NO:5493、SEQ ID NO:5506、SEQ ID NO:5509、SEQ ID NO:5517、SEQ ID NO:5521、SEQ ID NO:5520、SEQ ID NO:5500、SEQ ID NO:5494、SEQ ID NO:5508、SEQ ID NO:5514和SEQ ID NO:5492，例如，选自SEQ ID NO:5496、SEQ ID NO:5498和SEQ ID NO:5509的导引结构域。在实施方案中，第三gRNA分子包含与选自例如本文所述的CIITA基因中的靶序列互补的导引结构域，例如，包含(例如，由其组成)选自SEQ ID NO:7771、SEQ ID NO:7769、SEQ ID NO:7773、SEQ ID NO:7726、SEQ ID NO:7758、SEQ ID NO:7739、SEQ ID NO:7779、SEQ ID NO:7770、SEQ ID NO:7749、SEQ ID NO:7754、SEQ ID NO:7745、SEQ ID NO:7785、SEQ ID NO:7731、SEQ ID NO:7772、SEQ ID NO:7743或SEQ ID NO:7750，例如，选自SEQ ID NO:7769、SEQ ID NO:7771、SEQ ID NO:7739或SEQ ID NO:7785的导引结构域。在优选的实施方案中，(例如，联合使用的)每种gRNA分子的导引结构域包含表33、表34或表38表中列出的任何组合的序列，例如由其组成。在实施方案中，每种gRNA分子的导引结构域包含以下任一项的序列，例如由其组成序：

a)表33的组合A1至组合A72，例如，组合A1至A4、组合A5至A8、组合A37至A40或组合A41至A44；

b)表34的组合B1至组合B84；或

c)表38的组合F1至组合F60，例如，组合F1至F4、组合F5至F8、组合F13至F16或组合F17至F20的任一者。

在治疗患有疾病的患者的方法的实施方案中，该方法还包括向所述细胞引入编码(例如本文所述的)NK抑制性分子的核酸分子，例如，编码HLA-G:B2M融合物的核酸分子，例如，编码SEQ ID NO:10674的核酸分子。在治疗患有疾病的患者的方法的实施方案中，细胞(或细胞群体)是免疫效应细胞(或免疫效应细胞群体)，例如，T细胞(或群体T细胞)。在实施方案中，细胞(或细胞群体)相对于患者是同种异体的，例如，从健康人供体分离。在其他实施方案中，细胞(或细胞群体)相对于患者是自体的。在实施方案中，CAR是(例如，本文所述的)CD19 CAR，例如，包含抗原结合结构域的CD19 CAR，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:7883至SEQ ID NO:7898中的任一者。在其他实施方案中，CAR是例如包含抗原识别结构域的BCMA CAR，所述抗原识别结构域包含SEQ ID NO:7939至SEQ ID NO:8112或SEQ ID NO:8155至SEQ ID NO:8166中的任一者，例如，包含抗原识别结构域，所述抗原识别结构域包含SEQ ID NO:7949，例如，由其组成，例如，包含SEQ ID NO:8549至SEQ ID NO:8621中的任一者，例如，包含SEQ ID NO:8559，例如，由其组成。

在另一个方面，本发明提供修饰的细胞，其相对于未修饰的相同类型细胞，具有减少或消除的以下表达：a)T细胞受体组分；b)B2M；和/或c)CIITA。在实施方案中，T细胞受体组分是TCRα链或TCRβ链，例如，TCRα链。在其他实施方案中，TCR的组分是CD3δ、CD3ε或CD3γ，例如，是CD3ε。在实施方案中，修饰的细胞(或细胞群体)具有减少或消除的T细胞受体组分B2M和CIITA的表达。

在另一个方面，本发明提供修饰的细胞，其相对于未修饰的相同类型细胞，在以下处或其附近包含碱基对(例如，多于一个碱基对)的插入或缺失：a)编码T细胞受体组分的基因；b)B2M；和/或c)CIITA。在实施方案中，每种所述插入或缺失是插入/缺失。在实施方案中，每种所述插入或缺失是移码突变。在实施方案中，修饰的细胞(或细胞群体)在编码T细胞受体组分、B2M和CIITA的基因处或其附近包含碱基对(例如，多于一个碱基对)的插入或缺失。

在另一个方面，本发明提供细胞群体，所述细胞群体包含前述细胞(例如，修饰的细胞)方面和实施方案中任一项的修饰的细胞，其中在至少约30％的细胞中，至少一个所述插入或缺失是移码突变，例如，如通过NGS所测量。

在另一个方面，本发明提供细胞，所述细胞包含(例如，包含一个细胞(例如，多于一个细胞)的细胞群体，所述细胞包含)：

(a)例如，编码例如本文所述的CAR的核酸序列；

(b)任选地，编码例如本文所述的NK抑制性分子的核酸序列，例如，编码如本文所述的HLA-G或HLA-G:B2M融合物的核酸；

(c)在编码TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3E、CD3D或CD3G，例如TRAC)的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3E、CD3D或CD3G例如TRAC)的导引结构域，例如，包含表1、表4、表5、表6e、表6f或表6g中列出的导引结构域；

(d)在编码B2M的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对B2M的导引结构域，例如，包含表1或表3中列出的导引结构域；

(e)任选地，在编码CIITA的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对CIITA的导引结构域，例如，包含表1或表6c中列出的导引结构域；和

(f)任选地，在编码LILRB1的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对LILRB1的导引结构域，例如，包含表6d中列出的导引结构域；

其中细胞(或包含所述细胞的细胞群体)表达CAR和，任选地，NK抑制性分子，并且显示以下一者或多者的表达和/或功能减少或消除：i)TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E或CD3G，例如TRAC)、ii)B2M、iii)CIITA和/或iv)LILRB1。在实施方案中，针对TCR、B2M和CIITA的组分的gRNA分子(如本文所述)的导引结构域序列包括例如表33、表34或表38中所列任何组合中列出的导引结构域，例如，由其组成。

a)表33的组合A1至组合A72，例如，组合A1至A4、组合A5至A8、组合A37至A40或组合A41至A44；

b)表34的组合B1至组合B84；或

c)表38的组合F1至组合F60，例如，组合F1至F4、组合F5至F8、组合F13至F16或组合F17至F20的任一者。

在另一个方面，本发明提供细胞，所述细胞包含(例如，包含一个细胞(例如，多于一个细胞)的细胞群体，所述细胞包含)：

(a)编码例如本文所述的CAR的核酸序列；

(b)任选地，编码(例如，如本文所述的)NK抑制性分子的核酸序列，例如，编码如本文所述的HLA-G的核酸；

(c)在编码TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E或CD3G，例如TRAC)的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E或CD3G，例如TRAC)的导引结构域，例如，包含表1、表4、表5、表6e、表6f或表6g中列出的导引结构域；

(d)在编码NLRC5的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对NLRC5的导引结构域，例如，包含表1中列出的导引结构域；

(e)任选地，在编码CIITA的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对CIITA的导引结构域，例如，包含表1或表6c中列出的导引结构域；和

(f)任选地，在编码LILRB1的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对LILRB1的导引结构域，例如，包含表6d中列出的导引结构域；

其中细胞(或包含一个或多个所述细胞的细胞群体)表达CAR和，任选地，NK抑制性分子，并且显示以下一者或多者的表达和/或功能减少或消除：i)TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E或CD3G，例如TRAC)、ii)B2M、iii)NLRC5和/或iv)LILRB1。

在另一个方面，本发明提供细胞，所述细胞包含(例如，包含一个细胞(例如，多于一个细胞)的细胞群体，所述细胞包含)：

(a)编码例如本文所述的CAR的核酸序列；

(b)在编码TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E或CD3G例如TRAC)的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E或CD3G例如TRAC)的导引结构域，例如，包含表1、表4、表5、表6e、表6f或表6g中列出的导引结构域；和

(c)在编码FKBP1A的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对FKBP1A的导引结构域，例如，包含表1或表6b中列出的导引结构域；

其中细胞(或包含一个细胞(例如多于一个细胞的细胞群体)，包含)表达CAR，并且显示以下一者或多者的表达和/或功能减少或消除：i)TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E或CD3G，例如TRAC)和/或ii)FKBP12。在实施方案中，针对TCR组分和FKBP1A的组分的gRNA分子(如本文所述)的导引结构域序列包括例如表35、表36或表37中所列任何组合中列出的导引结构域，例如，由其组成。

a)表35的组合C1至组合C42；

b)表36的组合D1至组合D36，例如，组合D2、组合D4、组合D20或组合D22；或

c)表37的组合E1至组合E30，例如，组合E2、组合E4、组合E8或组合E10。

在另一个方面，本发明提供细胞，所述细胞包含(例如，包含一个细胞(例如，多于一个细胞)的细胞群体，所述细胞包含)：

(a)编码例如本文所述的CAR的核酸序列；

(b)编码(例如，如本文所述的)耐受雷帕霉素的mTor的核酸序列，例如，编码包含S2035突变(例如，S2035I突变)的mTor的核酸序列；和；

(c)在编码TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E或CD3G，例如TRAC)的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E或CD3G，例如TRAC)的导引结构域，例如，包含表1、表4、表5、表6e、表6f或表6g中列出的导引结构域；

其中细胞(或包含所述细胞，例如，多于一个所述细胞的细胞群体)表达CAR和耐受雷帕霉素的mTor，并且显示TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E或CD3G，例如TRAC)表达和/或功能降低或消除。

在编码TCR组分、B2M和CIITA的基因处或其附近包含插入/缺失的实施方案中，针对TCR组分的gRNA分子的导引结构域、针对B2M的gRNA分子的导引结构域和针对CIIRA的gRNA分子的导引结构域分别包含a)针对表33中A1至A72的任何组合中列出的所述gRNA分子的导引结构域序列；b)针对表38中F1至F60的任何组合中列出的所述gRNA分子的导引结构域序列；或c)针对表34中B1至B84的任何组合内列出的每种gRNA分子的导引结构域序列，例如，由其组成。

在编码TCR组分和FKBP1A的基因处或其附近包含插入/缺失的实施方案中，针对TCR组分的gRNA分子的导引结构域和针对FKBP1A的gRNA分子的导引结构域分别包含a)针对表35中C1至C42的任何组合中列出的所述gRNA分子的导引结构域序列；b)针对表36中D1至D36的任何组合中列出的所述gRNA分子的导引结构域序列；或c)针对表37中E1至E30的任何组合内列出的所述gRNA分子的导引结构域序列，例如，由其组成。

在上文描述的细胞方面和实施方案的任一者的实施方案中，通过以下方式在所述细胞中产生每个所述插入/缺失：向所述细胞引入gRNA分子，例如，多于一种gRNA分子(例如，包含所述gRNA分子(例如，所述多于一种gRNA分子的每一者)的CRISPR系统，例如，多于一个CRISPR系统)，各自包含在每个所述插入/缺失处或其附近与靶序列互补的导引结构域。

在另一个方面，本发明提供细胞群体，其中群体的至少约30％，例如，至少约50％，例如，至少约75％，例如，至少约90％细胞是前述细胞方面或实施方案的任一项的细胞。在实施方案中，在至少约30％的所述细胞中(例如，在至少约40％中，例如，在至少约50％中，例如，在至少约60％中，例如，在至少约70％中，例如，在至少约80％中，例如，在至少约90％中，例如，在至少约95％中，例如，在至少约99％的所述细胞中)，每个所述插入/缺失是移码突变。在实施方案中，包括在前述细胞方面和实施方案的任一者中，本发明提供细胞(或细胞群体)，其包含在图34A、图34B或图49中列出的插入/缺失。在实施方案中，包括在前述细胞方面和实施方案的任一者中，本发明提供细胞(或细胞群体)，其包含在图36或图48中列出的插入/缺失。在实施方案中，包括在前述细胞方面和实施方案的任一者中，本发明提供细胞(或细胞群体)，其包含在图38、图41、图44或图50中列出的插入/缺失。在实施方案中，包括在前述细胞方面和实施方案的任一者中，本发明提供细胞(或细胞群体)，其包含在图53中列出的插入/缺失。

在另一个方面，本发明提供细胞群体，其包含前述细胞方面和实施方案的任一项的细胞。在实施方案中，细胞群体的至少约20％细胞是前述细胞方面和实施方案的任一项的细胞。在实施方案中，细胞群体的至少约50％细胞是前述细胞方面和实施方案的任一项的细胞。在实施方案中，细胞群体的小于约5％，例如，小于约1％，例如，小于约0.01％的细胞包含脱靶插入/缺失。在实施方案中，细胞群体的细胞经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。在实施方案中，CAR是(例如，本文所述的)CD19 CAR，例如，包含有包含SEQ ID NO:7883至SEQ ID NO:7898中任一者的抗原结合结构域的CD19 CAR，或包含SEQ ID NO:7909或SEQ ID NO:7920的序列。在其他实施方案中，CAR是例如包含抗原识别结构域的BCMA CAR，所述抗原识别结构域包含SEQ ID NO:7939至SEQ ID NO:8112或SEQ ID NO:8155至SEQ ID NO:8166中的任一者，例如，包含抗原识别结构域，所述抗原识别结构域包含SEQ ID NO:7949，例如，由其组成，例如，包含SEQ ID NO:8549至SEQ ID NO:8621中的任一者，例如，包含SEQ ID NO:8559，例如，由其组成。在实施方案中，细胞是动物细胞，例如，哺乳动物细胞、灵长类细胞或人细胞，例如，人细胞。在实施方案中，细胞是免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)，例如，T细胞或NK细胞，例如，T细胞，例如，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或其组合。在实施方案中，细胞相对于待施用所述细胞的患者是同种异体的，例如，细胞从健康人受试者分离。在其他实施方案中，细胞相对于待施用所述细胞的患者是自体的。

在另一个方面，本发明提供一种治疗有需要的患者中疾病(例如，癌症)的方法，所述方法包含施用前述细胞方面和实施方案的任一项的细胞。在实施方案中，特别地在其中已经减少或消除免疫抑制剂的靶的表达或功能的实施方案中，该方法还包括施用免疫抑制剂，例如，RAD001。

在另一个方面，本发明提供如本文(例如，在前述gRNA分子方面和实施方案的任一者中)所述的gRNA分子、如本文(例如在前述组合物方面和实施方案的任一者中)所述的组合物、如本文(例如在前述核酸方面和实施方案的任一者中)所述的核酸、如本文(例如在前述载体方面和实施方案的任一者中)所述的载体，或如本文(例如在前述细胞(例如，修饰的细胞)或细胞群体方面和实施方案的任一者中)所述的细胞(或细胞群体)用作药物。

在另一个方面，本发明提供如本文(例如，在前述gRNA分子方面和实施方案的任一者中)所述的gRNA分子、如本文(例如在前述组合物方面和实施方案的任一者中)所述的组合物、如本文(例如在前述核酸方面和实施方案的任一者中)所述的核酸、如本文(例如在前述载体方面和实施方案的任一者中)所述的载体，或如本文(例如在前述细胞(例如，修饰的细胞)或细胞群体方面和实施方案的任一者中)所述的细胞(或细胞群体)在制造药物中的用途。

在另一个方面，本发明提供如本文(例如，在前述gRNA分子方面和实施方案的任一者中)所述的gRNA分子、如本文(例如在前述组合物方面和实施方案的任一者中)所述的组合物、如本文(例如在前述核酸方面和实施方案的任一者中)所述的核酸、如本文(例如在前述载体方面和实施方案的任一者中)所述的载体，或如本文(例如在前述细胞(例如，修饰的细胞)或细胞群体方面和实施方案的任一者中)所述的细胞(或细胞群体)用于治疗疾病。

在另一个方面，本发明提供用于治疗疾病的如本文(例如，在前述gRNA分子方面和实施方案的任一者中)所述的gRNA分子、如本文(例如在前述组合物方面和实施方案的任一者中)所述的组合物、如本文(例如在前述核酸方面和实施方案的任一者中)所述的核酸、如本文(例如在前述载体方面和实施方案的任一者中)所述的载体，或如本文(例如在前述细胞(例如，修饰的细胞)或细胞群体方面和实施方案的任一者中)所述的细胞(或细胞群体)，其中疾病是与肿瘤抗原表达相关的疾病，例如，与肿瘤抗原表达相关的增生性疾病、癌前期病状、癌症和非癌症相关适应症。

在另一个方面，本发明提供如本文(例如，在前述gRNA分子方面和实施方案的任一者中)所述的gRNA分子、如本文(例如在前述组合物方面和实施方案的任一者中)所述的组合物、如本文(例如在前述核酸方面和实施方案的任一者中)所述的核酸、如本文(例如在前述载体方面和实施方案的任一者中)所述的载体或如本文(例如在前述细胞(例如，修饰的细胞)或细胞群体方面和实施方案的任一者中)所述的细胞(或细胞群体)用于治疗癌症，其中癌症是选自以下的血液学癌：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴样白血病(ALL)、B细胞急性淋巴样白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴样白血病(T-ALL)、慢性髓性白血病(CML)、急性髓样白血病(AML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和白血病前期。

在另一个方面，本发明提供如本文(例如，在前述gRNA分子方面和实施方案的任一者中)所述的gRNA分子、如本文(例如在前述组合物方面和实施方案的任一者中)所述的组合物、如本文(例如在前述核酸方面和实施方案的任一者中)所述的核酸、如本文(例如在前述载体方面和实施方案的任一者中)所述的载体，或如本文(例如在前述细胞(例如，修饰的细胞)或细胞群体方面和实施方案的任一者中)所述的细胞(或细胞群体)用于治疗癌症，例如，其中癌症选自间皮瘤、腺癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊枢椎肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、Kaposi肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境所致癌、所述癌的组合和所述癌的转移病灶。

除上文描述的本发明具体特征之外，还构思了gRNA分子，Cas9分子和细胞的以下一般特征适用于本文所述的本发明任何方面和实施方案，包括上文描述的那些方面和实施方案。

在本文公开的任何方面和实施方案中，gRNA分子(例如，gRNA分子，或gRNA分子组合，包括本文所述的导引结构域)可以包含以下一个或多个特征：

在某些实施方案中，gRNA分子(例如，gRNA分子，或gRNA分子组合的一种或多种gRNA分子，包括本文所述的导引结构域)是dgRNA分子，其中导引结构域和tracr设置在分开的核酸分子上。在实施方案中，crRNA从5’至3’包含[导引结构域]-：

a)SEQ ID NO:6584；

b)SEQ ID NO:6585；

c)SEQ ID NO:6605；

d)SEQ ID NO:6606；

e)SEQ ID NO:6607；

f)SEQ ID NO:6608；或

g)SEQ ID NO:7806。在一个优选实施方案中，crRNA从5’至3’包含[导引结构域]-[SEQ ID NO:6607]。在实施方案中，tracr包含化脓性链球菌tracr序列(GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)的多于15个，例如，20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、60个或更多个、70个或更多个或80个或更多个核苷酸。在实施方案中，tracr额外地在3'端包含1个或更多个，例如，1、2、3、4、5、6或7个，例如，优选地4个或7个U核苷酸。在优选的dgRNA实施方案中，tracr包含SEQ ID NO:7820。在实施方案中，tracr额外地在3'端包含1个或更多个，例如，1、2、3、4、5、6或7个，例如，优选地4个或7个U核苷酸。在优选的dgRNA实施方案中，tracr包含SEQ ID NO:6660，例如，由其组成。在优选的dgRNA实施方案中，crRNA包含[导引结构域]-SEQ ID NO:6607，例如，由其组成，并且tracr包含SEQ ID NO:7820，例如，包含SEQ ID NO:6660，例如，由其组成。

在其他实施方案中，gRNA分子(例如，gRNA分子，或gRNA分子组合的一种或多种gRNA分子，包括本文所述的导引结构域)是sgRNA分子，其中导引结构域和tracr设置在单个核酸分子上。在实施方案中，sgRNA分子包含以下项，例如，由其组成：[导引结构域]-

(a)SEQ ID NO:6601；

(b)SEQ ID NO:6602；

(c)SEQ ID NO:6603；

(d)SEQ ID NO:6604；或

(e)以上(a)至(d)的任意项，在3'端还包含1、2、3、4、5、6或7个尿嘧啶(U)核苷酸。在一个优选实施方案中，sgRNA分子包含[导引结构域]-SEQ ID NO:6601。在一个优选实施方案中，sgRNA分子包含[导引结构域]-SEQ ID NO:7811，例如，由其组成。

在实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，本文所述的gRNA分子的一种或多种核酸分子，例如，本文所述的gRNA分子的全部核酸分子，不含对核苷酸或核苷酸间键的改变。在其他实施方案中，包括在前述方面和实施方案的任一者中，本文所述的gRNA分子的一种或多种核酸分子包含对例如本文所述的核苷酸或核苷酸间键的一个或多个修饰。在实施方案中，所述修饰包括2’O-甲基修饰。在实施方案中，所述修饰包括硫代磷酸酯修饰。在实施方案中，所述修饰包括各自在gRNA分子的核酸的1、2个、3个或更多个(例如3个)3’核苷酸处的2’O-甲基修饰。在实施方案中，所述修饰包括各自在gRNA分子的核酸的倒数第4、倒数第3和倒数第2的3’核苷酸处的2’O-甲基修饰。在实施方案中，所述修饰包括在gRNA分子的核酸的1、2个、3个或更多个(例如3个)5’核苷酸处各自的2’O-甲基改变。在实施方案中，所述修饰包括各自在gRNA分子的核酸的倒数第4、倒数第3和倒数第2的3’核苷酸处的2’O-甲基修饰和在gRNA分子的核酸的1、2个、3个或更多个(例如3个)5’核苷酸处各自的2’O-甲基修饰。在实施方案中，所述修饰包括在gRNA的核酸分子3'端的一个或多个，例如，1、2、3个或更多个，例如，3个硫代磷酸酯键。在实施方案中，所述修饰包括在gRNA的核酸分子5'端的一个或多个，例如，1、2、3个或更多个，例如，3个硫代磷酸酯键。在实施方案中，所述修饰包括在gRNA的核酸分子3'端和在其5'端的一个或多个，例如，1、2、3个或更多个，例如，3个硫代磷酸酯键。在涉及dgRNA分子的实施方案中，包含tracr的分子和包含crRNA的分子如本文所述那样修饰。在涉及dgRNA分子的其他实施方案中，包含tracr的分子未修饰并且包含crRNA的分子如本文所述那样修饰。在涉及dgRNA分子的其他实施方案中，包含crRNA的分子未修饰并且包含tracr的分子如本文所述那样修饰。

在包括多于一种gRNA分子的本发明方面，每个gRNA分子可以独立地是例如本文所述的dgRNA分子或sgRNA分子。在实施方案中，本文所述的组合的全部gRNA分子均是dgRNA分子。在实施方案中，本文所述的组合的全部gRNA分子均是sgRNA分子。在实施方案中，本文所述的组合的一种或多种gRNA分子是dgRNA分子，并且本文所述的组合的一种或多种其他gRNA分子是sgRNA分子。

在实施方案中，本发明的gRNA分子是引入本文所述的细胞时，在gRNA的靶序列处或其附近产生插入/缺失的gRNA分子。在实施方案中，本发明的gRNA分子是在引入gRNA分子的细胞群体(例如本文所述的细胞)的至少约70％，例如，至少约80％，例如，至少约90％，例如，至少约95％，例如，至少约96％，例如，至少约97％，例如，至少约98％，例如，至少约99％或更多中产生插入/缺失的gRNA分子。在实施方案中，通过例如本文所述的NGS测量插入/缺失频率。在实施方案中，所述插入/缺失或多个插入/缺失是或包括移码突变。在实施方案中，本发明的gRNA分子是在引入gRNA分子的细胞群体的至少约30％，例如，至少约40％，例如，至少约50％，例如，至少约60％，例如，至少约70％，例如，至少约75％，例如，至少约80％，例如，至少约85％，例如，至少约90％，例如，至少约95％或更多例如本文所述的细胞中产生插入/缺失的gRNA分子。在实施方案中，通过例如本文所述的NGS测量移码突变频率。在实施方案中，在gRNA分子作为具有本文所述的Cas9分子的RNP引入后在细胞(或群体或细胞)中测量所述插入/缺失、插入/缺失频率、移码突变和/或移码突变频率。在实施方案中，在通过电穿孔引入gRNA分子后在细胞(或群体或细胞)中测量所述插入/缺失、插入/缺失频率、移码突变和/或移码突变频率。

在实施方案中，本发明的gRNA分子是引入本文所述的细胞或细胞群体时，在脱靶位点按照比gRNA的靶序列处或其附近低至少50倍，例如，至少100倍，例如，至少1000倍的频率产生插入/缺失的gRNA分子。在优选的实施方案中，引入本文所述的细胞或细胞群体时，gRNA在任何脱靶位点不产生可检测的插入/缺失。在实施方案中，通过例如本文所述的预测的脱靶结合位点定向脱靶测序，测量脱靶插入/缺失分析。在实施方案中，通过例如本文所述的核苷酸插入分析，测量脱靶插入/缺失分析。在实施方案中，在gRNA分子作为具有本文所述的Cas9分子的RNP引入后在细胞(或群体或细胞)中测量脱靶分析。在实施方案中，在通过电穿孔引入gRNA分子后在细胞(或群体或细胞)中测量脱靶分析。

在实施方案中，通过单一电穿孔，将RNP或RNP组合递送至细胞。在实施方案中，本发明的细胞仅经受单个电穿孔步骤。

在包括gRNA分子组合的本发明方面和实施方案中，该组合的每种gRNA分子可以独立地包含前述特征的任一项。

在本文公开的任何方面和实施方案中，Cas9分子可以包含以下一个或多个特征：

在多个方面，Cas9分子是化脓性链球菌Cas9，例如，如本文所述的修饰或未修饰的化脓性链球菌Cas9分子。在实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:6611。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7821，例如，由其组成。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7822，例如，由其组成。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7823，例如，由其组成。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7824，例如，由其组成。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7825，例如，由其组成。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7826，例如，由其组成。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7827，例如，由其组成。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7828，例如，由其组成。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7829，例如，由其组成。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7830，例如，由其组成。在其他实施方案中，Cas9分子包含SEQ ID NO:7831，例如，由其组成。优选的Cas9分子是这样的Cas9分子，其包含SEQ ID NO:7821、SEQ ID NO:7822、SEQ ID NO:7825和SEQ ID NO:7828，例如，由其组成。

在包含一种或多种RNP复合体(例如，包括本文所述的Cas9分子的一个或多个RNP复合体)的方面和实施方案中，每种所述RNP复合体处于小于约10uM，例如，小于约3uM，例如，小于约1uM，例如，小于约0.5uM，例如，小于约0.3uM，例如，小于约0.1uM的浓度。在实施方案中，所述浓度是组合物中RNP复合体的浓度，所述组合物包括例如本文所述，例如，通过电穿孔待引入RNP的例如本文所述的细胞(例如，细胞群体)。在实施方案中，组合物的基质适于电穿孔。

在包含gRNA分子组合(例如，包含不同gRNA分子的RNP组合)的本发明方面和实施方案中，该组合的每种Cas9分子可以独立地包含前述特征的任一项。

在本文公开的任何方面和实施方案中，细胞(例如，细胞群体)可以包含以下一个或多个特征：

在多个方面，细胞(例如，细胞群体)包含一种或多种具有减少或消除的T细胞受体(TCR)组分表达的细胞。在实施方案中，减少或消除的T细胞受体(TCR)组分表达包括减少或消除的TRAC表达。在实施方案中，减少或消除的T细胞受体(TCR)组分表达包括减少或消除的TRBC1表达。在实施方案中，减少或消除的T细胞受体(TCR)组分表达包括减少或消除的TRBC2表达。在实施方案中，减少或消除的T细胞受体(TCR)组分表达包括减少或消除的CD3G表达。在实施方案中，减少或消除的T细胞受体(TCR)组分表达包括减少或消除的CD3D表达。在实施方案中，减少或消除的T细胞受体(TCR)组分表达包括减少或消除的CD3E表达。在实施方案中，所述TCR组分的所述减少或消除表达是向所述细胞引入本文所述的一种或多种，例如，一种或两种，例如，一种针对所述TCR组分的gRNA分子的结果。在实施方案中，细胞在针对所述TCR组分的gRNA分子的导引结构域的靶序列处或其附近包含如本文所述的插入/缺失，例如，移码突变。在实施方案中，细胞群体包含至少约50％，例如，至少约60％，例如，至少约70％，例如，至少约80％，例如，至少约90％或更多显示出TCR组分表达减少或消除的(如本文所述)细胞。在实施方案中，如通过例如本文所述的流式细胞术测量所述减少或消除的TCR组分表达。

在多个方面，(包含备选地或额外地减少或消除的TCR组分表达的)细胞(例如，细胞群体)包含一个或多个具有减少或消除的β-2微球蛋白(B2M)表达的细胞。在实施方案中，所述B2M的所述减少或消除表达是向所述细胞引入本文所述的一种或多种，例如，一种或两种，例如，一种针对B2M的gRNA分子的结果。在实施方案中，细胞在针对所述B2M的gRNA分子的导引结构域的靶序列处或其附近包含如本文所述的插入/缺失，例如，移码突变。在实施方案中，细胞群体包含至少约50％，例如，至少约60％，例如，至少约70％，例如，至少约80％，例如，至少约90％或更多显示出B2M表达减少或消除的(如本文所述)细胞。在实施方案中，如通过例如本文所述的流式细胞术测量所述减少或消除的B2M表达。

在多个方面，(包含备选地或额外地的减少或消除的TCR和/或B2M组分表达)的细胞(例如，细胞群体)包含一个或多个具有减少或消除的CIITA表达的细胞。在实施方案中，所述CIITA的所述减少或消除表达是向所述细胞引入本文所述的一种或多种，例如，一种或两种，例如，一种针对所述CIITA的gRNA分子的结果。在实施方案中，细胞在针对所述CIITA的gRNA分子的导引结构域的靶序列处或其附近包含如本文所述的插入/缺失，例如，移码突变。在实施方案中，细胞群体包含至少约50％，例如，至少约60％，例如，至少约70％，例如，至少约80％，例如，至少约90％或更多显示出CIITA表达减少或消除的(如本文所述)细胞。在实施方案中，如通过例如本文所述的流式细胞术测量所述减少或消除的B2M表达。

在多个方面，(包含备选地或额外地减少或消除的TCR组分表达的)细胞(例如，细胞群体)包含一个或多个具有减少或消除的免疫抑制剂的靶(例如，FKBP1A)表达的细胞。在实施方案中，所述FKBP1A的所述减少或消除表达是向所述细胞引入本文所述的一种或多种，例如，一种或两种，例如，一种针对所述FKBP1A的gRNA分子的结果。在实施方案中，细胞在针对所述FKBP1A的gRNA分子的导引结构域的靶序列处或其附近包含如本文所述的插入/缺失，例如，移码突变。在实施方案中，细胞群体包含至少约50％，例如，至少约60％，例如，至少约70％，例如，至少约80％，例如，至少约90％或更多显示出FKBP1A表达减少或消除的(如本文所述)细胞。在实施方案中，如通过例如本文所述的流式细胞术测量所述减少或消除的FKBP1A表达。

在一些方面，需要细胞显示出多于一个基因的表达减少或消除。在一个方面，细胞显示减少或消除的TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3E、CD3G和/或CD3D)表达，减少或消除的B2M表达和减少或消除的CIITA表达。在实施方案中，减少或消除的表达因向细胞引入gRNA分子组合而产生，其中gRNA分子组合包含在组合A1至A72的任一项中列出的导引结构域序列。在实施方案中，减少或消除的表达因向细胞引入gRNA分子组合而产生，其中gRNA分子组合包含在组合B1至B84的任一项中列出的导引结构域序列。在实施方案中，所述细胞在表33、表34或表38中所列的每种gRNA分子(例如，在组合A1至A72、B1至B84或F1至F60的任一项中的gRNA分子)的导引结构域的靶序列处或其附近包含插入/缺失，例如，移码突变。

在一些方面，需要细胞显示出多于一个基因的表达减少或消除。在一个方面，细胞显示减少或消除的TCR组分(例如，TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3E、CD3G和/或CD3D)表达，和减少或消除的免疫抑制剂的靶(例如，FKBP1A)表达。在实施方案中，减少或消除的表达因向细胞引入gRNA分子组合而产生，其中gRNA分子组合包含在组合C1至C42的任一项中列出的导引结构域序列。在实施方案中，减少或消除的表达因向细胞引入gRNA分子组合而产生，其中gRNA分子组合包含在组合D1至D36的任一项中列出的导引结构域序列。在实施方案中，所述细胞在表35、表36或表37中所列的每种gRNA分子(例如，在组合C1至C42、D1至D36，或E1至E30的任一项中的gRNA分子)的导引结构域的靶序列处或其附近包含插入/缺失，例如，移码突变。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRAC和B2M)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶，例如，CIITA)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRAC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7833、SEQ ID NO:7834、SEQ ID NO:7835、包含SEQ ID NO:7836和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7837和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7836和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7837和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向B2M的gRNA分子选自SEQ ID NO:7853、SEQ ID NO:7854、SEQ ID NO:7855、包含SEQ ID NO:7856和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7857和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7856和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7857和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRAC和B2M)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶，例如，CIITA)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRAC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7833、SEQ ID NO:7834、SEQ ID NO:7835、包含SEQ ID NO:7836和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7837和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7836和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7837和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向B2M的gRNA分子选自SEQ ID NO:7858、SEQ ID NO:7859、SEQ ID NO:7860、包含SEQ ID NO:7861和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7862和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7861和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7862和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRAC和B2M)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶，例如，CIITA)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRAC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7838、SEQ ID NO:7839、SEQ ID NO:7840、包含SEQ ID NO:7841和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7842和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7841和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7842和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向B2M的gRNA分子选自SEQ ID NO:7853、SEQ ID NO:7854、SEQ ID NO:7855、包含SEQ ID NO:7856和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7857和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7856和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7857和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRAC和B2M)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶，例如，CIITA)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRAC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7838、SEQ ID NO:7839、SEQ ID NO:7840、包含SEQ ID NO:7841和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7842和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7841和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7842和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向B2M的gRNA分子选自SEQ ID NO:7858、SEQ ID NO:7859、SEQ ID NO:7860、包含SEQ ID NO:7861和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7862和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7861和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7862和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRBC和B2M)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶，例如，CIITA)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRBC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7843、SEQ ID NO:7844、SEQ ID NO:7845、包含SEQ ID NO:7846和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7847和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7846和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7847和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向B2M的gRNA分子选自SEQ ID NO:7853、SEQ ID NO:7854、SEQ ID NO:7855、包含SEQ ID NO:7856和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7857和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7856和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7857和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRBC和B2M)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶，例如，CIITA)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRBC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7843、SEQ ID NO:7844、SEQ ID NO:7845、包含SEQ ID NO:7846和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7847和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7846和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7847和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向B2M的gRNA分子选自SEQ ID NO:7858、SEQ ID NO:7859、SEQ ID NO:7860、包含SEQ ID NO:7861和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7862和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7861和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7862和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRBC和B2M)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶，例如，CIITA)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRBC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7848、SEQ ID NO:7849、SEQ ID NO:7850、包含SEQ ID NO:7851和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7852和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7851和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7852和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向B2M的gRNA分子选自SEQ ID NO:7853、SEQ ID NO:7854、SEQ ID NO:7855、包含SEQ ID NO:7856和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7857和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7856和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7857和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRBC和B2M)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶，例如，CIITA)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRBC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7848、SEQ ID NO:7849、SEQ ID NO:7850、包含SEQ ID NO:7851和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7852和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7851和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7852和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向B2M的gRNA分子选自SEQ ID NO:7858、SEQ ID NO:7859、SEQ ID NO:7860、包含SEQ ID NO:7861和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7862和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7861和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7862和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRAC和FKBP1A)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRAC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7833、SEQ ID NO:7834、SEQ ID NO:7835、包含SEQ ID NO:7836和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7837和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7836和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7837和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向FKBP1A的gRNA分子选自SEQ ID NO:7863、SEQ ID NO:7864、SEQ ID NO:7865、包含SEQ ID NO:7866和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7867和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7866和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7867和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRAC和FKBP1A)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRAC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7833、SEQ ID NO:7834、SEQ ID NO:7835、包含SEQ ID NO:7836和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7837和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7836和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7837和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向FKBP1A的gRNA分子选自SEQ ID NO:7868、SEQ ID NO:7869、SEQ ID NO:7870、包含SEQ ID NO:7871和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7872和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7871和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7872和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRAC和FKBP1A)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRAC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7838、SEQ ID NO:7839、SEQ ID NO:7840、包含SEQ ID NO:7841和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7842和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7841和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7842和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向FKBP1A的gRNA分子选自SEQ ID NO:7863、SEQ ID NO:7864、SEQ ID NO:7865、包含SEQ ID NO:7866和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7867和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7866和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7867和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRAC和FKBP1A)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRAC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7838、SEQ ID NO:7839、SEQ ID NO:7840、包含SEQ ID NO:7841和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7842和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7841和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7842和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向FKBP1A的gRNA分子选自SEQ ID NO:7868、SEQ ID NO:7869、SEQ ID NO:7870、包含SEQ ID NO:7871和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7872和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7871和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7872和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRBC和FKBP1A)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRBC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7843、SEQ ID NO:7844、SEQ ID NO:7845、包含SEQ ID NO:7846和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7847和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7846和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7847和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向FKBP1A的gRNA分子选自SEQ ID NO:7863、SEQ ID NO:7864、SEQ ID NO:7865、包含SEQ ID NO:7866和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7867和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7866和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7867和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRBC和FKBP1A)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRBC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7843、SEQ ID NO:7844、SEQ ID NO:7845、包含SEQ ID NO:7846和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7847和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7846和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7847和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向FKBP1A的gRNA分子选自SEQ ID NO:7868、SEQ ID NO:7869、SEQ ID NO:7870、包含SEQ ID NO:7871和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7872和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7871和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7872和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRBC和FKBP1A)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRBC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7848、SEQ ID NO:7849、SEQ ID NO:7850、包含SEQ ID NO:7851和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7852和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7851和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7852和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向FKBP1A的gRNA分子选自SEQ ID NO:7863、SEQ ID NO:7864、SEQ ID NO:7865、包含SEQ ID NO:7866和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7867和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7866和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7867和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在意图减少或消除T细胞受体的两种组分(例如，TRBC和FKBP1A)表达的优选实施方案中(包括还减少或消除附加靶(例如，多于一种附加靶)的表达或功能时的实施方案)，靶向TRBC的gRNA分子选自SEQ ID NO:7848、SEQ ID NO:7849、SEQ ID NO:7850、包含SEQ ID NO:7851和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7852和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7851和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7852和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA，并且靶向FKBP1A的gRNA分子选自SEQ ID NO:7868、SEQ ID NO:7869、SEQ ID NO:7870、包含SEQ ID NO:7871和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7872和SEQ ID NO:6660(例如，由其组成)的dgRNA、包含SEQ ID NO:7871和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA和包含SEQ ID NO:7872和SEQ ID NO:10798(例如，由其组成)的dgRNA。如本文所述，在任何组合的实施方案中，将每个所述gRNA分子作为具有Cas9分子(例如，本文所述的Cas9分子)的RNP提供。

在一个方面，细胞显示仅一个TCR组分的表达减少或消除(不过它可以显示并非TCR组分的一种或多种其他靶的表达减少或消除)。在实施方案中，细胞在作为TCR组分的仅单一基因(或其调节元件)内部的靶序列处或其附近包含插入/缺失(不过细胞可以在并非TCR组分的一个或多个附加基因(或其调节元件)内部的靶序列处或其附近包含插入/缺失)。因此，在实施方案中，细胞在多于一个作为TCR组分的基因内部不包含插入/缺失。在实施方案中，细胞在TRAC内部和在编码第二TCR组分(例如，TRBC1或TRBC2)的基因内部不包含插入/缺失。

在一个方面，细胞不显示基因减少或消除的表达，所述基因包含抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的靶序列(不过它可以显示出一个或多个其他基因的表达减少或消除)。在实施方案中，细胞不在抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的基因(或其调节元件)中靶序列处或其附近包含插入/缺失(不过它可以在一个或多个其他基因(或其调节元件)包含插入/缺失)。在实施方案中，细胞不在PDCD1或其调节元件内部包含插入/缺失。

在多个方面，细胞是动物细胞，例如，哺乳动物细胞、灵长类细胞或人细胞，例如，人细胞。在多个方面，细胞是免疫效应细胞(例如，包含一个或多个免疫效应细胞的细胞群体)，例如，T细胞或NK细胞，例如T细胞，例如CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或其组合。

在多个方面，细胞细胞相对于待施用所述细胞的患者是自体的。在其他方面，细胞相对于待施用所述细胞的患者是同种异体的。在实施方案中，细胞相对于待施用所述细胞的患者是同种异体的，并且是诱导的多潜能干细胞或是从其中衍生的细胞。在实施方案中，细胞相对于待施用所述细胞的患者是同种异体的，并且是从健康人供体分离的免疫效应细胞，例如，T细胞。

在多个方面，例如，通过本文所述的方法离体调节和/或改变例如本文所述的细胞(或细胞群体)，例如，如本文所述的表达CAR的细胞。在多个方面，例如，通过本文所述的方法在体外调节和/或改变例如本文所述的细胞(或细胞群体)，例如，如本文所述的表达CAR的细胞。在多个方面，将本发明的CRISPR系统、(包括在具有如本文所述的Cas9分子的RNP复合体中的)gRNA分子和/或组合物(例如，包含多于一种本发明gRNA分子的组合物)离体引入例如本文所述的细胞，例如，如本文所述的表达CAR的细胞。在其他方面，将本发明的CRISPR系统、(包括在具有如本文所述的Cas9分子的RNP复合体中的)gRNA分子和/或组合物(例如，包含多于一种本发明gRNA分子的组合物)在体内引入例如本文所述的细胞，例如，如本文所述的表达CAR的细胞。

在多个方面，如本文所述，细胞已经、被或将要工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)(例如，细胞包含，或将要包含编码CAR的核酸序列)。在实施方案中，例如本文所述，CAR识别选自以下的抗原：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称作CD2亚类1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞黏附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾丸或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关黏蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞黏附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(蛋白酶体，巨蛋白因子)亚基Β型9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酰Lewis黏附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类第5群成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿路上皮分化特异糖蛋白(uroplakin)2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白(pannexin)3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ可变可读框蛋白(TARP)；Wilm肿瘤蛋白(WT1))；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于第12p号染色体上的ETS转位变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合性细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；存活；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)、T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤凋亡抑制蛋白(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对的框蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc鸟髓细胞增多症病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印迹位点调节蛋白兄弟(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对的框蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；高级糖基化终末产物的受体(RAGE-1)；肾遍在1(RU1)；肾遍存2(RU2)；豆荚蛋白(legumain)；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓间质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的黏蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰基醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

在实施方案中，CAR包含例如本文所述的结合CD19的抗原识别结构域。在实施方案中，CAR包含有包含SEQ ID NO:7895，例如，由其组成的抗CD19结合结构域。在实施方案中，CAR包含有包含SEQ ID NO:7884，例如，由其组成的抗CD19结合结构域。

在实施方案中，CAR包含例如本文所述的结合BCMA的抗原识别结构域。在实施方案中，CAR包含有包含SEQ ID NO:7949，例如，由其组成的抗BCMA结合结构域。

在实施方案中，CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。在实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6644的序列。在实施方案中，胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在实施方案中，初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:6648或SEQ ID NO:6650的序列，例如，由其组成。在实施方案中，共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:6646或SEQ ID NO:6636的序列，例如，由其组成，例如，包含SEQ ID NO:6646的序列，例如，由其组成。在其他实施方案中，共刺激信号传导结构域包含来自CD28的胞内信号传导结构域的序列。

在实施方案中，CAR是CD19 CAR，并且包含SEQ ID NO:7920的序列，例如，由其组成。在实施方案中，CAR是CD19 CAR，并且包含SEQ ID NO:7909的序列，例如，由其组成。在实施方案中，例如，本文所述的细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码本文所述的CD19 CAR，例如，包含SEQ ID NO:7920或SEQ ID NO:7909的序列的CD19 CAR。

在实施方案中，CAR是BCMA CAR，并且包含SEQ ID NO:8559的序列，例如，由其组成。在实施方案中，例如，本文所述的细胞包含核酸序列，所述核酸序列编码本文所述的BCMA CAR，例如，包含SEQ ID NO:8559的BCMA CAR。在实施方案中，编码BCMA CAR的核酸序列包含SEQ ID NO:8574，例如，由其组成。

在多个方面，例如，本文所述的本发明细胞(例如，本发明的群体细胞)还含编码NK抑制性分子的核酸序列。当细胞显示出一个或多个主要组织相容性I类(MHC I)分子的表达减少或消除(例如，通过减少或消除B2M的表达，例如，通过本文所述方法实现)和/或一个或多个主要组织相容性II类(MHC II)分子的表达减少或消除(例如，通过减少或消除CIITA的表达，例如，通过本文所述的方法实现)时，优选这类细胞。在实施方案中，NK抑制性分子是HLA-G分子，例如，不需要B2M的HLA-G分子，例如，HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4。在其他实施方案中，NK抑制性分子是HLA-G:B2M融合分子。示例性HLA-G:B2M融合分子是SEQ ID NO:10674。编码所述HLA-G:B2M融合物的示例性核酸序列是SEQ ID NO:10675。

在实施方案中，细胞(例如，细胞群体)，显示NK抑制性分子的靶的表达减少或消除，例如，LILRB1的表达减少或消除。

在实施方案中，本发明的表达CAR的细胞(例如，其中例如通过本文所述的方法已经减少或消除一种或多种蛋白质的表达或功能的细胞，)，维持响应于刺激而增殖的能力，例如，令CAR与其靶抗原结合。在实施方案中，增殖离体发生。在实施方案中，增殖在体内发生。在实施方案中，增殖离体和体内发生。在实施方案中，增殖水平基本上与相同细胞类型(例如，相同类型的表达CAR的细胞)显示的增殖水平相同，但所述细胞类型尚未例如通过本文所述方法使一种或多种蛋白质的表达或功能减少或消除。在实施方案中，增殖水平是相同细胞类型(例如，相同类型的表达CAR的细胞)显示的增殖水平的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％至少98％或更大，但所述细胞类型尚未例如通过本文所述方法使一种或多种蛋白质的表达或功能减少或消除。

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或检验本发明，然而现在描述合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，所述材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。标题、副标题或编号或字母编号的要素，例如，(a)、(b)、(i)等，仅为了易于阅读而展示。使用本文件中的标题或编号或字母编号的要素不要求步骤或要素按字母顺序进行并且该步骤或要素必然地彼此独立。本发明的其他特征、目的和优点将从本描述及附图并且从权利要求书中显而易见。

附图说明

图1：B2M基因座的Cas9编辑。通过脂质体转染法递送靶向B2M基因座和trRNA的crRNA后24小时，HEK-293 Cas9GFP中通过NGS检测到的编辑分数。每个点代表不同的crRNA，trRNA保持恒定。基因组坐标显示在染色体15上的位置(n＝3)。

图2：借助如表1中列出的包含针对TCR-α的导引结构域的gRNA分子编辑后TCR表达的直方图。显示了使用三个不同浓度的慢病毒7天后Jurkat细胞中的mCherry+TCR-细胞％。

图3：显示在引入编码所示gRNA和Cas9/mCherry的慢病毒后6天和12天的TCR-原代T细胞％。数据显示mCherry+TCR-编辑的细胞的％。

图4：显示在用编码所示gRNA和Cas9/mCherry的慢病毒转染的细胞中，(用CD3/CD28珠)重新刺激3天后和激活后8天的mCherry+门控群体中的PD1-原代T细胞％。

图5A和图5B：显示使用TRAC-8 gRNA在培养第7天时TCR的表达直方图(图5A)和使用PD1-6 gRNA在培养第8天时PD-1的表达直方图(图5B)。

图6：经工程化以表达CD19 CAR并经包含靶向TCRα的gRNA的RNP处理的原代T细胞的表达谱。富集前显示了培养11天后为CAR+/-和TCR+/-的细胞群体。富集后显示在使用CD3微珠负向选择步骤分离后TCR-T细胞>98％。

图7：显示CD19 CAR转导的T细胞对靶阳性细胞系(Nalm6-luc)和靶阴性细胞系(K562-luc)的细胞毒活性。“T1”和“T8”分别指gRNA TRAC-1和TRAC-8。显示是慢病毒引入或RNP引入的Cas9/gRNA，及未分选和TCR分选(“分选”)的T细胞群体的结果

图8：B2M基因内部使用包含二种gRNA分子的CRISPR系统切除。在每个实验中，如所示，细胞暴露于具有CR00442的导引结构域的gRNA和第二gRNA分子。显示了预测的切除产物大小。

图9：gRNA对暴露于B2M基因的结果，预期的切除产物小于100。*表示见到的预期切除产物(绿色箭头)；？＝不能从测定法解析出预期的切除产物。黄色箭头指示野生型片段。

图10：gRNA对暴露于B2M基因的结果，预期的切除产物为～4000碱基对。红色*表示见到的预期切除产物(绿色框)；紫*＝小于10％的编辑效率。橙色框展示野生型片段。

图11：gRNA对暴露于B2M基因的结果，预期的切除产物为～6000碱基对。红色*表示见到的预期切除产物(绿色框)；紫*＝小于10％的编辑效率。橙色框展示野生型片段。

图12：HEK细胞(稳定表达Cas9)或原代人CD3+ T细胞(通过电穿孔递送dgRNA:Cas9 RNP)中具有如所示针对TRAC的dgRNA的CRISPR系统的平均(n≥3)编辑作用。还显示了如使用抗TCRa/b抗体，通过流式细胞术测定的显示TCR丢失的细胞％。

图13：HEK细胞(稳定表达Cas9)中具有如所示针对TRBC1和TRBC2之编码区的dgRNA的CRISPR系统的平均(n≥3)编辑作用。还显示了如使用抗TCR a/b抗体，通过流式细胞术测定的显示TCR丢失的细胞％。

图14：HEK细胞(稳定表达Cas9)中、CD34+原代人造血干细胞中具有如所示针对B2M的dgRNA的CRISPR系统的平均(n≥3)编辑作用，和原代CD3+ T细胞中如通过流式细胞术所测量的B2M损失％。在CRISPR系统引入所示细胞后，NGS测定法进行24小时；在CRISPR系统引入CD3+ T细胞后，流式细胞分析进行3-5天。

图15：如通过TCR丢失所测量(流式细胞术)在源于三位不同供体的原代人CD3+ T细胞中包含所示gRNA分子的CRISPR系统的编辑作用。对于每种gRNA，左侧条＝供体#1；中间条＝供体#2；右侧条＝供体#3。

图16：HEK细胞(稳定表达Cas9)中如通过NGS所测量和原代人CD3+细胞(RNP电穿孔)中如通过PD-1丢失所测量(使用抗PD-1抗体的流式细胞术)的具有如所示针对PDCD1的dgRNA的CRISPR系统的平均(n≥3)编辑作用。

图17A：按所示比率电穿孔针对TRAC和/或B2M的gRNA后，TCR和/或B2M的流式细胞术表达。

图17B：按所示gRNA比率时B2M和TCR均阴性的细胞％。

图17C：如通过流式细胞术所测量的B2M或TCR的编辑作用。

图17D：电穿孔后24小时细胞的活力。

图18：使用含有针对PDCD1的导引结构域(所示CRxxxx序列的导引结构域)的dgRNA时，原代CD3+ T细胞中如通过NGS(黄色条)或依据(使用抗PD-1抗体)流式细胞术的PD-1丢失所测量的编辑％。递送RNP后24小时进行NGS测序；在递送RNP后第5天进行流式细胞术。

图19：三位不同供体(供体#4，最左侧条；供体$5，中间条；供体#6，最右侧条)之间，使用含有针对PDCD1的导引结构域(所示CRxxxx序列的导引结构域)的dgRNA时，原代CD3+ T细胞中如依据(使用抗PD-1抗体)流式细胞术的PD-1丢失所测量的编辑％(n>＝3)。具有针对一些靶的导引结构域的系统显示PD-1丢失>50％，多位供体之间结果一致。包含CR00852、CR00828、CR00870、CR00848、CR00855和CR00838的导引结构域的gRNA显示至少2位供体之间编辑作用大于50％。

图20：三位不同供体(供体#1，最左侧条；供体#4，中间条；供体#5，最右侧条)之间，使用含有针对B2M的导引结构域(所示CRxxxx序列的导引结构域)的dgRNA时，原代CD3+ T细胞中如依据流式细胞术的B2M丢失所测量的编辑％(n>＝3)。具有针对一些靶序列的导引结构域的系统显示B2M丢失>40％，多位供体之间结果一致。包含CR00442、CR00444和CR00455的导引结构域的gRNA显示至少2位供体之间编辑作用大于40％。

图21：使用包含如所示的针对FKBP1A的导引结构域的dgRNA时，在稳定表达Cas9的HEK293细胞中如通过NGS所测量的编辑％(N＝3)(每个未标记的条使用落在标记数值之间的奇数编号的CRxxxx的导引结构域。例如，在落在标记的CR002072和CR002074之间的条处报告包含CR002073的导引结构域的dgRNA的数据)。

图22：使用包含如所示的针对FKBP1A的导引结构域的dgRNA时，在稳定表达Cas9的HEK293细胞中如通过NGS所测量的编辑％(N＝3)和移码编辑(FS)％。

图23：使用包含如所示的针对FKBP1A的导引结构域的dgRNA时，在稳定表达Cas9的HEK293细胞中如通过NGS所测量的编辑％(N＝3)和移码编辑(FS)％。

图24：使用包含具有所示的针对FKBP1A的导引结构域的dgRNA的RNP时，在CD3+ T细胞中如通过NGS所测量的编辑％(N＝3)和移码编辑(FS编辑)％。

图25：在包含针对靶的gRNA的RNP依次电穿孔或包含针对靶的gRNA的RNP同时电穿孔后，如通过FACS所测量(在首次电穿孔后第4天)，呈B2M-、TCR-(如通过抗CD3 Ab所测量)或B2M-/TCR-(双阴性)的CD3+ T细胞％。

图26：在包含针对靶的gRNA的RNP单次电穿孔、依次电穿孔或包含针对靶(B2M和TRAC)的gRNA的RNP同时(“Simult”)电穿孔后，如通过NGS所测量(在首次电穿孔后48小时)，呈B2M-、TCR-(如通过抗CD3Ab所测量)或B2M-/TCR-(双阴性)的CD3+ T细胞％。

图27：制备基因编辑的TCR-/B2M-BCMA CAR转导的T细胞的示意图。

图28：(RNP)电穿孔五天后TCR(使用抗CD3-PercpCy5.5)和B2M(使用抗B2M-APC)的表面表达。经含有针对B2M的gRNA的RNP转导的T细胞标记为“B2M”；经含有针对TRAC的gRNA的RNP转导的T细胞标记为“TCR”。经含BCMA CAR转导的T细胞显示为“CAR”。未转导的细胞指示为“UTD”。经Cas9电穿孔、但无向导RNA的细胞显示为“无向导”。在下半小图中显示使用抗CD4-V450的CD4染色，以验证丧失CD3染色归因于TCR丢失并且不归因于T细胞丢失。

图29：来自每个群体的总T细胞相对于CAR+ T细胞中比较的TCR和B2M的表面表达。“CAR”表示CAR转导；“无向导”表示无gRNA情况下的Cas9电穿孔；“B2M”表示采用含有B2M特异性gRNA的RNP电穿孔；“TCR”表示采用含有TRAC特异性gRNA的RNP电穿孔。

图30：采用含有B2M(“B2M”)和TRAC(“TCR”)特异性gRNA的RNP的电穿孔或有Cas9无grNA时电穿孔(“无向导”)的细胞中的CAR表达水平。

图31：评价响应于表达高水平BCMA(KMS11)、低水平BCMA(RPMI8226)或呈BCMA-(Nalm6)的肿瘤细胞系的T细胞增殖。T细胞进行有cas9无grNA的电穿孔(“无向导”)或含有针对B2M和TRAC的gRNA的RNP的电穿孔(“B2M+ TCR”)；和/或用编码BCMA CAR的慢病毒载体转导(“BCMA CAR”)或未转导(“UTD”)，如所示。

图32：响应于表达高水平BCMA(KMS11)、低水平BCMA(RPMI8226)或呈BCMA-(Nalm6)的肿瘤细胞系的CAR+CD4+和/或CD8+ T细胞增殖。细胞进行有cas9无grNA的电穿孔(“无向导”)或含有针对B2M和TRAC的gRNA的RNP的电穿孔(“B2M+ TCR”)；和/或用编码BCMA CAR的慢病毒载体转导(“BCMA CAR”)或未转导(“UTD”)，如所示。

图33A和33B：评价靶向TRAC的gRNA对细胞表面TCR表达的影响。33A显示，对于含有向导CR000961(961)、CR000978(978)、CR000984(984)、CR000992(992)、CR000985(985)和CR000960(gRNA1)和CR000979(gRNA8)的RNP，显示CD3染色丧失。33B显示，对于含有向导CR000991(991)、CR000992(992)、CR000993(993)和CR000978(978)的RNP，显示CD3染色丧失。991和992几乎可重叠。

图33C：显示了TRAC基因座的基因组编辑作用，其因采用含有靶向TRAC基因座的所示gRNA的RNP电穿孔人原代T细胞产生。指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数(移码编辑％)。

图34A和图34B：对用于编辑原代人T细胞的每种靶向TRAC的gRNA详细显示前5个最频繁观察到的序列变化。图34A和图34B是来自2个独立进行的电穿孔实验的结果。野生型(wt)未修饰的碱基以大写字母显示。相对于wt序列的缺失由“-”显示；相对于wt序列的插入由“小写字母”显示。每个实验的数据是来自三次重复PCR产物的平均数。图34A至图34B按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:10845-10899。

图35：评价靶向B2M的gRNA对细胞表面B2M表达的影响。向导编号表示导引结构域的CR00xxx标示符。

图36：B2M基因座的基因组编辑作用，其因采用含有靶向B2M基因座的所示gRNA的RNP电穿孔人原代T细胞产生。顶部小图中指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数(移码编辑％)。底部小图中，对用于编辑原代人T细胞的每种靶向B2M的gRNA详细显示了前10个最频繁观察到的序列变化。野生型(wt)未修饰的碱基以大写字母显示。相对于wt序列的缺失由“-”显示；相对于wt序列的插入由“小写字母”显示。数据是来自三次重复PCR产物的平均数。图36按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:10900-10919。

图37：如通过使用抗HLA-DR试剂的流式细胞术所测量，原代人T细胞中由包含针对CIITA的所示dgRNA(编号表示导引结构域的CRxxxxx标识符)的RNP按所示浓度电穿孔后第3天(细胞培养第5天)的编辑％。

图38：显示了CIITA基因座的基因组编辑作用，其因采用含有靶向CIITA基因座的所示gRNA的RNP电穿孔人原代T细胞产生。指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数(移码编辑％)。底部小图中详细显示了前5个最频繁观察到的序列变化。野生型(wt)未修饰的碱基以大写字母显示。相对于wt序列的缺失由“-”显示；相对于wt序列的插入由“小写字母”显示。数据是来自三次重复PCR产物的平均数。图38按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:10920-10939。

图39：如通过使用抗HLA-DR试剂的流式细胞术所测量，原代人T细胞中由包含针对CIITA的所示dgRNA(编号表示导引结构域的CR00xxxx标识符)的RNP按所示浓度电穿孔后第3天的编辑％。编辑％代表相对于未采用向导RNA的电穿孔的细胞中的表达，采用CIITA向导电穿孔的细胞中细胞表面处HLA-DR的表达。

图40：显示了CIITA基因座的基因组编辑作用，其因采用含有靶向CIITA基因座的所示gRNA的RNP电穿孔人原代T细胞产生。指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数(移码编辑％)。

图41：用于编辑原代人T细胞的每种靶向CIITA的gRNA的前5个最频繁观察到的序列变化(插入/缺失)。数据是来自三次重复PCR产物的平均数。野生型(wt)未修饰的碱基以大写字母显示。相对于wt序列的缺失由“-”显示；相对于wt序列的插入由“小写字母”显示。图41按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:10940-10974。

图42：如通过使用抗HLA-DR试剂的流式细胞术所测量，原代人T细胞中由包含针对CIITA的所示dgRNA(编号表示导引结构域的CR00xxxx标识符)的RNP按所示浓度电穿孔后第3天的编辑％。编辑％代表相对于未采用向导RNA的电穿孔的细胞中的表达，采用CIITA向导电穿孔的细胞中细胞表面处HLA-DR的表达。

图43：显示了CIITA基因座的基因组编辑作用，其因采用含有靶向CIITA基因座的所示gRNA的RNP电穿孔人原代T细胞产生。指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数(移码编辑％)。

图44.用于编辑原代人T细胞的每种靶向CIITA的gRNA的前5个最频繁观察到的序列变化。数据是来自三次重复PCR产物的平均数。野生型(wt)未修饰的碱基以大写字母显示。相对于wt序列的缺失由“-”显示；相对于wt序列的插入由“小写字母”显示。图44按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:10975-11014。

图45：用于制备在B2M、TRAC和CIITA基因座编辑的原代人T细胞(三重编辑的细胞)的示意性方案。

图46：通过流式细胞术分别检验CD3ε、B2M和HLA-DR的细胞表面表达评价对TRAC、B2M和CIITA的编辑。在细胞中检验细胞表面表达，其中已经用单一靶向性RNP(B2M 442单一、TRAC 961单一或CIITA 991单一)或用3种RNP同时(三重1、三重2、三重3、三重4；根据图45中详情)电穿孔所述细胞。未电穿孔的细胞显示为“无EP”。经Cas9电穿孔、但无向导RNA的细胞显示为“无向导”。

图47：B2M、TRAC和CIITA基因座的基因组编辑作用，其因采用3种含有靶向B2M、TRAC和CIITA基因座的gRNA的RNP同时电穿孔人原代T细胞产生。括号中指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数。

图48：采用不同浓度的如图45的示意图中所示每种RNP，在同时编辑3个基因座(三重编辑)的背景下，对于靶向B2M的gRNA CR00442而言原代人T细胞中B2M基因座处前10个最频繁观察到的序列变化。野生型(wt)未修饰的碱基以大写字母显示。相对于wt序列的缺失由“-”显示；相对于wt序列的插入由“小写字母”显示。数据是来自三次重复PCR产物的平均数。图48按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:11015-11054。

图49：采用不同浓度的如图45的示意图中所示每种RNP，在同时编辑3个基因座(三重编辑)的背景下，对于靶向TRAC的gRNA CR000961而言原代人T细胞中TRAC基因座处前10个最频繁观察到的序列变化。野生型(wt)未修饰的碱基以大写字母显示。相对于wt序列的缺失由“-”显示；相对于wt序列的插入由“小写字母”显示。数据是来自三次重复PCR产物的平均数。图49按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:11055-11094。

图50：采用不同浓度的如图45的示意图中所示每种RNP，在同时编辑3个基因座(三重编辑)的背景下，对于靶向CIITA的gRNA CR002991而言原代人T细胞中CIITA基因座处前10个最频繁观察到的序列变化。野生型(wt)未修饰的碱基以大写字母显示。相对于wt序列的缺失由“-”显示；相对于wt序列的插入由“小写字母”显示。数据是来自三次重复PCR产物的平均数。图50按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:11095-11134。

图51：对向导RNA的样式评价编辑效率。针对TRAC(CR000961；上半小图)或B2M(CR00442；下半小图)的向导RNA按照单向导或双向导样式在具有或没有所示化学修饰(PS或OMePS)合成。将RNP按所示的浓度电穿孔入人原代T细胞。借助流式细胞术，通过分析CD3ε的细胞表面染色，评价TRAC编辑过程的编辑效率(上部)并且通过分析B2M蛋白的细胞表面染色，评价B2M编辑过程的编辑效率(下部)。

图52：FKBP1A基因座的基因组编辑作用，其因采用含有靶向FKBP1A的所示gRNA的RNP电穿孔人原代T细胞产生。指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数。

图53：显示了用于编辑原代人T细胞的每种靶向FKBP1A的gRNA的前5个最频繁观察到的序列变化。野生型(wt)未修饰的碱基以大写字母显示。相对于wt序列的缺失由“-”显示；相对于wt序列的插入由“小写字母”显示。数据是来自三次重复PCR产物的平均数。图53按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:11135-11159。

图54：用含有gRNA的RNP或用阴性对照：442(靶向B2M的无关向导CR00442)；Cas9(无trRNA或crRNA的单独Cas9)；trRNA(tracer RNA，但无crRNA或Cas9蛋白)；Cas9+trRNA(Cas9和tracer RNA，但无crRNA)；EP(仅电穿孔的细胞)；无EP(仅细胞，无电穿孔)编辑T细胞，其中所述gRNA包含针对FKBP1A的导引结构域(CR002086、CR002097、CR002122；分别显示为2086、2097和2112)。在电穿孔后，将细胞用2.5nM RAD001(上半小图)处理或未作处理(下半小图)并且通过流式细胞术分析S6磷酸化(pS6)评价对mTOR途径抑制作用的影响。Y-轴表示前向散射(FSC)并且X-轴表示pS6水平。通过高于同种型抗体染色的对照中所见的荧光水平(未显示)设门控，确定pS6阳性染色(门控迹线中显示)。在下半小图的曲线中显示从流式细胞术数据对S6磷酸化的定量。

图55A和图55B：编辑的CART细胞响应于抗原暴露的细胞因子产生。使用靶向TRAC基因座的向导CR000961和/或靶向FKBP1A基因座的向导CR002097和CR002086(如分别通过cr961、2097和2086所示)，对CART细胞进行基因编辑。制备经不含向导RNA的RNP电穿孔的CART细胞作为阴性对照。将表达CART-CD19、CART-BCMA-10的或未转导(UTD)的CART细胞(如所示)与所示癌细胞(KMS11(BCMA阳性)、Nalm6(CD19阳性)或RPMI8226(BCMA阳性))按1:1或1:2.5的效应物/目标比(如所示)混合。收集细胞培养上清液并测量干扰素γ(图A)或测量IL-2(图B)。

图56：编辑的CART细胞对抗原阳性癌细胞系的杀伤作用。使用靶向TRAC基因座的向导CR000961和/或靶向FKBP1A基因座的向导CR002097和CR002086(如分别通过cr961、2097和2086所示)，对CART细胞进行基因编辑。制备经不含向导RNA的RNP电穿孔的CART细胞作为阴性对照。将表达CART-CD19、CART-BCMA-10的或未转导(UTD)的CART细胞(如所示)与稳定表达萤光素酶报道分子的所示癌细胞(KMS11(BCMA阳性)、Nalm6(CD19阳性)或RPMI8226(BCMA阳性))按1:1的效应物/目标比混合。测量萤光素酶信号并且将细胞杀伤作用作为萤光素酶活性的丧失测定。

图57：编辑的CART细胞响应于抗原暴露增殖。使用靶向TRAC基因座的向导CR000961和/或靶向FKBP1A基因座的向导CR002097和CR002086(如分别通过961、2097和2086所示)，对CART细胞进行基因编辑。制备经不含向导RNA的RNP电穿孔的CART细胞作为阴性对照。将表达CART-CD19(标记的CD19 CAR)、CART-BCMA-10(标记的BCMA10CAR)的或未转导(UTD)的CART细胞(如所示)与所示癌细胞系(KMS11(BCMA阳性)、Nalm6(CD19阳性)或RPMI8226(BCMA阳性))按1:1的效应物/目标比混合。通过相对于固定数目的计数珠，计数呈CAR+的CD4+细胞和CD8+细胞的总数，测量增殖。

图58：基因编辑(TRAC和/或FKBP1A)的CART细胞相对于RAD001的灵敏度。制备了表达BCMA10 CAR(A)、CD19 CAR(B)或无CAR(C；UTD)的CART细胞。使用靶向TRAC基因座的向导CR000961和/或靶向FKBP1A基因座的向导CR002097和CR002086(如分别通过961、2097和2086所示)，对CART细胞或UTD细胞进行基因编辑。制备经不含向导RNA的RNP电穿孔的CART细胞作为阴性对照。在RNP电穿孔后，将细胞用2.5nM RAD001(上半小图，显示为+RAD001)处理或未作处理(下半小图，显示为-RAD001)并且通过流式细胞术分析S6磷酸化(pS6)评价对mTOR途径抑制作用的影响。Y-轴表示侧向散射(SSC)并且X-轴表示磷酸化的S6蛋白(pS6)的水平。通过高于同种型抗体染色的对照中所见的荧光水平(未显示)设门控，确定pS6阳性染色，FACS图的右下象限中显示。含磷酸化S6的细胞的百分数用直方图(上半小图)并通过图(下半小图)显示。

图59：SupT1细胞中HLA-G/B2M融合蛋白的表达，如通过HLA-G流式细胞术检测。浅灰色直方图表示未转导的细胞中PE通道的背景荧光。深灰色直方图表示来自HLA-G/B2M转导的细胞中PE通道的荧光。

图60：不同Cas9变体在CD34+造血干细胞中靶向的B2M基因座处的编辑效率，如通过NGS和流式细胞术评价。NLS＝SV40 NLS；His6(SEQ ID NO:10795)或His8(SEQ ID NO:10796)分别指6个或8个组氨酸残基；TEV＝烟草蚀纹病毒剪切位点；Cas9＝野生型化脓性链球菌Cas9–突变或变体如所示)。

图61：不同Cas9变体和一系列浓度在原代人T细胞中靶向的B2M基因座处的编辑效率，如通过流式细胞术所测量。

图62：使用靶向B2M(左小图)或TRAC(右小图)的两种不同gRNA时，二个不同的Cas9变体在多种浓度时在原代人T细胞中的编辑效率。通过测量B2M(左小图)或TCR(右小图)的细胞表面表达丢失，通过流式细胞术测量编辑效率(编辑％)，。

图63：在过量表达Cas9的HEK-293细胞中使用dsDNA寡聚物-插入方法评估TRAC向导和B2M向导的脱靶活性。显示检测到的中靶位点(三角形)和潜在脱靶位点(圆圈)；y-轴表示检测频率。全部gRNA均按dgRNA样式测试，导引结构域由CRxxxxx识别码指示。在指示的情况下，如此修饰每种gRNA，从而5’三个核苷酸间键和3’三个核苷酸间键是硫代磷酸酯键(“PS”)。

图64：在过量表达Cas9的HEK-293细胞中使用dsDNA寡聚物-插入方法评估靶向CIITA、靶向FKBP1A、靶向PDCD1、靶向TRAC和靶向TRBC2的向导RNA分子的脱靶活性。显示检测到的中靶位点(三角形)和潜在脱靶位点(圆圈)；y-轴表示检测频率。全部gRNA均按dgRNA样式测试，导引结构域由CRxxxxx识别码指示。

图65：在引入靶向CD3δ的CRISPR系统(包含所示导引结构域的dgRNA)后72小时，原代人CD3+T细胞中如依据(如通过流式细胞术所测量的)CD3表面表达丢失所测量的编辑％。每个CD3阴性细胞％是三次独立实验的平均数(SD＝标准偏差)。

图66：在引入靶向CD3γ的CRISPR系统(包含所示导引结构域的dgRNA)后72小时，原代人CD3+ T细胞中如依据(如通过流式细胞术所测量的)CD3表面表达丢失所计量的编辑％。每个CD3阴性细胞％均值是三次独立实验的平均数(SD＝标准偏差)。

定义

术语“CRISPR系统”、“Cas系统”或“CRISPR/Cas系统”指包含RNA指导的核酸酶或其他效应分子和gRNA分子的一组分子，这些分子是指引和实现由RNA指导的核酸酶或其他效应分子在靶序列处修饰核酸共同必需的和足够的。在一个实施方案中，CRISPR系统包含gRNA和Cas蛋白，例如，Cas9蛋白。包含Cas9或修饰的Cas9分子的这类系统在本文中称作“Cas9系统”或“CRISPR/Cas9系统”。在一个例子中，gRNA分子和Cas分子可以复合，以形成核糖核蛋白(RNP)复合体。

术语“向导RNA”、“向导RNA分子”、“gRNA分子”或“gRNA”互换使用并且指一组促进特异性指引RNA指导的核酸酶或其他效应分子(一般与gRNA分子复合)至靶序列上的核酸分子。在一些实施方案中，通过gRNA的一部分与DNA(例如，通过gRNA导引结构域)杂交并且通过gRNA分子的一部分与RNA指导的核酸酶或其他效应分子结合(例如，至少通过gRNA tracr)实现所述指引。在实施方案中，gRNA分子由单一的连续多核苷酸分子组成，在本文中称作“单一向导RNA”或“sgRNA”等。在其他实施方案中，gRNA分子由本身能够缔合(一般通过杂交)的多个(通常二个)多核苷酸分子组成，在本文中称作“双重向导RNA”或“dgRNA”等。下文更详细地描述gRNA分子，但它通常包含导引结构域和tracr。在实施方案中，导引结构域和tracr设置在单一多核苷酸上。在其他实施方案中，导引结构域和tracr设置在分开的多核苷酸上。

如术语“导引结构域”联系gRNA使用时，该术语是gRNA分子的部分，所述部分识别靶序列(例如，细胞的核酸内部，例如，基因内部的靶序列)，例如，与之互补。

如术语“crRNA”联系gRNA使用时，该术语是gRNA分子的部分，所述部分包含导引结构域和与tracr相互作用以形成旗杆区的区域。

术语“靶序列”指核酸的与gRNA导引结构域互补例如与之完全互补的序列。在实施方案中，靶序列设置在基因组DNA上。在一个实施方案中，靶序列毗邻于(在DNA的相同链上或其互补链上)被具有核酸酶或其他效应子活性的蛋白质识别的前间区序列(protospacer)邻近基序(PAM)序列，例如，Cas9识别的PAM序列。在实施方案中，靶序列是同种异体T细胞靶的靶序列。在实施方案中，靶序列是抑制性分子的靶序列。在实施方案中，靶序列是抑制性分子的下游效应物的靶序列。

如本文中联系gRNA分子所用，术语“旗杆”指gRNA的部分，在所述部分中crRNA和tracr彼此结合或杂交。

如本文中联系gRNA分子所用，术语“tracr”指指gRNA的部分，所述部分与核酸酶或其他效应分子结合。在实施方案中，tracr包含与Cas9特异性结合的核酸序列。在实施方案中，tracr包含形成旗杆组成部分的核酸序列。

术语“Cas9”或“Cas9分子”指负责剪切DNA的来自细菌II型CRISPR/Cas系统的酶。Cas9还包括野生型蛋白以及其有功能和无功能的突变体。

如联系核酸使用，术语“互补的”指碱基A与T或U及G与C配对。术语互补性指完全互补即在整个参考序列范围内形成A与T或U配对和G与C配对的核酸分子以及至少80％、85％、90％、95％、99％互补的分子。

如同源性指导的修复或同源重组联系使用，“模板核酸”指在修饰位点借助CRISPR系统供体序列待插入供切割位点处基因修复(插入)的核酸。在一个方面，模板核酸包含编码(例如本文所述的)嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。在一个方面，模板核酸包含载体，所述载体包含编码(例如本文所述的)嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。

如本文所用，术语“插入/缺失”指相对于参考核酸，包含一个或多个核苷酸插入、一个或多个核苷酸缺失或核苷酸插入和缺失组合的核酸，其在暴露于包含gRNA分子的组合物(例如CRISPR系统)后产生。可以在暴露于包含gRNA分子的组合物后通过核酸测序，例如通过NGS，确定插入/缺失。关于插入/缺失位点，如果插入/缺失在参考位点(例如，与gRNA分子的导引结构域互补的位点)的约10、9、8、7、6、5、4、3、2个或1个核苷酸范围内包含至少一个插入或缺失或与所述参考位点的部分或全部重叠(例如，包含至少一个与gRNA分子(例如，本文所述的gRNA分子)的导引结构域互补的位点的10、9、8、7、6、5、4、3、2个或1个核苷酸重叠或在其范围内的插入或缺失)，则称插入/缺失“在参考位点处或其附近”。

如本文所用，术语“插入/缺失样式”指暴露于包含gRNA分子的组合物后产生的一组插入/缺失。在一个实施方案中，按出现频率，插入/缺失样式由前三个插入/缺失组成。在一个实施方案中，按出现频率，插入/缺失样式由前五个插入/缺失组成。在一个实施方案中，插入/缺失样式由相对于全部测序读段按大于约5％频率存在的插入/缺失组成。在一个实施方案中，插入/缺失样式由相对于插入/缺失测序读段(即，不由未修饰的参考核酸序列组成的那些读段)的总数按大于约10％频率存在的插入/缺失组成。在一个实施方案中，插入/缺失样式包含前五个最频繁观察到的插入/缺失中的任何3个。可以例如通过对暴露于gRNA分子的细胞群体的细胞测序，确定插入/缺失样式。

如本文所用，术语“脱靶插入/缺失”指在gRNA分子的导引结构域的靶序列之外的位点处或其附近的插入/缺失。相对于gRNA的导引结构域的序列，这类位点可以包含例如1、2、3、4、5个或更多个错配核苷酸。在示例性实施方案中，使用计算机预测的脱靶位点的定向测序或通过本领域已知的插入法，探测这类位点。

术语“抑制性分子”指当激活时造成或促进抑制细胞存活、活化、增殖和/或功能的分子和编码所述分子的基因及其相关调节元件，例如，启动子。在实施方案中，抑制性分子是在免疫效应细胞上(例如，在T细胞上)表达的分子。抑制性分子的非限制性例子是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)，VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD107)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ。应当理解，当联系靶序列或gRNA分子使用时，术语抑制性分子指编码抑制性分子蛋白的基因(及其相关调节元件)。在一个实施方案中，编码抑制性分子的基因是CD274。在一个实施方案中，编码抑制性分子的基因是HAVCR2。在一个实施方案中，编码抑制性分子的基因是LAG3。在一个实施方案中，编码抑制性分子的基因是PDCD1。

术语“借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物”指介导抑制性分子之抑制作用的分子；和编码所述分子的基因及其相关调节元件，例如，启动子。应当理解，当联系靶序列或gRNA分子使用时，术语“借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物”指编码借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物蛋白的基因(及其相关调节元件)。在一个实施方案中，编码借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的基因是PTPN11。

术语“同种异体T细胞靶”和“同种异体T-细胞靶”在本文中互换地使用，并且指介导或促进宿主抗移植物反应、介导或促进移植物抗宿主反应或作为免疫抑制剂的靶的蛋白质；和编码所述分子的基因及其相关调节元件，例如，启动子。应当理解，当联系靶序列或gRNA分子使用时，术语“同种异体T细胞靶”指编码同种异体T细胞靶蛋白的基因(及其相关调节元件)。不受理论约束，例如，通过本文公开的方法和组合物，对一种或多种同种异体T细胞靶的抑制或消除可以例如，通过减少或消除不利免疫原性(如宿主抗移植物反应或移植物抗宿主反应)，改善同种异体细胞(例如，同种异体T细胞)的功效、存活、功能和/或活力。

在非限制性例子中，介导或促进移植物抗宿主反应或宿主抗移植物反应的蛋白质是T细胞受体的一种或多种组分。在一个实施方案中，T细胞受体的组分是T细胞受体α，例如，TCRα的恒定结构域。在一个实施方案中，T细胞受体的组分是T细胞受体β链，例如，TCRβ的恒定结构域1或恒定结构域2。在一个实施方案中，T细胞受体的组分是T细胞受体δ链。在一个实施方案中，T细胞受体的组分是T细胞受体ε链。在一个实施方案中，T细胞受体的组分是T细胞受体ζ链。在一个实施方案中，T细胞受体的组分是T细胞受体γ链。因此，在其中同种异体T细胞靶编码的蛋白质是TCR组分的实施方案中，编码同种异体T细胞靶的基因可以例如是TRAC、TRBC1、TRBC2、CD3D、CD3E、CD3G或CD247及其组合。

在非限制性例子中，介导或促进移植物抗宿主反应或宿主抗移植物反应的蛋白质是HLA蛋白或B2M。HLA蛋白的例子包括HLA-A、HLA-B和HLA-C。因此，在其中同种异体T细胞靶蛋白是HLA或B2M蛋白的实施方案中，编码同种异体T细胞靶的基因可以例如是HLA-A、HLA-B、HLA-C或B2M及其组合。在其他实施方案中，同种异体T细胞靶蛋白是NLRC5，并且编码同种异体T细胞靶的基因可以例如是NLRC5。

在非限制性例子中，介导或促进移植物抗宿主反应或宿主抗移植物反应的蛋白质是主要组织相容性复合体II类(MHC II)分子(例如，HLA-Dx(其中x指MHC II蛋白的字母，例如，HLA-DM、HLA-DO、HLA-DR、HLA-DQ和/或HLA-DP))，或MHC II表达的调节因子及其组合。一个非限制性例子是CIITA(本文也称作C2TA)。因此，在其中同种异体T细胞靶蛋白是CIITA的实施方案中，编码同种异体T细胞靶的基因可以例如是CIITA。在另一个非限制性例子中，介导或促进移植物抗宿主反应或宿主抗移植物反应的蛋白质是RFXANK。在另一个非限制性例子中，介导或促进移植物抗宿主反应或宿主抗移植物反应的蛋白质是RFXAP。在另一个非限制性例子中，介导或促进移植物抗宿主反应或宿主抗移植物反应的蛋白质是RFX5。

如本文所用，术语“免疫抑制剂的靶”指免疫抑制剂的分子靶，例如受体或其他蛋白质(术语“免疫抑制剂”和“免疫抑制药”在本文中联系某药物或某药物的靶互换使用)。免疫抑制剂是通过几种作用机制之一阻抑免疫功能的物质。换句话说，免疫抑制剂是某化合物发挥的作用，其中通过通过削弱免疫应答程度和/或贪婪性的能力展示所述作用。免疫抑制剂展示的活性类型的一个例子是消除T细胞(例如，活化型T细胞)的活性。免疫抑制剂展示的活性类型的另一个例子是减少T细胞活性或其活化水平的活性。作为一个非限制性例子，免疫抑制剂可以是钙调神经磷酸酶抑制剂、雷帕霉素的靶、白介素-2a-链阻滞剂、肌苷一磷酸脱氢酶抑制剂、二氢酸还原酶抑制剂、皮质类固醇、环孢菌素、或免疫抑制性抗代谢物。经典的细胞毒性免疫抑制剂通过抑制DNA合成发挥作用。其他可以通过活化T细胞或通过抑制辅助细胞的活化起作用。作为限制例子，免疫抑制剂的靶可以是免疫抑制剂的受体如：脱氧胞苷激酶、CD52、糖皮质激素受体(GR)、FKBP家族基因成员(例如，FKBP12)和亲环蛋白家族基因成员。在一个实施方案中，免疫抑制剂的靶是脱氧胞苷激酶(DCK)并且免疫抑制剂是基于核苷类似物的药物如阿糖胞苷(嘧啶阿糖甙)或吉西他滨。在一个实施方案中，免疫抑制剂的靶是GR，并且免疫抑制剂是皮质类固醇如地塞米松。在一个实施方案中，免疫抑制剂的靶是CD52，并且免疫抑制剂是抗CD52抗体或其抗原结合片段如阿伦珠单抗在一个实施方案中，免疫抑制剂的靶是FKBP12，并且免疫抑制剂是FK506(或其类似物或FKBP12结合片段)、环孢菌素、雷帕霉素或雷帕霉素类似物或mTor抑制剂如RAD001。因此，在其中同种异体T细胞靶是免疫抑制性蛋白质的靶的实施方案中，编码同种异体T细胞靶的基因可以例如是NR3C1、FKBP1A、CD52或DCK及其组合。

术语“耐受雷帕霉素的mTor”指与FKBP12结合作用减少或消除(包括在雷帕霉素、FK506、雷帕霉素类似物、环孢菌素和/或其他mTor抑制剂如RAD001存在下)的mTor蛋白(和编码所述mTor蛋白的基因)。在示例性实施方案中，耐受雷帕霉素的mTor包含对FRB结构域的一个或多个突变。在一个示例性实施方案中，耐受雷帕霉素的mTor包含对S2035的突变，例如，由其组成，例如，包含S2035I突变，例如，由其组成。

术语“一个(a)”和“一种(an)”指该冠词的一个或多于一个(即，指至少一个)的语法对象。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。

当指可度量值如数量、时间持续期等时，术语“约”意在涵盖距指定值±20％的变动或在一些情况下±10％的变动或在一些情况下±5％的变动或在一些情况下±1％的变动或在一些情况下±0.1％的变动，因为这类变动适于开展所公开的方法。

术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”指一组多肽，最简单的实施方案中一般指两种多肽，在免疫效应细胞中时，所述多肽为细胞提供针对靶细胞(一般是癌细胞)的特异性及提供胞内信号生成。在一些实施方案中，CAR至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文也称作“胞内信号传导结构域”)，所述胞质信号传导结构域包含从如下文定义的刺激性分子和/或共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域。在一些方面，该组多肽彼此邻接。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其中存在二聚化分子时，所述二聚化开关可以使多肽彼此偶联，例如，可以使抗原结合结构域与胞内信号传导结构域偶联。在一个方面，刺激性分子是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。在一个方面，胞质信号传导结构域还包含从至少一种如下文定义的共刺激分子衍生的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如，4 1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含从共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含两个从一种或多种共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域至少包含两个从一种或多种共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基端(N-ter)包含任选的前导序列。在一个方面，CAR还在胞外抗原结合结构域的N末端包含前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原结合结构域(例如，scFv)切下。

包含靶向特定肿瘤标记X的抗原结合结构域(例如，scFv或TCR)(如本文所述的那些)的CAR也称作XCAR。例如，包含靶向CD19的抗原结合结构域的CAR也称作CD19CAR。作为另一个例子，包含靶向BCMA的抗原结合结构域的CAR也称作BCMA CAR。

术语“信号传导结构域”指蛋白质的功能性部分，所述的功能性部分通过在细胞内部传输信息而发挥以下作用：通过产生第二信使或通过响应于这类信使作为效应子发挥功能，借助限定的信号传导途径调节细胞活性。

如本文所用，术语“抗体”指与抗原特异性结合的蛋白质或衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子中的多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链或完整的免疫球蛋白并且可以衍生自天然来源或衍生自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。

术语“抗体片段”指抗体的至少一个部分，所述部分保留与抗原的表位特异性相互作用的能力(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(或者VL或VH)、驼类(camelid)VHH结构域、从抗体片段形成的多特异性抗体如包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的双价片段，和抗体的分离的CDR或其他表位结合片段。也可以将抗原结合片段并入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体、纳米体、胞内抗体(intrabody)、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology,23:1126-1136,2005)。也可以将抗原结合片段移植至基于多肽的支架如纤连蛋白III型(Fn3)(参见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽微型抗体)。

术语“scFv”指一种融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中轻链可变区和重链可变区连续地连接，例如，借助合成性接头，例如，柔性短多肽接头连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留从衍生它的完整抗体的特异性。除非指定，否则如本文所用，scFv可以具有按任何顺序(例如，相对于多肽的N末端和C末端)的VL可变区和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。

包含抗体或其抗体片段的本发明CAR的部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的部分，例如包括单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999,引自：Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,引自：Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本发明CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在又一个方面，CAR包含了构成scFv的抗体片段。可以使用多种熟知方案的任一者确定给定CDR的精确氨基酸序列界限，所述熟知方案包括由Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的那些或其组合。

如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如，免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个免疫球蛋白可变结构域序列的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第一表位的结合特异性并且多个免疫球蛋白可变结构域序列的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第二表位的结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子以针对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列为特征。

包含抗体或其抗体片段的本发明CAR的部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的部分，例如包括单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999,引自：Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,引自：Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本发明CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在又一个方面，CAR包含了构成scFv的抗体片段。

术语“抗体重链”指以其天然存在构象在抗体分子中存在的两种类型多肽链中的较大者，其在正常情况下决定抗体所属的类别。

术语“抗体轻链”指以其天然存在构象在抗体分子中存在的两种类型多肽链中的较小者。kappa(κ)轻链和lambda(λ)轻链指两个主要的抗体轻链同种型。

术语“重组抗体”指使用重组DNA技术生成的抗体，例如，通过噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。本术语应当还解释为意指已经通过合成编码抗体的DNA分子并且表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列的DNA分子而产生的抗体，其中已经使用本领域可获得的和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得DNA或氨基酸序列。

术语“抗原”或“Ag”指激发免疫应答的分子。这种免疫应答可以涉及抗体产生、或特异性免疫活性细胞的活化、或这两者。技术人员将会理解，任何大分子，实际上包括全部蛋白质或肽，可以充当抗原。另外，抗原可以衍生自重组DNA或基因组DNA。技术人员将会理解，包含编码蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用本术语那样的“抗原”，其中所述蛋白质激发免疫应答。另外，本领域技术人员将会理解，抗原不必完全由基因的全长核苷酸序列编码。轻易显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列并且这些核苷酸序列按多种组合布置以编码激发所需免疫应答的多肽。另外，技术人员将会理解，抗原完全不必要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以生成、合成或可以衍生自生物样品、或除多肽外还可能是大分子。这种生物样品可以包括但不限于具有其他生物学组分的组织样品、肿瘤样品、细胞或流体。

术语“抗癌作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于，例如，肿瘤体积减少、癌细胞数目减少、转移灶数目减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活减少或与癌状况相关的多种生理症状改善。“抗癌作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体预防癌在首发位置出现的能力展示。术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于，例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。

术语“自体的”指这样的任何物质，所述物质从稍后将向其再次引入所述物质的相同个体衍生。

术语“同种异体的”指这样的任何物质，所述物质从与引入所述物质的个体相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两位或更多位个体彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上明显地不相似以发生抗原性相互作用。

术语“异种的”指从不同物种的动物衍生的移植体。

术语“癌症”指异常细胞失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。本文中描述了各种癌症的例子并且它们包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，例如，两种术语涵盖实体瘤和液体肿瘤，例如，弥散型或循环型肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。

“衍生自”如该术语在本文中所用那样，表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常指第一分子和第二分子之间的结构相似性并且不暗示或不包括对衍生自第二分子的第一分子的过程限制或来源限制。例如，在胞内信号传导结构域衍生自CD3ζ分子的情况下，胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，从而具有需要的功能，即，适宜条件下产生信号的能力。它不暗示或不包括对产生胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它不意指，为了提供胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列出发并且删除不想要的序列，或加以突变，以获得胞内信号传导结构域。

短语“与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的疾病”包括但不限于与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的疾病或与表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞相关的病状，例如，包括增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前期病状如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一个方面，与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的癌是血液学癌。在一个方面，与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的癌是实体癌。与本文所述的肿瘤抗原表达相关的其他疾病例如包括但不限于与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病。与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症例如包括但不限于自身免疫疾病、(例如，狼疮)、炎性疾病(过敏和哮喘)和移植。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达过编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以按正常水平或减低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。

术语“保守序列修饰”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这类种保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体或抗体片段引入修饰。保守性氨基酸置换是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明CAR内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR。

术语“刺激”指由刺激性分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其同族配体(或在CAR的情况下肿瘤抗原)的结合所诱导的初次应答，所述初次应答因而介导信号转导事件，如，但不限于借助TCR/CD3复合物的信号转导或借助适宜NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的表达改变。

术语“刺激性分子”指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供胞质信号传导序列，所述胞质信号传导序列相对于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面以刺激性方式调节免疫细胞的活化。在一个方面，信号是初级信号，所述初级信号例如通过TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞反应，包括但不限于、增殖、活化、分化等。以刺激性方式发挥作用的初级胞质信号传导序列(也称作“初级信号传导结构域”)可以含有称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有在本发明中特别有用的胞质信号传导序列的ITAM的例子包括但不限于衍生自CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在本发明的具体CAR中，本发明的任一种或多种CARS中的胞内信号传导结构域包含胞内信号传导序列，例如，CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的具体CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是作为SEQ ID NO:18提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本发明的具体CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是在SEQ ID NO:20中提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。

术语“抗原呈递细胞”或“APC”指在其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞如附属细胞(例如，B细胞、树状细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将它们呈递至T细胞。

如本文中所用那样，术语“胞内信号传导结构域”指分子的胞内部分。胞内信号传导结构域产生信号，所述信号促进含有CAR的细胞(例如，CART细胞)的免疫效应子功能。(例如，在CART细胞中的)免疫效应子功能的例子包括溶细胞活性和辅助活性，包括分泌细胞因子。

在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括从负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子衍生的那些。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括从负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子衍生的那些。例如，在CART的情况下，初级胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自辅助受体或共刺激分子的胞质序列。

初级胞内信号传导结构域可以包含称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括但不限于衍生自CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。

术语“ζ”或备选地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为作为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基，并且“ζ刺激性结构域”或备选地“CD3-ζ刺激性结构域”或“TCR-ζ刺激性结构域”定义为来自ζ链胞质域或其功能衍生物的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个方面，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，“ζ刺激性结构域”或“CD3-ζ刺激性结构域”是作为SEQ ID NO:18提供的序列。在一个方面，“ζ刺激性结构域”或“CD3-ζ刺激性结构域”是作为SEQ ID NO:20提供的序列。

术语“共刺激分子”指T细胞上与共刺激配体特异性结合，因而介导通过T细胞的共刺激反应(如但不限于增殖)的同族结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外有助于高效免疫应答的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这类共刺激分子的其他例子包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。

共刺激胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的胞内部分。共刺激分子可以呈现于以下蛋白质家族中：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化性NK细胞受体。这类分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。

胞内信号传导结构域可以包含从中衍生它的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信号传导结构域或其功能性片段或衍生物。

术语“4-1BB”指TNFR超家族成员，所述成员具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQ ID NO:14提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。

如该术语在本文中所用那样，术语“免疫效应细胞”指涉及免疫应答，例如涉及促进免疫效应子反应的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和髓细胞衍生的吞噬细胞。

如该术语在本文中所用那样，“免疫效应子功能或免疫效应子反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T细胞或NK细胞特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的例子。

术语“编码”指的是多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序列在生物学过程中充当合成具有限定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的内在特性和因其产生的生物学特性。因此，如果与该基因相对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生某蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和作为基因或cDNA转录的模板使用的非编码链均可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

除非另外说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此作为简并形式并编码相同氨基酸序列的全部核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的“核苷酸序列”还可以包括内含子到这样的程度，从而编码蛋白质的核苷酸序列可以在某个形式中含有内含子。

术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中互换地使用并且指化合物、制剂、材料或组合物如本文所述那样有效实现特定生物学结果的量。

术语“内源”指来自生物、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。

术语“外源”指从生物、细胞、组织或系统外部引入或在其外部产生的任何物质。

术语“表达”指受启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

术语“转移载体”指物质组合物，所述物质组合物包含分离的核酸并且可以用来向细胞的内部递送分离的核酸。众多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性化合结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制型质粒或病毒。该术语还应当解释成进一步包括促进核酸转移入细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

术语“表达载体”指一种包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够顺式作用元件；其他表达用元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的全部那些表达载体，包括并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或含于脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

术语“同源的”或“同一性”指两个聚合物分子之间(例如，在两个核酸分子(如，两个DNA分子或两个RNA分子之间)或在两个多肽分子之间)的次级单位序列同一性。当这两个分子中的次级单位位置被相同单体性次级单位占据时，例如，若两个DNA分子中每个分子中的某位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源或相同的。两个序列之间的同一性直接随匹配位置或同源位置的数目而变化，例如，如果两个序列中一半位置(例如长度为十个次级单位的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个位置中9个位置)是匹配或同源的，则这两个序列是90％同源的。

非人类(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式是含有从非人免疫球蛋白衍生的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原结合子序列)。对大部分情况而言，人源化抗体及其抗体片段是这些人免疫球蛋白(受者抗体或抗体片段)，其中来自所述受者的互补决定区(CDR)中的残基替换为来自非人类物种(供者抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR中的残基。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基替换。另外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受者抗体中又不在输入的CDR或构架序列中存在的残基。这些修饰可以进一步修正和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将基本上包含至少一个、并且一般二个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的CDR区与非人类免疫球蛋白的那些CDR区对应并且全部或显著部分的FR区是具有人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体或抗体片段还可以包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于其他细节，参见Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。

“全人”指免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人源的或由与抗体或免疫球蛋白的人类形式相同的氨基酸序列组成。

术语“分离的”意指从天然状态改变或取出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是部分或完全与其天然状态的共存物质分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以按基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境(例如宿主细胞)中。

术语“有效连接”或“转录性控制”指调节序列和异源核酸序列之间导致异源核酸序列表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码性序列的转录或表达，则启动子与编码序列有效连接。有效连接的DNA序列可以彼此邻接并且，例如，在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，处于相同的可读框中。

术语免疫原性组合物的“肠胃外”施用例如包括皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。

术语“核酸”或“多核苷酸”指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限制，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，特定核酸序列也内在包括其保守方式修饰的变体(例如简并密码子置换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，实现简并密码子置换(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081,(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,(1994))。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”互换使用并且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸并且不限制可以构成蛋白质或肽的序列的最大氨基酸数。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，本术语指短链，例如，所述短链还常见地在本领域称为肽、寡肽和寡聚体，并且还指较长链，所述较长链通常在本领域称为蛋白质，所述蛋白质存在许多类型。“多肽”例如包括多肽的生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。

术语“启动子”指由细胞合成装置或引入的合成装置识别、为多核苷酸序列特异性转录所需要的DNA序列。

术语“启动子/调节序列”指表达与启动子/调节序列有效连接的基因产物所需要的核酸序列。在一些情况下，这个序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，这个序列还可以包含表达基因产物需要的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的那种。

术语“组成型”启动子指与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中在细胞的大部分或全部生理条件下产生的核苷酸序列。

术语“诱导型”启动子指与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中基本上仅当存在对应于细胞中该启动子的诱导物时才产生的核苷酸序列。

术语“组织特异性”启动子指与基因编码或规定的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中基本上只有细胞是与该启动子相对应的组织型的细胞才产生的核苷酸序列。

术语“癌相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指在癌细胞表面上完整或作为片段(例如，MHC/肽)表达并且可用于偏好性导引药理学物质至癌细胞的分子(一般是蛋白质、糖或脂质)。在一些实施方案中，肿瘤抗原是正常细胞和癌细胞二者表达的标志物，例如，谱系标志物，例如，B细胞上的CD19。在一些实施方案中，肿瘤抗原是这样的细胞表面分子，所述细胞表面分子与正常细胞相比，在癌细胞中过量表达，例如，与正常细胞相比，1倍过量表达、2倍过量表达，3倍或更多倍过量表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原是这样的细胞表面分子，所述细胞表面分子在癌细胞中不适宜地合成，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原将排他地在癌细胞表面上完整或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且在正常细胞的表面上不合成或不表达。在一些实施方案中，本发明的CAR包括了包含与MHC呈递的肽结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常，衍生自内源蛋白的肽填满主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的袋，并且由CD8+ T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合体由全部有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合体代表用于免疫疗法的独特类别细胞表面靶。已经描述了人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2背景下从病毒或肿瘤抗原衍生的TCR样抗体靶向肽(参见，例如，Sastry等人,J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，可以通过筛选文库，如人scFv噬菌体展示文库，鉴定TCR样抗体。

术语“肿瘤支持抗原”或“癌支持抗原”可互换地指在以下细胞的表面上表达的分子(一般是蛋白质、糖或脂质)，所述细胞本身非癌，但是支持癌细胞，例如，通过促进它们生长或存活(例如，免疫细胞抵抗性)支持癌细胞。这种类型的示例性细胞包括间质细胞和髓系衍生的抑制细胞(MDSC)。肿瘤支持抗原本身不需要在支持肿瘤细胞中发挥作用，只要抗原存在于支持癌细胞的细胞上即可。

如scFv的背景下所用的术语“柔性多肽接头”或“接头”指由氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，其中单独或组合使用所述肽接头以将可变重链区和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5和n＝6，n＝7，n＝8，n＝9并且n＝10(SEQ ID NO:6592)。在一个实施方案中，柔性多肽接头包含但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:6593)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:6594)。在另一个实施方案中，接头包含(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复序列(SEQ ID NO:6595)。本发明的范围内还包括接头在通过引用方式并入本文的WO 2012/138475中描述。

如本文与信使RNA(mRNA)联系所用，5'帽(还称作RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是已经紧接在转录起点后添加至真核信使RNA“前端”或5'末端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的端基组成。其存在对核糖体识别并保护免遭RNA酶作用至关重要。帽添加与转录偶联并且以共转录方式出现，从而每者影响另一者。在转录起始后不久，正在合成的mRNA的5'末端被结合于RNA聚合酶的帽合成复合物约束。这种酶促复合物催化mRNA加帽需要的化学反应。合成过程作为多步骤生物化学反应推进。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。

如本文所用，“体外转录的RNA”指已经在体外合成的RNA，优选地mRNA。通常，体外转录的RNA从体外转录载体产生。体外转录载体包括用来产生体外转录的RNA的模板。

如本文所用，“聚腺苷酸”是通过多聚腺苷化与mRNA连接的一系列腺苷。在瞬时表达构建体的优选实施方案中，聚腺苷酸数在50和5000之间(SEQ ID NO:6596)、优选地大于64、更优选地大于100、最优选地大于300或400。可以化学或酶促地修饰聚腺苷酸序列以调节mRNA功能如定位、稳定性或翻译效率。

如本文所用，“多聚腺苷化”指聚腺苷酰基部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大部分信使RNA(mRNA)分子在3'末端聚腺苷酸化。3'聚腺苷酸尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加至前mRNA的长腺嘌呤核苷酸序列(经常几百个)。在高等真核生物中，聚腺苷酸尾添加到含有特定序列(多聚腺苷化信号)的转录物上。聚腺苷酸尾和与之结合的蛋白质协助保护mRNA免遭核酸外切酶降解。多聚腺苷化还对转录终止、mRNA从胞核输出和翻译是重要的。多聚腺苷化在DNA转录成RNA后立即在胞核中发生，但额外地还可以稍后在细胞质中发生。在转录已经终止后，mRNA链因与RNA聚合酶结合的核酸内切酶复合体的作用而切割。切割位点通常以切割位点附近存在碱基序列AAUAAA为特征。在已经切割mRNA后，腺苷残基被添加至切割位点处的游离3’末端。

如本文所用，“瞬时”指非整合的转基因表达数小时、数天或数周时间，其中表达时间段小于如果基因在宿主细胞中整合至基因组中或含于稳定质粒复制子内部时该基因表达的时间段。

如本文所用，术语“治疗”、“疗法”和“治疗着”指因施用一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗药如本发明的CAR)而产生减少或改善增殖性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增殖性病症的一个或多个症状(优选地，一个或多个可察觉症状)。在具体实施方案中，“治疗”、“疗法”和“治疗着”指改善增殖性病症的并不必然由患者可察觉的至少一个可度量身体参数，如肿瘤生长。在其他实施方案中，“治疗”、“疗法”和“治疗着”指在身体上(例如，通过稳定可察觉症状)、生理上(例如，通过稳定身体参数)或这两方抑制增殖性病症的进展。在其他实施方案中，“治疗”、“疗法”和“治疗着”指肿瘤尺寸或癌细胞计数减少或稳定。

术语“信号转导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号转导分子之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号和跨细胞膜传输信号的分子和分子复合物。

术语“受试者”意在包括其中可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物、人)。

术语“基本上纯化的”细胞指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下通常与之结合的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体指均一的细胞群体。在其他情况下，这个术语单纯地指已经与其天然状态下天然与们结合的细胞分离的细胞。在一些方面，细胞在体外培养。在其他方面，细胞未在体外培养。

如本文所用的术语“治疗性”意指治疗。治疗作用通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态而获得。

如本文所用的术语“预防”意指预防或保护性治疗疾病或疾病状态。

在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性疾病抗原”或“与过度增殖性疾病相关的抗原”指特定过度增殖性疾病常见的抗原。在某些方面，本发明的过度增殖性疾病抗原衍生自癌，所述癌包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。

术语“转染”或“转化”或“转导”指借以将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主题细胞和其后代。

术语“特异性结合”指这样的分子，所述分子识别样品中存在的结合配偶体(例如，蛋白质或核酸)并与之结合，但所述分子基本上不识别或结合样品中的其他分子。

如该术语在本文中所用那样，“膜锚定物”或“膜束缚结构域”指足以锚定胞外或胞内结构域至质膜的多肽或部分，例如，肉豆蔻酰基。

术语“生物等效的”指为产生与参比剂量或参比量的参比化合物(例如，RAD001)产生的效果等同的效果所需要的除参比化合物(例如，RAD001)之外的药物量。在一个实施方案中，效果是mTOR抑制水平，例如，如通过P70 S6激酶抑制作用所测量，例如，如在体内或体外测定法中评价，例如，如通过本文所述的测定法(例如，Boulay测定法)所测量。在一个实施方案中，效果是PD-1阳性/PD-1阴性T细胞的比率改变，如通过细胞分选法所测量。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参比剂量或参比量的参比化合物相同的P70 S6激酶抑制水平的量或剂量。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参比剂量或参比量的参比化合物相同的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比率改变水平的量或剂量。

联系mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR抑制剂，例如，RAD001或雷帕霉素、或催化性mTOR抑制剂)使用时，术语“免疫增强性低剂量”指(例如，如通过抑制P70 S6激酶活性所测量)部分地但非完全抑制mTOR活性的mTOR抑制剂剂量。本文中讨论了用于(例如，通过抑制P70 S6激酶)评价mTOR活性的方法。该剂量不足以导致完全的免疫抑制，但是足以增强免疫应答。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的免疫增强性低剂量导致PD-1阳性T细胞的数目下降和/或PD-1阴性T细胞的数目增加、或PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞的比率增加。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的免疫增强性低剂量导致原初(naive)T细胞的数目增加。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的免疫增强性低剂量导致以下一种或多种情况：

以下一种或多种标记物的表达增加：例如，在记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的CD62Lhigh、CD127high、CD27+和BCL2；

记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上KLRG1的表达减少；和

记忆T细胞前体的数目增加，所述记忆T细胞前体例如是具有以下特征的任一个或其组合的细胞：CD62L^high增加、CD127^high增加、CD27⁺增加、KLRG1减少和BCL2增加；

其中例如，如与未处理的受试者相比，上文描述的任何变化出现，例如，至少暂时出现。

如本文所用的“难治性”，指不响应于治疗的疾病，例如，癌症。在实施方案中，难治性癌症可以在治疗开始前或在治疗开始时抵抗治疗。在其他实施方案中，难治性癌症可以在治疗期间变得耐药。难治性癌症也称作耐药性癌症。

如本文所用的“复发”指在改善阶段后(例如，在某疗法(例如，癌疗法)既往治疗后)后，疾病(例如，癌症)或疾病(例如，癌症)体征和症状返回。

范围：在本公开各处，本发明的多个方面可以按范围样式展示。应当理解，以范围样式描述仅出于方便和简洁目的并且不应当解释为刚性限制本发明的范围。因此，范围的描述应当视为具有具体公开的全部可能子范围以及该范围内部的各个数值。例如，范围如从1至6的描述应当视为具有具体公开的如下子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内部的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个例子，范围(如95-99％同一性)包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性。无论范围的宽度多大，这均适用。

发明详述

本文所述的gRNA分子、组合物和方法涉及真核细胞中使用CRISPR/Cas系统(例如，Cas9系统)进行基因组编辑。特别地，本文所述的gRNA分子、组合物和方法涉及调节靶分子的表达(或其功能形式的表达)，所述靶分子影响已移植细胞(例如用于癌症免疫治疗的细胞)的功能。在一个方面，移植的细胞是免疫效应细胞，例如，NK细胞或T细胞。在一个方面，细胞是同种异体细胞。在一个方面，细胞已经、正被或将要工程化以表达嵌合抗原受体。因此，本文中提供用于改变(例如，抑制或减少)基因产物的表达和/或功能(例如，功能形式的表达水平)的组合物和方法，所述基因产物可以改善已移植细胞(例如，已移植的免疫效应细胞，例如NK细胞或T细胞，例如经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，例如用于免疫疗法的表达CAR的同种异体T细胞)的功效(例如，通过减少或消除不利免疫原性(如宿主抗移植物反应或移植物抗宿主反应))、功能、增殖、刺激或存活。

在多个方面，基因产物是同种异体T细胞靶，如T细胞受体组分，例如，CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、T细胞受体(TCR)α或TCRβ；HLA分子或β-2微球蛋白(B2M)，例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C或B2M；CIITA分子；或免疫抑制剂例如糖皮质激素受体、脱氧胞苷激酶、FKBP、CD52或亲环蛋白家族成员的靶；及其组合。不受理论约束，认为抑制或消除同种异体T细胞靶的水平或同种异体T细胞靶基因产物的表达水平(例如，通过改变基因)，可以通过减少或消除移植物抗宿主反应、宿主抗移植物反应或将使所述移植的细胞抵抗免疫抑制剂治疗，改善细胞(例如，移植的细胞，例如，移植的免疫效应细胞，例如，CART细胞，例如，同种异体CART细胞)的功能。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变T细胞受体(TCR)组分(例如，CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、T细胞受体(TCR)α，例如，TCRα或TCRβ的恒定区)的基因，例如，TCRβ的恒定区1或恒定区2基因，改善细胞(例如，T细胞，例如，CAR工程化的T细胞，例如，CAR工程化的同种异体T细胞)的功能(例如，通过减少或消除不利免疫原性(如宿主抗移植物反应或移植物抗宿主反应))、存活、增殖和/或功效。不希望受理论约束的同时，认为通过消除T细胞受体识别和应答于宿主组织，有功能的T细胞受体组分的表达减少或不存在减少或消除了所述细胞表面上TCR的存在，因而减少或防止移植物抗宿主病。因此，这种方法可以用来产生“现成的”T细胞(Torikai等人,2012Blood 119,5697-5705)。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变主要组织相容性复合体的组分(例如，HLA蛋白或B2M，例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C或B2M(由B2M基因编码))的基因或调节主要组织相容性复合体的一种或多种组分表达的蛋白质(例如，NLRC5)的基因，改善细胞(例如，T细胞，例如，CAR工程化的T细胞，例如，CAR工程化的同种异体T细胞)的功能(例如，通过减少或消除不利免疫原性(如宿主抗移植物反应或移植物抗宿主反应))、存活、增殖和/或功效。不希望受理论约束的同时，认为通过消除宿主T细胞受体识别和应答于错配(例如，同种异体)的移植物组织，错配(例如，不匹配接受细胞疗法的受试者的类型)的HLA蛋白(或组分)表达减少或不存在减少或消除了宿主抗移植物病。因此，这种方法可以用来产生“现成的”T细胞。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变主要组织相容性复合体II类的组分的基因或MHC II类表达的调节物(例如，CIITA(由CIITA基因编码)、RFXANK、RFX5或RFXAP及其组合，例如，CIITA)的基因，改善细胞(例如，T细胞，例如，CAR工程化的T细胞，例如，CAR工程化的同种异体T细胞)的功能(例如，通过减少或消除不利免疫原性(如宿主抗移植物反应或移植物抗宿主反应))、存活、增殖和/或功效。不希望受理论约束的同时，认为减少或消除MHC II类表达的调节物(例如，CIITA)表达将减少或消除同种异体细胞上MHC II类分子的表达，因而减少或消除错配(例如，不匹配接受细胞疗法的受试者的类型)的MHC II类蛋白(或组分)表达，因而例如通过消除宿主T细胞受体识别和应答于如本文所述的错配(例如，同种异体)的移植物组织(例如，同种异体T细胞，例如，同种异体CART细胞)，减少或消除宿主抗移植物病。因此，这种方法可以用来产生“现成的”T细胞。

在一个方面，可能有益的是减少或消除例如T细胞中(例如，同种异体T细胞中，例如，例如本文所述的同种异体CART细胞中)一种或多种MHC I类分子和一种或多种MHC II分子的表达，以进一步减少或消除施用细胞时的宿主抗移植物病反应。因此，在本发明细胞和方法的实施方案中，细胞可以与包含例如本文所述的针对B2M的gRNA分子的本发明组合物(例如，包含gRNA和Cas9分子的组合物)接触(例如，如此接触，从而所述细胞中一种或多种MHC I类分子的表达减少或消除)并与包含例如本文所述的针对CIITA的gRNA分子的本发明组合物(例如，包含gRNA和Cas9分子的组合物)接触(例如，如此接触，从而一种或多种MHC II类分子的表达减少或消除)。在实施方案中细胞和本发明的方法，细胞也可以与包含例如本文所述的针对TCR组分(例如，针对TRAC和/或TRBC)的gRNA分子的本发明组合物(例如，包含gRNA和Cas9分子的组合物)接触(例如，如此接触，从而T细胞受体(例如，一种或多种TCR组分)的表达减少或消除)。在一个实施方案中，本发明的细胞具有减少或消除的TCR表达(例如，如通过流式细胞术检测到)、减少或消除的一种或多种MHC I类分子表达(例如，如通过流式细胞术检测到)和减少或消除的一种或多种MHC II类分子表达(例如，如通过流式细胞术检测到)。在一个实施方案中，本发明的细胞具有减少或消除的TRAC表达、减少或消除的B2M表达和减少或消除的CIITA表达。在一个实施方案中，本发明的细胞具有减少或消除的TRAC表达、减少或消除的NLRC5表达和减少或消除的CIITA表达。在实施方案中，相对于尚未用本发明组合物或CRISPR系统处理的相似细胞，测量减少或消除的表达。在实施方案中，细胞是免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞，例如，例如本文所述的T细胞。在实施方案中，细胞是经工程化以表达例如本文所述的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。在实施方案中，CAR是例如本文所述的BCMA CAR。在一个实施方案中，本发明提供经工程化以表达BCMA CAR的细胞，例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞，例如，T细胞，所述细胞为TCR-/B2M-/CIITA-或TCR-/NLRC5-/CIITA-。在实施方案中，细胞是人细胞。在实施方案中，细胞相对于待施用所述细胞的受试者是同种异体的。在实施方案中，通过向所述细胞引入例如本文所述的本发明组合物、CRISPR系统或gRNA或通过如本文所述的方法，实现减少或消除的TCR、B2M、NLRC5和/或CIITA表达。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变免疫抑制剂的靶(例如，糖皮质激素受体(GR)(由NR3C1编码))的基因，改善细胞(例如，T细胞，例如，CAR工程化的T细胞，例如，CAR工程化的同种异体T细胞)的功能(例如，通过减少或消除不利免疫原性(如宿主抗移植物反应或移植物抗宿主反应))、存活、增殖和/或功效。不受理论约束，认为细胞疗法产品上有功能GR表达的不存在或减少允许细胞疗法产品在免疫抑制药如皮质类固醇如地塞米松存在下发挥作用，例如正在施用所述免疫抑制药以减少或消除宿主抗移植物病。因此，这种方法可以用来产生“现成的”T细胞。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变免疫抑制剂的靶(例如，CD52(由CD52编码))的基因，改善细胞(例如，T细胞，例如，CAR工程化的T细胞，例如，CAR工程化的同种异体T细胞)的功能(例如，通过减少或消除不利免疫原性(如宿主抗移植物反应或移植物抗宿主反应))、存活、增殖和/或功效。不受理论约束，认为细胞疗法产品上有功能CD52表达的不存在或减少允许细胞疗法产品在免疫抑制药如抗CD52抗体或其抗原结合片段(如阿伦珠单抗)存在下发挥作用，例如正在施用所述免疫抑制药以减少或消除宿主抗移植物病。因此，这种方法可以用来产生“现成的”T细胞。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变免疫抑制剂的靶(例如，FKBP家族成员，例如，FKBP12(由FKBP1A编码))的基因，改善细胞(例如，T细胞，例如，CAR工程化的T细胞，例如，CAR工程化的同种异体T细胞)的功能(例如，通过减少或消除不利免疫原性(如宿主抗移植物反应或移植物抗宿主反应))、存活、增殖和/或功效。不受理论约束，认为细胞疗法产品上有功能FKBP12表达的不存在或减少允许细胞疗法产品在免疫抑制药如FK506(或FKBP12结合片段或其类似物)、环孢菌素、雷帕霉素或雷帕霉素类似物或mTor抑制剂如RAD001存在下发挥作用，例如正在施用所述免疫抑制药以减少或消除宿主抗移植物病。因此，这种方法可以用来产生“现成的”T细胞。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变免疫抑制剂的靶(例如，脱氧胞苷激酶(由DCK编码))的基因，改善细胞(例如，T细胞，例如，CAR工程化的T细胞，例如，CAR工程化的同种异体T细胞)的功能(例如，通过减少或消除不利免疫原性(如宿主抗移植物反应或移植物抗宿主反应))、存活、增殖和/或功效。不受理论约束，认为细胞疗法产品上有功能脱氧胞苷激酶表达的不存在或减少允许细胞疗法产品在免疫抑制药如基于核苷类似物的药物(如阿糖胞苷(嘧啶阿糖甙)或吉西他滨)存在下发挥作用，例如正在施用所述免疫抑制药以减少或消除宿主抗移植物病或治疗癌症。因此，这种方法可以用来产生“现成的”T细胞。

在多个方面，基因产物是抑制性分子，例如，免疫检查点蛋白，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)，VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD107)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ。不受理论约束，认为抑制或消除抑制性分子的水平或抑制性分子基因产物的表达水平(例如，通过改变基因)，可以通过减少或消除由所述抑制性分子介导的抑制性作用，改善细胞(例如，移植的细胞，例如，移植的免疫效应细胞，例如，CART细胞，例如，同种异体CART细胞)的功能。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变抑制性分子(例如，PD1)的基因，减少免疫抑制性因子对细胞(例如，CAR工程化的T细胞)的影响。不希望受理论约束的同时，认为程序性细胞死亡1(PD-1)(由PDCD1编码)的表达减少或不存在消除了对受阻抑或无响应状态(“无变应性”)的诱导。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变抑制性分子(例如，Tim3)的基因，减少免疫抑制性因子对细胞(例如，CAR工程化的T细胞)的影响。不希望受理论约束的同时，认为Tim3(由HAVCR2编码)的表达减少或不存在消除了对受阻抑或无响应状态(“无变应性”)的诱导。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变抑制性分子的基因(例如，CTLA4基因)，减少免疫抑制性因子对细胞(例如，CAR工程化的T细胞)的影响。不希望受理论约束的同时，认为细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(由CTLA4编码)的表达减少或不存在消除了对受阻抑或无响应状态(“无变应性”)的诱导。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变抑制性分子的基因(例如，Lag3基因)，减少免疫抑制性因子对细胞(例如，CAR工程化的T细胞)的影响。不希望受理论约束的同时，认为淋巴细胞活化基因3(Lag3)(由LAG3编码)的表达减少或不存在消除了对受阻抑或无响应状态(“无变应性”)的诱导。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变抑制性分子的基因(例如，PD-L1基因)，减少免疫抑制性因子对细胞(例如，CAR工程化的T细胞)的影响。不希望受理论约束的同时，认为程序性死亡配体1(PD-L1，也称作CD274和B7-H1)(由CD274编码)的表达减少或不存在消除了对受阻抑或无响应状态(“无变应性”)的诱导。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来通过改变抑制性分子的下游效应物分子的基因(例如，酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型1基因)，减少免疫抑制性因子对细胞(例如，CAR工程化的T细胞)的影响。不希望受理论约束的同时，认为通过影响借助抑制性分子发生信号传导，有功能的酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型1(也称作蛋白质酪氨酸磷酸酶1B)(由PTPN1编码)的表达减少或不存在消除了对受阻抑或无响应状态(“无变应性”)的诱导。

在多个方面，本文所述的组合物和方法可以组合用于产生细胞，例如，移植的细胞，例如，同种异体细胞，例如，免疫效应细胞，例如，NK细胞或T细胞，例如CAR工程化T细胞，其相对于未修饰的细胞具有增强的功效(例如，通过减少或消除不利免疫原性(如宿主抗移植物反应或移植物抗宿主反应))、生存、增殖和/或刺激作用。

在一个方案中，本文所述的组合物和方法可以用来产生细胞，其已经减少或消除功能性TCR组分的水平或表达水平和其中已经减少或消除有功能MHC的水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TCRα和HLA-A水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TCRα和HLA-B水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TCRα和HLA-C水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TCRα和B2M水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TCRα和NLRC5水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TCRβ和HLA-A水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TCRβ和HLA-B水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TCRβ和HLA-C水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TCRβ和B2M水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TCRβ和NLRC5水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3ζ和HLA-A水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3ζ和HLA-B水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3ζ和HLA-C水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3ζ和B2M水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3ζ和NLRC5水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3ε和HLA-A水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3ε和HLA-B水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3ε和HLA-C水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3ε和B2M水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3ε和NLRC5水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3γ和HLA-A水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3γ和HLA-B水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3γ和HLA-C水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3γ和B2M水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3γ和NLRC5水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3δ和HLA-A水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3δ和HLA-B水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3δ和HLA-C水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3δ和B2M水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的CD3δ和NLRC5水平或表达水平。在前述实施方案的任一项中，细胞可以具有减少或消除的CIITA水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TRAC、B2M和CIITA水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TRBC、B2M和CIITA水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TRAC、TRBC、B2M和CIITA水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TRAC、NLRC5和CIITA水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TRBC、NLRC5和CIITA水平或表达水平。在一个实施方案中，细胞具有减少或消除的TRAC、TRBC、NLRC5和CIITA水平或表达水平。在中中任一项前述实施方案，细胞可以另外具有减少或消除的一种或多种抑制性分子或抑制性分子下游效应物水平或表达水平。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-1。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-L1。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括Lag3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括Tim3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括CTLA4。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PTPN1。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-1和PD-L1。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-1和Lag3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-1和Tim3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-1和CTLA4。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-L1和Lag3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-L1和Tim3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-L1和CTLA4。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括Tim3和Lag3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括Tim3和CTLA4。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括Lag3和CTLA4。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-1、PD-L1和Lag3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-1、PD-L1和Tim3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-1、PD-L1和CTLA-4。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-1、Tim3和Lag3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括PD-L1、Tim3和Lag3。在一个方面，一种或多种抑制性分子包括CTLA4、Tim3和Lag3。

在一个方面，本文所述的组合物和方法可以用来产生细胞，例如，T细胞，例如，CAR工程化的T细胞，其中已经减少或消除两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子的水平或表达水平。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-1和PD-L1。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-1和Lag3。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-1和Tim3。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-1和CTLA4。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-L1和Lag3。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-L1和Tim3。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-L1和CTLA4。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括Tim3和Lag3。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括Tim3和CTLA4。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括Lag3和CTLA4。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-1、PD-L1和Lag3。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-1、PD-L1和Tim3。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-1、PD-L1和CTLA-4。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-1、Tim3和Lag3。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括PD-L1、Tim3和Lag3。在一个方面，两种或更多种(例如，2种，例如，3种，例如，4种)抑制性分子包括CTLA4、Tim3和Lag3。

在细胞具有减少或消除的TCRα水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ.ID NO：SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965或SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623，例如，SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5587、SEQ ID NO:5592或SEQ ID NO:5586，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965或SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的TCRβ水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097或SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097或SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。在细胞具有减少或消除的TCRβ水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226或SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226或SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的CD3ζ(由CD247基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的CD3ε(由CD3E基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的CD3δ(由CD3D基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的CD3γ(由CD3G基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的B2M(由B2M基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的NLRC5(由NLRC5基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:8622至SEQ ID NO:10089，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:8622至SEQ ID NO:10089的17、18、19，或20个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的HLA-A(由HLA-A基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的HLA-B(由HLA-B基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的HLA-C(由HLA-C基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的CIITA(由CTIIA基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:6750至SEQ ID NO:7716中任一者的，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:6750至SEQ ID NO:7716的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。在实施方案中，gRNA分子包含有包含SEQ ID NO:7717至SEQ ID NO:7804中任一者的导引结构域。

在细胞具有减少或消除的GR(由NR3C1基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的FKBP12(由FKBP1A基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的CD52(由CD52基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的DCK(由DCK基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的PD-L1(由CD274基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的Tim3(由HAVCR2基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的Lag3(由LAG3基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在细胞具有减少或消除的PD-1(由PDCD1基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589或SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589或SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。在一个实施方案中，gRNA分子包含了包含SEQ ID NO:5775的导引结构域或包含了包含SEQ ID NO:5775的17、18、或19个连续核苷酸或由其组成的导引结构域。

在细胞具有减少或消除的酪氨酸-蛋白质磷酸酶非受体型1(由PTPN1基因编码)水平或表达水平的实施方案中，细胞优选地包含或曾经包含了包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域包含SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277，或包含导引结构域的gRNA分子，所述导引结构域由SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸，优选地20个连续核苷酸组成。

在前述方面和实施方案的任一者中，细胞是自体细胞。在前述方面和实施方案的任一者中，细胞是同种异体细胞。在任一项前述实施方案和方面中，细胞是或将要经工程化以表达例如本文所述的嵌合抗原受体(CAR)。在前述方面和实施方案的任一者中，细胞是T细胞。

下文详细描述本发明gRNA分子、CRISPR系统、Cas9分子、细胞、CAR分子和方法的附加特征。

I.gRNA分子

gRNA分子可以具有众多结构域，如下文更充分那样那样，然而，gRNA分子一般包含至少一个crRNA结构域(包含导引结构域)和一个tracr。作为CRISPR系统的组分使用的本发明gRNA分子可用于在靶位点或其附近修饰(例如，修饰序列)DNA。这类修饰包括例如导致包含靶位点的基因的功能性产物表达减少或消除的缺失和或插入。下文更充分地描述这些用途和附加使用。

在一个实施方案中，单分子或sgRNA包含，优选地从5'至3'包含：crRNA(其含有与靶序列互补的导引结构域和形成旗杆组成部分的区域(即，crRNA旗杆区))；环；和tracr(其含有与crRNA旗杆区互补的结构域和额外结合核酸酶或其他效应分子(例如，Cas分子，例如，Cas9分子)的结构域)，并且可以采取以下样式(从5’至3’)：

[导引结构域]–[crRNA旗杆区]–[任选的第一旗杆延长部分]–[环]–[任选的第一tracr延长部分]–[tracr旗杆区]–[tracr核酸酶结合结构域]。

在实施方案中，tracr核酸酶结合结构域与Cas蛋白(例如，Cas9蛋白)结合。

在一个实施方案中，双分子或dgRNA包含二个多核苷酸，第一多核苷酸优选地从5'至3'为：crRNA(其含有与靶序列互补的导引结构域和形成旗杆组成部分的区域)；并且第二多核苷酸优选地从5'至3'为：tracr(其含有与crRNA旗杆区互补的结构域和额外结合核酸酶或其他效应分子(例如，Cas分子，例如，Cas9分子)的结构域)，并且可以采取以下样式(从5’至3’)：

多核苷酸1(crRNA)：[导引结构域]–[crRNA旗杆区]–[任选的第一旗杆延长部分]–[任选的第二旗杆延长部分]

多核苷酸2(tracr)：[任选的第一tracr延长部分]–[tracr旗杆区]-[tracr核酸酶结合结构域]

在实施方案中，tracr核酸酶结合结构域与Cas蛋白(例如，Cas9蛋白)结合。

在一些方面，导引结构域包含本文所述的导引结构域序列，例如，表1、2、3、4、5、6、6b或6c中描述的导引结构域或包含表1、2、3、4、5、6、6b或6c中所述导引结构域序列的17、18、19、20、21、22、23、24或25(优选地20)个连续核苷酸或由其组成的导引结构域，或由其组成。

在一些方面，旗杆(例如，crRNA旗杆区)从5’至3’包含：GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO:6584)。

在一些方面，旗杆(例如，crRNA旗杆区)从5’至3’包含：GUUUAAGAGCUA(SEQ ID NO:6585)。

在一些方面，环从5’至3’包含：GAAA(SEQ ID NO:6588)。

在一些方面，tracr从5’至3’包含：UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6589)并且优选地用于包含SEQ ID NO:6584的gRNA分子中。

在一些方面，tracr从5’至3’包含：UAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6590)并且优选地用于包含SEQ ID NO:6585的gRNA分子中。

在一些方面，gRNA还可以在3'端包含附加的U核酸。例如，gRNA可以在3'端包含附加的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个U核酸(SEQ ID NO:10806)。在一个实施方案中，gRNA在3'端包含附加的4个U核酸。在dgRNA的情况下，dgRNA的一个或多个多核苷酸(例如，包含导引结构域的多核苷酸和包含tracr的多核苷酸)可以在3'端包含附加的U核酸。例如，在dgRNA的情况下，dgRNA的一个或多个多核苷酸(例如，包含导引结构域的多核苷酸和包含tracr的多核苷酸)可以在3'端包含附加的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个U核酸(SEQ ID NO:10806)。在一个实施方案中，在dgRNA的情况下，dgRNA的一个或多个多核苷酸(例如，包含导引结构域的多核苷酸和包含tracr的多核苷酸)在3'端包含附加的4个U核酸。在dgRNA的一个实施方案中，仅包含tracr的多核苷酸包含附加的U核酸，例如，4个U核酸。在dgRNA的一个实施方案中，仅包含导引结构域的多核苷酸包含附加的U核酸。在dgRNA的一个实施方案中，包含导引结构域的多核苷酸和包含tracr的多核苷酸均包含附加的U核酸，例如，4个U核酸。

在一些方面，gRNA还可以在3'端包含附加的A核酸。例如，gRNA可以在3'端包含附加的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个A核酸(SEQ ID NO:10809)。在一个实施方案中，gRNA在3'端包含附加的4个A核酸。在dgRNA的情况下，dgRNA的一个或多个多核苷酸(例如，包含导引结构域的多核苷酸和包含tracr的多核苷酸)可以在3'端包含附加的A核酸。例如，在dgRNA的情况下，dgRNA的一个或多个多核苷酸(例如，包含导引结构域的多核苷酸和包含tracr的多核苷酸)可以在3'端包含附加的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个A核酸(SEQ ID NO:10809)。在一个实施方案中，在dgRNA的情况下，dgRNA的一个或多个多核苷酸(例如，包含导引结构域的多核苷酸和包含tracr的多核苷酸)在3'端包含附加的4个A核酸。在dgRNA的一个实施方案中，仅包含tracr的多核苷酸包含附加的A核酸，例如，4个A核酸。在dgRNA的一个实施方案中，仅包含导引结构域的多核苷酸包含附加的A核酸。在dgRNA的一个实施方案中，包含导引结构域的多核苷酸和包含tracr的多核苷酸均包含附加的A核酸，例如，4个A核酸。

在实施方案中，gRNA分子的一个或多个多核苷酸可以在5'端包含帽。

在一个实施方案中，单分子或sgRNA包含，优选地从5'至3'包含：crRNA(其含有与靶序列互补的导引结构域；crRNA旗杆区)；第一旗杆延长部分；环；第一tracr延长部分(其含有与第一旗杆延长部分的至少一部分互补的结构域)；和tracr(其含有与crRNA旗杆区互补的结构域和额外地结合Cas9分子的结构域)。在一些方面，导引结构域包含本文所述的导引结构域序列，例如，表1、2、3、4、5、6、6b或6c中描述的导引结构域，或包含表1、2、3、4、5、6、6b或6c中所述导引结构域序列的17、18、19、20、21、22、23、24或25(优选地20)个连续核苷酸(例如，例如表1、2、3、4、5、6、6b或6c中描述的导引结构域序列的3’17、18、19、20、21、22、23、24或25(优选地20)个连续核苷酸)或由其组成的导引结构域。

在包含第一旗杆延长部分和/或第一tracr延长部分的多个方面，旗杆序列、环序列和tracr序列可以如上文所述。通常，可以使用任何第一旗杆延长部分和第一tracr延长部分，前提是它们互补。在实施方案中，第一旗杆延长部分和第一tracr延长部分由3、4、5、6、7、8、9、10或更多个互补核苷酸组成。

在一些方面，第一旗杆延长部分从5’至3’包含：UGCUG(SEQ ID NO:6586)。在一些方面，第一旗杆延长部分由SEQ ID NO:6586组成。

在一些方面，第一tracr延长部分从5’至3’包含：CAGCA(SEQ ID NO:6591)。在一些方面，第一tracr延长部分由SEQ ID NO:6591组成。

在一个实施方案中，dgRNA包含二个核酸分子。在一些方面，dgRNA包含第一核酸，其含有，优选地从5'至3'含有：与靶序列互补的导引结构域；crRNA旗杆区；任选地第一旗杆延长部分；和任选地，第二旗杆延长部分；和第二核酸(其可以在本文中称作tracr，并且至少包含结合Cas分子(例如，Cas9分子)的结构域)，其优选地从5’至3’包含：任选地第一tracr延长部分；和tracr(其含有与crRNA旗杆区互补的结构域，和额外地结合Cas(例如，Cas9)分子的结构域)。第二核酸可以在3'端(例如，tracr的3’)另外地包含附加的U核酸。例如，tracr可以在3'端(例如，tracr的3’)包含附加的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个U核酸(SEQ ID NO:10806)。第二核酸可以在3'端(例如，tracr的3’)另外或交替地包含附加的A核酸。例如，tracr可以在3'端(例如，tracr的3’)包含附加的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个A核酸(SEQ ID NO:10809)。在一些方面，导引结构域包含本文所述的导引结构域序列，例如，表1、2、3、4、5、6、6b或6c中描述的导引结构域或包含表1、2、3、4、5、6、6b或6c中所述导引结构域序列的17、18、19、20、21、22、23、24或25(优选地20)个连续核苷酸或由其组成的导引结构域。

在涉及dgRNA、crRNA旗杆区的多个方面，任选的第一旗杆延长部分序列、任选的第一tracr延长部分序列和tracr序列可以如上文所述。

在一些方面，任选的第二旗杆延长部分从5’至3’包含：UUUUG(SEQ ID NO:6587)。

在实施方案中，gRNA分子(和在dgRNA分子的情况下，包含导引结构域的多核苷酸和/或包含tracr的多核苷酸)的3’1、2、3、4或5个核苷酸，5’1、2、3、4或5个核苷酸或3’和5’1、2、3、4或5个核苷是修饰的核酸，如下文第XIII部分中更充分所述那样。

以下简要讨论这些结构域：

1)导引结构域：

关于选择导引结构域的指导可以例如在以下文献中找到：Fu Y等人,NAT BIOTECHNOL 2014(doi:10.1038/nbt.2808)和Sternberg SH等人,NATURE 2014(doi:10.1038/naturel3011)。

导引结构域包含与靶核酸上的靶序列互补，例如，至少80、85、90、95或99％互补，例如，完全互补的核苷酸序列。导引结构域是RNA分子的组成部分并且将因此包含尿嘧啶(U)碱基，而编码gRNA分子的任何DNA将包含碱基胸腺嘧啶(T)。不希望受理论约束的同时，认为导引结构域与靶序列的互补性有助于gRNA分子/Cas9分子复合体与靶核酸发生特异性相互作用。可以理解，在导引结构域和靶序列对中，导引结构域的尿嘧啶碱基将与靶序列中的腺嘌呤碱基配对。

在一个实施方案中，导引结构域具有5至50个，例如，10至40个，例如，10至30个，例如，15至30个，例如，15至25个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有16个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有17个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有18个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有19个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有20个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有21个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有22个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有23个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有24个核苷酸长度。在一个实施方案中，导引结构域具有25个核苷酸长度。在实施方案中，前述的16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸包含来自表1、2、3、4、5、6、6b或6c中描述的导引结构域的5’-16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在实施方案中，前述的16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸包含来自表1、2、3、4、5、6、6b或6c中描述的导引结构域的3’-16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。

不受理论约束，认为设置在导引结构域3'端的8、9或10个导引结构域核酸对导引靶序列重要，并且可以因此称作导引结构域“核心”区。在一个实施方案中，核心结构域完全与靶序列互补。

靶核酸的与导引结构域互补的链在本文中称作靶序列。在一些方面，靶序列设置在染色体上，例如，是基因内部的靶。在一些方面，靶序列设置在基因的外显子内。在一些方面，靶序列设置在基因的内含子内。在一些方面，靶序列包含目的基因的调节元件的结合位点(例如，启动子或转录因子结合位点)或与之近邻(例如，在10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或1000个核酸内)。该结构域的一些或全部核苷酸可以具有修饰，例如，在本文第XIII部分中存在的修饰。

2)crRNA旗杆区：

旗杆含有来自crRNA和tracr二者的部分。crRNA旗杆区与tracr的一部分互补，并且在一个实施方案中，与tracr的一部分具有足够互补性，以在至少一些生理条件(例如，正常生理条件下)形成双链体区域。在一个实施方案中，crRNA旗杆区具有5至30个核苷酸长度。在一个实施方案中，crRNA旗杆区具有5至25个核苷酸长度。crRNA旗杆区可以与来自细菌CRISPR阵列的重复序列的天然存在部分共有同源性或从其衍生。在一个实施方案中，它与本文公开的crRNA旗杆区(例如，化脓性链球菌或嗜热链球菌crRNA旗杆区)具有至少50％同源性。

在一个实施方案中，旗杆(例如，crRNA旗杆区)包含SEQ ID NO:6584。在一个实施方案中，旗杆(例如，crRNA旗杆区)包含与SEQ ID NO:6584具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列。在一个实施方案中，旗杆(例如，crRNA旗杆区)包含SEQ ID NO:6584的至少5、6、7、8、9、10或11个核苷酸。在一个实施方案中，旗杆(例如，crRNA旗杆区)包含SEQ ID NO:6585。在一个实施方案中，旗杆包含与SEQ ID NO:6585具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列。在一个实施方案中，旗杆(例如，crRNA旗杆区)包含SEQ ID NO:6585的至少5、6、7、8、9、10或11核苷酸。

该结构域的一些或全部核苷酸可以具有修饰，例如，在本文第XIII部分中所述的修饰。

3)第一旗杆延长部分

当使用包含第一tracr延长部分的tracr时，crRNA可以包含第一旗杆延长部分。通常，可以使用任何第一旗杆延长部分和第一tracr延长部分，前提是它们互补。在实施方案中，第一旗杆延长部分和第一tracr延长部分由3、4、5、6、7、8、9、10或更多个互补核苷酸组成。

第一旗杆延长部分可以包含与第一tracr延长部分的核苷酸互补，例如，80％、85％、90％、95％或99％，例如，完全互补的核苷酸。在一些方面，与第一tracr延长部分的互补核苷酸杂交的第一旗杆延长部分核苷酸是连续的。在一些方面，与第一tracr延长部分的互补核苷酸杂交的第一旗杆延长部分核苷酸是不连续的，包含两个或更多个由不与第一tracr延长部分的核苷酸发生碱基配对的核苷酸分隔的杂交区域。在一些方面，第一旗杆延长部分包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核苷酸。在一些方面，第一旗杆延长部分从5’至3’包含：UGCUG(SEQ ID NO:6586)。在一些方面，第一旗杆延长部分由SEQ ID NO:6586组成。在一些方面，第一旗杆延长部分包含与SEQ ID NO:6586至少80％、85％、90％、95％或99％同源的核酸。

第一tracr延长部分的一些或全部核苷酸可以具有修饰例如，在本文第XIII部分中存在的修饰。

3)环

环起到将sgRNA的crRNA旗杆区(或任选地第一旗杆延长部分，当存在时)与tracr(或任选地第一tracr延长部分，当存在时)连接的作用。环可以共价地或非共价地连接crRNA旗杆区和tracr。在一个实施方案中，键为共价的。在一个实施方案中，环共价地偶联crRNA旗杆区和tracr。在一个实施方案中，环共价地偶联第一旗杆延长部分和第一tracr延长部分。在一个实施方案中，环是或包含间插在crRNA旗杆区和与crRNA旗杆区杂交的tracr结构域之间的共价键。一般，环包含一个或多个，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。

在dgRNA分子中，二个分子可以通过至少crRNA的一部分(例如，crRNA旗杆区)和至少tracr的一部分(例如，与crRNA旗杆区互补的tracr结构域)之间的杂交作用缔合。

多种类型的环适用于sgRNA中。环可以由共价键组成，或短至一个或数个核苷酸，例如，1、2、3、4或5个核苷酸长度。在一个实施方案中，环具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸长度。在一个实施方案中，环具有2至50、2至40、2至30、2至20、2至10或2至5个核苷酸长度。在一个实施方案中，环与天然存在的序列共有同源性或衍生自其中。在一个实施方案中，环与本文公开的环具有至少50％同源性。在一个实施方案中，环包含SEQ ID NO:6588。

该结构域的一些或全部核苷酸可以具有修饰，例如，在本文第XIII部分中所述的修饰。

4)第二旗杆延长部分

在一个实施方案中，dgRNA可以包含crRNA旗杆区3'的附加序列或，存在第一旗杆延长部分时，其在本文中称作第二旗杆延长部分。在一个实施方案中，第二旗杆延长部分具有2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5或2-4个核苷酸长度。在一个实施方案中，第二旗杆延长部分具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸长度。在一个实施方案中，第二旗杆延长部分包含SEQ ID NO:6587。

5)Tracr：

tracr是核酸酶(例如，Cas9)结合作用所要求的核酸序列。不受理论约束，认为每个Cas9物种与特定的tracr序列缔合。Tracr序列用于sgRNA系统和dgRNA系统中。在一个实施方案中，tracr包含来自或衍生自化脓性链球菌tracr的序列。在一些方面，tracr具有与crRNA的旗杆部分杂交的部分，例如，与crRNA旗杆区具有足够互补性，以在至少一些生理条件下形成双链体区域(有时在本文中称作tracr旗杆区或与crRNA旗杆区互补的tracr结构域)。在实施方案中，与crRNA旗杆区杂交的tracr结构域包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与crRNA旗杆区的互补核苷酸杂交的核苷酸。在一些方面，与crRNA旗杆区的互补核苷酸杂交的tracr核苷酸是连续的。在一些方面，与crRNA旗杆区的互补核苷酸杂交的tracr核苷酸是不连续的，包含两个或更多个由不与crRNA旗杆区的核苷酸发生碱基配对的核苷酸分隔的杂交区域。在一些方面，与crRNA旗杆区杂交的tracr部分从5’至3’包含：UAGCAAGUUAAAA(SEQ ID NO:6597)。在一些方面，与crRNA旗杆区杂交的tracr部分从5’至3’包含：UAGCAAGUUUAAA(SEQ ID NO:6598)。在实施方案中，与crRNA旗杆区杂交的序列相对于额外结合核酸酶(例如，Cas分子，例如，Cas9分子)的tracr序列的5’设置在tracr上。

tracr还包含额外与核酸酶(例如，Cas分子，例如，Cas9分子)结合的结构域。不受理论约束，认为来自不同物种的Cas9与不同的tracr序列结合。在一些方面，tracr包含与化脓性链球菌Cas9分子结合的序列。在一些方面，tracr包含与本文公开的Cas9分子结合的序列。在一些方面，额外结合Cas9分子的结构域从5’至3’包含：UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6599)。在一些方面，额外结合Cas9分子的结构域从5’至3’包含：UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:6600)。

在一些实施方案中，tracr包含SEQ ID NO:6589。在一些实施方案中，tracr包含SEQ ID NO:6590。

tracr的一些或全部核苷酸可以具有修饰，例如，在本文第XIII部分中存在的修饰。在实施方案中，gRNA(例如，sgRNA或dgRNA的tracr和/或crRNA)，例如，上文描述的任何gRNA或gRNA组分，在gRNA的5'端，3’端或5’端和3’端包含反转的非碱基残基。在实施方案中，gRNA(例如，sgRNA或dgRNA的tracr和/或crRNA)，例如，上文描述的任何gRNA或gRNA组分，在多核苷酸5'端包含一个或多个在残基之间的硫代磷酸酯键，例如，在头两个5’残基之间、在头三个5’残基的每者之间、在头四个5’残基的每者之间或在头五个5’残基的每者之间的硫代磷酸酯键。在实施方案中，gRNA或gRNA组分可以交替或额外地在多核苷酸3'端包含一个或多个在残基之间的硫代磷酸酯键，例如，在头两个3’残基之间、在头三个3’残基的每者之间、在头四个3’残基的每者之间或在头五个3’残基的每者之间的硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，gRNA(例如，sgRNA或dgRNA的tracr和/或crRNA)，例如，上文描述的任何gRNA或gRNA组分，包含在头四个5’残基的每者之间的硫代磷酸酯键(例如，在5'末端包含三个硫代磷酸酯键，例如，由其组成)，和在头四个3’残基的每者之间的硫代磷酸酯键(例如，在3'端包含三个硫代磷酸酯键，例如，由其组成)。在一个实施方案中，上文描述的任何硫代磷酸酯修饰与多核苷酸的5'端、3’端或5’端和3’端的倒转非碱基残基组合。在这类实施方案中，倒转非碱基核苷酸可以通过磷酸酯键或硫代磷酸酯键连接至5’和/或3’核苷酸。在实施方案中，gRNA(例如，sgRNA或dgRNA的tracr和/或crRNA)，例如，上文描述的任何gRNA或gRNA组分，包含一个或多个包含2’O-甲基修饰的核苷酸。在实施方案中，头1、2、3或更多个5’残基各自包含2’O-甲基修饰。在实施方案中，头1、2、3或更多个3’残基各自包含2’O-甲基修饰。在实施方案中，倒数第4末端、倒数第3末端和倒数第2末端3’残基包含2’O-甲基修饰。在实施方案中，头1、2、3或更多个5’残基各自包含2’O-甲基修饰，并且头1、2、3或更多个3’残基各自包含2’O-甲基修饰。在一个实施方案中，头3个5’残基各自包含2’O-甲基修饰，并且头3个3’残基各自包含2’O-甲基修饰。在实施方案中，头3个5’残基各自包含2’O-甲基修饰，并且倒数第4末端、倒数第3末端和倒数第2末端3’残基包含2’O-甲基修饰。在实施方案中，任何2’O-甲基修饰(例如，如上文所述)可以与一个或多个硫代磷酸酯修饰(例如，如上文所述)和/或一个或多个倒转非碱基修饰(例如，如上文所述)组合。在一个实施方案中，gRNA(例如，sgRNA或dgRNA的tracr和/或crRNA)，例如，上文描述的任何gRNA或gRNA组分，包含在头四个5’残基的每者之间的硫代磷酸酯键，例如，由其组成(例如，在多核苷酸的5'端包含三个硫代磷酸酯键，例如，由其组成)，和在头四个3’残基的每者之间的硫代磷酸酯键，例如，由其组成(例如，在多核苷酸的5'端包含三个硫代磷酸酯键，例如，由其组成)、在头三个5’残基的每者处的2’O-甲基修饰和在头三个3’残基的每者处的2’O-甲基修饰。在一个实施方案中，gRNA(例如，sgRNA或dgRNA的tracr和/或crRNA)，例如，上文描述的任何gRNA或gRNA组分，包含在头四个5’残基的每者之间的硫代磷酸酯键，例如，由其组成(例如，在多核苷酸的5'端包含三个硫代磷酸酯键，例如，由其组成)，和在头四个3’残基的每者之间的硫代磷酸酯键，例如，由其组成(例如，在多核苷酸的5'端包含三个硫代磷酸酯键，例如，由其组成)、在头三个5’残基的每者处的2’O-甲基修饰和在倒数第4末端、倒数第3末端和倒数第2末端3’残基的每者处的2’O-甲基修饰。

在一个实施方案中，gRNA(例如，sgRNA或dgRNA的tracr和/或crRNA)，例如，上文描述的任何gRNA或gRNA组分，包含在头四个5’残基的每者之间的硫代磷酸酯键，例如，由其组成(例如，在多核苷酸的5'末端包含三个硫代磷酸酯键，例如，由其组成)，和在头四个3’残基的每者之间的硫代磷酸酯键，例如，由其组成(例如，在多核苷酸的5'端包含三个硫代磷酸酯键，例如，由其组成)、在头三个5’残基的每者处的2’O-甲基修饰、在头三个3’残基的每者处的2’O-甲基修饰和在5’端和3’端的每者处的附加倒转非碱基残基。

在一个实施方案中，gRNA(例如，sgRNA或dgRNA的tracr和/或crRNA)，例如，上文描述的任何gRNA或gRNA组分，包含在头四个5’残基的每者之间的硫代磷酸酯键，例如，由其组成(例如，在多核苷酸的5'端包含三个硫代磷酸酯键，例如，由其组成)，和在头四个3’残基的每者之间的硫代磷酸酯键，例如，由其组成(例如，在多核苷酸的5'端包含三个硫代磷酸酯键，例如，由其组成)、在头三个5’残基的每者处的2’O-甲基修饰和在倒数第4末端、倒数第3末端和倒数第2末端3’残基的每者处的2’O-甲基修饰及在5’端和3’端的每者处的附加倒转非碱基残基。

在实施方案中，gRNA是dgRNA并且包含如下，例如，由其组成：

crRNA：

mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU(SEQ ID NO:10797)，其中m表示具有2'O-甲基修饰的碱基，*表示硫代磷酸酯键，并且N表示(例如，如本文所述的)导引结构域的残基(任选地在5’末端和/或3’末端具有倒转非碱基残基)；和

tracr：

AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)(任选地在5’末端和/或3’末端具有倒转非碱基残基)。

在实施方案中，gRNA是dgRNA并且包含如下，例如，由其组成：

crRNA：

mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU(SEQ ID NO:10797)，其中m表示具有2'O-甲基修饰的碱基，*表示硫代磷酸酯键，并且N表示(例如，如本文所述的)导引结构域的残基(任选地在5’末端和/或3’末端具有倒转非碱基残基)；和

tracr：

mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:10798)，其中m表示具有2'O-甲基修饰的碱基，*表示硫代磷酸酯键，并且N表示导引结构域的残基(任选地在5’末端和/或3’末端具有倒转非碱基残基)。

在实施方案中，gRNA是dgRNA并且包含如下，例如，由其组成：

crRNA：

mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:)，其中m表示具有2'O-甲基修饰的碱基，*表示硫代磷酸酯键，并且N表示(例如，如本文所述的)导引结构域的残基(任选地在5’末端和/或3’末端具有倒转非碱基残基)；和

tracr：

AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)(任选地在5’末端和/或3’末端具有倒转非碱基残基)。

在实施方案中，gRNA是dgRNA并且包含如下，例如，由其组成：

crRNA：

mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:)，其中m表示具有2'O-甲基修饰的碱基，*表示硫代磷酸酯键，并且N表示(例如，如本文所述的)导引结构域的残基(任选地在5’末端和/或3’末端具有倒转非碱基残基)；和

tracr：

mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:10798)，其中m表示具有2'O-甲基修饰的碱基并且*表示硫代磷酸酯键(任选地在5’末端和/或3’末端具有倒转非碱基残基)。

在实施方案中，gRNA是sgRNA并且包含如下，例如，由其组成：

mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:10799)，其中m表示具有2'O-甲基修饰的碱基，*表示硫代磷酸酯键，并且N’s表示(例如，如本文所述的)导引结构域的残基(任选地在5’末端和/或3’末端具有倒转非碱基残基)。

在实施方案中，gRNA是sgRNA并且包含如下，例如，由其组成：

mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U，其中m表示具有2'O-甲基修饰的碱基，*表示硫代磷酸酯键，并且N’s表示(例如，如本文所述的)导引结构域的残基(任选地在5’末端和/或3’末端具有倒转非碱基残基)。

6)第一tracr延长部分

其中gRNA包含第一旗杆延长部分，tracr可以包含第一tracr延长部分。第一tracr延长部分可以包含与第一旗杆延长部分的核苷酸互补，例如，80％、85％、90％、95％或99％，例如，完全互补的核苷酸。在一些方面，与第一旗杆延长部分的互补核苷酸杂交的第一tracr延长部分核苷酸是连续的。在一些方面，与第一旗杆延长部分的互补核苷酸杂交的第一tracr延长部分核苷酸是不连续的，包含两个或更个由不与第一旗杆延长部分的核苷酸发生碱基配对的核苷酸分隔的杂交区域。在一些方面，第一tracr延长部分包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核苷酸。在一些方面，第一tracr延长部分包含SEQ ID NO:6591。在一些方面，第一tracr延长部分包含与SEQ ID NO:6591至少80％、85％、90％、95％或99％同源的核酸。

第一tracr延长部分的一些或全部核苷酸可以具有修饰例如，在本文第XIII部分中存在的修饰。

在一些实施方案中，sgRNA可以从5’至3’包含在导引结构域的3’设置的以下序列：

a)

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6601)；

b)

GUUUAAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6602)；

c)

GUUUUAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6603)；

d)

GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6604)；

e)以上a)至d)的任意项，在3'端还包含至少1、2、3、4、5、6或7个尿嘧啶(U)核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6或7个尿嘧啶(U)核苷酸；

f)以上a)至d)的任意项，在3'端还包含至少1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸；或

g)以上a)至f)的任一项，在5'端(例如，在5'末端，例如导引结构域的5')还包含至少1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的sgRNA从5’至3’包含以下序列，例如，由其组成：[导引结构域]-

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7811)。

在一个实施方案中，本发明的sgRNA从5’至3’包含以下序列，例如，由其组成：[导引结构域]-

GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7807)。

在实施方案中，以上a)至g)的任一项直接设置在导引结构域的3’。

在一些实施方案中，dgRNA可以包含：

crRNA，其从5’至3’包含以下序列，所述序列优选直接设置在导引结构域的3’：

a)GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO:6584)；

b)GUUUAAGAGCUA(SEQ ID NO:6585)；

c)GUUUUAGAGCUAUGCUG(SEQ ID NO:6605)；

d)GUUUAAGAGCUAUGCUG(SEQ ID NO:6606)；

e)GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:6607)；

f)GUUUAAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:6608)；或

g)GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO:7806):

和tracr，其从5’至3’包含：

a)

UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6589)；

b)

UAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6590)；

c)

CAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6609)；

d)

CAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:6610)；

e)

AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)；

f)

AACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6661)；

g)

GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7807)；

h)

AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO:7808)；

i)

GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO:7809)；

j)

AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:7820)；

k)以上a)至j)的任一项，在3'端还包含至少1、2、3、4、5、6或7个尿嘧啶(U)核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6或7个尿嘧啶(U)核苷酸；

l)以上a)至j)的任一项，在3'端还包含至少1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸；或

m)以上a)至l)的任一项，在5'端(例如，在5'末端)还包含至少1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸。

在一个实施方案中，例如，若U6启动子用于转录，则以上k)的序列包含3'序列UUUUUU。在一个实施方案中，例如，若HI启动子用于转录，则以上k)的序列包含3'序列UUUU。在一个实施方案中，例如，取决于所用pol-III启动子的终止信号，则以上k)的序列包含可变数目的3'U。在一个实施方案中，如果使用T7启动子，则以上k)的序列包含衍生自DNA模板的可变3'序列。在一个实施方案中，例如，如果体外转录用来产生RNA分子，则以上k)的序列包含衍生自DNA模板的可变3'序列。在一个实施方案中，例如，如果pol-II启动子用来驱动转录，则以上k)的序列包含衍生自DNA模板的可变3'序列。

在一个实施方案中，crRNA包含SEQ ID NO:6607，并且tracr包含AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)，例如，由其组成。

在一个实施方案中，crRNA包含SEQ ID NO:6608，并且tracr包含AACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6661)，例如，由其组成。

在一个实施方案中，crRNA包含导引结构域(例如，由其组成)和在导引结构域的3’设置(例如，直接在导引结构域的3’设置)的序列，所述序列包含GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO:7806)(例如，由其组成)，以及tracr包含(例如，由其组成)GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7807)。

在一个实施方案中，crRNA包含导引结构域(例如，由其组成)和在导引结构域的3’设置(例如，直接在导引结构域的3’设置)的序列，所述序列包含GUUUUAGAGCUAUGCU(SEQ ID NO:7806)(例如，由其组成)，以及tracr包含(例如，由其组成)AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO:7808)。

在一个实施方案中，crRNA包含导引结构域(例如，由其组成)和在导引结构域的3’设置(例如，直接在导引结构域的3’设置)的序列，所述序列包含GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:6607)(例如，由其组成)，以及tracr包含(例如，由其组成)GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO:7809)。

7)可用于改变同种异体T细胞靶、抑制性分子和/或抑制性分子下游效应物的表达的导引结构域

下表中提供用于本发明组合物和方法中(例如，用于改变同种异体T细胞靶基因、抑制性分子基因和/或抑制性分子基因下游效应物表达或改变这些基因)的gRNA分子导引结构域。

表1：针对示例性同种异体T细胞靶的gRNA导引结构域

表2：示例性抑制性分子的gRNA导引结构域

下表中描述了可用于本发明组合物和方法中的示例性优选的gRNA导引结构域。

表3：针对人B2M的gRNA导引结构域

在本发明的多个方面，gRNA分子可以包含上文所列的导引结构域。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00465的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00443的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00445的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00444的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00449的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00442的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00453的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00461的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00439的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00452的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00455的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00463的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00467的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00466的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00446的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00440的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00454的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00460的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00438的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR00439的导引结构域，例如，由其组成。这类gRNA分子及其组合适用于例如，本文所述的本发明CRISPR系统、方法和细胞和其他方面中。

表4：人T细胞受体α(TRAC)的gRNA导引结构域序列

在本发明的多个方面，gRNA分子可以包含上文所列的导引结构域。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000961的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000977的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000984的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000993的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000981的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000992的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000986的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000963的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000985的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000966的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000990的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000978的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000991的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000983的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000960的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR001002的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR001000的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR001009的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR001011的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR001012的导引结构域，例如，由其组成。这类gRNA分子及其组合适用于例如，本文所述的本发明CRISPR系统、方法和细胞和其他方面中。

表5：人T细胞受体Β(恒定结构域1和恒定结构域2)的gRNA导引结构域

在本发明的多个方面，gRNA分子可以包含上文所列的导引结构域。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000823的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000798的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000810的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000800的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000815的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000812的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000813的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000816的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000807的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000811的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000791的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000809的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000817的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000819的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000814的导引结构域，例如，由其组成。这类gRNA分子及其组合适用于例如，本文所述的本发明CRISPR系统、方法和细胞和其他方面中。

表6：针对人PDCD1的gRNA导引结构域

在本发明的多个方面，gRNA分子可以包含上文所列的导引结构域。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000847的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000902的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000852的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000826的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000904的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000839的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000828的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000835的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000829的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000879的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000870的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000831的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000848的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000855的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR000838的导引结构域，例如，由其组成。这类gRNA分子及其组合适用于例如，本文所述的本发明CRISPR系统、方法和细胞和其他方面中。

表6b：针对人FKBP1A的gRNA导引结构域

在本发明的多个方面，gRNA分子可以包含上文所列的导引结构域。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002100的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002097的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002091的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002085的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002086的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002089的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002088的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002095的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002096的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002080的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002109的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002112的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002110的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002108的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002104的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002115的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002116的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002087的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002107的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002113的导引结构域，例如，由其组成。这类gRNA分子(包括其组合)适用于例如，本文所述的本发明CRISPR系统、方法和细胞和其他方面中。

表6c：针对人CIITA的gRNA导引结构域

在本发明的多个方面，gRNA分子可以包含上文所列的导引结构域。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002939的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002940的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002941的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002942的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002943的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002944的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002945的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002946的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002947的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002948的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002949的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002950的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002951的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002952的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002953的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002954的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002955的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002956的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002957的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002958的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002959的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002960的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002961的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002962的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002963的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002964的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002965的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002966的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002967的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002968的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002969的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002970的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002971的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002972的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002973的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002974的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002975的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002976的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002977的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002978的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002979的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002980的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002981的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002982的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002983的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002984的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002985的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002986的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002987的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002988的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002989的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002990的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002991的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002992的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002993的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002994的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002995的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002996的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002997的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002998的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR002999的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003000的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003001的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003002的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003003的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003004的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003005的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003006的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003007的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003008的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003009的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003010的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003011的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003012的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003013的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003014的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003015的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003016的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003017的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003018的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003019的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003020的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003021的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003022的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003023的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003024的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003025的导引结构域，例如，由其组成。在一个实施方案中，本发明gRNA的导引结构域包含CR003026的导引结构域，例如，由其组成。这类gRNA分子及其组合适用于例如，本文所述的本发明CRISPR系统、方法和细胞和其他方面中。

表6d.人LILRB1(NK抑制性分子的示例性靶)的导引结构域。

表6e.靶向CD3E的gRNA分子的示例性优选导引结构域

表6f.靶向CD3G的gRNA分子的示例性优选导引结构域

表6g.靶向CD3D的gRNA分子的示例性优选导引结构域

在本发明的多个方面，在本发明的CRISPR系统、方法、细胞和其他方面和实施方案(及其组合)中，包括在涉及多于一种例如本文所述的gRNA分子的方面，使用包含CR00961的导引结构域(SEQ ID NO:5569，下方加下划线，或其修饰形式(也如下文加下划线))的针对TRAC的gRNA，例如，下文描述的gRNA分子之一：

sgRNA CR00961#1:

AGAGUCUCUCAGCUGGUACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7833)

sgRNA CR00961#2:

mA*mG*mA*GUCUCUCAGCUGGUACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:7834)

sgRNA CR00961#3:

mA*mG*mA*GUCUCUCAGCUGGUACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO:7835)

dgRNA CR00961#1:

crRNA:AGAGUCUCUCAGCUGGUACAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:7836)

tracr:

AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)

dgRNA CR00961#2:

crRNA:

mA*mG*mA*GUCUCUCAGCUGGUACAGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7837)

tracr:

mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:10798)

dgRNA CR00961#3:

crRNA:mA*mG*mA*GUCUCUCAGCUGGUACAGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7837)

tracr:

AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)。

在本发明的多个方面，在本发明的CRISPR系统、方法、细胞和其他方面和实施方案(及其组合)中，包括在涉及多于一种例如本文所述的gRNA分子的方面，使用包含CR00984的导引结构域(SEQ ID NO:5592，下方加下划线，或其修饰形式(也如下文加下划线))的针对TRAC的gRNA，例如，下文描述的gRNA分子之一：

sgRNA CR00984#1：

UUCGGAACCCAAUCACUGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7838)

sgRNA CR00984#2：

mU*mU*mC*GGAACCCAAUCACUGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:7839)

sgRNA CR00984#3：

mU*mU*mC*GGAACCCAAUCACUGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO:7840)

dgRNA CR00984#1：

crRNA：UUCGGAACCCAAUCACUGACGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:7841)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)

dgRNA CR00984#2：

crRNA：mU*mU*mC*GGAACCCAAUCACUGACGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7842)

tracr：mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQID NO:10798)

dgRNA CR00984#3：

crRNA：mU*mU*mC*GGAACCCAAUCACUGACGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7842)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)。

在本发明的多个方面，在本发明的CRISPR系统、方法、细胞和其他方面和实施方案(及其组合)中，包括在涉及多于一种例如本文所述的gRNA分子的方面，使用包含CR00798的导引结构域(SEQ ID NO:5694，下方加下划线，或其修饰形式(也如下文加下划线))的针对TRBC的gRNA，例如，下文描述的gRNA分子之一：

sgRNA CR00798#1：

UGGCUCAAACACAGCGACCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7843)

sgRNA CR00798#2：

mU*mG*mG*CUCAAACACAGCGACCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:7844)

sgRNA CR00798#3：

mU*mG*mG*CUCAAACACAGCGACCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO:7845)

dgRNA CR00798#1：

crRNA：UGGCUCAAACACAGCGACCUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:7846)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)

dgRNA CR00798#2：

crRNA：mU*mG*mG*CUCAAACACAGCGACCUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7847)

tracr：mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQID NO:10798)

dgRNA CR00798#3：

crRNA：mU*mG*mG*CUCAAACACAGCGACCUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7847)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)。

在本发明的多个方面，在本发明的CRISPR系统、方法、细胞和其他方面和实施方案(及其组合)中，包括在涉及多于一种例如本文所述的gRNA分子的方面，使用包含CR00823的导引结构域(SEQ ID NO:5719，下方加下划线，或其修饰形式(也如下文加下划线))的针对TRBC的gRNA，例如，下文描述的gRNA分子之一：

sgRNA CR00823#1：

UCCCUAGCAAGAUCUCAUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7848)

sgRNA CR00823#2：

mU*mC*mC*CUAGCAAGAUCUCAUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:7849)

sgRNA CR00823#3：

mU*mC*mC*CUAGCAAGAUCUCAUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO:7850)

dgRNA CR00823#1：

crRNA：UCCCUAGCAAGAUCUCAUAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:7851)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)

dgRNA CR00823#2：

crRNA：mU*mC*mC*CUAGCAAGAUCUCAUAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7852)

tracr：mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:10798)

dgRNA CR00823#3：

crRNA：mU*mC*mC*CUAGCAAGAUCUCAUAGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7852)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)。

在本发明的多个方面，在本发明的CRISPR系统、方法、细胞和其他方面和实施方案(及其组合)中，包括在涉及多于一种例如本文所述的gRNA分子的方面，使用包含CR00442的导引结构域的(SEQ ID NO:5496，下方加下划线，或其修饰形式(也如下文加下划线))针对B2M的gRNA，例如，下文描述的gRNA分子之一：

sgRNA CR00442#1：

GGCCACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7853)

sgRNA CR00442#2：

mG*mG*mC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:7854)

sgRNA CR00442#3：

mG*mG*mC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO:7855)

dgRNA CR00442#1：

crRNA：GGCCACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:7856)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)

dgRNA CR00442#2：

crRNA：mG*mG*mC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7857)

tracr：mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:10798)

dgRNA CR00442#3：

crRNA：mG*mG*mC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7857)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)。

在本发明的多个方面，在本发明的CRISPR系统、方法、细胞和其他方面和实施方案(及其组合)中，包括在涉及多于一种例如本文所述的gRNA分子的方面，使用包含CR00444的导引结构域(SEQ ID NO:5498，下方加下划线，或其修饰形式(也如下文加下划线))的针对B2M的gRNA，例如，下文描述的gRNA分子之一：

sgRNA CR00444#1：

GAGUAGCGCGAGCACAGCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7858)

sgRNA CR00444#2：

mG*mA*mU*AGCGCGAGCACAGCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:7859)

sgRNA CR00444#3：

mG*mA*mU*AGCGCGAGCACAGCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO:7860)

dgRNA CR00444#1：

crRNA：GAGUAGCGCGAGCACAGCUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:7861)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)

dgRNA CR00444#2：

crRNA：mG*mA*mU*AGCGCGAGCACAGCUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7862)

tracr：mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:10798)

dgRNA CR00444#3：

crRNA：mG*mA*mU*AGCGCGAGCACAGCUAGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7862)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)。

在本发明的多个方面，在本发明的CRISPR系统、方法、细胞和其他方面和实施方案(及其组合)中，包括在涉及多于一种例如本文所述的gRNA分子的方面，使用包含CR002097的导引结构域(SEQ ID NO:6705，下方加下划线，或其修饰形式(也如下文加下划线))的针对FKBP1A的gRNA，例如，下文描述的gRNA分子之一：

sgRNA CR002097#1：

CAAGCGCGGCCAGACCUGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7863)

sgRNA CR002097#2：

mC*mA*mA*GCGCGGCCAGACCUGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:7864)

sgRNA CR002097#3：

mC*mA*mA*GCGCGGCCAGACCUGCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO:7865)

dgRNA CR002097#1：

crRNA：CAAGCGCGGCCAGACCUGCGGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:7866)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)

dgRNA CR002097#2：

crRNA：mC*mA*mA*GCGCGGCCAGACCUGCGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7867)

tracr：mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:10798)

dgRNA CR002097#3：

crRNA：mC*mA*mA*GCGCGGCCAGACCUGCGGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7867)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)。

在本发明的多个方面，在本发明的CRISPR系统、方法、细胞和其他方面和实施方案(及其组合)中，包括在涉及多于一种例如本文所述的gRNA分子的方面，使用包含CR002100的导引结构域(SEQ ID NO:6708，下方加下划线，或其修饰形式(也如下文加下划线))的针对FKBP1A的gRNA，例如，下文描述的gRNA分子之一：

sgRNA CR002100#1：

CCGCUGGGCCCCCGACUCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:7868)

sgRNA CR002100#2：

mC*mC*mG*CUGGGCCCCCGACUCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:7869)

sgRNA CR002100#3：

mC*mC*mG*CUGGGCCCCCGACUCACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U(SEQ ID NO:7870)

dgRNA CR002100#1：

crRNA：CCGCUGGGCCCCCGACUCACGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQID NO:7871)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)

dgRNA CR002100#2：

crRNA：mC*mC*mG*CUGGGCCCCCGACUCACGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7872)

tracr：mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU(SEQID NO:10798)

dgRNA CR002100#3：

crRNA：mC*mC*mG*CUGGGCCCCCGACUCACGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG(SEQ ID NO:7872)

tracr：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)。

在上文描述的每种gRNA分子中，“*”指相邻核苷酸之间的硫代磷酸酯键，并且“mN”(其中N＝A、G、C或U)指2’-OMe修饰的核苷酸。在实施方案中，本文所述的(例如，上文描述)任何gRNA分子与(例如，如本文所述的)Cas9分子复合，以形成核糖核蛋白复合体(RNP)。这类RNP特别可用于(例如，本文所述的)的本发明方法、细胞和其他方面和实施方案中。

III.设计gRNA的方法

本文中描述了设计gRNA的方法，包括选择、设计和验证靶序列的方法。本文还提供示例性导引结构域。本文中讨论的导引结构域可以并入本文所述的gRNA中。

例如以下文献中描述了用于选择和验证靶序列以及脱靶分析的方法：Mali等人,2013 SCIENCE 339(6121):823-826；Hsu等人,2013 NAT BIOTECHNOL,31(9):827-32；Fu等人,2014 NAT BIOTECHNOL,doi:10.1038/nbt.2808。PubMed PM ID:24463574；Heigwer等人,2014 NAT METHODS ll(2):122-3.doi:10.1038/nmeth.2812。PubMed PMID:24481216；Bae等人,2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID:24463181；Xiao A等人,2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID:24389662。

例如，软件工具可以用来在用户的靶序列内部优化gRNA的选择，例如，用来最大限度减少整个基因组范围内的总脱靶活性。脱靶活性可以不同于剪切作用。对于每可能的gRNA选择，例如，使用化脓性链球菌Cas9时，该工具可以在整个基因组范围鉴定含有直至某个数目(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)的错配碱基配对的全部脱靶序列(例如，位于NAG或NGG PAM之前)。例如，使用实验推算的加权方案，可以预测每个脱靶序列处的剪切效率。每种可能的gRNA随后根据其总预测的脱靶剪切作用排序；居首排序的gRNA代表可能具有最大中靶剪切作用和最低脱靶剪切作用的那些。工具中也可以包含其他功能，例如，CRISPR构建的自动化试剂设计、中靶Surveyor分析的引物设计和高通量检测的引物设计和借助下一代测序法的脱靶剪切作用定量。可以通过已知现有技术或如本文所述的方法评价候选gRNA分子。

尽管软件算法可以用来产生潜在gRNA分子的初始清单，但切割效率和特异性将不必然地反映预测值，并且gRNA分子一般需要在特定细胞系(例如，原代人细胞系，例如，原代人免疫效应细胞，例如，原代人T细胞)中筛选，以确定例如切割效率、插入/缺失形成，切割特异性和所需表型的变化。可以通过本文所述的方法确定这些特性。

IV.Cas分子

Cas9分子

在优选的实施方案中，Cas分子是Cas9分子。多个物种的Cas9分子可以用于本文所述的方法和组合物中。尽管化脓性链球菌Cas9分子是本文公开的绝对主题，也可以使用衍生自或基于本文所列其他物种的Cas9蛋白的Cas9分子。换句话说，其他Cas9分子，例如，嗜热链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和/或脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)Cas9分子，可以用于本文所述的系统、方法和组合物中。其他的Cas9物种包括：燕麦噬酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、Actinomyces sp.,cycliphilus denitrificans、少食氨基单胞菌(Aminomonas paucivorans)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、史氏芽胞杆菌(Bacillus smithii)、苏云金芽孢杆菌(Baccillus thuringiensis)、拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)、海洋芽殖小小梨形菌(Blastopirellula marina)、慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium sp.)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus latemsporus)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、弯曲杆菌属(Campylobacterlad)、Candidatus Puniceispirillum、解纤维素梭菌(Clostridiu cellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拥挤棒状杆菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、马氏棒状杆菌(Corynebacterium matruchotii)、Dinoroseobacter sliibae、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、γ变形杆菌、固氮醋杆菌(Gluconacetobacler diazotrophicus)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、生痰嗜血杆菌(Haemophilus sputorum)、加拿大螺杆菌(Helicobacter canadensis)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、雪貂螺杆菌(Helicobacte rmustelae)、Ilyobacler polytropus、金氏金氏菌(Kingella kingae)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)、单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、李斯特菌科(Listeriaceae)细菌、甲基孢囊菌属物种(Methylocystis sp.)、发孢甲基弯曲菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)、杆状奈瑟氏菌(Neisseria bacilliformis)、灰奈瑟氏菌(Neisseria cinerea)、黄色奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)、奈瑟氏菌属物种(Neisseria sp.)、Neisseria wadsworthii、亚硝化单胞菌属物种(Nitrosomonas sp.)、Parvibaculum lavamentivorans、多杀巴斯德菌、Phascolarctobacterium succinatutens、丁香罗尔斯顿菌(Ralstonia syzygii)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌属物种(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单胞菌属物种(Sphingomonas sp.)、葡萄园芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus vineae)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、链球菌属物种(streptococcus sp.)、Subdoligranulum sp.、Tislrella mobilis、密螺旋体属(Treponema sp.)或Verminephrobacter eiseniae。

如该术语在本文中所用那样，Cas9分子指可以与gRNA分子(例如，tracr的某结构域的序列)相互作用并且与gRNA分子配合定位到(例如，靶向或归巢)到包含靶序列和PAM序列的位点上的分子。

在一个实施方案中，Cas9分子能够切割靶核酸分子，这可以在本文中称作活性Cas9分子。在一个实施方案中，活性Cas9分子，包含以下一个或多个活性：切刻酶活性，即，切割核酸分子单条链(例如，非互补链或互补链)的能力；双链核酸酶活性，即，切割双链核酸的两条链并产生双链断口的能力(在一个实施方案中为存在二种切刻酶活性)；核酸内切酶活性；核酸外切酶活性；和解旋酶活性，即，解开双链核酸的螺旋结构的能力。

在一个实施方案中，有酶促活性的Cas9分子切割两条DNA链并产生双链断口。在一个实施方案中，Cas9分子仅切割一条链，例如，gRNA杂交的链或与gRNA杂交的链互补的链。在一个实施方案中，活性Cas9分子包含与HNH样结构域相关的切割活性。在一个实施方案中，活性Cas9分子包含与N末端RuvC样结构域相关的切割活性。在一个实施方案中，活性Cas9分子包含与HNH样结构域相关的切割活性和与N末端RuvC样结构域相关的切割活性。在一个实施方案中，活性Cas9分子包含活性或有剪切能力的HNH样结构域和无活性或无剪切能力的N末端RuvC样结构域。在一个实施方案中，活性Cas9分子包含无活性或无剪切能力的HNH样结构域和活性或有剪切能力的N末端RuvC样结构域。

在一个实施方案中，活性Cas9分子相互作用于并切割靶核酸的能力是PAM序列依赖的。PAM序列是靶核酸中的序列。在一个实施方案中，靶核酸切割从PAM序列上游发生。来自不同细菌物种的活性Cas9分子可以识别不同的序列基序(例如，PAM序列)。在一个实施方案中，化脓性链球菌的活性Cas9分子识别序列基序NGG并指导从该序列上游1至10(例如，3至5个)碱基对切割靶核酸序列。参见，例如，Mali等人,SCIENCE 2013；339(6121):823-826。在一个实施方案中，嗜热链球菌的活性Cas9分子识别序列基序NGGNG和NNAG AAW(W＝A或T)并指导从这些序列上游1至10(例如，3至5个)碱基对切割核心靶核酸序列。参见，例如，Horvath等人,SCIENCE 2010；327(5962):167-170和Deveau等人,J BACTERIOL 2008；190(4):1390-1400。在一个实施方案中，变形链球菌(S.mulans)的活性Cas9分子识别序列基序NGG或NAAR(R-A或G)并指导从该序列上游1至10(例如，3至5个)碱基对切割核心靶核酸序列。参见，例如，Deveau等人,J BACTERIOL 2008；190(4):1 390-1400。

在一个实施方案中，金黄色葡萄球菌的活性Cas9分子识别序列基序NNGRR(R＝A或G)并指导从该序列上游1至10(例如，3至5个)碱基对切割靶核酸序列。参见，例如，Ran F.等人,NATURE,vol.520,2015,第186-191页。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟菌的活性Cas9分子识别序列基序NNNNGATT并指导从该序列上游1至10(例如，3至5个)碱基对切割靶核酸序列。参见，例如Hou等人,PNAS EARLY EDITION 2013,1-6.例如，使用Jinek等人,SCIENCE 2012,337:816中描述的转化测定法，可以确定Cas9分子识别PAM序列的能力。

一些Cas9分子具有与gRNA分子相互作用并连同gRNA分子一起归巢(例如，导引或定位)至核心靶结构域的能力，但不能够切割靶核酸或不能够以高效速率切割。没有或基本上没有切割活性的Cas9分子可以在本文中称作无活性Cas9(无酶促活性的Cas9)、死Cas9或dCas9分子。例如，无活性Cas9分子可以缺少切割活性或具有明显更小的活性，例如，小于20％、10％、5％、1％或0.1％的参考Cas9分子切割活性，如通过本文所述的测定法所测量。

Chylinski等人RNA Biology 2013；10:5,727-737中描述了示例性天然存在的Cas9分子。这类Cas9分子包括簇集1细菌家族、簇集2细菌家族、簇集3细菌家族、簇集4细菌家族、簇集5细菌家族、簇集6细菌家族、簇集7细菌家族、簇集8细菌家族、簇集9细菌家族、簇集10细菌家族、簇集11细菌家族、簇集12细菌家族、簇集13细菌家族、簇集14细菌家族、簇集1细菌家族、簇集16细菌家族、簇集17细菌家族、簇集18细菌家族、簇集19细菌家族、簇集20细菌家族、簇集21细菌家族、簇集22细菌家族、簇集23细菌家族、簇集24细菌家族、簇集25细菌家族、簇集26细菌家族、簇集27细菌家族、簇集28细菌家族、簇集29细菌家族、簇集30细菌家族、簇集31细菌家族、簇集32细菌家族、簇集33细菌家族、簇集34细菌家族、簇集35细菌家族、簇集36细菌家族、簇集37细菌家族、簇集38细菌家族、簇集39细菌家族、簇集40细菌家族、簇集41细菌家族、簇集42细菌家族、簇集43细菌家族、簇集44细菌家族、簇集45细菌家族、簇集46细菌家族、簇集47细菌家族、簇集48细菌家族、簇集49细菌家族、簇集50细菌家族、簇集51细菌家族、簇集52细菌家族、簇集53细菌家族、簇集54细菌家族、簇集55细菌家族、簇集56细菌家族、簇集57细菌家族、簇集58细菌家族、簇集59细菌家族、簇集60细菌家族、簇集61细菌家族、簇集62细菌家族、簇集63细菌家族、簇集64细菌家族、簇集65细菌家族、簇集66细菌家族、簇集67细菌家族、簇集68细菌家族、簇集69细菌家族、簇集70细菌家族、簇集71细菌家族、簇集72细菌家族、簇集73细菌家族、簇集74细菌家族、簇集75细菌家族、簇集76细菌家族、簇集77细菌家族或簇集78细菌家族的Cas9分子。

示例性天然存在的Cas9分子包括簇集1细菌家族的Cas9分子。例子包括以下物种的Cas9分子：化脓性链球菌(例如，菌株SF370、MGAS 10270、MGAS 10750、MGAS2096、MGAS315、MGAS5005、MGAS6180、MGAS9429、NZ131和SSI-1)、嗜热链球菌(例如，菌株LMD-9)、假豕链球菌(S.pseudoporcinus)(例如，菌株SPIN20026)、变形链球菌(例如，菌株UA159、NN2025)、猕猴链球菌(S.macacae)(例如，菌株NCTC 11558)、S.gallolylicus(例如，菌株UCN34、ATCC BAA-2069)、马链球菌(S.equines)(例如，菌株ATCC9812、MGCS 124)、停乳链球菌(S.dysdalactiae)(例如，菌株GGS124)、牛链球菌(S.bovis)(例如，菌株ATCC700338)、S.cmginosus(例如；菌株F0211)、无乳链球菌(S.agalactia)*(例如，菌株NEM316、A909)、单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(例如，菌株F6854)、无害李斯特菌(Listeria innocua)(L.innocua，例如，菌株Clip l 1262)、EtUerococcus italicus(例如，菌株DSM15952)或屎肠球菌(Enterococcus faecium)(例如，菌株1,231,408)。其他示例性Cas9分子是脑膜炎奈瑟菌Cas9分子(Hou等人,PNAS Early Edition 2013,1-6)和金黄色葡萄球菌Cas9分子。

在一个实施方案中，Cas9分子，例如，活性Cas9分子或无活性Cas9分子，包含与本文所述的任何Cas9分子序列或天然存在的Cas9分子序列(例如，来自本文所列物种或Chylinski等人,RNA Biology 2013,10:5,′I2′I-Τ,1；Hou等人,PNAS Early Edition 2013,1-6中所述的Cas9分子)具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，或99％同源性的氨基酸序列；与前述Cas9分子序列比较时，在不多于1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％，或40％的氨基酸残基处不同；与前述Cas9分子序列差异至少1、2、5、10或20个氨基酸，但差异不多于100、80、70、60、50、40或30个氨基酸；或与前述Cas9分子序列相同。

在一个实施方案中，Cas9分子包含与化脓性链球菌Cas9具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％，或99％同源性的氨基酸序列；与前者比较时，在不多于1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％，或40％的氨基酸残基处不同；与前者差异至少1、2、5、10或20个氨基酸，但差异不多于100、80、70、60、50、40或30个氨基酸；或与前者相同。

(SEQ ID NO:6611)

在实施方案中，Cas9分子是SEQ ID NO:6611的化脓性链球菌Cas9变体，所述变体包含一个或多个对带正电荷氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)的突变，所述突变在所述位置引入不带电荷的或非极性氨基酸，例如，丙氨酸。在实施方案中，突变是针对Cas9的核苷酸槽中的一个或多个带正电荷的氨基酸。在实施方案中，Cas9分子是SEQ ID NO:6611的化脓性链球菌Cas9变体，所述变体包含在SEQ ID NO:6611的位置855处的突变，例如，在SEQ ID NO:6611的位置855处成为不带电荷氨基酸(例如，丙氨酸)的突变。在实施方案中，Cas9分子仅在SEQ ID NO:6611的位置855处相对于SEQ ID NO:6611具有例如，成为不带电荷氨基酸(例如，丙氨酸)的突变。在实施方案中，Cas9分子是SEQ ID NO:6611的化脓性链球菌Cas9变体，所述变体包含在SEQ ID NO:6611的位置810处的突变、在其位置1003处的突变和/或在其位置1060处的突变，例如在SEQ ID NO:6611的位置810、位置1003和/或位置1060处成为丙氨酸的突变。在实施方案中，Cas9分子仅在SEQ ID NO:6611的位置810、位置1003和位置1060处相对于SEQ ID NO:6611具有突变，例如，其中每个突变是成为不带电荷的氨基酸，例如，丙氨酸。在实施方案中，Cas9分子是SEQ ID NO:6611的化脓性链球菌Cas9变体，所述变体包含在SEQ ID NO:6611的位置848处的突变、在其位置1003处的突变和/或在其位置1060处的突变，例如在SEQ ID NO:6611的位置848、位置1003和/或位置1060处成为丙氨酸的突变。在实施方案中，Cas9分子仅在SEQ ID NO:6611的位置848、位置1003和位置1060处相对于SEQ ID NO:6611具有突变，例如，其中每个突变是成为不带电荷的氨基酸，例如，丙氨酸。在实施方案中，Cas9分子是如Science DOI:10.1126/science.aad5227处2015年12月1日可在线获得的Slaymaker等人,Science Express中所述的Cas9分子。

在实施方案中，Cas9分子是SEQ ID NO:6611的化脓性链球菌Cas9变体，所述变体包含一个或多个突变。在实施方案中，Cas9变体包含在SEQ ID NO:6611的位置80处的突变，例如，包含在SEQ ID NO:6611的位置80处的亮氨酸(即，包含具有C80L突变的SEQ ID NO:6611，例如，由其组成)。在实施方案中，Cas9变体包含在SEQ ID NO:6611的位置574处的突变，例如，包含在SEQ ID NO:6611的位置574处的谷氨酸(即，包含具有C574E突变的SEQ ID NO:6611，例如，由其组成)。在实施方案中，Cas9变体包含在SEQ ID NO:6611的位置80处的突变和位置574处的突变，例如，包含在SEQ ID NO:6611的位置80处的亮氨酸和在SEQ ID NO:6611的位置574处的谷氨酸(即，包含具有C80L突变和C574E突变的SEQ ID NO:6611，例如，由其组成)。不受理论约束，认为这类突变改善Cas9分子的溶解特性。

在实施方案中，Cas9分子是SEQ ID NO:6611的化脓性链球菌Cas9变体，所述变体包含一个或多个突变。在实施方案中，Cas9变体包含在SEQ ID NO:6611的位置147处的突变，例如，包含在SEQ ID NO:6611的位置147处的酪氨酸(即，包含具有D147Y突变的SEQ ID NO:6611，例如，由其组成)。在实施方案中，Cas9变体包含在SEQ ID NO:6611的位置411处的突变，例如，包含在SEQ ID NO:6611的位置411处的苏氨酸(即，包含具有P411T突变的SEQ ID NO:6611，例如，由其组成)。在实施方案中，Cas9变体包含在位置147处的突变和在SEQ ID NO:6611的位置411处的突变，例如，包含在SEQ ID NO:6611的位置147处的酪氨酸和在SEQ ID NO:6611的位置411处的苏氨酸(即，包含具有D147Y突变和P411T突变的SEQ ID NO:6611，例如，由其组成)。不受理论约束，认为这类突变改善例如酵母中Cas9分子的导引效率。

在实施方案中，Cas9分子是SEQ ID NO:6611的化脓性链球菌Cas9变体，所述变体包含一个或多个突变。在实施方案中，Cas9变体包含在SEQ ID NO:6611的位置1135处的突变，例如，包含在SEQ ID NO:6611的位置1135处的谷氨酸(即，包含具有D1135E突变的SEQ ID NO:6611，例如，由其组成)。不受理论约束，认为相对于NAG PAM序列，这类突变改善Cas9分子对NGG PAM序列的选择性。

在实施方案中，Cas9分子是SEQ ID NO:6611的化脓性链球菌Cas9变体，所述变体包含一个或多个在某些位置引入不带电荷或非极性氨基酸(例如，丙氨酸)的突变。在实施方案中，Cas9分子是SEQ ID NO:6611的化脓性链球菌Cas9变体，所述变体包含在SEQ ID NO:6611的位置497处的突变、在其位置661处的突变、在其位置695处的突变和/或在其位置926处的突变，例如在SEQ ID NO:6611的位置497处、位置661、位置695和/或位置926处成为丙氨酸的突变。在实施方案中，Cas9分子仅在SEQ ID NO:6611的位置497、位置661、位置695和位置926处相对于SEQ ID NO:6611具有突变，例如，其中每个突变是成为不带电荷的氨基酸，例如，丙氨酸。不受理论约束，认为这类突变减少Cas9分子在脱靶位点的切割

应当理解本文所述的Cas9分子突变可以组合，并且可以与本文所述的任何融合或其他修饰和本文所述的测定法中受测的Cas9分子组合。

多种类型的Cas分子可以用来实施本文公开的发明。在一些实施方案中，使用II型Cas系统的Cas分子。在其他实施方案中，使用其他Cas系统的Cas分子。例如，可以使用I型或III型Cas分子。示例性Cas分子(和Cas系统)例如在Haft等人,PLoS COMPUTATIONAL BIOLOGY 2005,1(6):e60和Makarova等人,NATURE REVIEW MICROBIOLOGY 201 1,9:467-477中描述，这两篇参考文献的内容通过引用方式完整并入本文。

在一个实施方案中，Cas9分子包含以下一个或多个活性：切刻酶活性；双链切割活性(例如，核酸内切酶和/或核酸外切酶活性)；解旋酶活性；或偕同gRNA分子定位至靶核酸的能力。

改变的Cas9分子

天然存在的Cas9分子拥有众多特性，包括：切刻酶活性，核酸酶活性(例如，核酸内切酶和/或核酸外切酶活性)；解旋酶活性；与gRNA分子功能性缔合的能力；和靶向(或定位到)核酸上某位点(例如，PAM识别和特异性)的能力。在一个实施方案中，Cas9分子可以包括这些特性的全部或子类。在常见的实施方案中，Cas9分子具有与gRNA分子相互作用和与gRNA分子配合定位核酸中某位点的能力。其他活性，例如，PAM特异性、切割活性或解旋酶活性可以在Cas9分子间更广泛地变动。

可以按许多方式产生具有所需特性的Cas9分子，例如，通过改变亲本，例如，天然存在的Cas9分子，以提供改变的具有所需特性的Cas9分子。例如，可以相对于亲本Cas9分子引入一个或多个突变或差异。这类突变和差异包括：置换(例如，保守性置换或非必需氨基酸的置换)；插入；或缺失。在一个实施方案中，相对于参考Cas9分子，Cas9分子可以包含一个或多个突变或差异，例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50个突变，但是少于200、100或80个突变。

在一个实施方案中，某个突变或多个突变不显著地影响Cas9活性，例如，本文所述的Cas9活性。在一个实施方案中，某个突变或多个突变显著地影响Cas9活性，例如，本文所述的Cas9活性。在一个实施方案中，示例性活性包括以下一种或多种：PAM特异性、切割活性和解旋酶活性。突变可以存在于例如以下结构域中：一个或多个RuvC样结构域，例如，N末端RuvC样结构域；HNH样结构域；RuvC样结构域和HNH样结构域外部的区域。在一些实施方案中，突变存在于N末端RuvC样结构域中。在一些实施方案中，突变存在于HNH样结构域中。在一些实施方案中，突变存在于N末端RuvC样结构域和HNH样结构域二者中。

可以例如通过评价该突变是否保守或通过第ΠΙ部分中描述的方法，评价或预测特定序列(例如，置换)是否可以影响一种或多种活性，如导引活性，切割活性等。在一个实施方案中，如Cas9分子的语境下中使用，“非必需”氨基酸残基是可以从Cas9分子(例如，天然存在的Cas9分子，例如，活性Cas9分子)的野生型序列改变，而不消除或更优选地，基本上不改变Cas9活性(例如，切割活性)的残基，而改变“必需”氨基酸残基导致活性(例如，切割活性)基本上丧失。

PAM识别作用改变或无PAM识别作用的Cas9分子

天然存在的Cas9分子可以识别特定PAM序列，例如上文对化脓性链球菌、嗜热链球菌、变形链球菌，金黄色葡萄球菌和脑膜炎奈瑟菌所述的PAM识别序列。

在一个实施方案中，Cas9分子具有与天然存在的Cas9分子相同的PAM特异性。在其他实施方案中，Cas9分子具有与天然存在的Cas9分子不相关的PAM特异性或与对其具有最接近序列同源性的天然存在Cas9分子不相关的PAM特异性。例如，可以改变天然存在的Cas9分子，例如，旨在改变PAM识别作用，例如，旨在改变Cas9分子识别的PAM序列以减少脱靶位点和/或改善特异性；或消除PAM识别要求。在一个实施方案中，可以改变Cas9分子，例如，旨在增加PAM识别序列长度和/或改善Cas9特异性，改变到高同一性水平以减少脱靶位点并增加特异性。在一个实施方案中，PAM识别序列的长度是至少4、5、6、7、8、9、10或15个氨基酸长度。可以使用定向进化法产生识别不同PAM序列和/或脱靶活性减少的Cas9分子。可以用于Cas9分子定向进化的示例性方法和系统例如在Esvelt等人,Nature 2011,472(7344):499-503中描述。可以评价候选Cas9分子，例如，通过本文所述的方法评价。

非切割性和剪切作用经调整的Cas9分子

在一个实施方案中，Cas9分子包含与天然存在的Cas9分子不同的切割特性，例如，与具有最接近同源性的天然存在的Cas9分子不同的切割特性。例如，Cas9分子可以与天然存在的Cas9分子(例如，化脓性链球菌Cas9分子)不同如下：可以消除例如，如与天然存在的Cas9分子(例如，化脓性链球菌Cas9分子)相比，其调节(例如，减少或增加)双链断口切割作用(核酸内切酶和/或核酸外切酶活性)的能力；例如，如与天然存在的Cas9分子(例如，化脓性链球菌Cas9分子)相比，其调节(例如，减少或增加)单条核酸链(例如，核酸分子的非互补链或核酸分子互补链)切割作用(切刻酶活性)的能力；或切割核酸分子(例如，双链或单链核酸分子)的能力。

切割作用修饰的活性Cas9分子

在一个实施方案中，Cas9分子的活性包括以下一种或多种活性：与N末端RuvC样结构域相关的切割活性；与HNH样结构域相关的切割活性；与HNH结构域相关的切割活性和与N末端RuvC样结构域相关的切割活性。

在一个实施方案中，Cas9分子是Cas9切刻酶，例如，仅切割DNA单链。在一个实施方案中，Cas9切刻酶包含在SEQ ID NO:6611的位置10处的突变和/或在其位置840处的突变，例如，包含对SEQ ID NO:6611的D10A和/或H840A突变。

非切割性的无活性Cas9分子

在一个实施方案中，改变的Cas9分子是不切割核酸分子(或者双链或单链核酸分子)或以明显更低效率(例如，小于20％、10％、5％、1％或0.1％的参考Cas9分子切割活性)切割核酸分子的无活性Cas9分子，例如，如通过本文所述的测定法所测量。参考Cas9分子可以是天然存在的未修饰的Cas9分子，例如，天然存在的Cas9分子，如化脓性链球菌、嗜热链球菌、金黄色葡萄球菌或脑膜炎奈瑟菌的Cas9分子。在一个实施方案中，参考Cas9分子是具有最接近序列同一性或同源性的天然存在的Cas9分子。在一个实施方案中，无活性Cas9分子缺少明显的与N末端RuvC样结构域相关的切割活性和与HNH样结构域相关的切割活性。

在一个实施方案中，Cas9分子是dCas9。Tsai等人,(2014),Nat.Biotech.32:569-577。

无催化活性的Cas9分子可以与转录阻遏蛋白融合。无活性的Cas9融合蛋白与gRNA复合并定位至gRNA的导引结构域指定的DNA序列，但是，不同于活性Cas9，它将不切割靶DNA。效应子结构域(如转录阻遏结构域)与无活性Cas9的融合能够实现召集效应子到gRNA指定的任何DNA位点。位点特异性导引Cas9融合蛋白到基因的启动子区可以阻断或影响与启动子区结合的聚合酶，例如，Cas9与结合核酸的转录因子(例如，转录激活蛋白)和/或转录增强子的融合增加或抑制转录激活。备选地，Cas9-融合转录阻遏蛋白位点特异性导引到针对某基因启动子区可以用来减少转录激活。

可以与无活性Cas9分子融合的转录阻遏蛋白或转录阻遏蛋白结构域可以包括ruppel相关框(KRAB或SKD)、Mad mSIN3相互作用结构域(SID)或ERF阻遏蛋白结构域(ERD)。

在另一个实施方案中，无活性Cas9分子可以与修饰染色质的蛋白质融合。例如，无活性Cas9分子可以与异染色质蛋白1(HPl)、组蛋白赖氨酸甲基转移酶(例如，SUV39H 1、SUV39H2、G9A、ESET/SETDB l、Pr-SET7/8、SUV4-20H 1、RIZ1)、组蛋白赖氨酸去甲基化酶(例如，LSD1/BHC1 10、SpLsdl/Sw、l/Safl 10、Su(var)3-3、JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C/GASC1、JMJD2D、Rph l、JARID 1A/RBP2、JARI DIB/PLU-I、JAR1D 1C/SMCX、JARID1D/SMCY、Lid、Jhn2、Jmj2)、组蛋白赖氨酸脱乙酰酶(例如，HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、Rpd3、Hos l、Cir6、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9、Hdal、Cir3、SIRT 1、SIRT2、Sir2、Hst l、Hst2、Hst3、Hst4、HDAC 1 1)和DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT2a/DMNT3b、MET1)融合。无活性Cas9修饰染色质的分子融合蛋白可以用来改变染色质状态以减少靶基因表达。

异源序列(例如，转录阻遏蛋白结构域)可以与无活性Cas9蛋白的N末端或C末端融合。在一个备选实施方案中，异源序列(例如，转录阻遏蛋白结构域)可以与无活性Cas9蛋白的内部部分(即，除N末端或C末端之外的部分)融合。

可以评价Cas9分子/gRNA分子复合体结合于并切割靶核酸的能力，例如，通过本文第ΠΙ部分中所述的方法评价。也可以通过本领域熟知的方法评价单独或在含gRNA分子的复合体中的Cas9分子(例如，活性Cas9或无活性Cas9)的活性，所述方法包括基因表达测定法和基于染色质的测定法，例如，染色质免疫沉淀法(ChiP)和染色质体内测定法(CiA)。

其他Cas9分子融合物

在实施方案中，Cas9分子，例如化脓性链球菌Cas9，可以另外包含一个或多个赋予附加活性的氨基酸序列。

在一些方面，Cas9分子可以包含一个或多个核定位序列(NLS)，如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS。在一些实施方案中，Cas9分子包含在氨基端或其附近的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS、在羧基端或其附近的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS或这些情况的组合(例如在氨基端的一个或多个NLS和在羧基端的一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，每者可以独立于其他而如此选择，从而单个NLS可以按照多于一个副本存在和/或与按照多于一个副本存在的一个或多个其他NLS组合。在一些实施方案中，当NLS的最近氨基酸位于沿多肽链距N末端或C末端约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个或更多个氨基酸的范围内时，认定该NLS接近N-或C末端。一般，NLS由暴露于蛋白质表面上的带正电荷的赖氨酸或精氨酸的一个或多个短序列组成，但是已知其他类型的NLS。NLS的非限制性例子包括包含或衍生自以下的NLS序列：具有PKKKRKV(SEQ ID NO:6612)的氨基酸序列的SV40病毒大T-抗原NLS；来自核质蛋白的NLS(例如，具有序列KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:6613)的核质蛋白二重NLS)；具有氨基酸序列PAAKRVKLD(SEQ ID NO:6614)或RQRRNELKRSP(SEQ ID NO:6615)的c-myc NLS；具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:6616)的hRNPA1M9NLS；来自输入素-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:6617)；肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP(SEQ ID NO:6618)和PPKKARED(SEQ ID NO:6619)；人p53的序列PQPKKKPL(SEQ ID NO:6620)；小鼠c-ab1IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:6621)；流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQ ID NO:6622)和PKQKKRK(SEQ ID NO:6623)；肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:6624)；小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO:6625)；人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:6626)；和甾体类激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:6627)。其他合适的NLS序列是本领域已知的(例如，Sorokin,Biochemistry(Moscow)(2007)72:13,1439-1457；Lange J Biol Chem.(2007)282:8,5101-5)。

在一些方面，Cas9分子可以包含一个或多个允许特异性识别Cas9分子的氨基酸序列，例如标签。在一个实施方案中，标签是组氨酸标签，例如，包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多个组氨酸氨基酸的组氨酸标签(SEQ ID NO:10800)。在实施方案中，组氨酸标签是His6标签(六组氨酸)(SEQ ID NO:10795)。在其他实施方案中，组氨酸标签是His8标签(八组氨酸)。在实施方案中，组氨酸标签可以通过接头与Cas9分子的一个或多个其他部分隔离。在实施方案中，接头是GGS。这种融合物的例子是Cas9分子iProt106520。

在一些方面，Cas9分子可以包含蛋白酶识别的一个或多个氨基酸序列(例如，包含蛋白酶剪切位点)。在实施方案中，剪切位点是烟草蚀纹病毒(TEV)剪切位点，例如，包含序列ENLYFQG(SEQ ID NO:7810)。在一些方面，蛋白酶剪切位点，例如，TEV剪切位点设置在标签(例如，His标签，例如，His6(SEQ ID NO:10795)或His8标签(SEQ ID NO:10796))和Cas9分子的剩余部分之间。不受理论约束，认为这类引入将允许标签用于例如纯化Cas9分子，并且随后用于后续切割，从而标签不干扰Cas9分子功能。

在实施方案中，Cas9分子(例如，如本文所述的Cas9分子)包含N末端NLS和C末端NLS(例如，从N末端至C末端包含NLS-Cas9-NLS)，例如，其中每个NLS是SV40 NLS(PKKKRKV(SEQ ID NO:6612))。在实施方案中，Cas9分子(例如，如本文所述的Cas9分子)包含N末端NLS、C末端NLS和C末端His6标签(SEQ ID NO:10795)(例如，从N末端至C末端包含NLS-Cas9-NLS-His标签)，例如，其中每个NLS是SV40 NLS(PKKKRKV(SEQ ID NO:6612))。在实施方案中，Cas9分子(例如，如本文所述的Cas9分子)包含N末端His标签(例如，His6标签(SEQ ID NO:10795))、N末端NLS和C末端NLS(例如，从N末端至C末端包含His标签-NLS-Cas9-NLS)，例如，其中每个NLS是SV40 NLS(PKKKRKV(SEQ ID NO:6612))。在实施方案中，Cas9分子(例如，如本文所述的Cas9分子)包含N末端NLS和C末端His标签(例如，His6标签(SEQ ID NO:10795))(例如，从N末端至C末端包含His标签-Cas9-NLS)，例如，其中NLS是SV40 NLS(PKKKRKV(SEQ ID NO:6612))。在实施方案中，Cas9分子(例如，如本文所述的Cas9分子)包含N末端His标签(例如，His6标签(SEQ ID NO:10795))和C末端NLS(例如，从N末端至C末端包含NLS-Cas9-His标签)，例如，其中NLS是SV40 NLS(PKKKRKV(SEQ ID NO:6612))。在实施方案中，Cas9分子(例如，如本文所述的Cas9分子)包含N末端His标签(例如，His8标签(SEQ ID NO:10796))、N末端剪切结构域(例如，烟草蚀纹病毒(TEV)剪切结构域(例如，包含序列ENLYFQG(SEQ ID NO:7810)))、N末端NLS(例如，SV40 NLS；SEQ ID NO:6612)和C末端NLS(例如，SV40 NLS；SEQ ID NO:6612)(例如，从N末端至C末端包含His标签-TEV-NLS-Cas9-NLS)。在前述实施方案的任一项中，Cas9具有SEQ ID NO:6611的序列。备选地，在任一项前述实施方案，例如本文所述，Cas9具有SEQ ID NO:6611的Cas9变体的序列。在前述实施方案的任一项中，Cas9分子包含在His标签和该分子其他部分之间的接头(例如，GGS接头)。下文提供上文描述的示例性Cas9分子的氨基酸序列。“iProt”标示符匹配图60中的那些标示符。

iProt105026(也称作iProt106154，iProt106331，iProt106545，和PID426303，取决于蛋白质的制备)(SEQ ID NO:7821)：

iProt106518(SEQ ID NO:7822)：

iProt106519(SEQ ID NO:7823)：

iProt106520(SEQ ID NO:7824)：

iProt106521(SEQ ID NO:7825)：

iProt106522(SEQ ID NO:7826)：

iProt106658(SEQ ID NO:7827)：

iProt106745(SEQ ID NO:7828)：

iProt106746(SEQ ID NO:7829)：

iProt106747(SEQ ID NO:7830)：

iProt106884(SEQ ID NO:7831)：

编码Cas9分子的核酸序列

本文中提供编码Cas9分子(例如，活性Cas9分子或无活性Cas9分子)的核酸。

编码Cas9分子的示例性核酸在以下文献中描述：Cong等人,SCIENCE 2013,399(6121):819-823；Wang等人,CELL 2013,153(4):910-918；Mali等人,SCIENCE 2013,399(6121):823-826；Jinek等人,SCIENCE 2012,337(6096):816-821。

在一个实施方案中，编码Cas9分子的核酸可以是合成性核酸序列。例如，合成性核酸分子可以经化学修饰，例如，如第XIII部分中所述。在一个实施方案中，Cas9 mRNA具有一个或多个(例如，全部)以下特性：它加帽、聚腺苷酸化、经5-甲基胞苷和/或假尿苷置换。

此外或备选地，合成性核酸序列可以经密码子优化，例如，至少一个非常见密码子或较不常见的密码子已经替换为常见密码子。例如，合成性核酸可以指导优化(例如，针对例如本文所述的哺乳动物表达系统中表达而优化)的信使mRNA合成。

下文提供密码子优化的示例性编码化脓性链球菌Cas9分子的核酸序列。

(SEQ ID NO:6628)

如果以上Cas9序列与肽或多肽在C末端(例如，无活性Cas9与转录阻遏蛋白在C末端融合)融合，可以理解，将移除终止密码子。

V.嵌合抗原受体

本发明提供与过继免疫治疗方法和试剂如嵌合抗原受体(CAR)免疫效应细胞(例如，T细胞)或嵌合TCR转导的免疫效应细胞(例如，T细胞)联合使用的gRNA分子和CRISPR系统。本发明的gRNA分子和CRISPR系统可以用来产生具有改进特性如疗效和安全性的过继免疫治疗细胞和组合物。本节描述通常与本发明的gRNA分子和CRISPR系统联合使用的CAR技术，并且描述了改进的CAR试剂(例如，细胞和组合物)和方法。

通常而言，本发明的方面涉及或包括一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离核酸分子，其中CAR包含与如本文所述的肿瘤抗原结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)和胞内信号传导结构域(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)(例如，包含共刺激结构域(例如，本文所述的共刺激结构域)的胞内信号传导结构域和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域)。在其他方面，本发明包括：含有以上核酸的宿主细胞和由这种核酸分子编码的分离的蛋白质。与本发明相关的CAR核酸构建体、编码的蛋白质、容纳载体、宿主细胞、药物组合物和施用与治疗方法在国际专利申请公开号WO2015142675中详细公开，所述文献通过引用的方式完整并入。

在一个方面，本发明涉及一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离核酸分子，其中CAR包含与肿瘤支持抗原(例如，如本文所述的肿瘤支持抗原)结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)和胞内信号传导结构域(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)(例如，包含共刺激结构域(例如，本文所述的共刺激结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域)的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，肿瘤支持抗原是在间质细胞或髓系衍生的抑制细胞(MDSC)上存在的抗原。在其他方面，本发明的特征在于这类核酸编码的多肽和含有这类核酸和/或多肽的宿主细胞。

备选地，本发明的方面涉及编码嵌合T细胞受体(TCR)的分离的核酸，所述嵌合T细胞受体包含对本文所述的癌抗原有特异性的TCRα和/或TCRβ可变结构域。参见例如，Dembic等人,Nature,320,232-238(1986)；Schumacher,Nat.Rev.Immunol.,2,512-519(2002)；Kershaw等人,Nat.Rev.Immunol.,5,928-940(2005)；Xue等人,Clin.Exp.Immunol.,139,167-172(2005)；Rossig等人,Mol.Ther.,10,5-18(2004)；和Murphy等人,Immunity,22,403-414(2005)；Morgan等人J.Immunol.,171,3287-3295(2003)；Hughes等人,Hum.Gene Ther.,16,1-16(2005)；Zhao等人,J.Immunol.,174,4415-4423(2005)；Roszkowski等人,Cancer Res.,65,1570-1576(2005)；和Engels等人,Hum.Gene Ther.,16,799-810(2005)；US2009/03046557，所述文献的内容因而通过引用的方式完整并入本文。这类嵌合TCR可以例如识别癌抗原，如MART-1、gp-100、p53和NY-ESO-1、MAGE A3/A6、MAGEA3、SSX2、HPV-16E6或HPV-16E7。在其他方面，本发明的特征在于这类核酸编码的多肽和含有这类核酸和/或多肽的宿主细胞。

靶

本发明提供包含或在任何时间包含了如本文所述的gRNA分子或CRISPR系统的、经进一步工程化以含有一个或多个指导免疫效应细胞针对不利细胞(例如，癌细胞)的CAR的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)。通过CAR上对癌相关抗原特异的抗原结合结构域实现这点。存在二类可以由本发明CAR靶向的癌相关抗原(肿瘤抗原)：(1)表达在癌细胞表面上的癌相关抗原；和(2)本身为细胞内，然而这类抗原(肽)的片段由MHC(主要组织相容性复合体)呈递在癌细胞表面上的癌相关抗原。

在一些实施方案中，肿瘤抗原选自以下一者或多者：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称作CD2亚类1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞黏附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾丸或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸-蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；Mucin 1，细胞表面相关黏蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞黏附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(蛋白酶体，巨蛋白因子)亚基Β型9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白型-A受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酰Lewis黏附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类第5群成员D(GPRC5D)；染色体X可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿路上皮分化特异糖蛋白(uroplakin)2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ可变可读框蛋白(TARP)；Wilm肿瘤蛋白(WT1))；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于第12p号染色体上的ETS转位变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合性细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；存活；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)、T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤凋亡抑制蛋白(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对的框蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc鸟髓细胞增多症病毒癌基因神经母细胞瘤衍的生同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印迹位点调节蛋白兄弟)、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对的框蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；高级糖基化终末产物的受体(RAGE-1)；肾遍在1(RU1)；肾遍在2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓间质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块的黏蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰基醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

本文所述的CAR可以包含与肿瘤支持抗原(例如，如本文所述的肿瘤支持抗原)结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)。在一些实施方案中，肿瘤支持抗原是在间质细胞或髓系衍生的抑制细胞(MDSC)上存在的抗原。间质细胞可以分泌在微环境下促进细胞分裂的生长因子。MDSC细胞可以抑制T细胞增殖和活化。不希望受理论约束，在一些实施方案中，表达CAR的细胞摧毁肿瘤支持细胞，因而间接地抑制肿瘤生长或存活。

在实施方案中，间质细胞抗原选自以下一种或多种：骨髓间质细胞抗原2(BST2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)和腱糖蛋白(tenascin)。在一个实施方案中，FAP特异性抗体是西罗珠单抗，与西罗珠单抗竞争结合，或具有与西罗珠单抗相同的CDR。在实施方案中，MDSC抗原选自以下一种或多种：CD33、CD11b、C14、CD15和CD66b。因此，在一些实施方案中，肿瘤支持抗原选自以下一种或多种：骨髓间质细胞抗原2(BST2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)或腱糖蛋白、CD33、CD11b、C14、CD15和CD66b。

抗原结合结构域结构

在一些实施方案中，编码的CAR分子的抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、驼类VHH结构域或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchi等人,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。

在一些情况下，scFv可以根据方法本领域已知的制备(参见，例如，Bird等人,(1988)Science 242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH区和VL区连接在一起产生scFv分子。ScFv分子包含长度和/或氨基酸组成优化的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以大大影响scFv的可变区怎样折叠并相互作用。实际上，如果使用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则防止链内折叠。还需要链间折叠以使这两个可变区一起形成有功能的表位结合位点。关于接头取向和大小的例子，参见，例如，Hollinger等人,1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、美国专利公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，和PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715，所述文献通过引用方式并入本文。

scFv可以在其VL区和VH区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头序列包含成组的甘氨酸和丝氨酸重复序列如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:6629)。在一个实施方案中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:6593)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:6594)。接头长度的变异性可以保留或增强活性，在活性研究中产生优越功效。

在另一个方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)，或其片段，例如，单链TCR(scTCR)。产生这类TCR的方法是本领域已知的。参见，例如，Willemsen RA等人,Gene Therapy 7:1369–1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther 11:487–496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.19(4):365-74(2012)(参考文献通过引用的方式完整并入)。例如，可以工程化含有接头(例如，柔性肽)连接的来自T细胞克隆的Vα基因和Vβ基因的scTCR。这种方法对本身为细胞内，然而这类抗原(肽)的片段由MHC呈递在癌细胞表面上的癌相关靶非常有用。

在某些实施方案中，编码的抗原结合结构域具有10^-4M至10^-8M KD的结合亲和力。

在一个实施方案中，编码的CAR分子包含对靶抗原具有10^-4M至10^-8M，例如10^-5M至10^-7M，例如10^-6M或10^-7MKD的结合亲和力的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域具有至少五倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍小于参考抗体(例如，本文所述的抗体)的结合亲和力。在一个实施方案中，编码的抗原结合结构域具有至少5倍小于参考抗体(例如，衍生出抗原结合结构域的抗体)的结合亲和力。在一个方面，这类抗体片段是有功能的，在于它们提供生物学应答，所述生物学应答可以包括但不限于激活免疫应答、抑制源自其靶抗原的信号转导、抑制激酶活性等，如技术人员将会理解。

在一个方面，CAR的抗原结合结构域是scFv抗体片段，所述scFv抗体片段与衍生它的scFv的鼠序列相比是人源化的。

在一个方面，本发明CAR的抗原结合结构域由其序列已经过密码子优化以便在哺乳动物细胞中表达的核酸分子编码。在一个方面，本发明的完整CAR构建体由其整个序列已经过密码子优化以便在哺乳动物细胞中表达的核酸分子编码。密码子优化指以下发现：编码性DNA中同义密码子(即，编码相同氨基酸的密码子)出现的频率在不同物种中有偏好。这种密码子简并性允许相同多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括，例如，至少在美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法。

抗原结合结构域(和靶向的抗原)

在一个实施方案中，针对CD19的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2012/079000；PCT公开WO2014/153270；Kochenderfer,J.N.等人,J.Immunother.32(7),689-702(2009)；Kochenderfer,J.N.等人,Blood,116(20),4099-4102(2010)；PCT公开WO2014/031687；Bejcek,Cancer Research,55,2346-2351,1995；或美国专利号7,446,190中描述的CAR、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对间皮素的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2015/090230中描述的抗体，抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。在一个实施方案中，针对间皮素的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO1997/025068、WO1999/028471、WO2005/014652、WO2006/099141、WO2009/045957、WO2009/068204、WO2013/142034、WO2013/040557或WO2013/063419中描述的抗体，抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。在一个实施方案中，针对间皮素的抗原结合结构域是在WO/2015/090230中描述的抗体，抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD123的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2014/130635中描述的抗体，抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。在一个实施方案中，针对CD123的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2014/138805、WO2014/138819、WO2013/173820、WO2014/144622、WO2001/66139、WO2010/126066、WO2014/144622或US2009/0252742中描述的抗体，抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。在一个实施方案中，针对CD123的抗原结合结构域是在WO/2016/028896中描述的抗体，抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。

包括来自WO2016/0028896的CAR分子的例子，其包含以下者的抗原结合结构域，或(在以下序列中，由(G4S)3接头(SEQ ID NO:6594)分隔)的VL和VH：

CD123-1：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDMNILATVPFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTYLNWYQQKPGKAPNLLIYAAFSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCQQGDSVPLTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:7812)；

CD123-2：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTLTRDTSISTVYMELSRLRSDDTAVYYCARDMNILATVPFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTVNSLQPEDFATYYCQQGDSVPLTFGGGTRLEIK(SEQ ID NO:7813)；

CD123-3：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSGLRSDDPAVYYCARDMNILATVPFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTVNSLQPEDFATYYCQQGDSVPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:7814)；或

CD123-4：

QVQLQQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWLRQAPGQGLEWMGWINPNSGDTNYAQKFQGRVTLTRDTSISTVYMELSRLRSDDTAVYYCARDMNILATVPFDIWGQGTMVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSVPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:7815)。

包含所述抗CD123结合结构域的CAR可以例如包含以下者的氨基酸序列：

CAR123-2：MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTLTRDTSISTVYMELSRLRSDDTAVYYCARDMNILATVPFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTVNSLQPEDFATYYCQQGDSVPLTFGGGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:7816)；

CAR123-3：

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSGLRSDDPAVYYCARDMNILATVPFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTVNSLQPEDFATYYCQQGDSVPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:7817)；

CAR123-4：

MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGAEVKKSGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWLRQAPGQGLEWMGWINPNSGDTNYAQKFQGRVTLTRDTSISTVYMELSRLRSDDTAVYYCARDMNILATVPFDIWGQGTMVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGDSVPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCK(SEQ ID NO:7818)；或

CAR123-1：malpvtalllplalllhaarpqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardmnilatvpfdiwgqgtmvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsistylnwyqqkpgkapnlliyaafslqsgvpsrfsgsgsgtdftltinslqpedfatyycqqgdsvpltfgggtkleiktttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:7819)。在每种情况下，CAR可以任选地包含或不包含上述序列中所含的前导序列(MALPVTALLLPLALLLHAARP；SEQ ID NO:6640)。

在一个实施方案中，针对EGFRvIII的抗原结合结构域是在例如WO/2014/130657中描述的抗体，抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD22的抗原结合结构域是在例如Haso等人,Blood,121(7):1165-1174(2013)；Wayne等人,Clin Cancer Res 16(6):1894-1903(2010)；Kato等人,Leuk Res 37(1):83-88(2013)；Creative BioMart(creativebiomart.net):MOM-18047-S(P)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CS-1的抗原结合结构域是依洛珠单抗(BMS)的抗原结合部分，例如，CDR，参见，例如，Tai等人,2008,Blood 112(4):1329-37；Tai等人,2007,Blood.110(5):1656-63。

在一个实施方案中，针对CLL-1的抗原结合结构域是从R&D、ebiosciences、Abcam可获得的抗体(例如PE-CLL1-hu目录号353604(BioLegend)；和PE-CLL1(CLEC12A)目录号562566(BD))的抗原结合部分，例如，CDR。在一个实施方案中，针对CLL-1的抗原结合结构域是在WO/2016/014535中描述的抗体，抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD33的抗原结合结构域是在例如Bross等人,Clin Cancer Res 7(6):1490-1496(2001)(吉妥单抗(Gemtuzumab ozogamicin)，hP67.6)；Caron等人,Cancer Res 52(24):6761-6767(1992)(林妥珠单抗，HuM195)；Lapusan等人,Invest New Drugs 30(3):1121-1131(2012)(AVE9633)；Aigner等人,Leukemia 27(5):1107-1115(2013)(AMG330,CD33 BiTE)；Dutour等人,Adv hematol 2012:683065(2012)和Pizzitola等人,Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62(2014)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。在一个实施方案中，针对CD33的抗原结合结构域是在WO/2016/014576中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对GD2的抗原结合结构域是在例如Mujoo等人,Cancer Res.47(4):1098-1104(1987)；Cheung等人,Cancer Res 45(6):2642-2649(1985)；Cheung等人,J Clin Oncol 5(9):1430-1440(1987)；Cheung等人,J Clin Oncol 16(9):3053-3060(1998)；Handgretinger等人,Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204(1992)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。在一些实施方案中，针对GD2的抗原结合结构域是选自mAb 14.18、14G2a、ch14.18、hu14.18、3F8、hu3F8、3G6、8B6、60C3、10B8、ME36.1和8H9的抗体的抗原结合部分，参见，例如WO2012033885、WO2013040371、WO2013192294、WO2013061273、WO2013123061、WO2013074916和WO201385552。在一些实施方案中，针对GD2的抗原结合结构域是在美国公开号20100150910或PCT公开号WO 2011160119中描述的抗体的抗原结合部分。

在一个实施方案中，针对BCMA的抗原结合结构域是在例如，WO2012163805、WO200112812和WO2003062401中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。在一个实施方案中，针对BCMA的抗原结合结构域是在WO/2016/014565中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对Tn抗原的抗原结合结构域是在例如US8,440,798、Brooks等人,PNAS 107(22):10056-10061(2010)和Stone等人,OncoImmunology 1(6):863-873(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对PSMA的抗原结合结构域是在例如Parker等人,Protein Expr Purif 89(2):136-145(2013)、US 20110268656(J591 ScFv)；Frigerio等人,European J Cancer 49(9):2223-2232(2013)(scFvD2B)；WO 2006125481(mAb 3/A12、3/E7和3/F11)和单链抗体片段(scFv A5和D7)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对ROR1的抗原结合结构域是在例如Hudecek等人,Clin Cancer Res 19(12):3153-3164(2013)；WO 2011159847；和US20130101607中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对FLT3的抗原结合结构域是在例如WO2011076922、US5777084、EP0754230、US20090297529中描述的抗体和几种商业目录抗体(R&D、ebiosciences、Abcam)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对TAG72的抗原结合结构域是在例如Hombach等人,Gastroenterology 113(4):1163-1170(1997)中描述的抗体和Abcam ab691的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对FAP的抗原结合结构域是在例如Ostermann等人,Clinical Cancer Research 14:4584-4592(2008)(FAP5)，美国专利公开号2009/0304718中描述的抗体；西罗珠单抗(sibrotuzumab)的抗原结合部分，例如，CDR(参见，例如，Hofheinz等人,Oncology Research and Treatment 26(1),2003)；和Tr等人,J Exp Med 210(6):1125-1135(2013)。

在一个实施方案中，针对CD38的抗原结合结构域是达雷木单抗(参见，例如，Groen等人,Blood 116(21):1261-1262(2010)、MOR202(参见，例如，US8,263,746)或在US8,362,211中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD44v6的抗原结合结构域是在例如Casucci等人,Blood 122(20):3461-3472(2013)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CEA的抗原结合结构域是在例如Chmielewski等人,Gastoenterology 143(4):1095-1107(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对EPCAM的抗原结合结构域是选自MT110、EpCAM-CD3双特异性Ab(参见，例如，clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596)；依决洛单抗；3622W94；ING-1；和阿德木单抗(MT201)的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对PRSS21的抗原结合结构域是在美国专利号8,080,650中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对B7H3的抗原结合结构域是抗体MGA271(Macrogenics)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对KIT的抗原结合结构域是在例如US7915391、US20120288506和几种商业目录抗体中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对IL-13Ra2的抗原结合结构域是在例如WO2008/146911、WO2004087758、几种商业目录抗体和WO2004087758中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD30的抗原结合结构域是在例如US7090843B1和EP0805871中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对GD3的抗原结合结构域是在例如US7253263；US 8,207,308；US 20120276046；EP1013761；WO2005035577和US6437098中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD171的抗原结合结构域是在例如Hong等人,J Immunother 37(2):93-104(2014)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对IL-11Ra的抗原结合结构域是从Abcam(目录号ab55262)或Novus Biologicals(目录号EPR5446)可获得的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。在另一个实施方案中，针对IL-11Ra的抗原结合结构域是一种肽，参见，例如，Huang等人,Cancer Res 72(1):271-281(2012)。

在一个实施方案中，针对PSCA的抗原结合结构域是在例如Morgenroth等人,Prostate 67(10):1121-1131(2007)(scFv 7F5)；Nejatollahi等人,J of Oncology 2013(2013),article ID 839831(scFv C5-II)；和美国专利公开号20090311181中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对VEGFR2的抗原结合结构域是在例如Chinnasamy等人,J Clin Invest 120(11):3953-3968(2010)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对LewisY的抗原结合结构域是例如在Kelly等人,Cancer Biother Radiopharm 23(4):411-423(2008)(hu3S193Ab(scFvs))；Dolezal等人,Protein Engineering 16(1):47-56(2003)(NC10scFv)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD24的抗原结合结构域是在例如Maliar等人,Gastroenterology 143(5):1375-1384(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对PDGFR-β的抗原结合结构域是抗体Abcam ab32570的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对SSEA-4的抗原结合结构域是抗体MC813(Cell Signaling)或其他市售抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD20的抗原结合结构域是抗体利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、维妥珠单抗或GA101的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对叶酸受体α的抗原结合结构域是抗体IMGN853或在US20120009181；US4851332、LK26：US5952484中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对ERBB2(Her2/neu)的抗原结合结构域是抗体曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对MUC1的抗原结合结构域是抗体SAR566658的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对EGFR的抗原结合结构域是抗体西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗或马妥珠单抗的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对NCAM的抗原结合结构域是抗体克隆2-2B：MAB5324(EMD Millipore)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对肝配蛋白B2的抗原结合结构域是在例如Abengozar等人,Blood 119(19):4565-4576(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对IGF-I受体的抗原结合结构域是在例如US8344112B2；EP2322550A1；WO 2006/138315或PCT/US2006/022995中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CAIX的抗原结合结构域是抗体克隆303123(R&D Systems)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对LMP2的抗原结合结构域是在例如US7,410,640或US20050129701中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对gp100的抗原结合结构域是抗体HMB45、NKIbetaB或在WO2013165940或US20130295007中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对酪氨酸酶的抗原结合结构域是在例如US5843674或US19950504048中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对EphA2的抗原结合结构域是在例如Yu等人,Mol Ther 22(1):102-111(2014)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对GD3的抗原结合结构域是在例如US7253263；US 8,207,308；US 20120276046；EP1013761 A3；20120276046；WO2005035577；或US6437098中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对岩藻糖基GM1的抗原结合结构域是在例如US20100297138或WO2007/067992中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对sLe的抗原结合结构域是抗体G193(针对lewis Y)的抗原结合部分，例如，CDR，参见Scott AM等人，Cancer Res 60:3254-61(2000)，还如Neeson等人,J Immunol May 2013 190(会议摘要补充材料)177.10中所述。

在一个实施方案中，针对GM3的抗原结合结构域是抗体CA 2523449(mAb 14F7)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对HMWMAA的抗原结合结构域是在例如Kmiecik等人,Oncoimmunology 3(1):e27185(2014)(PMID：24575382)(mAb9.2.27)；US6528481；WO2010033866；或US 20140004124中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对o-乙酰基-GD2的抗原结合结构域是抗体8B6的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对TEM1/CD248的抗原结合结构域是在例如Marty等人,Cancer Lett 235(2):298-308(2006)；Zhao等人,J Immunol Methods 363(2):221-232(2011)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CLDN6的抗原结合结构域是抗体IMAB027(Ganymed Pharmaceuticals)的抗原结合部分，例如，CDR，参见，例如，clinicaltrial.gov/show/NCT02054351。

在一个实施方案中，针对TSHR的抗原结合结构域是在例如US8,603,466；US8,501,415或US8,309,693中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对GPRC5D的抗原结合结构域是抗体FAB6300A(R&D Systems)或LS-A4180(Lifespan Biosciences)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD97的抗原结合结构域是在例如US6,846,911；de Groot等人,J.Immunol 183(6):4127-4134(2009)中描述的抗体的或来自R&D的抗体MAB3734的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对ALK的抗原结合结构域是在例如Mino-Kenudson等人,Clin Cancer Res 16(5):1561-1571(2010)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对聚唾液酸的抗原结合结构域是在例如Nagae等人,J Biol Chem 288(47):33784-33796(2013)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对PLAC1的抗原结合结构域是在例如Ghods等人,Biotechnol Appl Biochem 2013 doi:10.1002/bab.1177中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对GloboH的抗原结合结构域是抗体VK9的抗原结合部分或在例如，Kudryashov V等人,Glycoconj J.15(3):243-9(1998)；Lou等人,Proc Natl Acad Sci USA 111(7):2482-2487(2014)中描述的抗体的抗原结合部分；Bremer E-G等人,J Biol Chem 259:14773–14777(1984)中描述MBr1的抗原结合部分。

在一个实施方案中，针对NY-BR-1的抗原结合结构域是在例如Jager等人,Appl Immunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83(2007)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对WT-1的抗原结合结构域是在例如Dao等人,Sci Transl Med 5(176):176ra33(2013)；或WO2012/135854中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对MAGE-A1的抗原结合结构域是在例如Willemsen等人,J.Immunol 174(12):7853-7858(2005)(TCR样scFv)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对精子蛋白17的抗原结合结构域是在例如Song等人,,Target Oncol 2013 Aug 14(PMID:23943313)；Song等人,Med Oncol 29(4):2923-2931(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对Tie 2的抗原结合结构域是抗体AB33(Cell Signaling Technology)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域是在例如PMID:2450952；US7635753中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对Fos-相关抗原1的抗原结合结构域是抗体12F9(Novus Biologicals)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对MelanA/MART1的抗原结合结构域是在EP2514766 A2或US 7,749,719中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对肉瘤易位断点的抗原结合结构域是在例如Luo等人,EMBO Mol.Med.4(6):453-461(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对TRP-2的抗原结合结构域是在例如Wang等人,J Exp Med.184(6):2207-16(1996)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CYP1B1的抗原结合结构域是在例如Maecker等人,Blood 102(9):3287-3294(2003)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对RAGE-1的抗原结合结构域是抗体MAB5328(EMD Millipore)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对人端粒酶逆转录酶的抗原结合结构域是抗体目录号LS-B95-100(Lifespan Biosciences)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对肠道的羧基酯酶的抗原结合结构域是抗体4F12(目录号LS-B6190-50(Lifespan Biosciences))的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对mut hsp70-2的抗原结合结构域是抗体Lifespan Biosciences：单克隆：目录号：LS-C133261-100(Lifespan Biosciences)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD79a的抗原结合结构域是从Abcam可获得抗CD79a抗体[HM47/A9](ab3121)；从Cell Signalling Technology可获得的CD79A抗体#3351；或兔中产生的从Sigma Aldrich可获得的HPA017748-抗CD79A抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD79b的抗原结合结构域是抗体polatuzumab-维多汀、在Dorn等人,“Therapeutic potential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate,anti-CD79b-vc-MMAE,for the treatment of non-Hodgkin lymphoma”Blood.2009 Sep 24；114(13):2721-9.doi:10.1182/blood-2009-02-205500.Epub 2009 Jul 24中描述的抗CD79b或在“4507 Pre-Clinical Characterization of T Cell-Dependent Bispecific Antibody Anti-CD79b/CD3As a Potential Therapy for B Cell Malignancies”Abstracts of 56^th ASH Annual Meeting and Exposition,San Francisco,CA December 6-9 2014中描述的双特异性抗体抗CD79b/CD3的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD72的抗原结合结构域是在Myers和Uckun,“An anti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia.”Leuk Lymphoma.1995 Jun；18(1-2):119-22中描述的抗体J3-109或在Polson等人,“Antibody-Drug Conjugates for the Treatment of Non–Hodgkin's Lymphoma:Target and Linker-Drug Selection”Cancer Res March 15,2009 69；2358中描述的抗CD72(10D6.8.1,mIgG1)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对LAIR1的抗原结合结构域是从ProSpec可获得的ANT-301 LAIR1抗体或从BioLegend可获得的抗人CD305(LAIR1)抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对FCAR的抗原结合结构域是从Sino Biological Inc.可获得的CD89/FCAR抗体(目录号10414-H08H)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对LILRA2的抗原结合结构域是从Abnova可获得的LILRA2单克隆抗体(M17)克隆3C7或从Lifespan Biosciences可获得的小鼠抗LILRA2抗体单克隆(2D7)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CD300LF的抗原结合结构域是从BioLegend可获得的小鼠抗CMRF35样分子1单克隆抗体[UP-D2]或从R&D Systems可获得的大鼠抗CMRF35样分子1单克隆抗体[234903]的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对CLEC12A的抗原结合结构域是在Noordhuis等人,“Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugates and Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody”53^rdASH Annual Meeting and Exposition,December 10-13,2011中描述的双特异性T细胞接合(BiTE)scFv-抗体和ADC，以及MCLA-117(Merus)的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对BST2(也称作CD317)的抗原结合结构域是从Antibodies-Online可获得的小鼠抗CD317单克隆抗体[3H4]或从R&D Systems可获得的小鼠抗CD317单克隆抗体[696739]的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对EMR2(也称作CD312)的抗原结合结构域是从Lifespan Biosciences可获得的小鼠抗CD312单克隆抗体[LS-B8033]或从R&D Systems可获得的小鼠抗CD312单克隆抗体[494025]的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对LY75的抗原结合结构域是从EMD Millipore可获得的小鼠抗淋巴细胞抗原75单克隆抗体[HD30]或从Life Technologies可获得的小鼠抗淋巴细胞抗原75单克隆抗体[A15797]的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对GPC3的抗原结合结构域是在Nakano K,Ishiguro T,Konishi H等人,Generation of a humanized anti-glypican 3 antibody by CDR grafting and stability optimization.Anticancer Drugs.2010 Nov；21(10):907–916中描述的抗体hGC33或三者均在Feng等人,“Glypican-3 antibodies:a new therapeutic target for liver cancer.”FEBS Lett.2014 Jan 21；588(2):377-82中描述的MDX-1414、HN3或YP7的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对FCRL5的抗原结合结构域是在Elkins等人,“FcRL5 as a target of antibody-drug conjugates for the treatment of multiple myeloma”Mol Cancer Ther.2012 Oct；11(10):2222-32中描述的抗FcRL5抗体的抗原结合部分，例如，CDR。在一个实施方案中，针对FCRL5的抗原结合结构域是在例如WO2001/038490、WO/2005/117986、WO2006/039238、WO2006/076691、WO2010/114940、WO2010/120561或WO2014/210064中描述的抗FcRL5抗体的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，针对IGLL1的抗原结合结构域是从Lifespan Biosciences可获得的小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽1单克隆抗体[AT1G4]、从BioLegend可获得的小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽1单克隆抗体[HSL11]的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，抗原结合结构域包含一个、二个、三个(例如，全部三个)来自上文所列抗体的重链CDR、HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或一个、二个、三个(例如，全部三个)来自上文所列抗体的轻链CDR、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含上文所列抗体的重链可变区和/或可变轻链区。

在另一个方面，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一些方面，非人类抗体是人源化的，其中修饰抗体的特定序列或区域以增加与人类中天然产生的抗体或其片段的相似性。在一个方面，抗原结合结构域是人源化的。

在一个实施方案中，CAR(例如，本发明细胞表达的CAR)的抗原结合结构域与CD19结合。CD19存在于原/前B细胞阶段至终末分化型浆细胞阶段的整个谱系分化期间的B细胞上。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人CD19结合的鼠scFv结构域，例如，CTL019的抗原结合结构域(例如，SEQ ID NO:7895)。在一个实施方案中，抗原结合结构域是衍生自鼠CTL019scFv的人源化抗体或抗体片段，例如，scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人CD19结合的人抗体或抗体片段。表14中提供与CD19结合的示例性scFv结构域(及其序列，例如，CDR、VL和VH序列)。表14中提供的scFv结构域序列包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH由包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6594)的接头例如按以下方向连接：VL-接头-VH。

表14.结合CD19的抗原结合结构域

表15中显示在表14中提供的CD19抗原结合结构域的scFv结构域的重链可变结构域CDR序列并且在表16中显示轻链可变结构域的相应序列。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。

表15.重链可变结构域CDR

表16：轻链可变结构域CDR

在一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗CD19抗体或其片段，例如，scFv。例如，抗原结合结构域包含表17中列出的可变重链和可变轻链。连接可变重和可变轻链的接头序列可以是本文所述的任何接头序列，或备选地，可以是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:8167)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。

表17.额外的抗CD19抗体结合结构域

在一个实施方案中，CD19结合结构域包含本文所述(例如，表14或表15中提供)的CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)、和/或本文所述(例如，表14或表16中提供)的CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施方案中，CD19结合结构域包含如通过引用方式并入本文的表16中提供的任何氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中一者、两者或全体；和如表15中提供的任何氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中一者、两者或全体。

在一个实施方案中，CD19抗原结合结构域包含：

(i)(a)SEQ ID NO:7905的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7906的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7907的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:7899的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7900的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7904的HC CDR3氨基酸序列

(ii)(a)SEQ ID NO:7905的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7906的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7907的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:7899的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7901的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7904的HC CDR3氨基酸序列；

(iii)(a)SEQ ID NO:7905的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7906的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7907的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:7899的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7902的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7904的HC CDR3氨基酸序列；或

(iv)(a)SEQ ID NO:7905的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7906的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7907的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:7899的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:7903的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7904的HC CDR3氨基酸序列。

在一个实施方案中，CD19包含本文(例如，表14或表17中)所述的轻链可变区和/或本文(例如，表14或表17中)所述的重链可变区。在一个实施方案中，CD19结合结构域是包含表14或表17中列出的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，CD19结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表14或表17中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表14或表17中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表14或表17中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表14或表17中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。

在一个实施方案中，CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:7883；SEQ ID NO:7884、SEQ ID NO:7885；SEQ ID NO:7886；SEQ ID NO:7887；SEQ ID NO:7888；SEQ ID NO:7889、SEQ ID NO:7890、SEQ ID NO:7891、SEQ ID NO:7892、SEQ ID NO:7893、SEQ ID NO:7894、SEQ ID NO:7895和SEQ ID NO:7898的氨基酸序列；或相对于前述任何序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或与前述任何序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，CD19结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表14或表17中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表14或表17中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，CD19结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、优选地3(SEQ ID NO:10801)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。

本领域的任何已知CD19 CAR，例如，任何已知CD19 CAR的CD19抗原结合结构域，可以根据本发明用来构建CAR。例如，LG-740；在美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood 122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood,118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood 116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood 122(25):4129-39(2013)；和16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)(May 15-18,Salt Lake City)2013,Abst 10中描述的CD19 CAR。在一个实施方案中，针对CD19的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2012/079000；PCT公开WO2014/153270；Kochenderfer,J.N.等人,J.Immunother.32(7),689-702(2009)；Kochenderfer,J.N.等人,Blood,116(20),4099-4102(2010)；PCT公开WO2014/031687；Bejcek,Cancer Research,55,2346-2351,1995；或美国专利号7,446,190中描述的CAR、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分，例如，CDR。

在一个实施方案中，CAR(例如，本发明细胞表达的CAR)的抗原结合结构域与BCMA结合。发现BCMA偏好表达于成熟的B淋巴细胞中。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人BCMA结合的鼠scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是结合人BCMA的人源化抗体或抗体片段，例如，scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人BCMA结合的人抗体或抗体片段。表18、表19、表20和表21中提供与BCMA结合的示例性scFv结构域(及其序列，例如，CDR、VL和VH序列)。表18和表19中提供的scFv结构域序列包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH由接头例如按以下方向连接：VH-接头-VL。

表18.结合BCMA的抗原结合结构域

还提供每个scFv的可变重链序列和可变轻链序列的氨基酸序列。

实施方案中，使用来自PCT公开WO2012/0163805的VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。在实施方案中，使用来自PCT公开WO2016/014565的VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。在实施方案中，使用来自PCT公开WO2014/122144的VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。在实施方案中，使用来自PCT公开WO2016/014789的CAR分子和/或VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。在实施方案中，使用来自PCT公开WO2014/089335的CAR分子和/或VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。在实施方案中，使用来自PCT公开WO2014/140248的CAR分子和/或VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。

在实施方案中，也可以使用表19中存在的VH和VL序列生成额外的示例性BCMA CAR构建体。表19中还存在包含VH结构域和VL结构域及接头序列的示例性scFv结构域和全长CAR的氨基酸序列。

表19.额外的示例性BCMA结合结构域序列

在表20中显示scFv结构域的对于重链可变结构域的人CDR序列，并且在表21中显示scFv结构域的对于轻链可变结构域的人CDR序列。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。CDR根据Kabat定义显示，然而，可以基于以上VH和VL序列轻易地推导出遵循其他惯例(例如，Chothi定义或联合Kabat/Chothi定义)的CDR。

表20：根据Kabat编号方案的重链可变结构域CDR(Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD)

表21：根据Kabat编号方案的轻链可变结构域CDR(Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD)

在一个实施方案中，BCMA结合结构域包含本文所述(例如，表18、表19或表21中提供)的BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)、和/或本文所述(例如，表18、表19或表20中提供)的BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施方案中，BCMA结合结构域包含如通过引用方式并入本文的表18中提供的任何氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中一者、两者或全体；和如表18中提供的任何氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中一者、两者或全体。

在一个实施方案中，BCMA抗原结合结构域包含：

(i)(a)SEQ ID NO:8414的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8454的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8494的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8294的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8334的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8374的HC CDR3氨基酸序列

(ii)(a)SEQ ID NO:8404的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8444的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8484的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8284的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8324的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8364的HC CDR3氨基酸序列

(iii)(a)SEQ ID NO:8405的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8445的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8485的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8285的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8325的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8365的HC CDR3氨基酸序列

(iv)(a)SEQ ID NO:8406的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8446的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8486的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8286的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8326的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8366的HC CDR3氨基酸序列

(v)(a)SEQ ID NO:8407的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8447的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8487的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8287的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8327的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8367的HC CDR3氨基酸序列

(vi)(a)SEQ ID NO:8408的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8448的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8488的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8288的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8328的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8368的HC CDR3氨基酸序列

(vii)(a)SEQ ID NO:8409的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8449的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8489的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8289的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8329的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8369的HC CDR3氨基酸序列

(viii)(a)SEQ ID NO:8410的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8450的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8490的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8290的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8330的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8370的HC CDR3氨基酸序列

(ix)(a)SEQ ID NO:8411的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8451的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8491的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8291的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8331的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8371的HC CDR3氨基酸序列

(x)(a)SEQ ID NO:8412的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8452的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8492的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8292的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8332的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8372的HC CDR3氨基酸序列

(xi)(a)SEQ ID NO:8413的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8453的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8493的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8293的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8333的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8373的HC CDR3氨基酸序列

(xii)(a)SEQ ID NO:8415的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8455的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8495的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8295的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8335的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8375的HC CDR3氨基酸序列

(xiii)(a)SEQ ID NO:8416的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8456的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8496的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8296的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8336的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8376的HC CDR3氨基酸序列

(xiv)(a)SEQ ID NO:8417的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8457的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8497的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8297的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8337的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8377的HC CDR3氨基酸序列

(xv)(a)SEQ ID NO:8418的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8458的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8498的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8298的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8338的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8378的HC CDR3氨基酸序列

(xvi)(a)SEQ ID NO:8419的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8459的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8499的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8299的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8339的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8379的HC CDR3氨基酸序列

(xvii)(a)SEQ ID NO:8420的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8460的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8500的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8300的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8340的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8380的HC CDR3氨基酸序列

(xviii)(a)SEQ ID NO:8421的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8461的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8501的LC CDR3氨基酸序列；和(b)SEQ ID NO:8301的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8341的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8381的HC CDR3氨基酸序列

(xix)(a)SEQ ID NO:8422的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8462的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8502的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8302的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8342的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8382的HC CDR3氨基酸序列

(xx)(a)SEQ ID NO:8423的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8463的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8503的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8303的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8343的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8383的HC CDR3氨基酸序列

(xxi)(a)SEQ ID NO:8424的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8464的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8504的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8304的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8344的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8384的HC CDR3氨基酸序列

(xxii)(a)SEQ ID NO:8425的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8465的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8505的LC CDR3氨基酸序列；和

(b)SEQ ID NO:8305的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8345的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8385的HC CDR3氨基酸序列或

(xxiii)(a)SEQ ID NO:8426的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8466的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8506的LC CDR3氨基酸序列；和(b)SEQ ID NO:8306的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:8346的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:8386的HC CDR3氨基酸序列。

在一个实施方案中，BCMA包含本文(例如，表18或表19中)所述的轻链可变区和/或本文(例如，表18或表19中)所述的重链可变区。在一个实施方案中，BCMA结合结构域是包含表18或表19中列出的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，BCMA结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表18或表19中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表18或表19中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表18或表19中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表18或表19中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。

在一个实施方案中，BCMA结合结构域包含选自SEQ ID NO:7949；SEQ ID NO:7939、SEQ ID NO:7940；SEQ ID NO:7941；SEQ ID NO:7942；SEQ ID NO:7943；SEQ ID NO:7944、SEQ ID NO:7945、SEQ ID NO:7946、SEQ ID NO:7947、SEQ ID NO:7948、SEQ ID NO:7950、SEQ ID NO:7951、SEQ ID NO:7952、SEQ ID NO:7953、SEQ ID NO:8029、SEQ ID NO:8030、SEQ ID NO:8031、SEQ ID NO:8032、SEQ ID NO:8033、SEQ ID NO:8034、SEQ ID NO:8035、SEQ ID NO:8036、SEQ ID NO:8037、SEQ ID NO:8038、SEQ ID NO:8039、SEQ ID NO:8040、SEQ ID NO:8041、SEQ ID NO:8042、SEQ ID NO:8043、SEQ ID NO:8044、SEQ ID NO:8045、SEQ ID NO:8046、SEQ ID NO:8047、SEQ ID NO:8048、SEQ ID NO:8049、SEQ ID NO:8163、SEQ ID NO:8164、SEQ ID NO:8165和SEQ ID NO:8166的氨基酸序列；或相对于前述任何序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或与前述任何序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，BCMA结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表18或表19中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表18或表19中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，BCMA结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、优选地3(SEQ ID NO:10801)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。

本领域的任何已知BCMA CAR，例如，任何已知BMC CAR的BCMA抗原结合结构域，可以根据本发明使用。例如，本文所述的那些。

示例性CAR分子

在一个方面，CAR，例如，本发明细胞表达的CAR，包括了包含抗原结合结构域的CAR分子，所述抗原结合结构域与(例如，如本文所述的)B细胞抗原(如CD19或BCMA)结合。

在一个实施方案中，CAR包括了包含CD19抗原结合结构域(例如，与CD19特异性结合的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)的CAR分子。

表22中提供本文所述的示例性CAR分子。表22中的CAR分子包含CD19抗原结合结构域，例如，表14中提供的任何CD19抗原结合结构域的氨基酸序列。

表22.示例性CD19 CAR分子

在一个实施方案中，CAR分子包含(例如，由其组成)如表22中或在2014年3月15日提交的国际公开号WO2014/153270的表3中提供的氨基酸序列；所述文献通过引用方式并入本文。在一个实施方案中，CAR分子包含(例如，由其组成)SEQ ID NO:7908、SEQ ID NO:7909、SEQ ID NO:7910、SEQ ID NO:7911、SEQ ID NO:7912、SEQ ID NO:7913、SEQ ID NO:7914、SEQ ID NO:7915、SEQ ID NO:7916、SEQ ID NO:7917、SEQ ID NO:7918、SEQ ID NO:7919或SEQ ID NO:7920的氨基酸序列；或具有SEQ ID NO:7908、SEQ ID NO:7909、SEQ ID NO:7910、SEQ ID NO:7911、SEQ ID NO:7912、SEQ ID NO:7913、SEQ ID NO:7914、SEQ ID NO:7915、SEQ ID NO:7916、SEQ ID NO:7917、SEQ ID NO:7918、SEQ ID NO:7919或SEQ ID NO:7920的氨基酸序列中至少一个、二个、三个、四个、五个、10、15、20或30个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于60、50或40个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或与SEQ ID ID NO:7908、SEQ ID NO:7909、SEQ ID NO:7910、SEQ ID NO:7911、SEQ ID NO:7912、SEQ ID NO:7913、SEQ ID NO:7914、SEQ ID NO:7915、SEQ ID NO:7916、SEQ ID NO:7917、SEQ ID NO:7918、SEQ ID NO:7919或SEQ ID NO:7920的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

在一个方面，CAR，例如，本发明细胞表达的CAR，包括这样的CAR分子，其包含与BCMA结合的抗原结合结构域，例如包含BCMA抗原结合结构域(例如，与BCMA(例如BCMA)特异性结合的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。

在表23中或WO2016/014565的表1中或如本文另外所述那样提供本文所述的CAR的示例性CAR分子。表23中的CAR分子包含BCMA抗原结合结构域，例如，表18或表19中提供的任何BCMA抗原结合结构域的氨基酸序列。

表23.示例性BCMA CAR分子。序列设有前导序列。

在一个实施方案中，CAR分子包含(例如，由其组成)表23中或WO2016/014565的表1中或如本文另外所述那样提供的氨基酸序列。在一个实施方案中，CAR分子包含(例如，由其组成)SEQ ID ID NO:8549、SEQ ID NO:8550、SEQ ID NO:8551、SEQ ID NO:8552、SEQ ID NO:8553、SEQ ID NO:8554、SEQ ID NO:8555、SEQ ID NO:8556、SEQ ID NO:8557、SEQ ID NO:8558、SEQ ID NO:8559、SEQ ID NO:8560、SEQ ID NO:8561、SEQ ID NO:8562、SEQ ID NO:8563、SEQ ID NO:8579、SEQ ID NO:8580、SEQ ID NO:8581、SEQ ID NO:8582、SEQ ID NO:8583、SEQ ID NO:8584、SEQ ID NO:8585、SEQ ID NO:8586、SEQ ID NO:8587、SEQ ID NO:8588、SEQ ID NO:8589、SEQ ID NO:8590、SEQ ID NO:8591、SEQ ID NO:8592、SEQ ID NO:8593、SEQ ID NO:8594、SEQ ID NO:8595、SEQ ID NO:8596、SEQ ID NO:8597、SEQ ID NO:8598或SEQ ID NO:8599的氨基酸序列；或具有SEQ ID ID NO:8549、SEQ ID NO:8550、SEQ ID NO:8551、SEQ ID NO:8552、SEQ ID NO:8553、SEQ ID NO:8554、SEQ ID NO:8555、SEQ ID NO:8556、SEQ ID NO:8557、SEQ ID NO:8558、SEQ ID NO:8559、SEQ ID NO:8560、SEQ ID NO:8561、SEQ ID NO:8562、SEQ ID NO:8563、SEQ ID NO:8579、SEQ ID NO:8580、SEQ ID NO:8581、SEQ ID NO:8582、SEQ ID NO:8583、SEQ ID NO:8584、SEQ ID NO:8585、SEQ ID NO:8586、SEQ ID NO:8587、SEQ ID NO:8588、SEQ ID NO:8589、SEQ ID NO:8590、SEQ ID NO:8591、SEQ ID NO:8592、SEQ ID NO:8593、SEQ ID NO:8594、SEQ ID NO:8595、SEQ ID NO:8596、SEQ ID NO:8597、SEQ ID NO:8598或SEQ ID NO:8599的氨基酸序列中至少一个、二个、三个、四个、五个、10、15、20或30个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于60、50或40个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或与SEQ ID ID NO:8549、SEQ ID NO:8550、SEQ ID NO:8551、SEQ ID NO:8552、SEQ ID NO:8553、SEQ ID NO:8554、SEQ ID NO:8555、SEQ ID NO:8556、SEQ ID NO:8557、SEQ ID NO:8558、SEQ ID NO:8559、SEQ ID NO:8560、SEQ ID NO:8561、SEQ ID NO:8562、SEQ ID NO:8563、SEQ ID NO:8579、SEQ ID NO:8580、SEQ ID NO:8581、SEQ ID NO:8582、SEQ ID NO:8583、SEQ ID NO:8584、SEQ ID NO:8585、SEQ ID NO:8586、SEQ ID NO:8587、SEQ ID NO:8588、SEQ ID NO:8589、SEQ ID NO:8590、SEQ ID NO:8591、SEQ ID NO:8592、SEQ ID NO:8593、SEQ ID NO:8594、SEQ ID NO:8595、SEQ ID NO:8596、SEQ ID NO:8597、SEQ ID NO:8598或SEQ ID NO:8599的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。

跨膜结构域

就跨膜结构域而言，在多种实施方案中，CAR可以设计成包含与CAR的胞外结构域连接的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括一个或多个与跨膜区毗邻的额外氨基酸，例如，一个或多个与衍生跨膜区的蛋白质的胞外区相关的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个直至15个胞外区氨基酸)和/或一个或多个与衍生跨膜蛋白的蛋白质的胞内区相关的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个至多15个胞内区氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是一个与CAR的其他结构域之一缔合的结构域，例如，在一个实施方案中，跨膜结构域可以来自衍生信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域的相同蛋白质。在另一个方面，跨膜结构域不从衍生CAR的任何其他结构域的相同蛋白质衍生。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免这类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以最大限度减少与受体复合体的其他构件的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞表面上的另一个CAR同型二聚化。在一个不同方面，可以修饰或置换跨膜结构域的氨基酸序列，从而最大限度减少与表达CAR的相同细胞中存在的天然结合配偶体的结合结构域相互作用。

跨膜结构域可以衍生自天然来源或重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个方面，每当CAR已经与靶结合时，跨膜结构域就能够向胞内结构域发送信号。在本发明中特别有用的跨膜结构域可以至少包含例如以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括至少例如以下蛋白质的跨膜区：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C。

在一些情况下，跨膜结构域可以借助铰链区(例如，来自人蛋白质的铰链区)与CAR的胞外区(例如，CAR的抗原结合结构域)连接。例如，在一个实施方案中，铰链区可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链区(例如，IgG4铰链区、IgD铰链区)、GS接头(例如，本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链区或CD8a铰链区。在一个实施方案中，铰链区或间隔区包含SEQ ID NO:6642的氨基酸序列(例如，由其组成)。在一个方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6644的跨膜结构域(例如，由其组成)。

在某些实施方案中，编码的跨膜结构域包含CD8跨膜结构域的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:6644的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6644的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码的跨膜结构域包含SEQ ID NO:6644的序列。

在其他实施方案中，编码CAR的核酸分子包含CD8跨膜结构域的核苷酸序列，例如，包含SEQ ID NO:6645序列，或与其具有95-99％同一性的序列。

在某些实施方案中，编码的抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，编码的铰链区包含CD8铰链区的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:6642；或IgG4铰链区的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:6630，或与SEQ ID NO:6642或6630具有95-99％同一性的序列。在其他实施方案中，编码铰链区的核酸序列包含分别与CD8铰链区或IgG4铰链区相对应的SEQ ID NO:6643或SEQ ID NO:6631的序列或与SEQ ID NO:6643或6631具有95-99％同一性的序列。

在一个方面，铰链区或间隔区包含IgG4铰链区。例如，在一个实施方案中，铰链区或间隔区包含具有以下氨基酸序列的铰链区ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:6630)。在一些实施方案中，铰链区或间隔区包含由以下核苷酸序列编码的铰链区GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQ ID NO:6631)。

在一个方面，铰链区或间隔区包含IgD铰链区。例如，在一个实施方案中，铰链区或间隔区包含具有以下氨基酸序列的铰链区RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:6632)。在一些实施方案中，铰链区或间隔区包含由以下核苷酸序列编码的铰链区AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:6633)。

在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下它将包含占多数的疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体可以在重组跨膜结构域的每个末端存在。

任选地，2和10个氨基酸长度之间的短寡聚物接头或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域和胞质区域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。例如，在一个方面，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:6634)。在一些实施方案中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:6635)的核苷酸序列编码。

在一个方面，铰链区或间隔区包含KIR2DS2铰链区。

信号传导结构域

在具有胞内信号传导结构域的本发明实施方案中，这种结构域可以例如含有一个或多个初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括编码初级信号传导结构域的序列。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。

在本发明CAR的胞质部分内部的胞内信号传导序列可以彼此按随机顺序或指定顺序连接。任选地，例如2个和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)长度之间的短寡聚物接头或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的接头。

在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号传导结构域由接头分子(例如，本文所述的接头分子)分隔。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。

初级信号传导结构域

初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激性方式发挥作用的初级胞内信号传导结构域可以含有称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。

含有ITAM的在本发明中特别有用的初级胞内信号传导结构域的例子包括CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在一个实施方案中，本发明的CAR包含胞内信号传导结构域，例如，CD3-ζ的初级信号传导结构域。

在一个实施方案中，编码的初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。编码的CD3ζ初级信号传导结构域可以包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID ID NO:6648或SEQ ID NO:6650的氨基酸序列中至少一个、两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰，或与SEQ ID ID NO:6648或SEQ ID NO:6650的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一些实施方案中，编码的初级信号传导结构域包括SEQ ID NO:6648或SEQ ID NO:6650的序列。在其他实施方案中，编码初级信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:6649或SEQ ID NO:6651的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。

共刺激信号传导结构域

在一些实施方案中，编码的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。例如，胞内信号传导结构域可以包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，编码的共刺激信号传导结构域包含选自以下一者或多者的蛋白质的功能性信号传导结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46或NKG2D。

在某些实施方案中，编码的共刺激信号传导结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID ID NO:6646或SEQ ID NO:6636的氨基酸序列中至少一个、两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰，或与SEQ ID ID NO:6646或SEQ ID NO:6636的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码的共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:6646或SEQ ID NO:6636的序列。在其他实施方案中，编码共刺激信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:6647或SEQ ID NO:6637的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。

在其他实施方案中，编码的胞内结构域包含SEQ ID NO:6646或SEQ ID NO:6636的序列，和SEQ ID NO:6648或SEQ ID NO:6650的序列，其中包含胞内信号传导结构域的序列在相同可读框中表达并作为单条多肽链表达。

在某些实施方案中，编码胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:6647或SEQ ID NO:6637的序列，或与其具有95-99％同一性的序列，和SEQ ID NO:6649或SEQ ID NO:6651的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。

在一些实施方案中，核酸分子还编码前导序列。在一个实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO:6640的序列。

在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:6646的信号传导结构域。在一个方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:6648的信号传导结构域。

在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含氨基酸序列QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:6636)。在一个方面，CD27的信号传导结构域由以下核酸序列编码AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:6637)。

载体

在另一个方面，本发明涉及载体，所述载体包含编码本文所述的CAR的核酸序列。在一个实施方案中，载体选自DNA载体、RNA载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是慢病毒载体。仅略述一二，这些载体或其部分可以用来产生如本文所述的模板核酸，随如本文所述的CRISPR系统一起使用。备选地，独立于CRISPR系统，载体可以用来直接递送核酸至细胞，例如，免疫效应细胞，例如，T细胞，例如，同种异体T细胞。

本发明还提供其中插入本发明DNA的载体。衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的附加优点，在于它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有附加的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如，编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)和从中衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体例如在Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology and Application”Viruses.2011Jun；3(6):677–713中描述。

在另一个实施方案中，包含编码本发明所需的CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，可以使用转座子如睡美人转座子、crisper、CAS9和锌指核酸酶完成编码CAR的核酸的表达。参见下文June等人,2009 Nature Reviews Immunology 9.10:704-716，所述文献通过引用方式并入本文。

可以将核酸克隆入众多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆入包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特定意义的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

本文公开了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。本发明还包括可以直接转染至细胞中的编码CAR的RNA构建体。一种产生用于转染的mRNA的方法可以涉及用专门设计的引物体外转录(IVT)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达核酸和聚腺苷酸化尾的构建体，长度一般为50-2000个碱基(SEQ ID NO:6638)。如此产生的RNA可以高效地转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括CAR的序列。

非病毒递送方法

在一些方面，非病毒方法可以用来递送编码本文所述的CAR的核酸至细胞或组织或受试者中。

在一些实施方案中，非病毒方法包括利用转座子(也称作转座元件)。在一些实施方案中，转座子是可以将本身插入基因组中的某位置处的一段DNA，例如，能够自我复制并将其副本插入基因组中的一段DNA或可以是从较长核酸剪接出来并插入基因组中的另一个位置的一段DNA。例如，转座子包含DNA序列，其包含反向重复序列，所述反向重复序列在用于转座的基因旁侧分布。

在一些实施方案中，通过使用采取SBTS的基因插入法和采取核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统或工程化大范围核酸酶再工程化归巢核酸内切酶)的遗传编辑法的组合，生成表达本文所述CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。

在一些实施方案中，通过以下方式产生(例如，如本文所述的)本发明细胞，例如，T或NK细胞，例如，同种异体T细胞(例如，表达本文所述的CAR)：使细胞与(a)包含一种或多种(例如本文所述的)gRNA分子和一种或多种(例如，如本文所述的)Cas分子(例如，Cas9分子)的组合物和(b)包含了编码(例如，如本文所述的)CAR的序列的核酸(如本文所述的模板核酸分子)接触。不受理论约束，上文(a)的所述组合物将在gRNA分子的导引结构域靶向的基因组DNA处或其附近诱导断口，并且(b)的核酸将在所述断口处或其附近(例如，部分或完整)并入基因组，从而当整合时，编码的CAR分子表达。在实施方案中，CAR的表达将受相对于基因组为内源的启动子或其他调节元件(例如，控制在其中插入(b)的核酸的基因表达的启动子)控制。在其他实施方案中，(b)的核酸还包含与编码CAR的序列有效连接的(例如，如本文所述的)启动子和/或其他调节元件(例如，EF1-α启动子)，从而当整合时，CAR的表达受该启动子和/或其他调节元件控制。在本申请中其他地方，例如，在涉及基因插入和同源重组的部分中，描述涉及(例如，如本文所述的)CRISPR/Cas9系统直接并入编码(例如，如本文所述的)CAR的核酸序列的用途的本发明附加特征。在实施方案中，上文a)的组合物是这样的组合物，其包含有包含一种或多种gRNA分子的RNP。在实施方案中，将包含了靶向独特靶序列的gRNA的RNP(例如，作为包含一种或多种gRNA的RNP混合物)同时引入细胞。在实施方案中，将包含了靶向独特靶序列的gRNA的RNP依次引入细胞。

在一些实施方案中，非病毒递送方法的使用允许再编程细胞(例如，T细胞或NK细胞)和直接输注细胞至受试者中。非病毒载体的优点包括但不限于便利和成本相对低地产生满足患者群体、储存期间稳定性和缺少免疫原性所要求的足够量。

抑制性结构域

在一个实施方案中，载体包含编码CAR(例如，本文所述的CAR)的核酸序列和编码抑制性分子的核酸序列，所述编码抑制性分子包含inhKIR胞质结构域；跨膜结构域，例如，KIR跨膜结构域；和抑制剂胞质结构域，例如，ITIM结构域，例如，inhKIR ITIM结构域。在一个实施方案中，抑制性分子是天然存在的inhKIR，或与天然存在的inhKIR共有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，或与其差异不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的序列。

在一个实施方案中，编码抑制性分子的核酸序列包含：SLAM家族胞质结构域；跨膜结构域，例如，SLAM家族跨膜结构域；和抑制剂胞质结构域，例如，SLAM家族结构域，例如，SLAM家族ITIM结构域。在一个实施方案中，抑制性分子是天然存在的SLAM家族成员，或与天然存在的SLAM家族成员共有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的序列，或与其差异不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的序列。

在一个实施方案中，载体是体外转录的载体，例如，转录本文所述核酸分子的RNA的载体。在一个实施方案中，载体中的核酸序列还包含聚腺苷酸尾，例如，多聚腺苷酸化尾。在一个实施方案中，载体中的核酸序列还包含3’UTR，例如，本文所述的3’UTR，例如，包含至少一个衍生自人β-球蛋白中的3’UTR的重复序列。在一个实施方案中，载体中的核酸序列还包含启动子，例如，T2A启动子。

启动子

在一个实施方案中，载体还包含启动子。在一些实施方案中，启动子选自EF-1启动子、CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、泛素C启动子或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一个实施方案中，启动子是EF-1启动子。在一个实施方案中，EF-1启动子包含SEQ ID NO:6639的序列。

表达CAR的宿主细胞

如上文所示，在一些方面，本发明涉及包含如本文所述的核酸分子、CAR多肽分子或载体的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，细胞群体，例如，免疫效应细胞群体)。

在本公开的某些方面，免疫效应细胞(例如，T细胞)可以从使用技术人员已知的任何种类的技术(如Ficoll^TM分离)从受试者采集的血液成分中获得。在一个优选的方面，通过单采血液成分术(apheresis)获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且任选地，将细胞放置于用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基。在一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个备选实施方案中，洗涤液缺少钙并且可以缺少镁或可以缺少许多(若非全部)二价阳离子。

在钙不存在情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将轻易领会，可以通过本领域技术人员已知的方法完成洗涤步骤，如根据制造商说明通过使用半自动化“通流”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)。在洗涤后，细胞可以重悬于多种生物相容缓冲液中，如，例如，无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyte A或含有或没有缓冲剂的其他盐水溶液。备选地，可以移除单采样品的不想要组分并且将细胞直接重悬于培养基中。

认识到，本申请方法可以利用包含5％或更少(例如2％)人AB血清的培养基条件并利用已知的培养基条件和组合物，例如在Smith等人,“Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中描述的那些。

在一个方面，通过裂解红细胞和耗尽单核细胞，例如，通过经PERCOLL^TM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞分离T细胞。

本文所述的方法可以例如包括例如使用(例如，本文所述的)负选择技术，选择特定免疫效应细胞(例如，T细胞)亚群，所述亚群是调节性T细胞耗尽的群体、CD25+耗尽的细胞。优选地，调节性T细胞耗尽的细胞群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。

在一个实施方案中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体(IL-2)从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+ T细胞。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段或CD25-结合配体与基材(例如，珠)缀合、或否则包被在基材(例如，珠)上。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段与如本文所述的基材缀合。

在一个实施方案中，使用来自Miltenyi^TM的CD25耗尽试剂从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+ T细胞。在一个实施方案中，细胞/CD25耗尽试剂的比率是1e7个细胞/20uL、或1e7个细胞/15uL、或1e7个细胞/10uL、或1e7个细胞/5uL、或1e7个细胞/2.5uL、或1e7个细胞/1.25uL。在一个实施方案中，例如，对于耗尽调节性T细胞，例如，CD25+而言，使用大于500百万个细胞/ml。在又一个方面，使用600、700、800、或900百万个细胞/ml的细胞浓度。

在一个实施方案中，待耗尽的免疫效应细胞群体包含约6x10⁹个CD25+ T细胞。在其他方面，待耗尽的免疫效应细胞群体包含约1x10⁹个至1x10¹⁰个和二者之间任何整数值个CD25+ T细胞。在一个实施方案中，所产生的调节性T细胞耗尽的群体具有2x10⁹个调节性T细胞，例如，CD25+细胞、或更少(例如，1x10⁹、5x10⁸、1x10⁸、5x10⁷、1x10⁷个或更少的CD25+细胞)。

在一个实施方案中，使用具有耗尽管路套件，例如，管路162-01的CliniMAC系统，从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+细胞。在一个实施方案中，CliniMAC系统在耗尽设定(如，例如，DEPLETION2.1)上运行。

不希望受具体理论约束，在单采血液成分术之前或在产生表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的负向调节物水平(例如，减少不想要的免疫细胞(例如，TREG细胞)的数目)可以降低受试者复发风险。例如，耗尽TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗尽、及其组合。

在一些实施方案中，生产方法包括在产生表达CAR的细胞之前减少TREG细胞的数目(例如，耗尽)。例如，生产方法包括使与样品(例如，单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25-结合配体)接触，例如，以在产生表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产品之前耗尽TREG细胞。

在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用减少TREG细胞的一种或多种疗法预治疗，因而相对于表达CAR的细胞治疗，降低受试者复发风险。在一个实施方案中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用以下一种或多种：环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽或其组合。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽或其组合中一者或多者可以在输注表达CAR的细胞产品之前、其期间或之后进行。

在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用环磷酰胺预治疗，因而相对于表达CAR的细胞治疗，降低受试者复发风险。在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用抗GITR抗体预治疗，因而相对于表达CAR的细胞治疗，降低受试者复发发风险。

在一个实施方案中，待移除的细胞群体既不是调节性T细胞，也不是肿瘤细胞，而是否则不利影响CART细胞的扩充和/或功能的细胞，例如，表达CD14、CD11b、CD33、CD15或由潜在免疫阻抑性细胞表达的其他标记的细胞。在一个实施方案中，构思将这类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞同时、或在所述耗尽后或按另一个顺序移除。

本文所述的方法可以包括多于一个选择步骤，例如，多于一个耗尽步骤。可以例如，用针对负向选择的细胞独有的表面标记物的抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。

本文所述的方法还可以包括从群体移除细胞，其表达肿瘤抗原(例如，不包括CD25的肿瘤抗原，例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)，旨在因而提供适于表达CAR(例如，本文所述的CAR)的调节性T细胞耗尽(例如，CD25+耗尽的细胞)和肿瘤抗原耗尽的细胞的群体。在一个实施方案中，将表达肿瘤抗原的细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同基质(例如，珠)，或抗CD25抗体或其片段或者抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接至分立的珠，所述分立珠的混合物可以用来移除细胞。在其他实施方案中，移除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)和移除表达肿瘤抗原的细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序进行。

还提供这些方法，所述方法包括从群体移除表达检查点抑制蛋白(例如，本文所述的检查点抑制蛋白)的细胞，例如，PD1+细胞、LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一者或多者，因而提供调节性T细胞耗尽(例如，CD25+耗尽的细胞)和检查点抑制蛋白耗尽的细胞(例如，PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗尽的细胞)的群体。示例性检查点抑制蛋白包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一个实施方案中，将表达检查点抑制蛋白的细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制蛋白抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同珠，或抗CD25抗体或其片段或者抗检查点抑制蛋白抗体或其片段可以连接至分立的珠，所述分立的珠的混合物可以用来移除细胞。在其他实施方案中，移除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)和移除表达检查点抑制蛋白的细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序进行。

本文所述的方法可以包括正选择步骤。例如，可以通过与抗CD3/抗CD28(例如，3x28)缀合的珠(如M-450CD3/CD28T)孵育一段足够正选择所需T细胞的时间，分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段是约30分钟。在又一个实施方案中，该时间段范围从30分钟至36小时或更长和二者之间的全部整数值。在又一个实施方案中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又一个实施方案中，该时间段是10至24小时，例如，24小时。较长的孵育时间可以用来在其中如与其他细胞类型相比存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)。另外，使用较长的孵育时间可以增加捕获CD8+ T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长该时间，允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率(如本文进一步所述那样)，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。额外地，通过增加或减少珠或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养伊始或在其他所需的时间点偏好地选择T细胞亚群。

在一个实施方案中，可以选择表达以下一者或多者的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔素、或其他适宜的分子，例如，其他细胞因子。可以例如通过PCT公开号WO 2013/126712中描述方法，确定用于筛选细胞表达的方法。

为了通过正向或负向选择分离所需的细胞群体，细胞和表面(例如，粒子如珠)的浓度可以变动。在某些方面，可能想要明显减少其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞浓度)以确保细胞和珠最大限度接触。例如，在一个方面，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、或50亿/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。

使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩充。另外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能微弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或捕获来自其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)中的细胞。这类细胞群体可能具有治疗价值并且将希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择正常情况下具有更弱CD28表达的CD8+ T细胞。

在一个相关方面，可能想要使用较低的细胞浓度。通过大幅度稀释T细胞和表面(例如，粒子如珠)的混合物，粒子和细胞之间的相互作用最小化。这选出表达高量待与粒子结合的所需抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28并且在稀释的浓度比CD8+ T细胞被更高效地捕获。在一个方面，使用的细胞浓度是5x10⁶/ml。在其他方面，所用的浓度可以是约1x10⁵/ml至1x10⁶/ml和其间的任何整数值。

在其他方面，可以将细胞在2-10℃或在室温在摇床上按不同的速度孵育长度不同的时间。

待刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论约束，通过移除细胞群体中的粒细胞和一定程度移除单核细胞，冷冻和后续解冻步骤提供更均匀的产物。在移除血浆和血小板的洗涤步骤后，细胞可以悬浮于冷冻液中。尽管许多冷冻液和参数是本领域已知的并且将用于这种环境下，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基或例如含有Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，细胞随后以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并且存储在液氮储罐的蒸气相中。也可以使用其他受控冷冻方法，以及立即在-20℃或在液氮中不受控冷冻。

在某些方面，将冷冻保存的细胞如本文所述那样解冻和洗涤并允许在室温静置一小时，之后使用本发明的方法激活。

在本发明背景下还构思，在可能需要如本文所述的已扩充细胞时之前的某个时间段从受试者采集血液样品或单采产品。就这一点而论，待扩充的细胞来源可以在需要的任何时间点采集，并且所需的细胞(如T细胞)可以分离并冷冻供稍后用于将从免疫效应细胞疗法获益的任何种类的疾病或病状(如本文所述的那些)的免疫效应细胞疗法中。在一个方面，血液样品或单采物取自总体上健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采物取自总体上健康的受试者，所述受试者面临形成疾病的风险、但是尚未形成疾病，并且将目的细胞分离并冷冻供稍后使用。在某些方面，可以将T细胞扩充、冷冻并在稍后时间使用。在某些方面，样品从诊断如本文所述的特定疾病后不久、但在任何治疗之前的患者采集。在又一个方面，在任何数目的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采物分离细胞，所述的治疗模式包括但不限于药物治疗，如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒药、化疗、辐射、免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸盐和FK506、抗体、或其他免疫清除剂如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷氮芥、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和照射。

在本发明的又一个方面，在留给受试者有功能的T细胞的治疗后马上从患者获得T细胞。在这个方面，已经观察到在某些癌症治疗、尤其用损伤免疫系统的药物治疗后，在治疗后不久在患者正常情况下将从治疗中恢复的时间期间，获得的T细胞的质量可能就其离体扩充能力而言最佳或得到改善。同样地，在使用本文所述的方法离体操作后，这些细胞可以处于移植物移入和体内扩充增强的优选状态。因此，在本发明背景范围内构思，在这个恢复期期间采集血细胞，包括T细胞、树状细胞或造血谱系的其他细胞。另外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和条件化方案可以用来在受试者中产生这样的条件，其中有利于特定细胞类型再增殖、再循环、再生和/或扩充，特别在治疗后的限定时间窗口期间有利。示意性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树状细胞和免疫系统的其他细胞。

在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞从已经接受低，免疫增强性剂量的mTOR抑制剂的受试者获得。在一个实施方案中，在足够时间后或在充分给予低，免疫增强性剂量的mTOR抑制剂后收获待工程化以表达CAR的免疫效应细胞群体(例如，T细胞)，从而受试者中的或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少一过性增加。

在其他实施方案中，可以通过与下述量的mTOR抑制剂接触，离体处理已经工程化或将会工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，所述量增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)数目或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率。

在一个实施方案中，T细胞群体是二酰甘油激酶(DGK)缺陷的。DGK缺陷性细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。可以通过遗传方法产生DGK缺陷性细胞，例如，施用减少或阻止DGK表达的RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)。备选地，可以通过用本文所述的DGK抑制剂处理，产生DGK缺陷性细胞。

在一个实施方案中，T细胞群体是Ikaros缺陷的。Ikaros缺陷性细胞包括不表达Ikaros RNA或蛋白质，或Ikaros活性降低或抑制的细胞。可以通过遗传方法产生Ikaros缺陷性细胞，例如，施用减少或阻止Ikaros表达的RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)。备选地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺)处理，产生Ikaros缺陷性细胞。

在实施方案中，T细胞群体是DGK缺陷的和Ikaros缺陷的，例如，不表达DGK和Ikaros、或具有减少或抑制的DGK活性和Ikaros活性。这类DGK和Ikaros缺陷性细胞可以通过本文所述任何方法产生。

在一个实施方案中，NK细胞从受试者获得。在另一个实施方案中，NK细胞是NK细胞系，例如，NK-92细胞系(Conkwest)。

在一些方面，本发明的细胞(例如，本发明的免疫效应细胞，例如，本发明表达CAR的细胞)是诱导型多潜能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(ESC)，或是从所述iPSC和/或ESC产生(例如，从中分化)的T细胞。可以例如通过本领域已知的方法从外周血T淋巴细胞(例如，从健康志愿者分离的外周血T淋巴细胞)产生iPSC。同时，可以通过本领域已知的方法，使这类细胞分化成T细胞。参见，例如Themeli M.et al.,Nat.Biotechnol.,31,pp.928-933(2013)；doi:10.1038/nbt.2678；WO2014/165707，所述每篇文献的内容通过引用方式完整并入本文。

表达的额外物质

在另一个实施方案中，本文所述的表达CAR的免疫效应细胞还可以表达另一种物质，例如，增强表达CAR的细胞活性的物质。例如，在一个实施方案中，物质可以是抑制了抑制性分子的物质。例如，如本文所述，抑制性分子的例子包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ。在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)接合。在一个实施方案中，该物质例如包含抑制性分子的第一多肽和第二多肽，该抑制性分子如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFβ或这些分子中任一者之片段，第二多肽作为本文所述胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，该物质包含PD-1或其片段的第一多肽和本文所述胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28、CD27、OX40或4-IBB信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在实施方案中，该物质包含抑制性分子的胞外结构域的第一多肽和本文所述的共刺激分子或本文所述的初级信号传导分子的胞内信号传导结构域的第二多肽。例如WO2013/019615中进一步描述了其中抑制性分子(例如，抑制性分子的结构域)与提供正信号的分子缔合(例如，共刺激分子或初级信号传导分子的结构域)的这类分子。

在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的免疫效应细胞还可以包含第二CAR，例如针对相同靶(例如，上文描述的靶)或不同靶的例如包含不同抗原结合结构域的第二CAR。在一个实施方案中，第二CAR包含针对下述靶的抗原结合结构域，所述靶表达在与第一CAR的靶相同的癌细胞类型上。在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR，其靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域但是不包含初级信号传导结构域，和第二CAR，其靶向第二种不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域，但是不包含共刺激信号传导结构域。

不希望受理论约束的同时，将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)安置到第一CAR上，并且将初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)安置在第二CAR上可以限制CAR对表达两种靶的细胞的活性。在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR，其包含靶向例如上文所述靶的抗原结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，和第二CAR，其靶向除第一CAR靶向的抗原之外的抗原(例如，与第一靶相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR，其包含靶向例如上文所述靶的抗原结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，和第二CAR，其靶向除第一CAR靶向的抗原之外的抗原(例如，与第一靶相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。

在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞包含本文所述的CAR(例如，针对上文所述靶的CAR)和抑制性CAR。在一个实施方案中，抑制性CAR包含结合抗原的抗原结合结构域，所述抗原存在于正常细胞上，但不存在于癌细胞上，例如，存在于还表达该靶的正常细胞上。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抗原结合结构域，跨膜结构域和抑制性分子的胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFβ的胞内结构域。

在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)包含第一CAR，其包含与如本文所述的肿瘤抗原结合的抗原结合结构域，并且第二CAR，其包含PD1胞外结构域或其片段。

在一个实施方案中，细胞还包含如上文所述的抑制性分子。

在一个实施方案中，细胞中的第二CAR是抑制性CAR，其中抑制性CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和抑制性分子的胞内结构域。抑制性分子可以选自以下一种或多种：PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFβ，CEACAM-1、CEACAM-3和CEACAM-5在一个实施方案中，第二CAR分子包含PD1的胞外结构域或其片段。

在实施方案中，细胞中的第二CAR分子还包含这样的胞内信号传导结构域，其包含初级信号传导结构域和/或胞内信号传导结构域。

在其他实施方案中，细胞中的胞内信号传导结构域包含有包含CD3ζ的功能性结构域的初级信号传导结构域和包含4-1BB的功能性结构域的共刺激信号传导结构域。

在一个实施方案中，细胞中的第二CAR分子包含SEQ ID NO:6654的氨基酸序列。

在某些实施方案中，第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv并且第二CAR分子的抗原结合结构域不包含scFv。例如，第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv并且第二CAR分子的抗原结合结构域包含驼类VHH结构域。

在其他方面和实施方案，本发明的细胞，例如，工程化以表达CAR的细胞，还经工程化以表达安全分子，如当适宜时(例如，在T细胞已经实现抗肿瘤功能后或如果T细胞造成危及生命的副作用)介导细胞(例如，CAR T细胞)耗尽的某种分子(或一套分子)。在一个示例性方面，安全分子分子不影响细胞的功能，但是其可以由另一种物质(例如，靶向所述分子的抗体或ADC分子)靶向。这种分子的一个示例性实施方案是截短型受体，例如，包含受体胞外结构域和跨膜结构域，但是缺少全部或绝大部分受体胞内结构域的受体。一个例子是截短型EGFR受体，例如，如WO2011/056894中所述。不受理论约束，抗EGFR抗体(例如，西妥昔单抗)靶向所述截短型EGFR受体将耗尽表达截短型EGFR受体的细胞。第二例子是iCasp9开关多肽，例如，具有二聚化结构域、任选性接头和胱天蛋白酶结构域的多肽，所述胱天蛋白酶结构域如此取向，从而，在哺乳动物宿主细胞中二聚化化合物存在下表达时，iCasp9开关多肽同型二聚化，导致宿主细胞凋亡。在实施方案中，二聚化结构域是基于FKBP的二聚化结构域，例如，该序列携带为AP1903和AP1903结构相关配体(如AP20187)提供互补性配合空穴的突变(F37V)，所述分子可以充当二聚化化合物。这类iCasp9开关多肽(和相关的二聚化化合物)在例如，WO1997/031899、US2011/286980、WO2014/164348、WO2013/040371、US2013/071414、WO2014/255360和N Engl J Med.2011 Nov 3；365(18):1673–83中描述。这种分子的第三个例子是抗CD20抗体靶向的分子，其中，例如，施用抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)引起所述细胞耗尽。抗CD20抗体靶向的分子的例子包括CD20及其截短形式(例如，包含抗CD20抗体可识别的胞外结构域、跨膜结构域并缺少胞内结构域至少一部分的分子)。

在其他方面和实施方案，本发明的细胞，例如，工程化以表达CAR的细胞，还经工程化以表达NK抑制性分子。如本文所用，术语“NK抑制性分子”指抑制NK细胞功能(例如，溶细胞功能)的分子。不受理论约束，认为具有减少或消除的一种或多种MHC I类分子表达(例如，具有减少或消除的B2M、NLRC5和/或CIITA表达，例如，因如本文所述的靶向B2M、NLRC5和/或CIITA的CRISPR系统引入到所述细胞所致)的细胞(例如，本发明的细胞)可以由NK细胞识别为非自我，并且被靶向以进行溶细胞。因此，一种或多种NK抑制性分子在所述细胞上的表达保护它免遭NK细胞破坏。在一个方面，NK抑制性分子是NK抑制性受体的配体。NK抑制性受体的非限制性例子包括具有基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)或与之缔合的NK细胞表面受体。这类受体的非限制性例子包括2B4(也称作CD244)；NK细胞受体蛋白1(NKR-P1)家族成员(例如，NKR-P1A、NKR-P1B、NKR-P1C、NKR-P1D、NKR-P1E和NKR-P1F，例如，NKR-P1B和NKR-P1D)；癌胚抗原相关的细胞黏附分子(CEACAM)家族成员(例如，CEACAM1)；唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(SIGLEC)家族成员(例如，SIGLEC7和SIGLEC9)；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；糖蛋白49B1(gp49B1)或其人类同源物；CD81；和信号调节蛋白(SIRP)家族成员。在实施方案中，NK抑制性分子是非MHC I类分子。NK抑制性分子的非限制性例子包括前述受体的配体，例如，CD48、C型凝集素相关家族成员(例如，CLR-B(也称作OCIL)，CLR-F和CLR-G(也称作OCILrP2))、CEACAM1、展示唾液酸的多肽和αVβ3整联蛋白。在实施方案中，NK抑制性分子是天然存在分子的片段，例如，包含NK抑制性分子的胞外结构域和跨膜结构域，但是缺少胞内结构域的全部或一部分(例如，缺少胞内ITIM或抑制性结构域)。在其他实施方案中，NK抑制性分子是HLA-G分子。已经显示HLA-G停滞或减少免疫系统(例如，NK细胞)的功能。Carosella等人.,Advances in Immunol.,vol.127,第33-144页,2015；Torikai H.等人,Blood.,vol.122(8),第1341-1349页,2013。不受理论约束，HLA-G在表达CAR的细胞(例如，(例如，如本文所述的)表达CAR的同种异体细胞，例如，(例如，如本文所述的)表达CAR的具有减少或消除的TCR、(B2M或NLRC5)和/或CIITA表达的细胞)的表面上存在可以保护细胞免遭NK细胞攻击。在实施方案中，NK抑制性分子是不需要B2M的HLA-G同工型，例如，HLA-G2、HLA-G3、HLA-G4。这类实施方案对于下述本发明细胞是优选的，(例如，如本文所述的)细胞包含抑制B2M功能和/或表达的物质或系统(例如，如本文所述的CRISPR/Cas系统)。备选地，在其他实施方案中，其中(例如，如本文所述的)本发明细胞包含(或在任何时间包含)抑制B2M功能和/或表达的物质或系统(例如，如本文所述的CRISPR/Cas系统)(即，已经(例如，如本文所述)减少或消除B2M功能和/或表达的细胞)，NK抑制性分子可以是在天然条件下与B2M形成复合体的HLA-G分子，前提是NK抑制性分子包含与B2M分子的融合物。本领域已知这类融合物和用于产生它们的方法。参见，例如Favier B,HoWangYin K-Y,Wu J,Caumartin J,Daouya M等人,(2011)Tolerogenic Function of Dimeric Forms of HLA-G Recombinant Proteins:A Comparative Study In Vivo.PLoS ONE 6(7):e21011.doi:10.1371/journal.pone.0021011。在这类实施方案中，编码HLA-G:B2M融合分子的基因包含B2M编码序列(其包含靶向B2M的gRNA分子的靶序列)到这样的程度，从而可以改变所述核酸的序列以减少或消除gRNA与编码HLA-G:B2M融合物的核酸结合，因而不减少或不消除HLA-G:B2M融合物的表达和/或功能。在实施方案中，HLA-G:B2M融合物还可以包含跨膜结构域或适于附着膜锚定物分子(如GPI锚着点)的序列。下文提供示例性HLA-G:B2M融合分子(例如，HLA-G1:B2M融合分子)，(G4S)3接头(SEQ ID NO:6594)以灰色突出显示。接头可以存在或不存在，并且还可以备选地包含(例如，如本文所述的)任何肽接头。这种具体构建体具有样式B2M-接头((G4S)3)-HLA-G：

SEQ ID NO:10674

下文提供编码以上HLA-G:B2M融合物的密码子优化的示例性核酸序列：

GCC ACC ATG AGC AGA TCT GTG GCC CTG GCT GTG CTG GCC CTG CTG TCT CTG TCT GGC CTG GAA GCC ATC CAG CGG ACC CCC AAG ATC CAG GTG TAC AGC AGA CAC CCC GCC GAA AAC GGC AAG AGC AAC TTC CTG AAC TGC TAC GTG TCC GGC TTC CAC CCC AGC GAC ATC GAG GTG GAC CTG CTG AAG AAC GGC GAG CGG ATC GAA AAG GTG GAA CAT AGC GAC CTG AGC TTC AGC AAG GAC TGG TCC TTC TAC CTG CTG TAC TAC ACC GAG TTC ACC CCC ACC GAA AAG GAC GAG TAC GCC TGC AGA GTG AAC CAC GTG ACC CTG AGC CAG CCC AAG ATC GTG AAG TGG GAC CGG GAT ATG GGC GGA GGC GGA TCC GGC GGC GGA GGA TCA GGG GGG GGA GGG TCC GGA TCC CAC AGC ATG CGG TAC TTC TCT GCC GCC GTG TCC AGA CCT GGA AGA GGC GAG CCC CGG TTT ATC GCC ATG GGC TAC GTG GAC GAC ACC CAG TTC GTC AGA TTC GAC AGC GAC AGC GCC TGC CCC CGG ATG GAA CCT AGA GCA CCT TGG GTG GAA CAG GAA GGC CCC GAG TAC TGG GAG GAA GAG ACA CGG AAC ACC AAG GCC CAC GCC CAG ACC GAC AGA ATG AAC CTG CAG ACC CTG CGG GGC TAC TAC AAC CAG AGC GAG GCC AGC AGC CAC ACC CTG CAG TGG ATG ATC GGC TGC GAT CTG GGC AGC GAC GGC AGA CTG CTG AGA GGT TAC GAA CAG TAC GCC TAC GAC GGC AAG GAC TAC CTG GCC CTG AAC GAG GAC CTG CGG TCT TGG ACA GCC GCC GAT ACA GCC GCC CAG ATC AGC AAG AGA AAG TGC GAG GCC GCC AAC GTG GCC GAG CAG AGA AGG GCT TAC CTG GAA GGC ACC TGT GTG GAA TGG CTG CAT AGA TAC CTG GAA AAC GGC AAA GAG ATG CTG CAG CGG GCC GAC CCC CCT AAG ACA CAC GTG ACA CAC CAC CCC GTG TTC GAC TAC GAG GCC ACC CTG AGA TGT TGG GCC CTG GGC TTC TAT CCT GCC GAG ATC ATC CTG ACC TGG CAG AGG GAT GGC GAG GAC CAG ACC CAG GAC GTG GAA CTG GTG GAA ACC AGA CCT GCC GGC GAC GGC ACC TTC CAG AAA TGG GCT GCT GTG GTG GTG CCC AGC GGC GAA GAA CAG AGA TAC ACC TGT CAC GTG CAG CAC GAG GGC CTG CCC GAA CCC CTG ATG CTG AGA TGG AAG CAG AGC AGC CTG CCC ACC ATC CCC ATC ATG GGA ATC GTG GCC GGA CTG GTG GTG CTG GCC GCT GTC GTG ACA GGC GCT GCA GTG GCC GCC GTG CTG TGG CGG AAG AAG TCC AGC GAC TAA

SEQ ID NO:10675

下文提供可以与B2M序列组合或在其不存在下使用的另一个示例性HLA-G分子(任选的前导序列以灰色突出显示)：

SEQ ID NO:10676

在其中NK抑制性分子需要B2M并且想要减少或消除一种或多种HLA I类分子表达的其他实施方案中，可以使用这样的CRISPR/Cas系统(例如，如本文所述)，其包含有包含与NLRC5(人NLRC5：Entrez 84166；UniProt Q86WI3)的靶序列或其调节元件互补的导引结构域的gRNA，例如，包含表1中所列的针对NLRC5的导引结构域(或表1中所列的针对NLRC5的这类导引结构域的片段，例如，这类导引结构域的3’20个核苷酸)的gRNA；例如，包含由SEQ ID NO:8622至SEQ ID NO:10089中任一者或其片段(例如，其片段的3’20个核苷酸)组成导引结构域的gRNA。不受理论约束，认为减少或消除NLRC5的表达和/或功能将减少或消除一种或多种MHC I类分子的表达和/或功能，甚至在B2M存在下也是如此。参见，例如，Downs,I.,Vijayan,S.,Sidiq,T.和Kobayashi,K.S.(2016),CITA/NLRC5:A critical transcriptional regulator of MHC class I gene expression。BioFactors,42:349–357.doi:10.1002/biof.1285。

在其他实施方案中，NK抑制性分子是HLA-G的膜结合同工型，例如，HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3和/或HLA-G4。在其他实施方案中，NK抑制性分子是HLA-G的可溶性同工型，例如，sHLA-G1(脱落型)、HLA-G5、HLA-G6和/或HLA-G7。在实施方案中，NK抑制性分子选自HLA-G2、HLA-G3和HLA-G4中一者或多者。在一个实施方案中，NK抑制性分子是HLA-G2。

在其他实施方案中，NK抑制性分子是HLA-E分子。已经显示HLA-E停滞或减少NK细胞针对HLA I类阴性细胞的功能。Torikai H.等人,Blood.,vol.122(8),第1341-1349页,2013。不受理论约束，HLA-E在表达CAR的细胞(例如，(例如，如本文所述的)表达CAR的同种异体细胞，例如，(例如，如本文所述的)表达CAR的具有减少或消除的TCR、(B2M或NLRC5)和/或CIITA表达的细胞)的表面上存在可以保护细胞免遭NK细胞攻击。在一个实施方案中，NK抑制性分子是HLA-G分子和HLA-E分子。

在其中本发明细胞(例如，(例如本文所述)本发明CAR表达的细胞)经工程化以表达NK抑制性分子的实施方案中，细胞可以进一步工程化以减少或消除所述NK抑制性分子的一种或多种配体或结合配偶体(本文中称作“NK抑制性分子的靶”)的表达和/或功能。不受理论约束，认为减少或消除NK抑制性分子的靶的表达和/或功能(例如，表面表达)将通过表达NK抑制性分子，减少或避免对目的细胞(例如，(例如本文所述)本发明CAR表达的细胞)的抑制，因而改善本发明细胞(例如，(例如本文所述)本发明CAR表达的细胞)的功能。在其他实施方案中，可以通过表达NK抑制性分子的靶的显性负性突变体或片段(例如，具有修饰或(部分或完全)消除的胞内抑制性结构域(例如，一个或多个ITIM结构域)的NK抑制性分子的靶，从而当结合NK抑制性分子时不传播抑制性信号)，在目的细胞((例如，如本文所述的)本发明表达CAR的细胞)中减少或消除NK抑制性分子的抑制性作用。在其中NK抑制性分子是(例如，如本文所述的)HLA-G分子的实施方案中，NK抑制性分子的靶是LILRB1(例如，人LILRB1：Entrez：10859；UniProt Q8NHL6)。在实施方案中，通过引入NK抑制性分子的靶的核酸抑制物(例如，对LILRB1特异的shRNA或siRNA分子)，实现减少或消除NK抑制性分子的靶(例如，LILRB1)的表达和/或功能。在其他实施方案中，通过引入基因编辑系统(例如，如本文所述的CRISPR/Cas基因编辑系统)，实现减少或消除NK抑制性分子的靶(例如，LILRB1)的表达和/或功能，所述基因编辑系统识别在NK抑制性分子的靶的基因或其调节元件中的靶序列(例如，识别在LILRB1基因或其调节元件中的靶序列)，从而NK抑制性分子的靶(例如，LILRB1)的表达和/或功能减少或消除。在其中NK抑制性分子的靶是LILRB1的实施方案中，基因编辑系统是(例如，如本文所述的)CRISPR/Cas系统，所述系统包含gRNA分子，所述分子包含表6d中列出的导引结构域(或，如本文所述，包含表6d中列出的导引结构域的片段，例如，20个核苷酸片段，例如，3’20个核苷酸)。

在实施方案和方面中，本发明涉及细胞，例如，免疫效应细胞，(或所述细胞的群)，其例如包含了编码NK抑制性分子的核酸，从而NK抑制性分子在所述细胞中表达，例如，包含与细胞中起效的启动子有效连接的编码NK抑制性分子的核酸。在实施方案中，编码NK抑制性分子的核酸分子包含了编码CAR的附加序列。在实施方案中，如本文所述，编码NK抑制性分子的核酸序列和编码CAR的核酸序列与独立的启动子有效连接。在其他实施方案中，编码NK抑制性分子的核酸序列和编码CAR的核酸序列从单一启动子表达，任选地连同设置于编码两种分子的序列之间的编码可切割肽(例如，2A肽)的序列一起表达。

本发明的细胞，例如，经工程化以表达CAR的细胞，可以工程化以表达上文描述的多于一种附加分子。在实施方案中，细胞经工程化以表达(例如，如本文所述的)CAR、iCasp9开关多肽和NK抑制性分子。

在实施方案和方面中，本发明的细胞，例如，免疫效应细胞(或所述细胞的群)，例如，如本文所述的表达CAR的细胞，具有减少或消除的包含CAR分子的靶抗原(例如，本文所述的靶抗原)的蛋白质表达。可以例如通过以下方式改变这种减少或消除的包含CAR分子的靶抗原的蛋白质表达，例如使用基因编辑系统，(例如，本文所述的CRISPR基因编辑系统(例如，包含与所述基因内部靶序列互补的gRNA分子))，在编码包含靶抗原的所述蛋白质的基因序列(或其调节元件)内部引入突变(例如，插入/缺失)。不受理论约束，减少或消除的包含CAR分子的靶抗原的蛋白质表达可以保护所述表达CAR的细胞免受自我识别和/或攻击。在实施方案中，减少或消除的包含CAR分子的靶抗原的所述蛋白质表达是相对于静息细胞(例如，静息T细胞)中包含CAR分子的靶抗原的所述蛋白质的表达而言。在其他实施方案中，减少或消除的包含CAR分子的靶抗原的所述蛋白质表达是相对于活化细胞(例如，活化的T细胞，例如，通过CD3和/或CD28刺激作用或通过途径CAR分子信号传导的活化过程而活化的T细胞)中包含CAR分子的靶抗原的所述蛋白质的表达而言。

分裂的CAR

在一些实施方案中，表达CAR的细胞使用分裂的CAR。出版物WO2014/055442和WO2014/055657中更详细地描述了分裂的CAR方案。简而言之，分裂的CAR系统包含细胞，所述细胞表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如，41BB)的第一CAR，并且细胞还表达具有第二抗原结合结构域和胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活并且细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，胞内信号传导结构域被激活并且细胞杀伤活性开启。因此，表达CAR的细胞仅在两种抗原存在下完全活化。

多重CAR表达

在一个方面，本文所述的表达CAR的细胞还可以包含例如针对相同靶或不同靶(例如，除本文所述的癌相关抗原或本文所述的不同癌相关抗原之外的靶)的第二CAR，例如，包含不同抗原结合结构域的第二CAR。在一个实施方案中，第二CAR包含针对下述靶的抗原结合结构域，所述靶表达在与癌相关抗原相同的癌细胞类型上。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR，其靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但是不包含初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域，和第二CAR，其靶向第二种不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域，但是不包含共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域。不希望受理论约束的同时，将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)安置到第一CAR上，并且将初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)安置在第二CAR上可以限制CAR对表达两种靶的细胞的活性。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一癌相关抗原CAR，其包含结合本文所述靶抗原的抗原结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，和第二CAR，其靶向不同靶抗原(例如，与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR，其包含结合本文所述靶抗原的抗原结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，和第二CAR，其靶向除第一靶抗原之外的抗原(例如，与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。

在一些实施方案中，要求保护的发明包含第一和第二CAR，其中所述第一CAR和所述第二CAR之一的抗原结合结构域不包含可变轻链结构域和可变重链结构域。在一些实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR之一的抗原结合结构域是scFv，并且另一个不是scFv。在一些实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR之一的抗原结合结构域包含单一VH结构域，例如，驼类、鲨鱼或七鳃鳗单一VH结构域，或衍生自人或小鼠序列的单一VH结构域。在一些实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR之一的抗原结合结构域包含纳米体。在一些实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR之一的抗原结合结构域包含驼类VHH结构域。

端粒酶表达

尽管不希望受任何具体理论约束，在一些实施方案中，治疗性T细胞在患者中具有短期留存，原因在于T细胞中端粒缩短；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善T细胞在患者中的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”,Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如，T细胞)异位表达端粒酶亚基，例如，端粒酶(例如，TERT，例如，hTERT)的催化性亚基。在一些方面，本公开提供一种产生表达CAR的细胞的方法，包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如，端粒酶(例如，TERT，例如，hTERT)的催化性亚基)的核酸接触。细胞可以在接触编码CAR的构建体之前、与之同时或之后与核酸接触。

在其中细胞经工程化以表达多于一个分子的实施方案中，编码每种所述分子的序列(例如，编码CAR的序列和编码NK抑制性分子的序列)可以设置在相同的核酸分子(例如，相同的质粒或载体，例如，病毒载体，例如，慢病毒载体)上。在一个实施方案中，(i)如本文中所述的编码CAR的序列和(ii)如本文中所述的编码NK抑制性分子的序列可以存在于相同的核酸(例如，载体)上。可以例如通过使用独立的启动子，或通过使用双顺反子转录产物(通过切割单一翻译产物或通过翻译两种独立的蛋白质产物，所述双顺反子转录产物可以导致产生两种蛋白质)实现相应蛋白质的产生。在一个实施方案中，编码可切割肽(例如，P2A、T2A或F2A序列)的序列布置在(i)和(ii)之间。在一个实施方案中，编码IRES(例如，EMCV IRES或EV71 IRES)的序列布置在(i)和(ii)之间。在这些实施方案中，(i)和(ii)转录为单一RNA。在其他方面，每个分子可以从不同启动子表达。在一个实施方案中，第一启动子与(i)有效连接并且第二启动子与(ii)有效连接，从而(i)和(ii)转录为独立的mRNA。

备选地，编码多于一种分子的序列可以设置在不同的核酸分子(例如，不同的质粒或载体，例如，病毒载体，例如，慢病毒载体)上。例如，(i)编码如本文所述的CAR的序列可以存在于第一核酸(例如，第一载体)上，并且(ii)编码NK抑制性分子的序列可以存在于第二核酸(例如，第二载体)上。

表7.CAR的多种组分的示例性序列(aa–氨基酸，na–编码相应蛋白质的核酸)

VI.细胞

在另一个方面，本发明提供包含或在任何时间包含如本文所述的gRNA分子(例如，一种或多种gRNA分子)或如本文所述的CRISPR系统的细胞。在一个实施方案中，通过引入如本文所述的gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)或如本文所述的CRISPR系统(或编码所述CRISPR系统的一种或多种组分的核酸)，例如，通过本文所述的方法，已经改变细胞，例如已经改变gRNA分子靶向的靶序列，例如，以产生插入/缺失。在一个实施方案中，改变导致包含靶位点的基因的功能性(例如，野生型)基因产物的表达减少或无表达。

在一个方面，细胞是动物细胞。在实施方案中，细胞是哺乳动物细胞、灵长类细胞或人细胞。在实施方案中，细胞是人细胞。在实施方案中，细胞是免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)，例如T细胞或NK细胞。在实施方案中，T细胞(例如，群体T细胞)是或包含CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或其组合。在实施方案中，细胞是自体的。在实施方案中，细胞是同种异体的。

在一个优选实施方案中，细胞(例如，细胞群体)已经或将要经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)，例如，如第V中所述的CAR。在实施方案中，细胞经工程化以表达(例如，如本文所述的)BCMA CAR。在实施方案中，CAR工程化的细胞是同种异体的。在实施方案中，CAR工程化的细胞是自体的。

在另一个方面，本发明提供细胞，如上文描述的那些，其包含、在任何时间已经包含或将要包含如本文所述的第二gRNA分子，例如，导引结构域异于第一gRNA分子的第二gRNA分子。在实施方案中，二种gRNA分子与相同基因内部的靶位点互补，例如，与相同同种异体T细胞靶的基因内部的两个靶位点互补，例如，包含TRAC基因内部的两个靶位点。这类细胞可以包含位于二种gRNA分子的靶位点之间的庞大、例如，20-60、20-70、20-80、20-90、20-100个或大于1000、大于2000、大于3000、大于4000、大于5000、大于6000个碱基对的DNA切除，如本文第VIII部分中所述。备选地，二种靶向相同基因的靶序列的gRNA可以不导致切除，反而倒可以例如在每个靶向的位点或其附近产生插入/缺失。在其他实施方案中，两种或更多种gRNA分子与其基因产物缔合以形成分子复合体的两个不同基因内部的靶位点互补。这个实施方案的例子是靶向TRAC的第一gRNA分子和靶向TRBC1的第二gRNA分子(其中TCRα恒定链和TCRβ恒定链1是细胞表面上的TCR组分)。不受理论约束，相对于引入仅靶向靶基因中单一靶序列的CRISPR系统，引入靶向相同基因的两个或更多个靶序列或靶向相同分子复合体的两个或更多个基因(例如，在靶向TRAC和TRBC1的情况下)的CRISPR系统可以导致靶基因产物的表达进一步减少或消除。

在靶向不同基因(或不同分子复合物，例如，当靶向TCR和B2M时)的两个或更多个靶位点，任何或全部不同基因(或分子复合体)的本发明任何方面和实施方案中，应当理解可以相对于一种或多种所述不同的基因或不同的分子复合物，利用两种或更多种gRNA。例如，在其中减少或消除TCR表达和B2M表达的实施方案和方面中，可以例如通过一种靶向TRAC的gRNA、通过多于一种靶向TRAC的gRNA分子或通过一种靶向TRAC的gRNA分子和靶向不同TCR组分(例如，TRBC1)的第二gRNA，实现TCR表达减少或消除；与此同时或备选地，可以例如通过一种靶向B2M的gRNA分子或通过两种或更多种靶向B2M的gRNA分子实现靶向B2M。

在其他实施方案中，两种或更多种(例如两种)gRNA分子与不同基因内部的靶位点互补。这类细胞可以在每个靶位点或其附近包含改变，例如，插入/缺失，从而减少或消除多于一个基因的功能性基因产物表达。如上文讨论，在这类实施方案中，可以使用多于一种靶向每个不同基因的gRNA分子。

在实施方案中，细胞包含、已经包含或将要包含这样的第一gRNA分子，其包含与同种异体T细胞靶的靶序列互补的导引结构域(例如，表1、3、4或5中描述的导引结构域)，和这样的第二gRNA分子，其包含与抑制性分子的靶序列或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的靶序列互补的导引结构域(例如，包括表2或表6中描述的导引结构域)。在实施方案中，抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物是CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PD-L2、CTLA4、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD113)，B7-H4(VTCN1)，HVEM(TNFRSF14或CD107)，KIR、A2aR、MHC I类，MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ或PTPN11。

在实施方案中，细胞包含、已经包含或将要包含这样的第一gRNA分子，其包含与TRAC、TRBC1、TRBC2、CD247、CD3D、CD3E或CD3G的靶序列互补的导引结构域，和这样的第二gRNA分子，其包含与B2M、NLRC5、HLA-A、HLA-B或HLA-C的靶序列互补的导引结构域。

在实施方案中，本发明的细胞包含、已经包含或将要包含这样的第一gRNA分子，其包含与TRAC、TRBC1、TRBC2、CD247、CD3D、CD3E或CD3G的靶序列互补的导引结构域；这样的第二gRNA分子，其包含与B2M、NLRC5、HLA-A、HLA-B或HLA-C的靶序列互补的导引结构域；和这样的第三gRNA分子，其包含与CIITA的靶序列互补的导引结构域。不受理论约束，认为例如使用针对B2M的gRNA或针对NLRC5的gRNA，通过本文所述的方法减少或消除MHC I类分子表达可以引起修饰的细胞上调一种或多种MHC II类分子的表达。在这类环境下，为了产生例如能够避免宿主抗移植物病反应的同种异体细胞(例如，同种异体T细胞，例如，本文所述的表达CAR的同种异体T细胞)，可能有益的是例如使用针对CIITA的gRNA，通过本文所述的方法减少或消除(一种或多种MHC I类分子之外的)一种或多种MHC II类分子的表达。在一个实施方案中，(例如，如本文所述的)细胞，例如，表达CAR的细胞，包含、已经包含或将要包含(例如，如本文所述的)针对TRAC的第一gRNA、(例如，如本文所述的)针对B2M的第二gRNA和(例如，如本文所述的)针对CIITA的第三gRNA。在一个实施方案中，(例如，如本文所述的)细胞，例如，表达CAR的细胞，包含、已经包含或将要包含(例如，如本文所述的)针对TRAC的第一gRNA，(例如，如本文所述的)针对NLRC5的第二gRNA和(例如，如本文所述的)针对CIITA的第三gRNA。

在实施方案中，本发明提供(例如，如本文所述的)细胞，例如，表达CAR的细胞，其包含对编码TCR组分(例如，TRAC或TRBC(例如，TRBC1或TRBC2))的内源性基因的一个或多个修饰(例如，核苷酸插入或缺失)；对内源B2M基因的一个或多个修饰(例如，核苷酸插入或缺失)；和/或对内源CIITA基因的一个或多个修饰(例如，核苷酸插入或缺失)。在实施方案中，所述修饰减少或消除所述基因的表达。在实施方案中，本发明提供(例如，如本文所述的)细胞，例如，表达CAR的细胞，所述细胞呈TCR-(例如，具有低于未修饰的相同类型细胞超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的TCR表达水平，如通过FACS(例如，使用抗CD3抗体的FACS)检测)、B2M-(例如，具有低于未修饰的相同类型细胞超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的B2M和/或一种或多种MHC I类蛋白表达水平，如通过FACS(例如，使用抗B2M抗体的FACS)检测)和/或CIITA-(例如，具有低于未修饰的相同类型细胞超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的CIITA和/或MHC II类蛋白表达水平，如通过FACS(例如，使用抗CIITA抗体的FACS)检测)。在一个实施方案中，细胞经工程化以表达(例如，如本文所述的)CAR分子。在实施方案中，CAR是(例如，如本文所述的)CD19 CAR。在其他实施方案中，CAR是(例如，如本文所述的)BCMA CAR。在其他实施方案中，CAR是(例如，如本文所述的)CD123CAR。

在实施方案中，本发明提供(例如，如本文所述的)细胞，例如，表达CAR的细胞，其包含对编码TCR组分(例如，TRAC或TRBC(例如，TRBC1或TRBC2))的内源性基因的一个或多个修饰(例如，核苷酸插入或缺失)；对内源NLRC5基因的一个或多个修饰(例如，核苷酸插入或缺失)；和/或对内源CIITA基因的一个或多个修饰(例如，核苷酸插入或缺失)。在实施方案中，所述修饰减少或消除所述基因的表达。在实施方案中，本发明提供(例如，如本文所述的)细胞，例如，表达CAR的细胞，所述细胞呈TCR-(例如，具有低于未修饰的相同类型细胞超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的TCR表达水平，如通过FACS(例如，使用抗CD3抗体的FACS)检测)、NLRC5-(例如，具有低于未修饰的相同类型细胞超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的NLRC5和/或一种或多种MHC I类蛋白表达水平，如通过FACS(例如，使用抗NLRC5抗体的FACS)检测)和/或CIITA-(例如，具有低于未修饰的相同类型细胞超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的CIITA和/或MHC II类蛋白表达水平，如通过FACS(例如，使用抗CIITA抗体的FACS)检测)。在一个实施方案中，细胞经工程化以表达(例如，如本文所述的)CAR分子。在实施方案中，CAR是(例如，如本文所述的)CD19 CAR。在其他实施方案中，CAR是(例如，如本文所述的)BCMA CAR。在其他实施方案中，CAR是(例如，如本文所述的)CD123 CAR。

在实施方案中，细胞包含、已经包含或将要包含这样的第一gRNA分子，其包含与TRAC、TRBC1、TRBC2、CD247、CD3D、CD3E或CD3G的靶序列互补的导引结构域，和这样的第二gRNA分子，其包含与NR3C1、DCK、CD52或FKBP1A的靶序列互补的导引结构域。

在实施方案中，细胞包含、已经包含或将要包含第一gRNA分子和第二gRNA分子，其中：(1)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；(2)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；(3)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；(4)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；(5)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；(6)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；(7)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；(8)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；(9)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；(10)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；(11)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；(12)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；(13)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；(14)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；(15)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；(16)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；(17)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；(18)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；(19)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；(20)第一gRNA分子包含选自SEQ.ID NO：5644至SEQ ID NO：5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；(21)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；(22)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；(23)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；(24)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；(25)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；(26)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；(27)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；(28)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；(29)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；(30)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；(31)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；(32)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；(33)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；(34)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；(35)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；(36)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；(37)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；(38)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；(39)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；(40)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；(41)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；(42)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；(43)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；(44)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；(45)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；(46)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；(47)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；(48)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；(49)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:5492至SEQ ID NO:5527的导引结构域；(50)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:969至SEQ ID NO:1345的导引结构域；(51)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1346至SEQ ID NO:1698的导引结构域；(52)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:1699至SEQ ID NO:2068的导引结构域；(53)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2069至SEQ ID NO:2941的导引结构域；(54)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:5278至SEQ ID NO:5491的导引结构域；(55)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6227至SEQ ID NO:6324的导引结构域；(55)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:6325至SEQ ID NO:6583的导引结构域；(56)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO：5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；(57)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；(58)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；(59)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；(60)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623或SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；(61)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；(62)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；(63)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；(64)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；(65)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5624至SEQ ID NO:5643或SEQ ID NO:5966至SEQ ID NO:6097的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；(66)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；(67)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；(68)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；(69)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；(70)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:5644至SEQ ID NO:5719或SEQ ID NO:6098至SEQ ID NO:6226的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；(71)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；(72)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；(73)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；(74)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；(75)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:84至SEQ ID NO:392的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；(76)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；(77)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；(78)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；(79)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；(80)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:393至SEQ ID NO:532的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；(81)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；(82)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；(83)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；(85)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；(86)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:533至SEQ ID NO:839的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域；(87)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:2942至SEQ ID NO:3270的导引结构域；(88)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3271至SEQ ID NO:3541的导引结构域；(89)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:3542至SEQ ID NO:4032的导引结构域；(90)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4033至SEQ ID NO:4589和SEQ ID NO:5720至SEQ ID NO:5815的导引结构域；或(91)第一gRNA分子包含选自SEQ ID NO:840至SEQ ID NO:968的导引结构域，并且第二向导RNA分子包含选自SEQ ID NO:4590至SEQ ID NO:5277的导引结构域。

在实施方案中，细胞包含、已经包含或将要包含这样的第一gRNA分子，其包含有包含SEQ ID NO:5569或5586(例如，由其组成)的导引结构域，和这样的第二gRNA分子，其包含有包含SEQ ID NO:5775(例如，由其组成)的导引结构域。所述细胞优选地包含对TRAC和PDCD1的改变，从而减少或消除有功能TCR的表达和有功能PD-1的表达。在一个实施方案中，细胞是免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，细胞是同种异体的。在一个实施方案中，细胞是自体的。在一个实施方案中，细胞是或将会进一步工程化以表达如本文所述的CAR。

在本发明的实施方案中，本发明的细胞包含、已经包含或将要包含这样的第一gRNA分子，其包含与T细胞受体组分(例如，TRAC)的靶序列互补的导引结构域；这样的第二gRNA分子，其包含与B2M的靶序列互补的导引结构域；和这样的第三gRNA分子，其包含与CIITA的靶序列互补的导引结构域。所述细胞优选地在所述第一gRNA、所述第二gRNA和所述第三gRNA分子的靶序列处或其附近包含修饰，从而减少或消除有功能TCR的表达、有功能B2M的表达和有功能CIITA的表达。在一个实施方案中，细胞是免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，细胞是同种异体的。在一个实施方案中，细胞是自体的。在一个实施方案中，细胞是或将会进一步工程化以表达如本文所述的CAR。

在一个方面，本发明的细胞包含(例如，本发明的细胞群体)包含一个或多个细胞，所述细胞包含：

(a)编码(例如，如本文所述的)CAR的核酸序列；

(b)编码(例如，如本文所述的)NK抑制性分子的核酸序列，例如，编码如本文所述的HLA-G或HLA-G:B2M融合物的核酸；

(c)在编码TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)的导引结构域，例如，包含表1、表4或表5中列出的导引结构域；

(d)在编码B2M的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对B2M的导引结构域，例如，包含表1或表3中列出的导引结构域；

(e)任选地，在编码CIITA的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对CIITA的导引结构域，例如，包含表1或表6c中列出的导引结构域；和

(f)任选地，在编码LILRB1的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对LILRB1的导引结构域，例如，包含表6d中列出的导引结构域；

其中细胞(或包含一个或多个细胞的细胞群体，所述细胞)表达CAR和NK抑制性分子，并且显示以下一者或多者的表达和/或功能减少或消除：i)TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)、ii)B2M、iii)CIITA和/或iv)LILRB1。在实施方案中，插入/缺失是

在一个方面，本发明的细胞包含(例如，本发明的细胞群体包含一个或多个细胞，所述细胞包含)：

(a)例如，编码(例如，如本文所述的)CAR的核酸序列；

(b)编码(例如，如本文所述的)NK抑制性分子的核酸序列，例如，编码如本文所述的HLA-G的核酸；

(c)在编码TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)的导引结构域，例如，包含表1、表4或表5中列出的导引结构域；

(d)在编码NLRC5的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对NLRC5的导引结构域，例如，包含表1中列出的导引结构域；

(e)任选地，在编码CIITA的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对CIITA的导引结构域，例如，包含表1或表6c中列出的导引结构域；和

(f)任选地，在编码LILRB1的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对LILRB1的导引结构域，例如，包含表6d中列出的导引结构域；

其中细胞(或包含一个或多个细胞的细胞群体，所述细胞)表达CAR和NK抑制性分子，并且显示以下一者或多者的表达和/或功能减少或消除：i)TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)、ii)B2M、iii)NLRC5和/或iv)LILRB1。

在一个方面，本发明的细胞包含(例如，本发明的细胞群体包含一个或多个细胞，所述细胞包含)：

(a)编码(例如，如本文所述的)CAR的核酸序列；

(b)在编码TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)的导引结构域，例如，包含表1、表4或表5中列出的导引结构域；和

(c)在编码FKBP1A的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对FKBP1A的导引结构域，例如，包含表1或表6b中列出的导引结构域；

其中细胞(或包含一个或多个细胞的细胞群体，所述细胞)表达CAR，并且显示以下一者或多者的表达和/或功能减少或消除：i)TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)和/或ii)FKBP12。这类细胞(或包含所述细胞的细胞群体)特别可用于例如包括施用免疫抑制剂(例如，环孢菌素、雷帕霉素或雷帕霉素类似物或mTor抑制剂，例如，RAD001)的治疗方法中。

在一个方面，本发明的细胞包含(例如，本发明的细胞群体包含一个或多个细胞，所述细胞包含)：

(a)编码(例如，如本文所述的)CAR的核酸序列；

(b)编码(例如，如本文所述的)耐受雷帕霉素的mTor的核酸序列，例如，编码包含S2035突变(例如，S2035I突变)的mTor的核酸序列；和；

(c)在编码TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)的基因或其调节元件的序列处或其附近的插入/缺失，例如，在gRNA的靶序列处或其附近的插入/缺失，所述gRNA包含针对TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)的导引结构域，例如，包含表1、表4或表5中列出的导引结构域；

其中细胞(或包含一个或多个细胞的细胞群体，所述细胞)表达CAR和耐受雷帕霉素的mTor，并且显示TCR组分(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2，例如TRAC)的表达和/或功能减少或消除。这类细胞(或包含所述细胞的细胞群体)特别可用于例如包括施用免疫抑制剂(例如，环孢菌素、雷帕霉素或雷帕霉素类似物或mTor抑制剂，例如，RAD001)的治疗方法中。

在任一项前述实施方案和方面中，细胞包含一种或多种(例如，如本文所述的)CRISPR系统，其包含所示的gRNA分子。在实施方案中，细胞包含一种或多种核糖核蛋白(RNP)复合体，所述复合体各自包含(例如，如本文所述的)Cas9分子和(例如，如本文所述的)包含所示导引结构域的gRNA分子。在其中使用针对多于一个靶序列的gRNA的实施方案中，包括在本文所述的任何方法中，可以将gRNA(和包含所述gRNA的CRISPR系统)同时地引入细胞。在其中使用针对多于一个靶序列的gRNA的其他实施方案中，包括在本文所述的任何方法中，可以将gRNA(和包含所述gRNA的CRISPR系统)依次地引入细胞。

在涉及前述实施方案或方面任一项的一个方面，细胞群体包含至少20％，例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或至少99％在每种gRNA分子靶向的每个靶序列处或其附近包含插入/缺失的细胞。可以例如通过利用高效率gRNA分子(例如，在>85％暴露于所述gRNA分子的所述细胞中引起插入/缺失的gRNA分子)或通过富集所需细胞的群体，例如，通过选择所需的细胞群体，例如，通过亲和色谱或细胞分选法，获得所述群体。

VII.模板核酸(用于引入核酸)

如本文所用的术语“模板核酸”或“供体模板”指在已经借助本发明CRISPR系统修饰(例如，切割)的靶序列处或其附近待插入的核酸。在一个实施方案中，修饰在靶序列处或其附近的核酸序列以具有、一般在切割位点处或其附近具有模板核酸的一些或全部序列。在一个实施方案中，模板核酸是单链的。在替代的实施方案中，模板核酸是双链的。在一个实施方案中，模板核酸是DNA，例如，双链DNA。在替代的实施方案中，模板核酸是单链DNA。

在实施方案中，模板核酸包含编码嵌合抗原受体(CAR)(例如，如上文在第V部分中所述的CAR)的序列。

在一个实施方案中，通过参与同源性指导的修复事件，模板核酸改变靶位置的结构。在一个实施方案中，模板核酸改变靶位置的序列。在一个实施方案中，模板核酸导致修饰或非天然存在的碱基掺入靶核酸。

可以使用本文中讨论的一个方案，校正在本文所述的基因或途径中的突变。在一个实施方案中，使用模板核酸，通过同源性指导的修复(HDR)，校正在本文所述的基因或途径中的突变。在一个实施方案中，使用模板核酸，通过同源重组(HR)，校正在本文所述的基因或途径中的突变。在一个实施方案中，使用模板核酸，通过非同源末端接合(NHEJ)修复，校正在本文所述的基因或途径中的突变。在其他实施方案中，编码目的分子的核酸可以在本发明CRISPR系统修饰的位点处或其附近插入。在一个实施方案中，插入的核酸编码如本文所述的嵌合抗原受体。在实施方案中，模板核酸包含与编码目的分子(例如(例如，如本文所述的)嵌合抗原受体)的核酸序列有效连接的调节元件，例如，一个或多个启动子和/或增强子。

HDR修复和模板核酸

如本文所述的，核酸酶诱导的同源性指导的修复(HDR)可以用来改变靶序列和校正(例如，修复或编辑)基因组中的突变。不希望受理论约束的同时，认为靶序列的改变因同源性指导的修复(HDR)连同供体模板或模板核酸而发生。例如，供体模板或模板核酸引起靶序列的改变。构思了可以用作同源重组模板的质粒供体。进一步构思，通过靶序列和供体模板之间替代性同源性指导修复方法(例如，单链复性)，单链供体模板可以作为模板用于改变靶序列。供体模板实现的靶序列改变取决于借助Cas9分子的切割作用。借助Cas9的切割作用可以包含一个双链断口或二个单链断口。

在一个实施方案中，可以通过单一双链断口或二个单链断口，校正突变。在一个实施方案中，突变可以是通过下述方式得到校正：(1)单一双链断口，(2)二个单链断口，(3)二个双链断口，其中断口出现在靶序列的每侧上，(4)一个双链断口和二个单链断口，其中双链断口和二个单链断口之一出现在靶序列的每侧上或(5)四个单链断口，其中在靶序列的每侧上出现一对单链断口。

双链断口介导的校正

在一个实施方案中，通过具有与HNH样结构域相关的切割活性和与RuvC样结构域(例如，N末端RuvC样结构域)相关的切割活性的Cas9分子(例如，野生型Cas9)，实现双链切割。这类实施方案仅需要单一gRNA。

单链断口介导的校正

在一个实施方案中，通过具有切刻酶活性(例如，与HNH样结构域相关的切割活性或与N末端RuvC样结构域相关的切割活性)的Cas9分子，实现二个单链断口或切刻。这类实施方案需要二个gRNA，每个用于置入每个单链断口。在一个实施方案中，具有切刻酶活性的Cas9分子切割杂交于gRNA的链，但不切割与杂交于gRNA的链互补的链。在一个实施方案中，具有切刻酶活性的Cas9分子不切割杂交于gRNA的链，反而切割与杂交于gRNA的链互补的链。

在一个实施方案中，切刻酶具有HNH活性，例如，令RuvC活性失活的Cas9分子，例如，具有D10处突变(例如，D10A突变)的Cas9分子。D10A失活RuvC；因此，Cas9切刻酶(仅)具有HN H活性并且将在与gRNA杂交的链(例如，其上没有NGG PAM的互补链)上切割。在其他实施方案中，具有H840突变(例如，H840A)的Cas9分子可以用作切刻酶。H840A失活HNH；因此，Cas9切刻酶(仅)具有RuvC活性并且在非互补链(例如，具有NGG PAM且其序列与gRNA相同的链)上切割。

在其中切刻酶和二种gRNA用来定位二个单链切刻的实施方案中，一个切刻在靶核酸的正链上并且一个切刻在其负链上。PAM面向外部。可以选择gRNA，从而gRNA由约0-50、0-100或0-200个核苷酸分隔。在一个实施方案中，与二种gRNA的导引结构域互补的靶序列之间不存在重叠。在一个实施方案中，这些gRNA不重叠并且由多达50、100或200个核苷酸分隔。在一个实施方案中，二种gRNA使用可以(例如，通过减少脱靶结合)增加特异性(Ran等人,CELL 2013)。

在一个实施方案中，单个切刻可以用来诱导HDR。本文中构思单个切刻可以用来增加给定切割位点处HDR、HR或NHEJ的比率。

相对于靶位置安置双链断口或单链断口

在链之一中的双链断口或单链断口应当充分接近于靶位置，从而校正过程出现。在一个实施方案中，该距离不多于50、100、200、300、350或400个核苷酸。尽管不希望受理论约束，但认为断口应当充分接近于靶位置，从而断口位于末端切除期间受核酸外切酶介导的移除的区域内部。如果靶位置和断口之间的距离太大，则突变可能未纳入末端切除中，并且，因此，可能未被校正，因为供体序列仅可以用来校正末端切除区域内部的序列。

在一个实施方案中，其中gRNA(单分子(或嵌合)或模块化gRNA)和Cas9核酸酶诱导双链断口，目的在于诱导HDR介导的或HR介导的校正，切割位点距靶位置0-200bp之间(例如，0至175、0至150、0至125、0至100、0至75、0至50、0至25、25至200、25至175、25至150、25至125、25至100、25至75、25至50、50至200、50至175、50至150、50至125、50至100、50至75、75至200、75至175、75至150、75至125、75至100bp之间)。在一个实施方案中，切割位点距靶位置0-100bp(例如，0至75、0至50、0至25、25至100、25至75、25至50、50至100、50至75或75至100bp之间)。

在一个实施方案中，其中两个与Cas9切刻酶复合的gRNA(分别为单分子(或嵌合)或模块化gRNA)诱导两个单链断口，目的在于诱导HDR介导的校正，近端切割距靶位置0-200bp之间(例如，0至175、0至150、0至125、0至100、0至75、0至50、0至25、25至200、25至175、25至150、25至125、25至100、25至75、25至50、50至200、50至175、50至150、50至125、50至100、50至75、75至200、75至175、75至150、75至125、75至100bp之间)并且二种切刻将理想地位于彼此25-55bp之间(例如，25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、30至55、30至50、30至45、30至40、30至35、35至55、35至50、35至45、35至40、40至55、40至50、40至45bp之间)内部并且彼此距离不多于100bp(例如，彼此距离不多于90、80、70、60、50、40、30、20、10或5bp)。在一个实施方案中，切割位点距靶位置0-100bp之间(例如，0至75、0至50、0至25、25至100、25至75、25至50、50至100、50至75或75至100bp之间)。

在一个实施方案中，将二个gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA)设置成在靶位置的两侧上定位双链断口。在替代实施方案中，将三个gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA)设置成在靶位置的任一侧上定位双链断口(即，一个gRNA与Cas9核酸酶复合)和二个单链断口或配对的单链断口(即，二个gRNA与Cas9切刻酶复合)(例如，第一gRNA用来靶向靶位置的上游(即，5')并且第二gRNA用来靶向靶位置的下游(即，3'))。在另一个实施方案中，将四个gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA)设置成在靶位置的任一侧上生成两对单链断口(即，两对的二个gRNA与Cas9切刻酶复合)(例如，第一gRNA用来靶向靶位置的上游(即，5')并且第二gRNA用来靶向靶位置的下游(即，3'))。双链断口或某个对子中二个单链切刻的较近者将理想地位于靶位置的0-500bp范围内(例如，距靶位置不多于450、400、350、300、250、200、150、100、50或25bp)。当使用切刻酶时，某个对子中的二个切刻彼此处于25-55bp中(例如，25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、50至55、45至55、40至55、35至55、30至55、30至50、35至50、40至50、45至50、35至45或40至45bp之间)范围内并且彼此距离不多于100bp(例如，不多于90、80、70、60、50、40、30、20或10bp)。

在一个实施方案中，将二个gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA)设置成在靶位置的两侧上定位双链断口。在替代实施方案中，将三个gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA)设置成在两个靶序列上定位双链断口(即，一个gRNA与Cas9核酸酶复合)和二个单链断口或配对单链断口(即，二个gRNA与Cas9切刻酶复合)(例如，第一gRNA用来靶向插入位点的上游(即，5')靶序列并且第二gRNA用来靶向其下游(即，3')靶序列)。在另一个实施方案中，设置四个gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA)以在插入位点的任一侧上生成两对单链断口(即，两对的二个gRNA与Cas9切刻酶复合)(例如，第一gRNA用来靶向本文所述的上游(即，5')靶序列并且第二gRNA用来靶向本文所述的下游(即，3')靶序列)。双链断口或某个对子中二个单链切刻的较近者将理想地位于靶位置的0-500bp范围内(例如，距靶位置不多于450、400、350、300、250、200、150、100、50或25bp)。当使用切刻酶时，某个对子中的二个切刻彼此处于25-55bp(例如，25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、50至55、45至55、40至55、35至55、30至55、30至50、35至50、40至50、45至50、35至45或40至45bp之间)的范围内并且彼此远离不多于100bp(例如，不多于90、80、70、60、50、40、30、20或10bp)。

同源性臂的长度

同源性臂应当延伸至少远及其中末端切除可以发生的区域，例如，目的是允许切除的单链突出端找到供体模板内部的互补区域。总体长度可能受如质粒大小或病毒包装限值等参数限制。在一个实施方案中，同源性臂不延伸入重复的元件，例如，ALU重复序列、LINE重复序列。模板可以具有长度相同或不同的二条同源性臂。

示例性同源性臂长度包括至少25、50、100、250、500、750或1000个核苷酸。

如本文所用，靶位置指受Cas9分子依赖性过程修饰的在靶核酸(例如，染色体)上的位点。例如，靶位置可以是靶核酸的修饰的Cas9分子切割和模板核酸指导的靶位置修饰(例如，校正)。在一个实施方案中，靶位置可以是向其添加一个或多个核苷酸的靶核酸上二个核苷酸(例如，相邻核苷酸)之间的位点。靶位置可以包含借助模板核酸改变(例如，校正)的一个或多个核苷酸。在一个实施方案中，靶位置位于靶序列(例如，与gRNA结合的序列)内部。在一个实施方案中，靶位置在靶序列(例如，与gRNA结合的序列)的上游或下游。

一般，模板序列经历断口介导或催化的与靶序列的重组。在一个实施方案中，模板核酸包含序列，所述序列对应于靶序列上由Cas9介导的切割事件切割的位点。在一个实施方案中，模板核酸包含序列，所述序列对应于靶序列上第一Cas9介导的切割事件中被切割的第一位点和靶序列上第二Cas9介导的切割事件中被切割的第二位点。

在一个实施方案中，模板核酸可以包含在已翻译序列的编码性序列中导致改变的序列，例如，导致蛋白质产物中一个氨基酸置换成另一个氨基酸，例如，将突变等位基因转变成野生型等位基因、将野生型等位基因转化成突变等位基因和/或引入终止密码子、插入氨基酸残基、删除氨基酸残基或无义突变的一个序列。

在其他实施方案中，模板核酸可以包含在非编码序列中产生改变(例如，在外显子中或在5'或3'非翻译或非转录的区域中产生改变)的序列。这类改变包括在控制元件(例如，启动子、增强子)中的改变和在顺式作用或反式作用控制元件中的改变。

模板核酸可以包含这样的序列，所述序列整合时导致：

减少正向控制元件的活性；

增加正向控制元件的活性；

减少负向控制元件的活性；

增加负向控制元件的活性；

减少基因的表达；

增加基因的表达；

增加对病症或疾病抗性；

增加对病毒进入的抵抗性；

校正突变或改变不想要的氨基酸残基

赋予、增加、消除或减少基因产物的生物学特性，例如，增加酶的酶活性或增加基因产物与另一种分子相互作用的能力。

模板核酸可以包含这样的序列，所述序列导致：

靶序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个核苷酸的序列改变。

在一个实施方案中，模板核酸具有20+/-10、30+/-10、40+/-10、50+/-10、60+/-10、70+/-10、80+/-10、90+/-10、100+/-10、110+/-10、120+/-10、130+/-10、140+/-10、150+/-10、160+/-10、170+/-10、180+/-10、190+/-10、200+/-10、210+/-10、220+/-10、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-2000、2000-3000个或超过3000个核苷酸长度。

模板核酸包含以下组分：

[5'同源性臂]-[插入序列]-[3'同源性臂]。

同源性臂引起重组入染色体，这可以用替换序列替换不想要的原件，例如，突变或特征标识。在一个实施方案中，同源性臂在最远端切割位点侧翼。

在一个实施方案中，5'同源性臂的3’端是紧邻替换序列5'端的位置。在一个实施方案中，5'同源性臂可以从替换序列5'端起5'延伸至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000个核苷酸。

在一个实施方案中，3'同源性臂的5’端是紧邻替换序列3'端的位置。在一个实施方案中，3'同源性臂可以从替换序列3'端起3'延伸至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000个核苷酸。

本文中构思可以缩短一个或两个同源性臂以避免包含某些序列重复元件，例如，Alu重复序列、LINE元件。例如，可以缩短5'同源性臂以避开序列重复元件。在其他实施方案中，可以缩短3'同源性臂以避开序列重复元件。在一些实施方案中，可以缩短5'和3'同源性臂以避免包含某些序列重复元件。

本文中构思，校正突变的模板核酸可以作为单链寡核苷酸(ssODN)设计。当使用ssODN时，5'和3'同源性臂可以具有直至约200个碱基对(bp)长度，例如，至少25、50、75、100、125、150、175或200bp长度。因为进行寡核苷酸合成的持续改进，所以还构思较长的同源性臂为ssODN。

在一个方面，插入序列包含编码(例如，如本文所述的)嵌合抗原受体的核酸序列。在一个实施方案中，插入序列还包含与编码嵌合抗原受体的核酸序列有效连接的启动子，例如，EF-1α启动子。在一个方面，插入序列包含了编码(例如，如本文所述的)嵌合抗原受体或其部分的载体。

基因打靶的NHEJ方法

如本文所述，核酸酶诱导的非同源末端接合(NHEJ)可以用来靶向基因特异性敲除。核酸酶诱导的NHEJ也可以用来移除(例如，删除)目的基因中的序列。

不希望受理论约束的同时，认为，在一个实施方案中，与本文所述方法相关的基因组改变依赖于核酸酶诱导的NHEJ和NHEJ修复途径的易错性质。NHEJ通过将DNA中二个末端连接在一起，修复DNA中的双链断口；然而，通常，只有二个相容性末端完全如它们由双链断口形成那样完美连接，才恢复原始序列。在重接合末端之前，双链断口的DNA末端频繁在一条链或两条链处遭酶促过程作用，导致添加或移除核苷酸。这导致DNA序列中NHEJ修复部位处存在插入突变和/或缺失(插入/缺失)突变。三分之二的这些突变可以改变可读框并因此产生无功能的蛋白质。另外，维持可读框，但是插入或删除明显数量序列的突变可以摧毁蛋白质的功能。这是基因座依赖的，因为蛋白质的关键功能性结构域中的突变多半比其非关键功能性结构域中的突变更不可忍受。

NHEJ产生的插入/缺失突变本质上不可预测；然而，在给定的断口位点处，某些插入/缺失序列有利并在群体中过度表现。缺失的长度可以广泛地变动；最常见地在1-50bp范围，但是它们可以轻易地达到大于100-200bp。插入倾向于较短并且经常包含紧邻断口位点周围的序列的短复制。但是，可以获得巨大插入，并且在这些情况下，插入序列经常追溯至基因组的其他区域或追溯至细胞中存在的质粒DNA。

因为NHEJ是致突变过程，所以它也可以用来删除小序列基序，只要不要求产生特定最终序列即可。如果靶向短靶序列附近的双链断口，NHEJ修复引起的缺失突变经常跨越并因此移走不想要的核苷酸。为了缺失较大的DNA区段，引入二个双链断口(序列的每侧上一个)NHEJ可以在末端之间移除整个间插序列。这两种方案均可以用来删除特定DNA序列；然而，NHEJ的易错性质仍可能在修复部位产生插入/缺失突变。

双链切割性Cas9分子和单链切割性或切刻酶Cas9分子均可以用于本文所述的方法和组合物中，以产生NHEJ介导的插入/缺失。靶向该基因(例如，目的基因的编码区，例如，早期编码区)的NHEJ介导的插入/缺失可以用来敲除目的基因(即，消除其表达)。例如，目的基因的早期编码区包含在编码性序列的第一外显子内部或在转录起始位点的500bp(例如，小于500、450、400、350、300、250、200、150、100或50bp)内部紧邻转录起始位点之后的序列。

相对于靶位置安置双链或单链断口

在一个实施方案中，其中为了诱导NHEJ介导的插入/缺失，gRNA和Cas9核酸酶产生双链断口，将gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA分子)设置成紧邻靶位置的核苷酸定位一个双链断口。在一个实施方案中，切割位点远离靶位置0-500bp(例如，离靶位置小于500、400、300、200、100、50、40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1bp)。

在一个实施方案中，其中为了诱导NHEJ介导的插入/缺失，与Cas9切刻酶复合的二个gRNA诱导二个单链断口，将两个gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA分子)设置成定位二个单链断口以提供靶位置的核苷酸供NHEJ修复。在一个实施方案中，将gRNA设置成基本上模拟双链断口的在不同链上的相同位置或彼此的一些核苷酸范围内定位切口。在一个实施方案中，更近的切刻距靶位置0-30bp(例如，距靶位置小于30、25、20、1、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1bp)，并且二个切刻处于彼此25-55bp(例如，25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、50至55、45至55、40至55、35至55、30至55、30至50、35至50、40至50、45至50、35至45或40至45bp之间)范围内并且彼此距离不多于100bp(例如，不多于90、80、70、60、50、40、30、20或10bp)。在一个实施方案中，将gRNA设置成在靶位置的核苷酸任一侧上安置单链断口。

双链切割性Cas9分子和单链切割性或切刻酶Cas9分子均可以用于本文所述的方法和组合物中，以在靶位置的双侧上产生断口。可以在靶位置的双侧上产生双链断口或配对的单链断口以移除二个切口之间的核酸序列(例如，删除二个断口之间的区域)。在一个实施方案中，将二个gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA)设置成在靶位置的两侧上定位双链断口(例如，第一gRNA用来靶向本文所述的基因或途径中突变的上游(即，5')并且第二gRNA用来靶向本文所述的基因或途径中突变的下游(即，3'))。在替代实施方案中，将三个gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA)设置成在靶位置的任一侧上定位双链断口(即，一个gRNA与Cas9核酸酶复合)和二个单链断口或配对的单链断口(即，二个gRNA与Cas9切刻酶复合)(例如，第一gRNA用来靶向本文所述的基因或途径中突变的上游(即，5')并且第二gRNA用来靶向本文所述的基因或途径中突变的下游(即，3'))。在另一个实施方案中，将四个gRNA(例如，独立地，单分子(或嵌合)或模块化gRNA)设置成在靶位置的任一侧上生成两对单链断口(即，两对二个gRNA与Cas9切刻酶复合)(例如，第一gRNA用来靶向本文所述的基因或途径中突变的上游(即，5')并且第二gRNA用来靶向本文所述的基因或途径中突变的下游(即，3'))。双链断口或某个对子中二个单链切刻的较近者将理想地位于靶位置的0-500bp范围内(例如，离靶位置不多于450、400、350、300、250、200、150、100、50或25bp)。当使用切刻酶时，某个对子中的二个切刻彼此处于25-55bp(例如，25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、50至55、45至55、40至55、35至55、30至55、30至50、35至50、40至50、45至50、35至45或40至45bp之间的)范围内并且彼此远离不多于100bp(例如，不多于90、80、70、60、50、40、30、20或10bp)。

VIII.包含多于一种gRNA分子的系统

尽管不希望受理论约束，本文中已经令人惊讶地显示，靶向连续核酸上紧邻存在的两个靶序列(例如，通过各自在其相应靶序列处或其附近诱导单链或双链断口的二种gRNA分子/Cas9分子复合体)诱导切除(例如，缺失)位于两个靶序列之间的核酸序列(或至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％核酸序列)。在一些方面，本公开提供包含导引结构域的两种或更多种gRNA分子的用途，所述导引结构域靶向连续核酸(例如，染色体，例如，基因或基因座，包括其内含子、外显子和调节元件)上紧邻的靶序列。该用途可以例如将两种或更多种gRNA分子，连同一种或多种Cas9分子(或编码两种或更多种gRNA分子和/或一种或多种Cas9分子的核酸)引入细胞。

在一些方面，两个或更多个gRNA分子的靶序列在连续核酸上相隔5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000或70000个核苷酸，但在连续核酸上相隔不多于10000个核苷酸。在一个实施方案中，靶序列相隔约4000个核苷酸。在一个实施方案中，靶序列相隔约6000个核苷酸。

在一些方面，多种gRNA分子各自靶向相同基因或基因座内部的序列。在另一个方面，多种gRNA分子各自靶向2个或更多个不同基因内部的序列。

在一些方面，本发明提供组合物和细胞，其包含本发明的多种(例如，2种或更多种，例如，2种)gRNA分子，其中多种gRNA分子靶向间隔小于10,000、小于9,000、小于8,000、小于7,000、小于6,000、小于5,000、小于4,000、小于3,000、小于2,000、小于1,000、小于900、小于800、小于700、小于600、小于500、小于400、小于300、小于200、小于100、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40或小于30个核苷酸的序列。在一个实施方案中，靶序列在双链体核酸的相同链上。在一个实施方案中，靶序列在双链体核酸的不同链上。

在一个实施方案中，本发明提供一种用于切除(例如，缺失)设置在二个gRNA结合位点之间的核酸的方法，所述结合位点在双链体核酸的相同或不同链上相隔小于10,000、小于9,000、小于8,000、小于7,000、小于6,000、小于5,000、小于4,000、小于3,000、小于2,000、小于1,000、小于900、小于800、小于700、小于600、小于500、小于400、小于300、小于200、小于100、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40或少于30个核苷酸设置。在一个实施方案中，该方法引起多于50％、多于60％、多于70％、多于80％、多于85％、多于86％、多于87％、多于88％、多于89％、多于90％、多于91％、多于92％、多于93％、多于94％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％、多于99％、或100％设置在与每个gRNA结合位点相关的PAM位点之间的核苷酸缺失。在实施方案中，缺失还包含与每个gRNA结合位点相关的一个或多个PAM位点内部的一个或多个核苷酸。在实施方案中，缺失还包含与每个gRNA结合位点相关的PAM位点之间区域以外的一个或多个核苷酸。

在一个方面，两个或更多个gRNA分子包含靶向在基因调节元件(例如，启动子结合位点、增强子区或阻遏蛋白区)旁侧分布的靶序列的导引结构域，从而切除间插序列(或一部分间插序列)造成目的基因上调或下调。

在一个实施方案中，两种或更多种gRNA分子选自表1的gRNA分子。在多个方面，两种或更多种gRNA分子包含与相同基因中序列互补的导引结构域。在多个方面，两种或更多种gRNA分子包含与不同基因中序列互补的导引结构域。在一个实施方案中，两种或更多种gRNA分子选自表2的gRNA分子。在多个方面，两种或更多种gRNA分子包含与相同基因中序列互补的导引结构域。在多个方面，两种或更多种gRNA分子包含与不同基因中序列互补的导引结构域。在一个实施方案中，两个或更多个gRNA分子选自表3的gRNA分子。在一个实施方案中，两种或更多种gRNA分子选自表4的gRNA分子。在一个实施方案中，两种或更多种gRNA分子选自表5的gRNA分子。在一个实施方案中，两种或更多种gRNA分子选自表6的gRNA分子。在一个实施方案中，第一和第二gRNA分子选自表1-6并且选自不同的表，例如，并且包含与不同基因的序列互补的导引结构域。在实施方案中，这两种或更多种gRNA分子可以另外与一种或多种与不同基因的靶结构域互补的附加gRNA分子组合，如本文所述。

在利用两种或更多种(例如，两种)gRNA分子的本发明方面，可能特别有用的是第一gRNA分子(或多于一种gRNA分子)包含对TRAC序列特异的导引结构域并且第二gRNA分子(或多于一种gRNA分子)包含对B2M序列特异的导引结构域。在这些方面，特别优选针对TRAC的第一gRNA分子包含图12的任何gRNA分子的导引结构域，并且针对B2M的第二gRNA分子包含图14的任何gRNA分子的导引结构域。在一个方面，针对TRAC的第一gRNA分子包含有包含SEQ ID NO:5569、SEQ ID NO:5587、SEQ ID NO:5592或SEQ ID NO:5586(例如，由其组成)的导引结构域，并且针对B2M的第二gRNA分子包含有包含SEQ ID NO:5496、SEQ ID NO:5498或SEQ ID NO:5509(例如，由其组成)的导引结构域。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在任一项前述组合中，本发明的方面或实施方案可以另外包含这样的第三gRNA分子(或多于一种gRNA分子)，其包含对(例如，如本文所述的)、例如本文在表6c中所述的CIITA序列特异的导引结构域。

在利用两种或更多种(例如，两种)gRNA分子的本发明方面，可能特别有用的是第一gRNA分子包含对TRBC(例如，TRBC1或TRBC2)序列特异的导引结构域并且第二gRNA分子包含对B2M序列特异的导引结构域。在这些方面，特别优选针对TRBC的第一gRNA分子包含图13的任何gRNA分子的导引结构域，并且针对B2M的第二gRNA分子包含图14的任何gRNA分子的导引结构域。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5719和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5694和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5706和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5696和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5711和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5708和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5709和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5712和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5703和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5707和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5687和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5705和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5713和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5715和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5519，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5494，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5508，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5514，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5710和SEQ ID NO:5492，例如，由其组成。在任一项前述组合中，本发明的方面或实施方案可以另外包含这样的第三gRNA分子(或多于一种gRNA分子)，其包含对(例如，如本文所述的)、例如本文在表6c中所述的CIITA序列特异的导引结构域。

在利用两种或更多种(例如，两种)gRNA分子的本发明方面，可能特别有用的是第一gRNA分子包含对TRAC序列特异的导引结构域并且第二gRNA分子包含对PDCD1序列特异的导引结构域。在这些方面，特别优选针对TRAC的第一gRNA分子包含图12的任何gRNA分子的导引结构域，并且针对PDCD1的第二gRNA分子包含图16的任何gRNA分子的导引结构域。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5497，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5499，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5498，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5503，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5496，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5507，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5515，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5493，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5506，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5509，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5517，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5521，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5520，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5569和SEQ ID NO:5500，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5585和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5592和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5601和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5589和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5600和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5594和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5571和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5593和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5574和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5598和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5586和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5599和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5591和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5568和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5610和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5608和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5617和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5619和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5743，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5798，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5748，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5722，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5800，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5735，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5724，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5731，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5725，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5775，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5766，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5727，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5744，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5751，例如，由其组成。在一个方面，第一gRNA分子和第二gRNA分子包含导引结构域，所述导引结构域分别地包含SEQ ID NO:5620和SEQ ID NO:5734，例如，由其组成。

如本文所述，构思产生(例如，如本文所述的)细胞(或细胞群体)，例如，免疫效应细胞，例如，表达CAR的免疫效应细胞，其具有减少或消除的TRAC、B2M和CIITA表达。尽管构思可以组合使用包含本文公开的针对这些靶中每者的任何导引结构域的gRNA，但下表33中提供了例如待组合使用的特别优选的导引结构域序列。在实施方案中，每种gRNA分子以双重向导RNA样式提供并且包含这样的crRNA，其包含序列[导引结构域]-SEQ ID NO:6607，例如，由其组成，和这样的tracr，其包含SEQ ID NO:6660的序列，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:6601，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:7811，例如，由其组成。在实施方案中，一种或多种gRNA分子，例如，全部gRNA分子，额外地包含本文所述的一个或多个修饰，例如，包含一个或多个(例如，3个)3’和/或5’硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，3个)3’和/或5’2’-OMe修饰。在实施方案中，每种gRNA分子与(例如，本文所述的)Cas9分子复合并且作为RNP例如，通过电穿孔递送至细胞(或(例如，如本文所述的)细胞群体)。在实施方案中，将包含每种gRNA分子的RNP与细胞混合并同时引入，例如，通过单一电穿孔步骤同时引入。在其他实施方案中，可以依次引入RNP。在实施方案中，构思减少或消除(如此处)细胞中B2M和CIITA二者表达的情况下，细胞可以进一步工程化以表达(例如，如本文所述的)NK抑制性分子，例如，本文所述的HLA-G:B2M融合物。

表33：可以组合使用以减少或消除细胞中TRAC、B2M和CIITA表达的第一、第二和第三gRNA分子的优选导引结构域的例子(如本文所述)。

特别优选的组合包括组合A1至A4、组合A5至A8、组合A37至A40或组合A41至A44。

如本文所述，构思产生(例如，如本文所述的)细胞(或细胞群体)，例如，免疫效应细胞，例如，表达CAR的免疫效应细胞，其具有减少或消除的CD3E、B2M和CIITA表达。尽管构思可以组合使用包含本文公开的针对这些靶中每者的任何导引结构域的gRNA，但下表34中提供了例如待组合使用的特别优选的导引结构域序列。在实施方案中，每种gRNA分子以双重向导RNA样式提供并且包含这样的crRNA，其包含序列[导引结构域]-SEQ ID NO:6607，例如，由其组成，和这样的tracr，其包含SEQ ID NO:6660的序列，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:6601，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:7811，例如，由其组成。在实施方案中，一种或多种gRNA分子，例如，全部gRNA分子，额外地包含本文所述的一个或多个修饰，例如，包含一个或多个(例如，3个)3’和/或5’硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，3个)3’和/或5’2’-OMe修饰。在实施方案中，每种gRNA分子与(例如，本文所述的)Cas9分子复合并且作为RNP例如，通过电穿孔递送至细胞(或(例如，如本文所述的)细胞群体)。在实施方案中，将包含每种gRNA分子的RNP与细胞混合并同时引入，例如，通过单一电穿孔步骤同时引入。在其他实施方案中，可以依次引入RNP。在实施方案中，构思减少或消除(如此处)细胞中B2M和CIITA二者表达的情况下，细胞可以进一步工程化以表达(例如，如本文所述的)NK抑制性分子，例如，本文所述的HLA-G:B2M融合物。

表34：可以组合使用以减少或消除细胞中CD3E、B2M和CIITA表达的第一、第二和第三gRNA分子的优选导引结构域的例子(如本文所述)。

如本文所述，构思产生(例如，如本文所述的)细胞(或细胞群体)，例如，免疫效应细胞，例如，表达CAR的免疫效应细胞，其具有减少或消除的TRBC、B2M和CIITA表达。尽管构思可以组合使用包含本文公开的针对这些靶中每者的任何导引结构域的gRNA，但下表38中提供了例如待组合使用的特别优选的导引结构域序列。在实施方案中，每种gRNA分子以双重向导RNA样式提供并且包含这样的crRNA，其包含序列[导引结构域]-SEQ ID NO:6607，例如，由其组成，和这样的tracr，其包含SEQ ID NO:6660的序列，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:6601，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:7811，例如，由其组成。在实施方案中，一种或多种gRNA分子，例如，全部gRNA分子，额外地包含本文所述的一个或多个修饰，例如，包含一个或多个(例如，3个)3’和/或5’硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，3个)3’和/或5’2’-OMe修饰。在实施方案中，每种gRNA分子与(例如，本文所述的)Cas9分子复合并且作为RNP例如，通过电穿孔递送至细胞(或(例如，如本文所述的)细胞群体)。在实施方案中，将包含每种gRNA分子的RNP与细胞混合并同时引入，例如，通过单一电穿孔步骤同时引入。在其他实施方案中，可以依次引入RNP。在实施方案中，构思减少或消除(如此处)细胞中B2M和CIITA二者表达的情况下，细胞可以进一步工程化以表达(例如，如本文所述的)NK抑制性分子，例如，本文所述的HLA-G:B2M融合物。

表38：可以组合使用以减少或消除细胞中TRBC、B2M和CIITA表达的第一、第二和第三gRNA分子的优选导引结构域的例子(如本文所述)。

特别优选的组合包括组合F1至F4、组合F5至F8、组合F13至F16或组合F17至F20。

如本文所述，构思产生(例如，如本文所述的)细胞(或细胞群体)，例如，免疫效应细胞，例如，表达CAR的免疫效应细胞，其具有减少或消除的CD3E和FKBP1A表达。尽管构思可以组合使用包含本文公开的针对这些靶中每者的任何导引结构域的gRNA，但下表35中提供了例如待组合使用的特别优选的导引结构域序列。在实施方案中，每种gRNA分子以双重向导RNA样式提供并且包含这样的crRNA，其包含序列[导引结构域]-SEQ ID NO:6607，例如，由其组成，和这样的tracr，其包含SEQ ID NO:6660的序列，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:6601，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:7811，例如，由其组成。在实施方案中，一种或多种gRNA分子，例如，全部gRNA分子，额外地包含本文所述的一个或多个修饰，例如，包含一个或多个(例如，3个)3’和/或5’硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，3个)3’和/或5’2’-OMe修饰。在实施方案中，每种gRNA分子与(例如，本文所述的)Cas9分子复合并且作为RNP例如，通过电穿孔递送至细胞(或细胞群体)。在实施方案中，将包含每种gRNA分子的RNP与细胞混合并同时引入，例如，通过单一电穿孔步骤同时引入。在其他实施方案中，可以依次引入RNP。

表35：可以组合使用以减少或消除细胞中CD3E和FKBP1A表达的第一、第二和(任选地)第三gRNA分子的优选导引结构域的例子(如本文所述)。

如本文所述，构思产生(例如，如本文所述的)细胞(或细胞群体)，例如，免疫效应细胞，例如，表达CAR的免疫效应细胞，其具有减少或消除的TRAC和FKBP1A表达。尽管构思可以组合使用包含本文公开的针对这些靶中每者的任何导引结构域的gRNA，但下表36中提供了例如待组合使用的特别优选的导引结构域序列。在实施方案中，每种gRNA分子以双重向导RNA样式提供并且包含这样的crRNA，其包含序列[导引结构域]-SEQ ID NO:6607，例如，由其组成，和这样的tracr，其包含SEQ ID NO:6660的序列，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:6601，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:7811，例如，由其组成。在实施方案中，一种或多种gRNA分子，例如，全部gRNA分子，额外地包含本文所述的一个或多个修饰，例如，包含一个或多个(例如，3个)3’和/或5’硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，3个)3’和/或5’2’-OMe修饰。在实施方案中，每种gRNA分子与(例如，本文所述的)Cas9分子复合并且作为RNP例如，通过电穿孔递送至细胞(或(例如，如本文所述的)细胞群体)。在实施方案中，将包含每种gRNA分子的RNP与细胞混合并同时引入，例如，通过单一电穿孔步骤同时引入。在其他实施方案中，可以依次引入RNP。

表36：可以组合使用以减少或消除细胞中TRAC和FKBP1A表达的第一、第二和(任选地)第三gRNA分子的优选导引结构域的例子(如本文所述)。

特别优选的组合包括组合D2、组合D4、组合D20或组合D22。

如本文所述，构思产生(例如，如本文所述的)细胞(或细胞群体)，例如，免疫效应细胞，例如，表达CAR的免疫效应细胞，其具有减少或消除的TRBC和FKBP1A表达。尽管构思可以组合使用包含本文公开的针对这些靶中每者的任何导引结构域的gRNA，但下表37中提供了例如待组合使用的特别优选的导引结构域序列。在实施方案中，每种gRNA分子以双重向导RNA样式提供并且包含这样的crRNA，其包含序列[导引结构域]-SEQ ID NO:6607，例如，由其组成，和这样的tracr，其包含SEQ ID NO:6660的序列，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:6601，例如，由其组成。在其他实施方案中，以单一向导RNA样式提供每种gRNA分子，其包含序列：[导引结构域]-SEQ ID NO:7811，例如，由其组成。在实施方案中，一种或多种gRNA分子，例如，全部gRNA分子，额外地包含本文所述的一个或多个修饰，例如，包含一个或多个(例如，3个)3’和/或5’硫代磷酸酯键，和/或一个或多个(例如，3个)3’和/或5’2’-OMe修饰。在实施方案中，每种gRNA分子与(例如，本文所述的)Cas9分子复合并且作为RNP例如，通过电穿孔递送至细胞(或细胞群体)。在实施方案中，将包含每种gRNA分子的RNP与细胞混合并同时引入，例如，通过单一电穿孔步骤同时引入。在其他实施方案中，可以依次引入RNP。

表37：可以组合使用以减少或消除细胞中TRBC和FKBP1A表达的第一、第二和(任选地)第三gRNA分子的优选导引结构域的例子(如本文所述)。

特别优选的组合包括组合E2、组合E4、组合E8或组合E10。

尽管不希望受理论约束，本文中还已经令人惊讶地显示，靶向位于不同基因内部的两个或更多个靶序列可以在每个靶向的位点处诱导突变(例如，插入或缺失或一个或多个核酸残基)，因而减少或消除细胞内部两个或更多个蛋白质的表达。本文中描述了靶向两个或更多个不同目的基因的gRNA的组合。

如本文所述的，当利用多于一种gRNA分子(或包含多于一种gRNA分子的CRISPR系统，例如，包含第一gRNA分子的CRISPR系统和包含第二gRNA分子的CRISPR系统，例如，其中每种gRNA分子与(例如，如本文所述的)Cas分子复合，例如，Cas9分子)时，可以将多于一种gRNA分子同时(例如，在单一引入步骤，例如，单一电穿孔步骤中)引入细胞。备选地，可以将多于一种gRNA分子(或包含所述gRNA分子的CRISPR系统)在多于一个步骤，例如，多于一次电穿孔中引入细胞。如果利用多个引入步骤，这些步骤可以相隔数小时、数天或数周，例如，相隔1小时，2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、24小时、2天、3、天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天时间或更时间。

IX.gRNA的特性

本文中已经进一步令人惊讶地显示，gRNA分子和包含所述gRNA分子的CRISPR系统在不同细胞类型中、跨不同递送方法和使用不同的crRNA/tracr组分时产生相似或相同的插入/缺失样式。不受理论约束，认为一些插入/缺失样式可能比其他更有利。例如，优势包含导致“移码突变”(例如，1碱基对或2碱基对插入或缺失，或其中n/3不是整数(其中n＝插入或缺失中的核苷酸数目)的任何插入或缺失)的插入和/或缺失的插入/缺失可能有益于减少或消除有功能的蛋白质表达。同样地，优势包含“巨大缺失”(缺失多于10、11、12、13、14、15、20、25或30个核苷酸)的插入/缺失也可能有益于例如移除关键调节序列如启动子结合位点，这可以类似地对有功能的蛋白质的表达产生改善作用。尽管已经令人惊讶地发现，如本文所述，给定gRNA/CRISPR系统诱导的插入/缺失样式跨细胞类型始终如一地重现，但引入gRNA/CRISPR系统时，给定细胞中将并非不可避免地产生任何单一插入/缺失结构。

本发明因此提供产生有益插入/缺失样式或结构的gRNA分子，例如其具有主要由移码突变和/或巨大缺失组成的插入/缺失样式或结构。可以如本文所述，通过NGS评估测试细胞(例如，HEK293细胞或在目的细胞(例如，T细胞)中)中候选gRNA分子产生的插入/缺失样式或结构，选择这类gRNA分子。如实施例中所示，已经发现在引入所需细胞群体时产生这样的细胞群体的gRNA分子，所述细胞群体包含显著部分的在靶向的基因中具有移码突变的细胞。在一些情况下，移码突变率高达75％、80％、85％、90％或更大。本发明因此提供细胞群体，其包含至少约40％(例如，至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)在本文所述的gRNA分子的靶位点或其附近具有(例如，如本文所述的)移码突变的细胞。本发明还提供细胞群体，其包含至少约50％(例如，至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)在本文所述的gRNA分子的靶位点或其附近具有(例如，如本文所述的)移码突变的细胞。

本发明因此提供选择用于本发明治疗方法中的gRNA分子的方法，所述方法包括：1)提供针对目的靶的多种gRNA分子，2)评估利用所述gRNA分子产生的插入/缺失样式或结构，3)选择形成由移码突变、巨大缺失或其组合优势组成的插入/缺失样式或结构的gRNA分子，和4)在本发明的方法中使用所选择的gRNA。

本发明还提供改变细胞的方法和改变的细胞，其中在该细胞类型中用给定的gRNA/CRISPR系统一致地产生特定插入/缺失样式。例如在实施例中公开了插入/缺失样式，包括随本文所述的gRNA/CRISPR系统观察到的头5个最频繁发生的插入/缺失。如实施例中所示，产生细胞群体，其中显著比例的细胞包含头5个插入/缺失之一(例如，在该群体多于30％、多于40％、多于50％、多于60％或更多细胞中存在头5个插入/缺失之一的细胞群体)。因此，本发明提供了包含随给定gRNA/CRISPR系统观察到的头5个插入/缺失中任一者的细胞，例如，免疫效应细胞，例如，(如本文所述)表达CAR的免疫效应细胞。因此，本发明提供了这样的细胞群体，例如，免疫效应细胞群体，例如，(如本文所述)表达CAR的免疫效应细胞群体，其中例如通过NGS评估时，所述群体包含高百分数的包含本文对给定gRNA/CRISPR系统所述的头5个插入/缺失之一的细胞。联系插入/缺失样式分析使用时，“高百分数”指包含本文对给定gRNA/CRISPR系统所述的头5个插入/缺失之一的群体的至少约50％(例如，至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)细胞。在其他实施方案中，细胞群体包含至少约25％(例如，从约25％至约60％、例如，从约25％至约50％、例如，从约25％至约40％、例如，从约25％至约35％)具有本文对给定gRNA/CRISPR系统所述的头5个插入/缺失之一的细胞。在实施方案中，图34A、图34B和图49中提供了靶向TRAC的给定gRNA/CRISPR系统的头5个插入/缺失。在实施方案中，图36和图48中提供了靶向B2M的给定gRNA/CRISPR系统的头5个插入/缺失。在实施方案中，图38、图41、图44和图50中提供了靶向CIITA的给定gRNA/CRISPR系统的头5个插入/缺失。在实施方案中，图53中提供了靶向FKBP1A的给定gRNA/CRISPR系统的头5个插入/缺失。

还已经发现某些gRNA分子在靶细胞类型的基因组内部的脱靶序列处不产生插入/缺失，或相对于靶位点处产生插入/缺失的频率，在脱靶位点以很低频率(例如，群体内部<5％的细胞)产生插入/缺失。因此，本发明提供在靶细胞类型中不显示脱靶插入/缺失形成或产生<5％脱靶插入/缺失形成频率的gRNA分子和CRISPR系统。在实施方案中，本发明提供在靶细胞类型中不显示出任何脱靶插入/缺失形成的gRNA分子和CRISPR系统。因此，本发明还提供这样的细胞，例如细胞群，例如，免疫效应细胞，例如，(如本文所述)表达CAR的免疫效应细胞，其在本文所述的gRNA分子的靶位点处或其附近包含插入/缺失(例如，移码插入/缺失或(例如，如本文所述的)给定gRNA/CRISPR系统产生的头5个插入/缺失中任一者)，但在gRNA分子的任何脱靶位点处不包含插入/缺失。因此，本发明还提供这样的细胞群，例如，免疫效应细胞，例如，(如本文所述)表达CAR的免疫效应细胞，其包含>50％在本文所述的gRNA分子的靶位点处或其附近具有插入/缺失(例如，移码插入/缺失或(例如，如本文所述的)给定gRNA/CRISPR系统产生的头5个插入/缺失中任一者)的细胞，但包含小于5％、例如，小于4％、小于3％、小于2％或少于1％在gRNA分子的任何脱靶位点处包含插入/缺失的细胞。

X.递送/构建体

诸组分(例如，Cas9分子或gRNA分子，或这两者)可以按多种形成递送、配制或施用。作为一个非限制性例子，可以将gRNA分子和Cas9分子配制(在一种或多种组合物中)、直接递送或施用至其中需要基因组编辑事件的细胞。备选地，可以配制(在一种或多种组合物中)、递送或施用编码一种或多种组分(例如，Cas9分子或gRNA分子，或这两者)的核酸。在一个方面，gRNA分子作为编码gRNA分子的DNA提供并且Cas9分子作为编码Cas9分子的DNA提供。在一个实施方案中，gRNA分子和Cas9分子在分离的核酸分子上编码。在一个实施方案中，gRNA分子和Cas9分子在相同的核酸分子上编码。在一个方面，gRNA分子作为RNA提供并且Cas9分子作为编码Cas9分子的DNA提供。在一个实施方案中，gRNA分子设有(例如，如本文所述的)一个或多个修饰。在一个方面，gRNA分子作为RNA提供并且Cas9分子作为编码Cas9分子的mRNA提供。在一个方面，gRNA分子作为RNA提供并且Cas9分子作为蛋白质提供。在一个实施方案中，gRNA和Cas9分子作为核糖核蛋白复合体(RNP)提供。在一个方面，gRNA分子作为编码gRNA分子的DNA提供并且Cas9分子作为蛋白质提供。

可以例如通过电穿孔(例如，如本领域已知)或令细胞膜可透过核酸和/或多肽分子的其他方法实现递送。令膜可透过的额外技术是本领域已知的并且例如包括细胞挤压法(例如，如WO2015/023982和WO2013/059343中所述，所述文献的内容因而通过引用的方式完整并入本文)、纳米针(例如，如Chiappini等人,Nat.Mat.,14；532-39或US2014/0295558中所述，所述文献的内容因而通过引用的方式完整并入本文)和纳米吸管(例如，如Xie,ACS Nano,7(5)；4351-58中所述，所述文献的内容因而通过引用的方式完整并入本文)。

当递送在DNA中编码的组分时，该DNA将一般包含控制区，例如，包含启动子，以实现表达。针对Cas9分子序列的有用启动子包括CMV、EF-α、MSCV、PGK、CAG控制启动子。针对gRNA的有用启动子包括H1、EF-1和U6启动子。可以选择具有相似或不相似强度的启动子以调节组分的表达。编码Cas9分子的序列可以包含核定位信号(NLS)，例如，SV40NLS。在一个实施方案中，Cas9分子或gRNA分子的启动子可以独立地是可诱导的、组织特异的或细胞特异性的。

基于DNA递送Cas9分子和或gRNA分子

可以通过现有技术已知或如本文所述的方法，将编码Cas9分子和/或gRNA分子的DNA施用至受试者或递送入细胞。例如，可以例如通过载体(例如，病毒或非病毒载体)、不基于载体的方法(例如，使用裸DNA或DNA复合体)或其组合，递送编码Cas9的和/或编码gRNA的DNA。

在一些实施方案中，通过载体(例如，病毒载体/病毒、质粒、微环或纳米质粒)递送编码Cas9的和/或编码gRNA的DNA。

载体可以包含编码Cas9分子和/或gRNA分子的序列。载体还可以包含编码例如与Cas9分子序列融合的信号肽(例如，核定位、核仁定位、线粒体定位)的序列。例如，载体可以包含一个或多个与编码Cas9分子的序列融合的核定位序列(例如，来自SV40)。

可以在载体中包含一个或多个调节/控制元件，例如，启动子、增强子、内含子、多聚腺苷化信号、Kozak共有序列、内部核糖体进入位点(IRES)、2A序列和剪接受体或供体。在一些实施方案中，启动子由RNA聚合酶II识别(例如，CMV启动子)。在其他实施方案中，启动子由RNA聚合酶III识别(例如，U6启动子)。在一些实施方案中，启动子是调节型启动子(例如，诱导型启动子)。在其他实施方案中，启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子。在一些实施方案中，启动子是病毒启动子。在其他实施方案中，启动子是非病毒启动子。

在一些实施方案中，载体或递送载具是微环。在一些实施方案中，载体或递送载具是纳米质粒。

在一些实施方案中，载体或递送载具是病毒载体(例如，用于产生重组病毒)。在一些实施方案中，病毒是DNA病毒(例如，dsDNA或ssDNA病毒)。在其他实施方案中，病毒是RNA病毒(例如，ssRNA病毒)。

示例性病毒载体/病毒例如包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、痘苗病毒、痘病毒和单纯疱疹病毒。病毒载体技术是本领域熟知的并且例如在Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)中及在其他病毒学和分子生物学手册中描述。

在一些实施方案中，病毒感染正在分裂的细胞。在其他实施方案中，病毒感染非分裂性细胞。在一些实施方案中，病毒感染分裂性和非分裂性细胞。在一些实施方案中，病毒可以整合入宿主基因组。在一些实施方案中，病毒经工程化以具有(例如，在人类中)降低的免疫力。在一些实施方案中，病毒是有复制能力的。在其他实施方案中，病毒是复制缺陷的，例如，将额外轮次的病毒粒复制和/或包装必需的基因的一个或多个编码区替换为其他基因或缺失。在一些实施方案中，病毒造成Cas9分子和/或gRNA分子的瞬时表达。在其他实施方案中，病毒造成Cas9分子和/或gRNA分子的长效表达，例如，至少1周、2周、1个月、2月、3月、6月、9月、1年、2年或永久性表达。病毒的包装容量可以变动，例如，从至少约4kb到至少约30kb，例如，至少约5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb或50kb。

在一些实施方案中，通过重组逆转录病毒递送编码Cas9的和/或编码gRNA的DNA。在一些实施方案中，逆转录病毒(例如，莫洛尼鼠白血病病毒)例如包含允许整合入宿主基因组的逆转录酶。在一些实施方案中，逆转录病毒是有复制能力的。在其他实施方案中，逆转录病毒是复制缺陷的，例如，将额外轮次的病毒粒复制和包装必需的基因的多个编码区之一替换为其他基因或缺失。

在一些实施方案中，通过重组慢病毒递送编码Cas9的和/或编码gRNA的DNA。例如，慢病毒是复制缺陷，例如，不包含病毒复制需要的一个或多个基因。

在一些实施方案中，通过重组腺病毒递送编码Cas9的和/或编码gRNA的DNA。在一些实施方案中，腺病毒经工程化以在人类中具有降低的免疫力。

在一些实施方案中，通过重组AAV递送编码Cas9的和/或编码gRNA的DNA。在一些实施方案中，AAV可以将其基因组并入宿主细胞(例如，如本文所述的靶细胞)中。在一些实施方案中，AAV是自身互补性腺相关病毒(scAAV)，例如，包装复性在一起以形成双链DNA的两条链的scAAV。可以在所公开方法中使用的AAV血清型例如包括AAV 1、AAV2、修饰的AAV2(例如，在Y444F、Y500F、Y730F和/或S662V处修饰)、AAV3、修饰的AAV3(例如，在Y705F、Y73 1F和/或T492V处修饰)、AAV4、AAV5、AAV6、修饰的AAV6(例如，在S663V和/或T492V处修饰)，AAV8、AAV 8.2、AAV9、AAV rh 10，并且也可以在所公开方法中使用假型化的AAV，如AAV2/8、AAV2/5和AAV2/6。

在一些实施方案中，通过杂合病毒，例如，本文所述的一种或多种病毒的杂合体递送编码Cas9的和/或编码gRNA的DNA。

包装细胞用来形成能够感染宿主或靶细胞的病毒粒子。这种细胞包括可以包装腺病毒的293细胞和可以包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。通常通过将核酸载体包装入病毒粒子的生产细胞系产生在基因治疗中使用的病毒载体。载体一般含有包装和后续整合入宿主或靶细胞(如果适用)所需要的最少病毒序列，而其他病毒序列由编码待表达蛋白质的表达盒替换。例如，基因治疗中使用的AAV载体一般仅拥有来自AAV基因组的为宿主或靶细胞中包装和基因表达必需的反向末端重复序列(ITR)。丢失的病毒功能由包装细胞系反式供应。此后，病毒DNA包装在细胞系中，所述细胞系含有编码其他AAV基因(即rep和cap)但缺少ITR序列的辅助质粒。该细胞系还用作为辅助病毒的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和AAV基因从辅助质粒表达。辅助质粒不以明显的量包装，原因在于缺少ITR序列。可以通过腺病毒比AAV更敏感的热处理，减少腺病毒污染。

在一个实施方案中，病毒载体具有细胞类型和/或组织型识别能力。例如，病毒载体可以用不同/备选性病毒包膜糖蛋白假型化；用细胞类型特异性受体工程化(例如，并入导引配体如肽配体，单链抗体、生长因子的病毒包膜糖蛋白基因修饰)；和/或经工程化以拥有具备双重特异性的分子桥，其具有识别病毒糖蛋白的一个末端和识别靶细胞表面的部分(例如，配体-受体、单克隆抗体、抗生物素蛋白-生物素和化学缀合)的另一个末端。

在一个实施方案中，病毒载体实现细胞类型特异性表达。例如，可以构建组织特异性启动子以限制转基因(Cas 9和gRNA)仅在靶细胞中表达。载体的特异性也可以由转基因表达的微RNA依赖性控制介导。在一个实施方案中，病毒载体具有增加的病毒载体和靶细胞膜融合效率。例如，可以并入融合蛋白如有融合能力的血凝素(HA)以增加病毒摄入细胞。在一个实施方案中，病毒载体具有核定位能力。例如，可以改变需要破坏细胞壁(在细胞分裂期间)并且因此将不感染非分裂性细胞的病毒，以在病毒的基质蛋白中并入核定位肽，因而使转导非增殖性细胞成为可能。

在一些实施方案中，通过不基于载体的方法(例如，使用裸DNA或DNA复合体)递送编码Cas9的和/或编码gRNA的DNA。例如，可以例如通过有机改性的二氧化硅或硅酸盐(Ormosil)、电穿孔、基因枪、声致穿孔法(sonoporation)、磁性转染、脂质介导转染、树状物、无机纳米粒子、磷酸钙或其组合递送DNA。

在一些实施方案中，通过载体和不基于载体的方法的组合，递送编码Cas9的和/或编码gRNA的DNA。例如，病毒体包含与灭活病毒(例如，HIV或流感病毒)组合的脂质体，这可以例如，在呼吸道上皮细胞中产生比单一病毒方法或单一脂质体方法更高效的基因转移。

在一个实施方案中，递送载具是非病毒载体。在一个实施方案中，非病毒载体是无机纳米粒子(例如，酬载与纳米粒子表面接合)。示例性无机纳米粒子例如包括磁性纳米粒子(例如，Fe lvlnO2)或二氧化硅。纳米粒子的外表面可以与允许接合(例如，缀合或包埋)酬载的带正电荷聚合物(例如，聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、聚丝氨酸)缀合。在一个实施方案中，非病毒载体是有机纳米粒子(例如，酬载包埋于纳米粒子内部)。示例性有机纳米粒子例如包括SNALP脂质体，所述脂质体含有阳离子脂质连同聚乙二醇(PEG)和鱼精蛋白包覆的中性辅助脂质和脂质涂层包覆的核酸复合物。

用于转移CRISPR系统或编码CRISPR系统或其组分的核酸(例如，载体)的示例性脂质和/或聚合物例如包括在WO2011/076807、WO2014/136086、WO2005/060697、WO2014/140211、WO2012/031046、WO2013/103467、WO2013/006825、WO2012/006378、WO2015/095340和WO2015/095346中描述的那些，前述每篇文献的内容含量因而通过引用的方式完整并入。在一个实施方案中，载具具有导引性修饰以增加靶细胞对纳米粒子和脂质体的摄取，例如，细胞特异性抗原、单克隆抗体、单链抗体、适配体、聚合物、糖和细胞渗透肽。在一个实施方案中，载具使用融合性和内体去稳定化肽/聚合物。在一个实施方案中，载具发生酸触发的构象变化(例如，以加速载货的内体逃逸)。在一个实施方案中，使用刺激可切割性聚合物，例如，用于细胞区室中释放。例如，可以使用还原型细胞环境下遭切割的基于二硫键的阳离子聚合物。

在一个实施方案中，递送载具是生物性非病毒递送载具。在一个实施方案中，载具是减毒的细菌(例如，经天然或人工工程化以具有侵入性，但经减毒以防止发病和表达转基因(例如，单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、某些沙门氏菌属(Salmonella)菌株、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和修饰的大肠杆菌(Escherichia coli))、具有营养嗜性和组织特异嗜性以靶向特定组织的细菌、具有修饰的表面蛋白以改变靶组织特异性的细菌)。在一个实施方案中，载具是基因修饰的噬菌体(例如，具有巨大包装容量、较低免疫原性、含有哺乳动物质粒维持序列并已经并入导引配体的工程化噬菌体)。在一个实施方案中，载具是哺乳动物病毒样颗粒。例如，可以生成修饰的病毒粒子(例如，通过纯化“空”粒子，随后用所需载货离体装配病毒)。载具也可以工程化以并入改变靶组织特异性的导引配体。在一个实施方案中，载具是生物脂质体。例如，生物性脂质体是衍生自人细胞(例如，红细胞血影，其为衍生自受试者的分解成球状结构物的红细胞)的基于磷脂的粒子(例如，可以通过接合各种组织特异性或细胞特异性配体实现组织导引)或分泌性外来体，即受试者(即、患者)衍生的内吞源性膜结合型纳米囊泡(30-100nm)(例如，可以从各种细胞类型产生并且可以因此在不需要导引配体的情况下为细胞摄取)。

在一个实施方案中，递送除Cas系统的组分(例如，本文所述的Cas9分子组分和/或gRNA分子组分)之外的一种或多种核酸分子(例如，DNA分子)。在一个实施方案中，与递送Cas系统的一种或多种组分的相同时间递送核酸分子。在一个实施方案中，在递送Cas9系统的一种或多种组分之前或之后(例如，小于约30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、1天、2天、3天、1周、2周或4周)递送核酸分子。在一个实施方案中，通过与递送Cas9系统的一种或多种组分(例如，Cas9分子组分和/或gRNA分子组分)不同的手段递送核酸分子。可以通过本文所述的任何递送方法递送核酸分子。例如，可以通过病毒载体(例如，整合缺陷型慢病毒)递送核酸分子，并且可以例如通过电穿孔递送Cas9分子组分和/或gRNA分子组分，从而可以减少核酸(例如，DNA)引起的毒性。在一个实施方案中，核酸分子编码治疗性蛋白，例如，本文所述的蛋白质。在一个实施方案中，核酸分子编码RNA分子，例如，本文所述的RNA分子。递送编码Cas9分子的RNA。

可以通过现有技术已知或如本文所述的方法，将编码Cas9分子(例如，活性Cas9分子、无活性Cas9分子或无活性Cas9融合蛋白)和/或gRNA分子的RNA递送入细胞，例如，本文所述的靶细胞。例如，可以例如通过微量注射、电穿孔、脂质介导的转染、肽介导的递送或其组合递送编码Cas9的和/或编码gRNA的RNA。

递送作为蛋白质的Cas9分子

可以通过现有技术已知或如本文所述的方法，将Cas9分子(例如，活性Cas9分子、无活性Cas9分子或无活性Cas9融合蛋白)递送入细胞。例如，可以例如通过通过微量注射、电穿孔、脂质介导的转染、肽介导的递送、细胞挤压或磨损(例如，通过纳米针)或其组合，递送Cas9蛋白分子。递送可以伴以编码gRNA的DNA或伴以gRNA。

在一个实施方案中，将(例如，如本文所述的)Cas9分子作为蛋白质递送并且将gRNA分子作为一种或多种RNA处递送(例如，作为如本文所述的dgRNA或sgRNA)。在实施方案中，在递送到(例如，如本文所述的)细胞之前，Cas9蛋白与gRNA分子复合，作为核糖核蛋白复合体(“RNP”)。在实施方案中，可以通过任何现有技术已知的方法，例如，电穿孔法，将RNP递送入(例如，本文所述的)细胞。如本文所述和不受理论约束，可以优选使用在(例如，本文所述的)靶细胞中靶序列处产生高编辑％(例如，>85％、>90％、>95％、>98％或>99％)的gRNA分子和Cas9分子，甚至当降低递送至细胞的RNP的浓度时也是如此。再次，不受理论约束，递送浓度降低或低的在靶细胞中靶序列处产生高编辑％(包括在低RNP浓度时)的包含gRNA分子的RNP可以是有益的，因为它可以减少脱靶编辑事件的频率和数目。在一个方面，若计划使用低浓度或降低浓度的RNP，则以下方法可以用来产生RNP：

1.在溶液中以高浓度(例如，比待递送至细胞的RNP终浓度更高的浓度)提供Cas9分子和tracr，并允许二种组分平衡；

2.提供crRNA分子并允许诸组分平衡(因而形成高浓度的RNP溶液)；

3.稀释RNP溶液至所需浓度；

4.例如，通过电穿孔，将所述RNP在所述的所需浓度递送至靶细胞。

可以通过省略以上步骤2并且在步骤1中提供溶液中高浓度的Cas9分子和sgRNA分子并允许组分平衡，调整上述方法以随sgRNA分子一起使用。在实施方案中，溶液中Cas9分子和每种gRNA组分按1:2比率(Cas9:gRNA)，例如，Cas9:gRNA分子1:2摩尔比提供。使用dgRNA分子时，该比率(例如，摩尔比)是1:2:2(Cas9:tracr:crRNA)。在实施方案中，RNP以20uM或更高的浓度(例如，约20uM至约50uM的浓度)形成。在实施方案中，RNP以10uM或更高的浓度(例如，约10uM至约30uM的浓度)形成。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中稀释至10uM或更小的终浓度(例如，约0.01uM至约10uM的浓度)，以递送至所述靶细胞。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中稀释至3uM或更小的终浓度(例如，约0.01uM至约3uM的浓度)，以递送至所述靶细胞。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中稀释至1uM或更小的终浓度(例如，约0.01uM至约1uM的浓度)，以递送至所述靶细胞。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中稀释至0.3uM或更小的终浓度(例如，约0.01uM至约0.3uM的浓度)，以递送至所述靶细胞。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中按约3uM的终浓度提供，以递送至所述靶细胞。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中按约1uM的终浓度提供，以递送至所述靶细胞。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中按约0.3uM的终浓度提供，以递送至所述靶细胞。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中按约0.1uM的终浓度提供，以递送至所述靶细胞。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中按约0.05uM的终浓度提供，以递送至所述靶细胞。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中按约0.03uM的终浓度提供，以递送至所述靶细胞。在实施方案中，将RNP在包含(例如，本文所述的)靶细胞的溶液中按约0.01uM的终浓度提供，以递送至所述靶细胞。

组分的双模式或差异性递送

分别递送Cas系统的组分(例如，Cas9分子组分和gRNA分子组分)并且更具体地，通过不同模式递送诸组分，可以例如通过改善组织特异性和安全性，增强性能。

在一个实施方案中，通过不同模式或如本文中有时称作差异性模式，递送Cas9分子和gRNA分子。如本文所用，不同或差异性模式指对主体组分分子(例如，Cas9分子、gRNA分子或模板核酸)赋予不同药效动力学特性或药代动力学特性的递送模式。例如，递送模式可以导致不同的组织分布、不同的半寿期或不同时间分布，例如，在选择的区室、组织、或器官中递送时。

一些递送模式，例如，通过在细胞中或后代细胞中(例如，通过自主复制或插入细胞核酸中)持续存在的核酸载体递送，导致更持续的组分表达和组分存在。

XI.治疗方法

本文所述的Cas系统，例如，一种或多种gRNA分子和一种或多种Cas分子(例如，Cas9分子)，可用于治疗哺乳动物中(例如，人类中)的疾病。术语“治疗”、“治疗着”、“治疗”和“治疗”包括向细胞施用cas系统(例如，一种或多种gRNA分子和一种或多种Cas9分子)，以阻止或延迟疾病的症状、并发症或生物化学指标的发作、减轻症状或停滞或抑制疾病、病状或病症的进一步发展。治疗可以是预防性的(以阻止或延迟疾病的发作，或以阻止其临床或亚临床症状表现)或在疾病表现后治疗性地抑制或减轻症状。可以通过本文所述的治疗指标描述测量治疗。本发明的“治疗”方法还包括施用通过向细胞引入cas系统(例如，一种或多种gRNA分子和一个或多个Cas分子)而改变的所述细胞至受试者，以治愈一种或多种疾病或病状的症状、降低其严重程度或减轻之，以延长受试者的健康或存活超出不存在这类治疗时的预期。例如，“治疗”包括减轻受试者中的疾病症状至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。

治疗方法/联合疗法

在另一个方面，本发明提供一种方法，所述方法包括向受试者施用本发明的细胞，例如，包含或在任何时间包含如本文所述的gRNA分子的细胞。在实施方案中，已经通过引入gRNA分子改变细胞，从而如此改变包含与gRNA分子导引结构域互补的序列的基因，从而该基因的功能性产物的表达相对于未修饰的细胞减少或消除。在实施方案中，细胞经进一步工程化以表达(例如，如本文所述的)CAR。在实施方案中，细胞是免疫效应细胞，例如，NK细胞或T细胞。在实施方案中，细胞是同种异体的。在实施方案中，细胞是自体的。

在另一个方面，本发明提供一种方法，所述方法包括向有需求的受试者施用gRNA分子，例如，本文所述的gRNA分子，或施用包含或在任何时间包含gRNA分子(例如，本文所述的gRNA分子)的细胞。在一个实施方案中，受试者患有本文所述的病症，例如，受试者含有癌症，例如，受试者患有表达本文所述的靶抗原的癌症。在一个实施方案中，受试者是人。

在另一个方面，本发明涉及一种治疗患有与表达如本文所述的癌相关抗原相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的gRNA分子(例如，本文所述的gRNA分子)，或包含或在任何时间包含gRNA分子(例如，本文所述的gRNA分子)的细胞。

在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗患有与表达肿瘤抗原(例如，本文所述的抗原)相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)，所述细胞包含或在任何时间包含gRNA分子(例如，本文所述的gRNA分子)，还包含CAR分子，其中CAR分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞内结构域包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域与疾病相关的肿瘤抗原(例如，如本文所述的肿瘤抗原)结合。

在一个相关方面，本发明的特征在于一种治疗患有与表达肿瘤抗原相关的疾病的受试者的方法。该方法包括向受试者施用与增加细胞功效的物质组合的有效量的gRNA分子(例如，本文所述的gRNA分子)或包含或在任何时间包含gRNA分子(例如，本文所述的gRNA分子)的细胞，其中：

增加免疫细胞功效的物质选自以下一种或多种：

蛋白质磷酸酶抑制剂；

激酶抑制剂；

细胞因子；

免疫抑制性分子的抑制剂；或

降低TREG细胞水平或活性的物质。

在另一个方面，本发明特征在于一种用于治疗患有与表达肿瘤抗原相关的疾病(例如，如本文所述的病症)的受试者的组合物，所述组合物包含有包含或在任何时间包含gRNA分子(例如，本文所述的gRNA分子)的免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)。

在前述任何方法或用途的某些实施方案中，已经改变包含或在任何时间包含本文所述的gRNA的细胞，从而已经减少或消除包含与gRNA导引结构域互补的靶序列的基因的功能性基因产物表达。在一个实施方案中，已经消除包含与gRNA导引结构域互补的靶序列的基因的功能性基因产物表达。在实施方案中，细胞进一步表达(例如，如本文所述的)CAR。在实施方案中，细胞是同种异体的。在实施方案中，细胞是自体的。

在前述任何方法或用途的某些实施方案中，与肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)相关的疾病选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前期病状如脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征或白血病前期，或是与表达本文所述的肿瘤抗原相关的非癌症相关适应症。在一个实施方案中，疾病是本文所述的癌症，例如，本文描述为如与本文所述的靶相关的癌症。在一个实施方案中，疾病是血液学癌。在一个实施方案中，血液学癌是白血病。在一个实施方案中，癌选自以下一种或多种：急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴样白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴样白血病(“TALL”)、急性淋巴样白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；额外的血液学癌或血液学疾病，包括但不限于，例如，B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和作为依据髓样血细胞无效产生(或异型增生)联合的多样性血液学疾病集合的“白血病前期”，并且与表达本文所述的肿瘤抗原相关的疾病包括但不限于表达如本文所述的肿瘤抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病；及其任意组合。在另一个实施方案中，与本文所述的肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤。

在某些实施方案中，这些方法或用途与增加免疫效应细胞功效的物质(例如，如本文所述的物质)组合实施。

在上述任何方法或用途中，与表达肿瘤抗原相关的疾病选自与表达肿瘤抗原相关的增生性疾病、癌前期病状、癌症和非癌症相关适应症。

癌症可以是血液学癌，例如，选自以下一者或多者的癌症：慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴样白血病(ALL)、B细胞急性淋巴样白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴样白血病(T-ALL)、慢性髓性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症或白血病前期。

癌症也可以选自结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊枢椎肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、Kaposi肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境所致癌、所述癌的组合和所述癌的转移性病变。

在本文所述的方法或用途的某些实施方案中，细胞与增加免疫效应细胞功效的物质(例如，一种或多种蛋白质磷酸酶抑制剂、激酶抑制剂、细胞因子、免疫抑制性分子的抑制剂或降低TREG细胞水平或活性的物质)组合施用。

在本文所述的方法或用途的某些实施方案中，蛋白质磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂和/或SHP-2抑制剂。

在本文所述的方法或用途的其他实施方案中，激酶抑制剂选自以下一者或多者：CDK4抑制剂、CDK4/6抑制剂(例如，palbociclib)、BTK抑制剂(例如，依鲁替尼(ibrutinib)或RN-486)、mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素或依维莫司(RAD001))、MNK抑制剂或双重P13K/mTOR抑制剂。在一个实施方案中，BTK抑制剂不减少或抑制白介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性。

在本文所述的方法或用途的其他实施方案中，降低TREG细胞水平或活性的物质选自环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽或其组合。

在其他实施方案中，对抑制性分子抑制的物质包含有包含抑制性分子或其片段的第一多肽和向细胞提供正信号的第二多肽，并且其中第一多肽和第二多肽表达在含有CAR的免疫细胞上，其中(i)第一多肽包含PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFβ、CEACAM-1、CEACAM-3和CEACAM-5或其片段；和/或(ii)第二多肽包含有包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性结构域；和/或共刺激信号传导结构域包含选自41BB、CD27和CD28的蛋白质的功能性结构域。

在其他实施方案中，细胞因子选自IL-7；IL-15；包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽与IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)组合的组合物；IL-18；IL-21或其组合。示例性hetIL-15是IL-15和IL-15Ra的异二聚非共价复合物(Admune Therapeutics,LLC)。例如在通过引用方式并入本文的美国8,124,084、美国2012/0177598、美国2009/0082299、美国2012/0141413和美国2011/0081311中描述这种hetIL-15。例如在通过引用方式并入本文的美国8,124,084、美国2012/0177598、美国2009/0082299、美国2012/0141413和美国2011/0081311中描述hetIL-15。hetIL-15的其他示例性实施方案是在IL-15多肽和IL-15R(例如，IL-15Ra)多肽之间的共价复合物。

在其他实施方案中，细胞和第二联合疗法(例如，本文公开的任何联合疗法(例如，增加细胞功效的物质))基本上同时或依次施用。

在其他实施方案中，细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子组合施用。在某些实施方案中，将靶向GITR和/或调节GITR功能的分子施用在表达CAR的细胞或细胞群体之前或在单采血液成分术之前。

在一个实施方案中，淋巴细胞输注，例如同种异体淋巴细胞输注，用于治疗癌症，其中淋巴细胞输注包含本发明的至少一个细胞，例如，表达CAR的细胞。在一个实施方案中，自体淋巴细胞输注用于治疗癌症，其中自体淋巴细胞输注包含至少一个细胞，例如，本文所述的表达CAR的细胞。

在一个实施方案中，细胞是T细胞并且该T细胞是二酰甘油激酶(DGK)缺陷的。在一个实施方案中，细胞是T细胞并且该T细胞是Ikaros缺陷的。在一个实施方案中，细胞是T细胞并且该T细胞是DGK缺陷和Ikaros缺陷的。

在一个实施方案中，该方法包括与增强细胞活性的物质组合施用如本文所述的本发明细胞，其中该物质是细胞因子(例如IL-7；IL-15)；包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽与IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)组合的组合物；IL-18；IL-21或其组合。细胞因子可以与施用细胞组合(例如，与之同时或在其之后不久)递送。备选地，细胞因子可以在施用细胞后延续一段时间之后(例如，在评定受试者对细胞的反应后)递送。在一个实施方案中，将细胞因子与施用根据权利要求61-80的细胞或细胞群体同时施用(例如，在同一天施用)或在其之后不久施用(例如，在其施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用)至受试者。在其他实施方案中，将细胞因子在施用根据权利要求61-80的细胞或细胞群体后延续一段时间(例如，至少2周、3周、4周、6周、8周、10周或更多周)之后或在评定受试者对细胞的反应后施用至受试者。

在其他实施方案中，经进一步工程化以表达CAR的本发明细胞与减轻与施用表达CAR分子的细胞相关的一种或多种副作用的物质组合施用。与表达CAR的细胞相关的副作用可以选自细胞因子释放综合征(CRS)或嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。

在前述任何方法或用途的实施方案中，将表达CAR分子的细胞与治疗与表达肿瘤抗原相关的疾病的物质(例如，本文公开的任何第二或第三疗法)组合施用。额外的示例性组合包括以下一种或多种。

在另一个实施方案中，(例如，如本文所述的)细胞可以与另一种物质(例如，本文所述的激酶抑制剂和/或检查点抑制蛋白)组合施用。在一个实施方案中，本发明的细胞还可以表达另一个物质，例如，增强细胞活性的物质。

例如，在一个实施方案中，增强细胞活性的物质可以是对抑制性分子抑制的物质。

在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质是作为dsRNA、siRNA或shRNA的抑制性核酸。

在另一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质例如是本文所述的分子，例如，包含第一多肽(例如，抑制性分子)的物质，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施方案中，该物质包含第一多肽(例如，抑制性分子的或其片段(例如，其胞外结构域的至少一部分)的第一多肽)和作为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施方案中，该物质包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。

在一个实施方案中，将本发明的细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用至已经接受既往干细胞移植(例如，自体干细胞移植)的受试者。

在一个实施方案中，将本发明的细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用至已经接受既往美法仑剂量的受试者。

在一个实施方案中，本发明的细胞与增加细胞功效的物质(例如，如本文所述的物质)组合施用。

在一个实施方案中，将本发明的细胞与低、免疫增强性剂量的mTOR抑制剂组合施用。尽管不希望受理论约束，据信用免疫增强性低剂量(例如，不足以完全抑制免疫系统，但足以改善免疫功能的剂量)治疗伴有PD-1阳性T细胞减少或PD-1阴性细胞增加。可以通过与表达PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2)的细胞衔接，耗尽PD-1阳性T细胞，但不耗尽PD-1阴性T细胞。

在一个实施方案中，这种方法可以用来优化本文所述的细胞在受试者中的性能。尽管不希望受理论约束，据信在一个实施方案中，改善了内源性未修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的性能。尽管不希望受理论约束，据信在一个实施方案中，改善了表达CAR的细胞的性能。在其他实施方案中，可以通过与下述量的mTOR抑制剂接触，离体处理包含或将会工程化以包含本发明gRNA分子的细胞(例如，T细胞或NK细胞)，所述的量增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的数目或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率。

在一个实施方案中，在施用表达本文所述的CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)之前启动免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂(例如，变构抑制剂(例如，RAD001)或催化性抑制剂)的施用。在一个实施方案中，在足够时间的mTOR抑制剂或充分给予mTOR抑制剂后施用细胞，从而PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的水平或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少短暂地增加。

在一个实施方案中，在足够时间后或在充分给予免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂后收获待工程化以包含本发明gRNA的细胞(例如，T细胞或NK细胞)，从而受试者中的或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少短暂地增加。

在一个实施方案中，本发明的细胞与改善施用细胞相关的一种或多种副作用的物质(例如，本文所述的物质)组合施用。

在一个实施方案中，该细胞与治疗与如本文所述的癌抗原相关的疾病的物质(例如，本文所述的物质)组合施用。

在一个实施方案中，将细胞按本文所述的剂量和/或给药方案施用。

在一个实施方案中，受试者(例如，人)接受本发明细胞的初始施用以及一次或多次后续施用本发明的细胞，其中一次或多次后续施用在先前施用后小于15天，例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。在一个实施方案中，将本发明细胞每周施用至受试者(例如，人)多于一次，例如，每周施用2、3、或4次包含CAR分子的细胞的施用。在一个实施方案中，受试者(例如，人类受试者)每周接受施用本发明细胞多于一次(例如，每周施用2、3或4次)(本文也称作周期)，随后不施用本发明细胞一周，并且随后向受试者额外施用本发明细胞一次或多次(例如，每周施用本发明细胞多于一次)。在另一个实施方案中，受试者(例如，人类受试者)接受多于一个周期的本发明细胞并且每个周期之间的时间小于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，将本发明的细胞每隔一日施用，每周施用3次。在一个实施方案中，将本发明的细胞施用至少两、三、四、五、六、七、八或更多周。

在一个实施方案中，本发明的细胞作为一线治疗对疾病(例如，癌症，例如，本文所述的癌症)施用。在另一个实施方案中，本发明的细胞作为对疾病的二线、三线、四线治疗(例如，癌症，例如，本文所述的癌症)施用。

在一个实施方案中，施用本文所述的细胞群体。

在另一个方面，本发明涉及用作药物的编码本发明gRNA的分离核酸分子、本发明gRNA分子和包含或在任何时间包含本发明gRNA的细胞。在实施方案中，改变或将改变包含或在任何时间包含本发明gRNA的细胞，从而减少或消除包含与gRNA导引结构域互补的序列的基因的功能性产物表达。

在另一个方面，本发明涉及用于治疗表达如本文所述的癌相关抗原的疾病的编码本发明gRNA的分离核酸分子、本发明gRNA分子和包含或在任何时间包含本发明gRNA的细胞。在实施方案中，改变或将改变包含或在任何时间包含本发明gRNA的细胞，从而减少或消除包含与gRNA导引结构域互补的序列的基因的功能性产物表达。

在另一个方面，本发明涉及作为药物与下述内容组合使用的编码本发明gRNA的分离核酸分子、本发明gRNA分子和包含或在任何时间包含本发明gRNA的细胞：细胞因子(例如，IL-7；IL-15)；包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽与IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)组合的组合物；IL-18；和/或IL-21；和/或其如本文所述的组合。在另一个方面，本发明涉及作为药物与本文所述的细胞组合使用的本文所述的细胞因子。在实施方案中，改变或将改变包含或在任何时间包含本发明gRNA的细胞，从而减少或消除包含与gRNA导引结构域互补的序列的基因的功能性产物表达。

在另一个方面，本发明涉及作为药物与如本文所述的激酶抑制剂和/或检查点抑制蛋白组合使用的编码本发明gRNA的分离核酸分子、本发明gRNA分子和包含或在任何时间包含本发明gRNA的细胞。在另一个方面，本发明涉及作为药物与包含或在任何时间包含本发明gRNA的细胞组合使用的本文所述的激酶抑制剂和/或检查点抑制蛋白。

在另一个方面，本发明的特征在于一种组合物，其包含用于治疗患有与表达肿瘤支持抗原相关的疾病(例如，如本文所述的病症的受试者)的本发明细胞。

在上述任何方法或用途中，与表达肿瘤支持抗原相关的疾病选自与表达肿瘤支持抗原相关的增生性疾病、癌前期病状、癌症和非癌症相关适应症。在一个实施方案中，与本文所述的肿瘤支持抗原相关的疾病是实体瘤。

在本文所述的方法或用途一个实施方案中，本发明的细胞与另一种物质组合施用。在一个实施方案中，该物质可以是激酶抑制剂，例如，CDK4/6抑制剂、BTK抑制剂、mTOR抑制剂、MNK抑制剂或双重PI3K/mTOR抑制剂及其组合。在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，本文所述的CDK4抑制剂，例如，CD4/6抑制剂，如，例如，6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称作palbociclib或PD0332991)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，本文所述的BTK抑制剂，如，例如，依鲁替尼。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，本文所述的mTOR抑制剂，如，例如，雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以例如是mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如，本文所述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如，本文所述的MNK抑制剂，如，例如，4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以例如是MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。双重PI3K/mTOR抑制剂可以例如是PF-04695102。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，选自aloisine A；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275、2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟-1-甲基-4-哌啶基]-4-色烯酮；克里唑替尼(PF-02341066)；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮、盐酸盐(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine(CYC202)；palbociclib(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基噁唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并吖庚因-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)和XL281(BMS908662)。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，palbociclib(PD0332991)，并且palbociclib以约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续28天周期的14-21天，或每日施用持续21天周期的7-12天。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的palbociclib。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是选自依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13的BTK抑制剂。在一个实施方案中，BTK抑制剂不减少或不抑制白介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，依鲁替尼(PCI-32765)，并且依鲁替尼以约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依鲁替尼。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是不抑制ITK的激酶活性的BTK抑制剂，例如，RN-486，并且RN-486以约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg(例如，150mg、200mg或250mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7个或更多个周期的RN-486。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是的mTOR抑制剂，选自坦罗莫司；地磷莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二氧杂-4-偶氮三环并[30.3.1.0^4,9]三十七碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基次膦酸酯，也称作AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；塞马莫德(simapimod)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N²-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-(SEQ ID NO:6659)，内盐(SF1126)；和XL765。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素，并且雷帕霉素以约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，依维莫司，并且依维莫司以约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依维莫司。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，选自CGP052088；4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢酰胺；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR双重抑制剂，选自2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧苯基)氨基]喹噁啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，本文所述的表达CAR的免疫效应细胞与蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如，本文所述的蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂)组合施用至受试者。在一个实施方案中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如，本文所述的SHP-1抑制剂，例如，葡萄糖酸锑钠。在一个实施方案中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂。

在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，本发明的细胞与另一种物质组合施用并且该物质是细胞因子。细胞因子可以例如是IL-7；IL-15；包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽与IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)组合的组合物；IL-18；IL-21；或其组合。在另一个实施方案中，本发明的细胞与检查点抑制蛋白(例如，本文所述的检查点抑制蛋白)组合施用。例如，在一个实施方案中，检查点抑制蛋白抑制选自PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ的抑制性分子。

在一个方面，本发明提供一种用包含或在任何时间包含本发明gRNA分子的同种异体细胞(例如同种异体的免疫效应细胞，例如表达CAR的同种异体T细胞)治疗受试者(例如，患有本文所述病状的受试者)的方法。在实施方案中，已经改变细胞，从而已经减少或消除包含与gRNA导引结构域互补的靶序列的基因的功能性基因产物的表达。

在一个方面，本发明提供一种治疗方法，所述治疗方法包括：

(a)从同种异体供体提供细胞群体；

(b)向细胞引入包含本发明第一gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)；

(c)任选地，选择那些其中已经减少或消除包含与第一gRNA的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)表达的细胞；

(d)用编码如本文所述的CAR的核酸转导细胞；并且

(e)施用细胞至有需要的患者，例如，患有与表达CAR识别的抗原相关的疾病的患者。

在实施方案中，第一gRNA分子包含与同种异体T细胞靶(例如，TCR组分)互补的导引结构域，例如，第一gRNA分子包含与选自CD247、CD3D、CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1和TRBC2的基因中靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，针对CD247、CD3D、CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1或TRBC2的第一gRNA是包含表1、表4或表5中列出的导引结构域的第一gRNA。在实施方案中，步骤(c)包括选择呈TCR表达阴性的那些细胞。在实施方案中，该方法还包括向该患者施用例如选择性抑制或损耗NK细胞的药剂和针对NK细胞特异抗原(例如T细胞上不表达的)的抗体或抗原结合片段。

在实施方案中，该方法还包括向细胞引入本发明的第二gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)，例如，向细胞引入包含本发明第二gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)。在实施方案中，第二gRNA分子包含与同种异体T细胞靶互补的导引结构域，例如，第二gRNA分子包含与选自B2M、HLA-A、HLA-B和HLA-C的基因中靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，针对B2M、HLA-A、HLA-B或HLA-C的第二gRNA是包含表1或表3的导引结构域的第二gRNA。在实施方案中，步骤(c)任选地包括：选择那些细胞，在该细胞中已经减少或消除包含与第一gRNA的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)的表达和减少或消除包含与第二gRNA的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)的表达。在实施方案中，步骤(c)包括选择呈TCR表达阴性和/或B2M或HLA表达阴性的那些细胞。在实施方案中，该方法还包括向该患者施用例如选择性抑制或损耗NK细胞的药剂和针对NK细胞特异抗原(例如T细胞上不表达的)的抗体或抗原结合片段。

在实施方案中，该方法还包括向细胞引入本发明的第三gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)，例如，向细胞引入包含本发明第三gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)。在实施方案中，第三gRNA分子包含与抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的基因中靶序列互补的导引结构域，例如，第三gRNA分子包含与选自CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PD-L2、CTLA4、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD113)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD107)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ及PTPN11的基因中靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，第三gRNA包含针对CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1或PTPN11的导引结构域，其选自表2或表6的导引结构域。在实施方案中，步骤(c)任选地包括：选择那些细胞，该细胞中已经减少或消除包含与第一gRNA的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)的表达、包含与第二gRNA的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)的表达和/或包含与第三gRNA的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)的表达。在实施方案中，步骤(c)包括选择那些呈TCR表达阴性、B2M或HLA表达阴性和/或被靶向的抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的表达阴性的细胞。在实施方案中，该方法还包括向该患者施用例如选择性抑制或损耗NK细胞的药剂和针对NK细胞特异抗原(例如T细胞上不表达的)的抗体或抗原结合片段。在其他实施方案中，第三gRNA包含与选自(例如，如本文所述的)CIITA、RFXANK、RFX5、RFXAP的基因中靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，第三gRNA包含与(例如，如本文(例如，在表6c中)所述的)CIITA基因中靶序列互补的导引结构域。

在前述方面和实施方案的任一者中，CAR是如本文所述的CAR。在前述方面和实施方案的任一者中，CAR是BCMA CAR，例如，本文所述的BCMA CAR，例如，包含有或经工程化以表达包含SEQ ID NO:8559的CAR。在多个方面，通过病毒载体(例如，慢病毒载体)转导，将编码CAR的核酸引入细胞。在其他方面，将编码CAR的核酸作为引入所述细胞的CRISPR系统之一所修饰的位点处或其附近并入宿主细胞基因组中的DNA引入。

在一个方面，本发明提供一种治疗方法，所述治疗方法包括：

(a)提供(例如，如本文所述的)细胞群体，例如免疫效应细胞群体，例如，T细胞或NK细胞群体(例如，来自同种异体供体的所述细胞的群体)；

(b)向细胞群体引入包含本发明第一gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第一gRNA分子包含与(例如，如本文所述的)CD247、CD3D、CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1、TRBC2中靶序列(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2中的靶序列，例如，TRAC中的靶序列)互补的导引结构域；

(c)向细胞群体引入包含本发明第二gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第二gRNA分子包含与(例如，如本文所述的)B2M中靶序列互补的导引结构域；

(d)任选地，选择那些其中已经减少或消除有功能TCR表达的细胞；

(e)用编码(例如，如本文所述的)CAR(例如，如本文所述的BCMA CAR)的核酸转导细胞群体；并且

(f)施用细胞群体至有需要的患者，例如，患有与CAR识别的抗原表达相关的疾病的患者。

在一个实施方案中，该方法还包括步骤(g)：向所述细胞群体引入包含本发明第三gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第三gRNA分子包含与(例如，如本文所述的)CIITA、RFXANK、RFX5或RFXAP中靶序列互补(例如，与CIITA中靶序列互补)的导引结构域。

在一个方面，本发明提供一种治疗方法，所述治疗方法包括：

(a)提供(例如，如本文所述的)细胞群体，例如免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞(例如，来自同种异体供体的所述细胞的群体)；

(b)向细胞群体引入包含本发明第一gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第一gRNA分子包含与(例如，如本文所述的)CD247、CD3D、CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1、TRBC2中靶序列(例如，TRAC、TRBC1或TRBC2中的靶序列，例如，TRAC中的靶序列)互补的导引结构域；

(c)向细胞群体引入包含本发明第二gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第二gRNA分子包含与(例如，如本文所述的)NLRC5中靶序列互补的导引结构域；

(d)任选地，选择那些其中已经减少或消除有功能TCR表达的细胞；

(e)用编码(例如，如本文所述的)CAR(例如，如本文所述的BCMA CAR)的核酸转导细胞群体；并且

(f)施用细胞群体至有需要的患者，例如，患有与CAR识别的抗原表达相关的疾病的患者。

在一个实施方案中，该方法还包括步骤(g)：向所述细胞群体引入包含本发明第三gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第三gRNA分子包含与(例如，如本文所述的)CIITA、RFXANK、RFX5或RFXAP中靶序列互补(例如，与CIITA中靶序列互补)的导引结构域。

在一个方面，本发明提供一种治疗方法，所述治疗方法包括：

(a)从同种异体供体或自体供体提供细胞群体，例如免疫效应细胞(例如，NK或T细胞)；

(b)向细胞引入包含本发明第一gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)；

(c)任选地，选择那些其中已经减少或消除包含与第一gRNA的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)表达的细胞；

(d)用编码如本文所述的CAR的核酸转导细胞；并且

(e)施用细胞至有需要的患者，例如，患有与表达CAR识别的抗原相关的疾病的患者。

在实施方案中，第一gRNA分子包含与抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的基因中靶序列互补的导引结构域，例如，第一gRNA分子包含与选自CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PD-L2、CTLA4、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD113)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD107)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ及PTPN11的基因中靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，第一gRNA包含针对CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1或PTPN11的导引结构域，其选自表2或表6的导引结构域。在实施方案中，步骤(c)任选地包括选择那些细胞，其中已经减少或消除包含与第一gRNA的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)的表达。

在实施方案中，该方法还包括向细胞至少引入本发明的第二gRNA分子(例如，2种或更多种gRNA分子)(或编码所述gRNA分子的核酸)。在实施方案中，每种额外的gRNA分子(例如，第二gRNA分子)包含与抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的基因中靶序列互补(例如，与选自CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1、PD-L2、CTLA4、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD113)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD107)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ及PTPN11的基因中靶序列互补)的导引结构域。在实施方案中，第三gRNA包含针对CD274、HAVCR2、LAG3、PDCD1或PTPN11的导引结构域，其选自表2或表6的导引结构域。在实施方案中，每种额外的gRNA分子包含与不同抑制性分子或借助抑制性分子发生信号传导的下游效应物的基因中靶序列互补的导引结构域。在实施方案中，步骤(c)任选地包括选择那些细胞，其中已经减少或消除包含与第一gRNA的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)的表达、包含与第二gRNA的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)的表达，和/或包含与第三或更多gRNA(若存在)的导引结构域互补的靶序列的基因的基因产物(例如，功能性基因产物)的表达。

在一个方面，本发明提供一种采用同种异体细胞(例如同种异体免疫效应细胞，例如表达CAR的同种异体T细胞)治疗受试者的方法，例如，受试者具有本文所述的病症，其中所述细胞包含或在任何时间包含靶向TCR组分的gRNA分子和靶向免疫抑制剂的靶的gRNA分子。在实施方案中，已经改变细胞，从而已经减少或消除有功能TCR的表达和免疫抑制剂的有功能靶的表达。

在一个方面，本发明提供一种治疗方法，所述治疗方法包括：

(a)从同种异体供体提供细胞群体；

(b)向细胞引入包含本发明第一gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第一gRNA分子包含与CD247、CD3D、CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1、TRBC2中靶序列互补的导引结构域；

(c)向细胞引入包含本发明第二gRNA分子(或编码所述gRNA分子的核酸)的CRISPR系统(例如，化脓性链球菌Cas9 CRISPR系统)，所述第二gRNA分子包含与DCK、CD52、FKBP1A或NR3C1中靶序列互补的导引结构域；

(d)任选地选择其中已经减少或消除有功能TCR表达、免疫抑制剂的有功能靶表达，或有功能TCR和免疫抑制剂的有功能靶表达的那些细胞；

(e)用编码如本文所述的CAR的核酸转导细胞；并且

(f)施用细胞至有需要的患者，例如，患有与表达CAR识别的抗原相关的疾病的患者；并且

(g)向患者施用与(c)的gRNA靶向的免疫抑制剂的靶结合的免疫抑制剂。

在实施方案中，针对CD247、CD3D、CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1或TRBC2的第一gRNA是包含表1、表4或表5中列出的导引结构域的第一gRNA。在实施方案中，针对DCK、CD52、FKBP1A或NR3C1的第二gRNA是包含表1中列出的导引结构域的第二gRNA分子。在实施方案中，第一gRNA靶向TRAC、TRBC1或TRBC2。在实施方案中，第二gRNA靶向DCK，并且(g)的免疫抑制剂是基于核苷类似物的药物如阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)或吉西他滨。在一个实施方案中，第二gRNA靶向NR3C1(编码糖皮质激素受体(GR)的基因)，并且免疫抑制剂是皮质类固醇如地塞米松。在一个实施方案中，第二gRNA靶向CD52，并且免疫抑制剂是抗CD52抗体或其抗原结合片段如阿伦珠单抗在一个实施方案中，第二gRNA靶向FKBP1A，并且免疫抑制剂是FK506(或FKBP12结合片段或其类似物)、环孢菌素、雷帕霉素或雷帕霉素类似物、或mTor抑制剂如RAD001。

在本发明的任何实施方案和方面，包括在前述方面和实施方案的任一者中，细胞群体可以例如在生产期间对特定亚群或亚群体(例如，对T细胞，例如，对干细胞记忆样T细胞)富集。

在另一个方面，提供一种在受试者中治疗受试者(例如，减少或缓解)的过度增生性病状或疾病(例如，癌症，例如，实体瘤、软组织肿瘤或转移性病灶)的方法。如本文所用，术语“癌”意在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。实体瘤的例子包括多个器官系统的恶性肿瘤，例如，肉瘤、腺癌和癌，如侵袭肝、肺、乳腺、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、生殖泌尿道(例如，肾、膀胱上皮细胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤如大部分结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。在一个实施方案中，癌症是黑素瘤，例如，晚期黑素瘤。前述癌的转移性病灶也可以使用本发明的方法和组合物治疗或预防。可以治疗的其他癌的例子包括骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、癌症肛区、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病，包括急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原代CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊枢椎肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、Kaposi肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境所致癌，包括石棉诱导的那些癌和所述癌的组合。可以使用本文所述的抗体分子实现对转移性癌(例如，表达PD-L1的转移性癌)(Iwai等人,(2005)Int.Immunol.17:133-144)的治疗。

可以抑制其生长的示例性癌包括一般响应于免疫疗法的癌。治疗的癌的非限制性例子包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素抵抗性前列腺腺癌)、乳腺癌、结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。另外，可以使用本文所述的分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。

在一个方面，本发明涉及一种治疗受试者中癌的方法。在一个方面，与表达如本文所述的癌相关抗原相关的癌是血液学癌。在一个方面，血液学癌是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与表达如本文所述的癌相关抗原相关的癌包括多种癌和恶性肿瘤，包括但不限于，例如，一种或多种急性白血病，包括但不限于例如，B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、急性淋巴样白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。与表达如本文所述的癌相关抗原相关的额外癌或血液学病状包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是依据髓样血细胞无效产生(或异型增生(dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合等。与如本文所述的癌相关抗原表达相关的其他疾病例如包括但不限于与表达如本文所述的癌相关抗原相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病。

在一些实施方案中，可以治疗的癌是多发性骨髓瘤。通常，借助流式细胞术，认为骨髓瘤细胞呈如本文所述的癌相关抗原表达阴性。因此，在一些实施方案中，经进一步工程化以如本文所述的表达CAR(例如，如本文所述的CD19 CAR或BCMA CAR)的细胞可以用来靶向骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，本发明的疗法可以与一种或多种附加疗法(例如，来那度胺治疗)组合使用。

在多个方面，施用T细胞或NK细胞至患者后，向患者施用的本发明的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)或其子代在患者中留存至少4个月、5个月、6个个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年或5年。

本发明还包括一个类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)进一步(例如，借助体外转录的RNA)修饰，以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)并且将CAR T细胞或NK细胞输注至有需求的接受者。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。因此，在多个方面，在施用T细胞或NK细胞至患者后，向患者施用的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)存在少于1个月，例如，3周、2周、1周。

不希望受任何具体理论约束，由CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)激发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答、或备选地可以归因直接与间接免疫应答。在一个方面，CAR转导的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)显示出响应于表达如本文所述的癌相关抗原的人癌细胞的特异性促炎细胞因子分泌和强力溶细胞活性、抵抗如本文所述的可溶性癌相关抗原的抑制作用、介导旁观者杀伤作用并介导建立的人肿瘤消退。例如，在表达如本文所述的癌相关抗原的肿瘤的不均一视野内部抗原较少的肿瘤细胞可能易遭如本文所述的癌相关抗原重定向的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的间接破坏，其中所述免疫效应细胞事先已经与毗邻的抗原阳性癌细胞反应。

离体程序是本领域熟知的并且在下文更充分地讨论。简而言之，从哺乳动物(例如，人)分离细胞并用本发明的gRNA分子和任选地用本文公开的表达CAR的载体对其进行基因修饰(即，在体外转导或转染)。修饰的细胞可以施用至哺乳动物受者以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人并且细胞可以相对于接受者是自体的。备选地，细胞可以相对于接受者是同种异体。

在通过引用方式并入本文的美国专利号5,199,942中描述了离体扩充造血干细胞和祖细胞的方法，可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此，本发明不限于离体扩充细胞的任何具体方法。简而言之，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的离体培养和扩充包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体采集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩充这类细胞。除美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子之外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体可以用于细胞的培养和扩充。

例如在WO2015/142675中描述了离体扩充免疫效应细胞(例如，T细胞)方法，所述文献的内容因而通过引用的方式完整并入本文。这类方法可以在与本文所述的方法组合使用时有用。

就离体免疫而言除使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供用于体内免疫以激发患者中针对抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常，如本文所述的细胞活化和扩充可以用于治疗和预防在免疫受损的个体中出现的疾病。特别地，本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)用于治疗与表达如本文所述的癌相关抗原相关的疾病、病症和病状中。在某些方面，本发明的细胞用于治疗这样的患者，所述患者面临形成与表达如本文所述的癌相关抗原相关的疾病、病症和病状的风险。因此，本发明提供用于治疗或预防与表达如本文所述的癌相关抗原相关的疾病、病症和病状的方法，所述方法包括向有需求的受试者施用治疗有效量的本发明CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。

在一个方面，本发明的细胞，包括进一步工程化以表达CAR的细胞，可以用来治疗增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前期病状如脊髓发育不良、脊髓发育不良综合征或白血病前期。与如本文所述的癌相关抗原表达相关的其他疾病包括但不限于例如表达如本文所述的癌相关抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病。与表达如本文所述的癌相关抗原相关的非癌症相关适应症例如包括但不限于自身免疫疾病、(例如，狼疮)、炎性疾病(过敏和哮喘)和移植。

本发明的细胞(例如，T细胞、NK细胞)可以单独施用或与稀释剂和/或与其他组分如IL-2或其他细胞因子或细胞群体作为药物组合物组合施用。

血液学癌

血液学癌疾病是多种类型侵袭血液、骨髓和淋巴系统的癌症如白血病、淋巴瘤和恶性淋巴细胞增生性疾病。

白血病可以划分成急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步划分为急性髓细胞白血病(AML)和急性淋巴样白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴样白血病(CLL)。其他相关的疾病包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称作“白血病前期”)，其是依据髓样血细胞无效产生(或异型增生(dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合，和转变成AML的风险。

淋巴瘤是一组从淋巴细胞形成的血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

本发明还提供用于抑制表达如本文所述的癌相关抗原的细胞群体增殖或减少该群体的方法，所述方法包括使包含表达如本文所述的癌相关抗原的细胞的细胞群体与本发明细胞(例如，NK细胞或T细胞)接触，所述的本发明细胞经进一步工程化以表达与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞结合的CAR。在一个具体方面，本发明提供用于抑制表达如本文所述的癌相关抗原的癌细胞群体增殖或减少该群体的方法，所述方法包括使表达如本文所述的癌相关抗原的癌细胞群体与本发明T细胞或NK细胞接触，所述的本发明T细胞或NK细胞经进一步工程化以表达与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞结合的CAR。在一个方面，本发明提供用于抑制表达如本文所述的癌相关抗原的癌细胞群体增殖或减少该群体的方法，所述方法包括使表达如本文所述的癌相关抗原的癌细胞群体与本发明T细胞或NK细胞接触，所述的本发明T细胞或NK细胞经进一步工程化以表达与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞结合的CAR。在某些方面，相对于阴性对照，在患有与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞相关的髓样白血病或另一种癌的受试者或前述疾病的动物模型中，本发明的T细胞或NK细胞减少细胞和/或癌细的量、数目、数量或百分数至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一个方面，受试者是人。

本发明还提供用于预防、治疗和/或管理与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞相关的疾病(例如，表达如本文所述的癌相关抗原的血液学癌或非典型癌)的方法，所述方法包括向有需求的受试者施用本发明的T细胞或NK细胞，包括经进一步工程化以表达与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞结合的CAR的那些细胞。在一个方面，受试者是人。与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞相关的病症的非限制性例子包括自体免疫疾病(如狼疮)、炎性疾病(如变态反应和哮喘)和癌(如表达如本文所述的癌相关抗原的血液癌症或非典型癌)。

本发明还提供用于预防、治疗和/或管理与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括向有需求的受试者施用本发明的T细胞或NK细胞，包括经进一步工程化以表达与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞结合的CAR的那些细胞。在一个方面，受试者是人。

本发明提供用于防止与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞相关的癌症复发的方法，所述方法包括向有需求的受试者施用本发明的T细胞或NK细胞，包括经进一步工程化以表达与表达如本文所述的癌相关抗原的细胞结合的CAR的那些细胞。在一个方面，这些方法包括施用与有效量的另一种疗法组合的细胞。

药物组合物和治疗

本发明的药物组合物可以包含与一种或多种药物或生理可接受载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的细胞，例如，多个细胞。这类组合物可以包含缓冲液如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，配制本发明的组合物以便静脉内施用。

本发明的药物组合物可以按适于待治疗(或预防)疾病的方式施用。施用的量和频率将由这类因素决定，如患者的状况和患者疾病的类型和严重性，不过适宜的剂量可以通过临床试验确定。

在一个实施方案中，药物组合物基本上不含(例如，不存在)可检测水平的杂质，例如，所述杂质选自内毒素、支原体(Mycoplasma)、有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残余抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、汇集的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，细菌是选自以下的至少一种：粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、白假丝酵母(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)A群。

当指出“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可以由医师在考虑年龄、体重、肿瘤尺寸、程度感染或转移和患者(受试者)状况的个体差异时确定。通常可以声称，本文所述的包含免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物可以按10⁴至10⁹个细胞/kg体重，在一些情况下10⁵至10⁶个细胞/kg体重(包括这些范围内部的全部整数值)的剂量施用。T细胞组合物也可以按这些剂量施用多次。细胞可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。

在某些方面，可能想要施用活化的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)至受试者并且随后回抽血液(或进行单采血液成分术)、根据本发明活化来自其中的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)并向患者回输这些活化和扩充的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。这个过程可以每数周实施多次。在某些方面，可以活化来自10cc至400cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在某些方面，活化来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。

施用主题组合物可以按任何便利方式实施，包括气溶胶吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、真皮内、瘤内、淋巴结内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹腔内施用至患者。在一个方面，通过真皮内或皮下注射向患者施用本发明的T细胞组合物。在一个方面，通过静脉内注射施用本发明的T细胞组合物。可以将免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的组合物直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位中。

在特定的示例性方面，受试者可以接受白细胞去除术，其中将白细胞收集、富集或离体耗尽以选择和/或分离目的细胞，例如，T细胞。这些T细胞分离物可以通过本领域已知的方法扩充并如本文所述那样处理，因而产生本发明的T细胞。有需求的受试者可以随后接受高剂量化疗标准治疗，接着进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植后或与移植同时地，受试者接受扩充的本发明T细胞输注。在一个额外的方面，将扩充的细胞在手术前或在之后施用。

待施用至患者的上述疗法的剂量将随正在治疗的病症的确切性质和治疗的接受者变动。人类施用剂量的放大可以根据本领域接受的惯例进行。对于成年患者，CAMPATH的剂量例如通常将在1至约100mg范围内，通常每日施用1天和30天之间的时间。优选的每日剂量是1至10mg每日，不过在一些情况下，使用至多每日40mg的更大剂量(美国专利号6,120,766中所述)。

在一个方面，使用慢病毒载体(如慢病毒)生成表达CAR的本发明细胞。以这种方式生成的细胞(例如，CART)将具有稳定的CAR表达。

在一个方面，使用病毒载体(如γ逆转录病毒载体，例如，本文所述的γ逆转录病毒载体)生成表达CAR的细胞，例如，CART。使用这些载体生成的CART可以具有稳定的CAR表达。

在一个方面，在转导后CART瞬时表达CAR载体4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。可以通过递送RNA CAR载体实现CAR的瞬时表达。在一个方面，将CAR RNA通过电穿孔法转导入T细胞中。

可能在使用瞬时表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)(尤其用鼠scFv携带CART)正在治疗的患者中出现的潜在问题是多次治疗后的变态反应。

在不受这个理论约束的情况下，认为这种变态反应可能由患者形成抗CAR体液应答(即，具有抗IgE同种型的抗CAR抗体)引起。认为当存在十至十四天抗原暴露间断期的情况下，产生抗体的患者细胞发生从(不引起变态反应的)IgG同种型至IgE同种型的类别转换。

如果患者在瞬时CAR疗法过程期间面临产生抗CAR抗体反应的高风险(如由RNA转导产生的那些)，CART输注间断期不应当持续超过十至十四天。

产生修饰的表达CAR的细胞的方法

在另一个方面，本发明涉及一种产生细胞(例如，免疫效应细胞或其群体)的方法，所述方法包括向细胞(例如，本文所述的T细胞或NK细胞)引入(例如，转导)载体，其包含编码CAR(例如，本文所述的CAR)的核酸或编码CAR分子(例如，本文所述的CAR)的核酸。

这些方法中的细胞是免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞、或其组合)。在一些实施方案中，在方法中的细胞是二酰甘油激酶(DGK)缺陷的和/或Ikaros缺陷的。

在一些实施方案中，引入编码CAR的核酸分子包括转导包含编码CAR的核酸分子的载体，或转染编码CAR的核酸分子，其中核酸分子是体外转录的RNA。

在一些实施方案中，该法还包括：

提供免疫效应细胞群体(例如，T细胞或NK细胞)；并且

从该群体移除调节性T细胞，因而提供调节性T细胞耗尽的群体；

其中步骤a)和b)在引入编码CAR和/或CRISPR系统的核酸至群体之前进行。

在这些方法的实施方案中，调节性T细胞包括CD25+ T细胞，并且使用抗CD25抗体或其片段从细胞群体移除。抗CD25抗体或其片段可以与基材(例如，珠)缀合。

在其他实施方案中，从步骤(b)提供的调节性T细胞耗尽的群体含有小于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。

在另外的其他实施方案中，该方法还包括从群体移除细胞，其表达不包含CD25的肿瘤抗原，以在引入编码CAR的核酸至群体之前，提供调节性T细胞耗尽和肿瘤抗原耗尽的细胞群体。肿瘤抗原可以选自CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b或其组合。

在另外的其他实施方案中，该方法还包括从群体移除表达检查点抑制蛋白的细胞，以在将编码CAR或CRISPR系统的核酸引入至群体之前，提供调节性T细胞耗尽和抑制性分子耗尽的细胞的群体。检查点抑制蛋白可以选自PD-1、LAG-3、TIM3、B7-H1、CD160、P1H、2B4、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、TIGIT、CTLA-4、BTLA及LAIR1。

本文公开的其他实施方案涵盖提供免疫效应细胞群体。可以基于CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA、和/或CD45RO中一者或多者的表达，选择所提供的免疫效应细胞群体。在某些实施方案中，所提供的免疫效应细胞群体为CD3+和/或CD28+。

在该方法的某些实施方案中，此方法还包括在已经引入编码CAR的核酸分子后扩充细胞群体。

在实施方案中，将细胞群体扩充8天或更短时间。

在某些实施方案中，将细胞群体在培养下扩充5天并且所产生的细胞比相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞更有效力。

在其他实施方案中，与相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞相比，在培养下扩充5天的细胞群体显示在抗原刺激时细胞倍增作用增长至少1、2、3或4倍。

在另外的其他实施方案中，将细胞群体在培养下扩充5天，并且如与相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞相比，所产生的细胞显示出更高的促炎IFN-γ和/或GM-CSF水平。

在其他实施方案中，通过在刺激CD3/TCR复合体相关信号的物质和/或刺激细胞表面上共刺激分子的配体存在下培养细胞，扩充细胞群体。该物质可以是与抗CD3抗体或其片段和/或抗CD28抗体或其片段缀合的珠。

在其他实施方案中，将细胞群体在适宜的培养基中扩充，所述培养基包含导致细胞历经14天扩充时间增加至少200倍、250倍、300倍或350倍的一种或多种白介素，如通过流式细胞术所测量。

在其他实施方案中，在IL-15和/或IL-7存在下扩充细胞群体。

在某些实施方案中，该方法还包括在适宜的扩充时间后深冷保存细胞群体。

在另外的其他实施方案中，本文公开的产生方法还包括使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基(例如，hTERT)的核酸接触。编码端粒酶亚基的核酸可以是DNA。

本发明还提供一种产生暂时表达外源RNA的RNA工程化细胞(例如，本文所述的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞))的群体的方法。该方法包括将体外转录的RNA或合成的RNA引入细胞，其中RNA包含编码本文所述的CAR分子的核酸。

在另一个方面，本发明涉及一种在受试者中提供抗肿瘤免疫力的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含CAR分子的细胞，例如，表达本文所述的CAR分子的细胞。在一个实施方案中，细胞是自体T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，细胞是同种异体T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，受试者是人。

在一个方面，本发明包含用载体转染或转导的自体细胞群体，所述载体包含编码(例如，如本文所述的)CAR分子的核酸分子。在一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是如本文他处描述的自我失活性慢病毒载体。在一个实施方案中，将载体递送(例如，通过转染或电穿孔)至细胞，例如，T细胞或NK细胞，其中载体包含编码如本文所述的本发明CAR的核酸分子，所述核酸分子转录为mRNA分子，并且本发明的CAR从RNA分子翻译并表达在细胞的表面上。

在另一个方面，本发明提供表达CAR的细胞(例如，表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞))的群体。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的群体可以包含第一细胞，其表达了具有与如本文所述的第一肿瘤抗原结合的抗原结合结构域的CAR；和第二细胞，其表达了具有与如本文所述的第二肿瘤抗原结合的不同抗原结合结构域的CAR。作为另一个例子，表达CAR的细胞的群体可以包含第一细胞，其表达了包含与如本文所述的肿瘤抗原结合的抗原结合结构域的CAR；和第二细胞，其表达了包含针对如本文所述的肿瘤抗原之外的靶的抗原结合结构域的CAR。在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群体包含第一细胞，其表达了包含初级胞内信号传导结构域的CAR；和第二细胞，其表达了包含次级信号传导结构域(例如，共刺激信号传导结构域)的CAR。

在另一个方面，本发明提供这样的细胞群体，其中群体的至少一个细胞表达具有与如本文所述的肿瘤抗原结合的抗原结合结构域的CAR，和这样的第二细胞，其表达另一种物质，例如，增强表达CAR的细胞活性的物质。例如，在一个实施方案中，物质可以是抑制了抑制性分子的物质。抑制性分子的例子包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ。在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质例如是本文所述的分子，例如，包含第一多肽(例如，抑制性分子)的物质，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施方案中，该物质例如包含抑制性分子如PD-1、LAG-3、CTLA-4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、2B4和TIGIT或这些分子中任一者之片段的第一多肽和作为本文所述胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施方案中，该物质包含PD-1或其片段的第一多肽和本文所述胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28、CD27、OX40或4-IBB信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。

在一个实施方案中，编码(例如，如本文所述的)本发明CAR分子的核酸分子作为mRNA分子表达。在一个实施方案中，可以通过将编码所需CAR的RNA分子(例如，无载体序列)转染或电穿孔入细胞，产生基因修饰的表达本发明CAR的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一个实施方案中，一旦并入，则本发明的CAR分子从RNA分子翻译并表达在重组细胞的表面上。

一种产生用于转染的mRNA的方法涉及用专门设计的引物在体外转录(IVT)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)(例如，本文所述的3’和/或5’UTR)、5’帽(例如，本文所述的5’帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文所述的IRES)、待表达的核酸和长度一般为50-2000碱基的聚腺苷酸化尾(SEQ ID NO:6638)的构建体。如此产生的RNA可以高效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，模板包括CAR的序列。在一个实施方案中，将RNA CAR载体通过电穿孔转导至细胞(例如，T细胞或NK细胞)中。

XII.制造方法

本公开提供方法产生经本文所述的gRNA分子修饰或待修饰的细胞，例如，T细胞，例如，同种异体T细胞，例如，CAR工程化的细胞。

引入CRISPR系统

本发明包含细胞，例如免疫效应细胞，例如，同种异体或自体细胞，所述细胞包含或曾经包含一种或多种如本文所述的gRNA分子。可以通过本文所述的任何方法，将本文所述的CRISPR系统引入细胞。细胞还可以工程化以表达如本文所述的CAR。

在一个方面，本公开提供一种用于产生细胞的方法，所述方法包括：

a)将如本文所述的gRNA分子或编码所述gRNA分子的核酸引入所述细胞；

b)将如本文所述的Cas9分子或编码所述Cas9分子的核酸引入所述细胞；

c)将编码CAR的核酸引入所述细胞；并且

d)扩充并且活化细胞。

在实施方案中，a)和b)的引入出现在步骤c)和d)之前。在实施方案中，c)的引入出现在a)和b)的引入之前。在实施方案中，c)的引入和d)的扩充和活化出现在a)和b)的引入之前。在实施方案中，该方法还包括e)选择表达CAR的细胞。在实施方案中，方法还包括f)选择没有步骤a)的gRNA分子靶向的基因表达或其表达减少的细胞。例如，如果gRNA分子包含与TRAC基因中靶序列互补的导引结构域(例如，包含有包含SEQ ID NO:5816至SEQ ID NO:5965或SEQ ID NO:5528至SEQ ID NO:5623中任一者的导引结构域)，则在a)和b)的引入后，缺少TCR表达(例如，如通过例如，抗CD3抗体可检测)的细胞可以经分选用于如本文所述的产生方法中的其他应用或本文所述的治疗方法中的其他应用。可以通过本领域已知的方法如细胞分选法或机械分离(例如，通过磁珠结合的抗CD3抗体分离以移除仍表达CD3/TCR的那些细胞)进行这类分选。

细胞的扩充和活化

可以通常使用如在例如以下文献中所述的方法，活化和扩充免疫效应细胞如T细胞：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005，所述每篇文献通过引用的方式完整并入。

通常，可以通过接触于下述表面扩充免疫效应细胞(例如，T调节性细胞耗尽的细胞)群体，所述表面已经与刺激CD3/TCR复合物相关的信号的物质和刺激T细胞表面上共刺激分子的配体连接。特别地，可以如本文所述那样，如通过接触于固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体，或通过接触于蛋白激酶C激活物(例如，苔藓抑素)连同钙离子载体，刺激T细胞群体。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群体可以在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的例子包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,France)，可以如本领域共知的其他方法那样使用(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。

在其中细胞具有降低的或不存在的TCR组分表达水平或水平的实施方案中，可以通过除与CD3相互作用之外的手段实现活化。在还表达CAR的细胞中，可以通过使所述细胞与CAR的抗原结合结构域所结合的抗原或其能够结合CAR的片段接触，实现活化。这类抗原或其片段可以例如存在于抗体支架、细胞(例如，抗原呈递细胞，例如，天然表达所述抗原或已经过人工工程化以在其细胞表面上表达所述抗原的细胞)或固相支持物(如珠或膜)上。

在某些方面，T细胞的初级刺激性信号和共刺激信号可以由不同方案提供。例如，提供每种信号的物质可以处于溶液中或与表面偶联。与表面偶联时，物质可以与相同表面(即，处于“顺式”形式)偶联或与分立的表面偶联(即，处于“反式”形式)。备选地，一个物质可以与表面偶联并且另一种物质处于溶液中。在一个方面，提供共刺激信号的物质与细胞表面结合并且提供初级激活信号的物质处于溶液中或与表面偶联。在某些方面，两种物质均可以处于溶液中。在一个方面，物质可以处于可溶性形式，并且随后交联至表面，如表达将会与该物质结合的Fc受体或抗体或其他结合物的细胞。在这个方面，关于在本发明中构思用于活化和扩充T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，参见例如，美国专利申请公开号20040101519和20060034810。

在一个方面，两种物质固定在珠上、固定在相同的珠上、即，“顺式”，或固定至分立的珠上、即，“反式”。例如，提供初级活化信号的物质是抗CD3抗体或其抗原结合片段并且提供共刺激信号的物质是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种物质均以等同的分子数量共同固定至相同珠上。在一个方面，对于CD4+ T细胞扩充和T细胞生长，使用与珠结合的每种抗体的1:1比率。在本发明的某些方面，如此使用与珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，从而如与使用比率1:1时观察到的扩充相比，观察到T细胞扩充增加。在一个特定方面中，如与使用比率1:1时观察到的扩充相比，观察到约1倍至约3倍的增加。在一个方面，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率是从100:1至1:100和其间的全部整数值。在一个方面，比抗CD3抗体更多的抗CD28抗体与粒子结合、即，CD3:CD28的比率小于1。在某些方面，与珠结合的抗CD28抗体对抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定的方面中，使用1:100与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个方面，使用1:75与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在又一个方面，使用1:50与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个方面，使用1:30与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个优选的方面，使用1:10与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个方面，使用1:3与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在又一个方面，使用3:1与珠结合的CD3:CD28抗体比率。

粒子对细胞比率1:500至500:1和其间任何整数值可以用来刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以轻易地领会，粒子对细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒子大小。例如，小规格珠仅可能结合一些细胞，而较大的珠可能结合许多细胞。在某些方面，细胞对粒子的比率范围从1:100至100:1和其间的任何整数值，并且在其他方面中，该比率包含1:9至9:1和其间的任何整数值、也可以用来刺激T细胞。导致刺激T细胞的抗CD3偶联粒子和抗CD28偶联粒子对T细胞的比率可以如上文所示变动，然而某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率是每个T细胞至少1:1粒子。在一个方面，使用1:1或更小的粒子对细胞比率。在一个特定方面，优选的粒子:细胞比率是1:5。在其他方面，粒子:细胞比率可以根据刺激的日期变动。例如，在一个方面，粒子:细胞比率在第1天是1:1至10:1，并且此后每日或每隔1日添加额外粒子至细胞持续至多10天，按1:1至1:10的最终比率(基于添加日时的细胞计数)添加。在一个特定方面，粒子:细胞比率在第1刺激日是1:1并且在第三刺激日和第五刺激日调节至1:5。在一个方面，基于每日或每隔1日添加粒子至第1刺激日时最终比率1:1，并且在第三刺激日和第五刺激日添加粒子至最终比率1:5。在一个方面，粒子:细胞比率在第1刺激日是2:1并且在第三刺激日和第五刺激日调节至1:10。在一个方面，基于每日或每隔1日添加粒子至第1刺激日时最终比率1:1，并且在第三刺激日和第五刺激日添加粒子至最终比率1:10。本领域技术人员将理解，多种其他比率可以在本发明中适用。特别地，比率将根据粒子大小和细胞尺寸和类型变动。在一个方面，使用的最常见比率在第1天接近1:1、2:1和3:1。

在其他方面，细胞(如T细胞)与物质包被的珠组合，随后分离珠和细胞，并且随后培养细胞。在备选方面，在培养之前，不分离物质包被的珠和细胞，而是在一起培养。在又一个方面，首先通过应用某种力(如磁力)浓缩珠和细胞、导致细胞表面标记物的连接增加，因而诱导细胞刺激作用。

例如，可以通过使得与抗CD3和抗CD28连接的顺磁珠(3x28珠)接触T细胞，连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如，10⁴个至10⁹个T细胞)和珠(例如，M-450 CD3/CD28T顺磁珠按比率1:1)在缓冲液例如PBS(不含二价阳离子如钙和镁)中合并。再次，本领域普通技术人员可以轻易地领会，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可能在样品中非常稀少并仅占样品的0.01％或整个样品(即，100％)可能包含目的靶细胞。因此，任何细胞数目均属于本发明的情景范围内。在某些方面，可能想要明显减少其中粒子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)以确保细胞和粒子最大限度接触。例如，在一个方面，使用约100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、50亿/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在又一个方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩充。另外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能微弱表达目的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。在某些方面，这类细胞群体可能具有治疗价值并且将希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择正常情况下具有更弱CD28表达的CD8+ T细胞。

在一个实施方案中，例如，通过本文所述方法，扩充本发明的细胞，例如，包含或在任何时间包含或将包含如本文所述的gRNA分子的细胞，例如，经编码CAR(例如，本文所述的CAR)的核酸转导的所述细胞。在一个实施方案中，将细胞在培养下扩充几小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一个实施方案中，将细胞扩充4至9天时间。在一个实施方案中，将细胞扩充8天或更短(例如，7、6或5天)时间。在一个实施方案中，将细胞在培养下扩充5天并且所产生的细胞比相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞更有效力。效力可以例如由多种T细胞功能定义，例如增殖、靶细胞杀伤作用、细胞因子产生、活化、移行、或其组合。在一个实施方案中，与相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞相比，扩充5天的细胞显示在抗原刺激时细胞倍增作用增长至少1、2、3或4倍。在一个实施方案中，将细胞在培养下扩充5天，并且与相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞相比，所产生的细胞显示出更高的促炎细胞因子产量，例如，IFN-γ水平和/或GM-CSF水平。在一个实施方案中，与相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞相比，扩充5天的细胞显示以pg/ml计的促炎细胞因子产量(例如，IFN-γ水平和/或GM-CSF水平)增长至少1、2、3、4、10倍或更多。

也可能需要几轮刺激，从而T细胞培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适宜的培养基(例如，极限基本培养基或RPMI培养基1640或、X-vivo 15、(Lonza))，所述培养基可以含有增殖和生存力必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加物。用于细胞生长的其他添加物包括但不限于表面活性剂、Plasmanate和还原剂如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包含RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer、连同添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适宜量的血清(或血浆)或限定的成组激素和/或足以生长和扩充T细胞的某种量的细胞因子。抗生素，例如，青霉素和链霉素仅包含于实验性培养物中，不包含于待输注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞在支持生长所必需的条件下维持，例如，适宜的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气外加5％CO2)。

在一个实施方案中，将细胞在适宜的培养基(例如，本文所述的培养基)中扩充，所述培养基包括导致细胞在14天扩充时间内增加至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)的一种或多种白介素，例如，如通过本文所述的方法(如流式细胞术)所测量的。在一个实施方案中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如，IL-15和IL-7)存在下扩充。

在实施方案中，本文所述的方法，产生本发明细胞(例如，包含或在任何时间包含过或将要包含如本文所述的gRNA分子的细胞，例如，表达CAR的所述细胞)的方法，包括例如使用抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体IL-2，从细胞群体移除调节性T细胞，例如，CD25+ T细胞。本文中描述了从细胞群体移除调节性T细胞(例如，CD25+ T细胞)的方法。在实施方案中，方法(例如，生产方法)还包括：使细胞群体与IL-15和/或IL-7接触，所述细胞群体例如是其中调节性T细胞(如CD25+ T细胞)已经耗尽的细胞群体；或先前已经接触过抗CD25抗体、其片段或CD25结合配体的细胞群体。例如，将细胞群体(例如，先前已经接触过抗CD25抗体、其片段或CD25结合配体的细胞群体)在IL-15和/或IL-7存在下扩充。

在一些实施方案中，本发明的细胞(例如，包含或在任何时间包含过或将要包含如本文所述的gRNA分子的细胞，例如，表达如本文所述的CAR的所述细胞)与包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽与IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)组合的组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。在实施方案中，本文所述的细胞与包含IL-15多肽的组合物在产生该细胞期间(例如，离体)接触。在实施方案中，本文所述的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽二者组合的组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。在实施方案中，本文所述的细胞与包含hetIL-15的组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。

在一个实施方案中，本发明的细胞(例如，包含或在任何时间包含过或将要包含如本文所述的gRNA分子的细胞，例如，表达如本文所述的CAR的所述细胞)与包含hetIL-15的组合物在离体扩充期间接触。在一个实施方案中，本文所述的细胞与包含IL-15多肽的组合物在离体扩充期间接触。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽二者的组合物在离体扩充期间接触。在一个实施方案中，接触过程导致淋巴细胞亚群(例如，CD8+ T细胞)存活和增殖。

已经暴露于变动的刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。例如，常见的血液或单采外周血单核细胞产物具有比细胞毒T细胞或阻抑T细胞群体(TC、CD8+)更大的辅助T细胞群体(TH、CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩充T细胞产生了这样的T细胞群体，其约第8-9天之前由TH细胞优势组成的T细胞群体，而约第8-9天之后，T细胞群体包含日益更大的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注由TH细胞优势组成的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已经分离TC细胞的抗原特异性亚群，可能有益的是更大程度地扩充这个亚群。

另外，除CD4和CD8标记物之外，其他表型标记也显著地变动，但是在细胞扩充过程期间大多可重复地变动。因此，这种重现性使得为特定目的而调整活化的T细胞产物的能力成为可能。

一旦构建了已经工程化以表达本文所述的CAR的本发明细胞，则各种测定法可以用来评价分子的活性，如但不限于抗原刺激后扩充T细胞的能力、在再次刺激不存在的情况下维持T细胞扩充的能力和在适宜体外模型和动物模型中的抗癌活性。下文进一步详细描述评价本发明car之作用的测定法。

原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析可以用来检测单体和二聚体的存在。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。非常简要地，将表达CAR的T细胞(CD4⁺ T细胞和CD8+ T细胞的1:1混合物)在体外扩充多于10天，随后裂解和在还原条件下进行SDS-PAGE。使用针对TCR-ζ链的抗体，通过蛋白质印迹法检测含有全长TCR-ζ胞质结构域和内源TCR-ζ链的CAR。相同T细胞亚群用于非还原性条件下的SDS-PAGE分析以允许评价共价二聚体形成。

可以通过流式细胞术测量在抗原刺激后CAR⁺ T细胞的体外扩充。例如，CD4⁺ T细胞和CD8+ T细胞的混合物用αCD3/αCD28 aAPC刺激，随后用在待分析的启动子控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、遍在蛋白C启动子或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在培养第6日通过流式细胞术评价CD4⁺和/或CD8+ T细胞亚群中的GFP荧光。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。备选地，CD4⁺ T细胞和CD8+ T细胞的混合物在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并且使用双顺反子慢病毒载体在第1天用CAR转导，其中所述双顺反子慢病毒载体使用2A核糖体跳跃序列表达CAR连同eGFP。在洗涤后，将培养物用如本文所述的癌相关抗原⁺K562细胞(表达如本文所述的癌相关抗原的K562)、野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞在抗CD3和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)存在下再刺激。每隔1日按100IU/ml添加外源IL-2至培养物。使用基于珠的计数法，通过流式细胞术计数GFP⁺T细胞。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。

也可以测量在再次刺激不存在的情况下维持的CAR+ T细胞扩充。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并在第1天用所示CAR转导后，在培养第8天使用库尔特粒度分析仪III粒子计数器Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter测量平均T细胞量(fl)。

动物模型也可以用来测量CART活性。例如，可以使用在免疫缺陷性小鼠中利用本文所述的癌相关抗原特异性人CAR⁺ T细胞处理原代人前B ALL的异种移植模型。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。非常简短地，在建立ALL后，将小鼠随机分配至治疗组。将不同数目的癌相关抗原特异性CAR工程化的T细胞按1:1比率共注射至携带B-ALL的NOD-SCID-γ^-/-小鼠中。在注射T细胞后的各种时间评价来自小鼠的脾DNA中癌相关抗原特异性CAR载体的拷贝数。按每周一次间隔评估动物的白血病。在用本文所述的癌相关抗原-ζCAR⁺ T细胞或模拟转导的T细胞注射的小鼠中测量外周血如本文所述的癌相关抗原⁺B-ALL母细胞计数。使用对数秩检验，比较各组的生存曲线。此外，也可以分析NOD-SCID-γ^-/-小鼠中注射T细胞后4周的外周血CD4⁺ T细胞绝对计数和CD8⁺ T细胞绝对计数。将小鼠用白血病细胞注射并且3周后，用经工程化以通过双顺反子慢病毒载体表达CAR的T细胞注射，所述双顺反子慢病毒载体编码与eGFP连接的CAR。通过注射之前与模拟转导的细胞混合，将T细胞对45–50％输入的GFP⁺ T细胞归一化，并且通过流式细胞术证实。按1周间隔评估动物的白血病。使用对数秩检验，比较各CAR⁺ T细胞组的生存曲线。

可以评估剂量依赖性CAR治疗反应。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。例如，在第21日用CAR T细胞、等同数目的模拟转导的T细胞或不用T细胞注射的小鼠中建立白血病后35–70天，获得外周血。来自每个组的小鼠随机采血以测定外周血如本文所述的癌相关抗原⁺ALL母细胞计数并且随后在第35天和第49天杀死。在第57和第70天评价剩余的动物。

先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如，在Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)处描述。简而言之，在微量滴定板中通过将洗涤的T细胞与表达本文所述的癌相关抗原(K19)的K562细胞或表达CD32和CD137的K562细胞(KT32-BBL)按T细胞:K562最终比率2:1混合，评估CAR介导的增殖。K562细胞在使用之前用γ-辐射照射。将抗CD3(克隆OKT3)单克隆抗体和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加至培养物，以KT32-BBL细胞充当刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持CD8+ T细胞离体长期扩充。如制造商所描述那样使用CountBright^TM荧光珠(Invitrogen,Carlsbad,CA)和流式细胞术，计数培养物中的T细胞。使用T细胞依据GFP表达鉴定CAR⁺ T细胞，其中所述T细胞用表达eGFP-2A连接的CAR的慢病毒载体工程化。对于不表达GFP的CAR⁺ T细胞，用生物素酰化的重组如本文所述的癌相关抗原蛋白和第二抗生物素蛋白-PE缀合物检测CAR⁺ T细胞。还同时用特异性单克隆抗体(BD Biosciences)检测T细胞上的CD4⁺表达和CD8⁺表达。使用人TH1/TH2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(BD Biosciences,San Diego,CA)根据制造商的说明，对再次刺激后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评估荧光并且根据制造商的说明分析数据。

细胞毒性可以由标准⁵¹Cr-释放测定法评估。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，将靶细胞(K562系和原代前B-ALL细胞)在37℃用⁵¹Cr(作为NaCrO4，New England Nuclear,Boston,MA)加载2小时伴以频繁搅拌，在完全RPMI中洗涤2次并铺种至微量滴定板中。在孔中，将效应T细胞与靶细胞在完全RPMI中按不同的效应细胞:靶细胞比率(E:T)混合。还配制了仅含有培养基(自发释放，SR)或1％triton-X100去垢剂溶液(总释放，TR)的额外孔。在37℃孵育4小时后，从每个孔收获上清液。随后使用γ粒子计数器(Packard Instrument Co.,Waltham,MA)测量释放的⁵¹Cr。每条件按至少三次重复进行并且使用下式计算裂解百分数：裂解％＝(ER-SR)/(TR–SR)，其中ER代表每种实验条件的⁵¹Cr平均释放。

成像技术可以用来评价携瘤动物模型中CAR的特异性转运和增殖。已经描述此类测定法，例如，在Barrett等人,Human Gene Therapy 22:1575-1586(2011)中描述。简而言之，将NOD/SCID/γc^–/–(NSG)小鼠用Nalm-6细胞静脉内注射，7天后，用CAR构建体电穿孔后4小时，用T细胞静脉内注射。T细胞用表达萤火虫萤光素酶的慢病毒构建体稳定转染并且对小鼠的生物发光成像。备选地，可以如下测量Nalm-6异种移植模型中单次注射CAR⁺ T细胞的治疗功效和特异性：用经转导以稳定表达萤火虫萤光素酶的Nalm-6注射NSG小鼠，7天后，随后单次尾静脉注射经本发明的car电穿孔的T细胞。在注射后的各种时间点对动物成像。例如，可以在第5日(处理前2天)和第8日(CAR⁺PBL后24小时)生成代表性小鼠中萤火虫萤光素酶阳性白血病的光子密度热图。

其他测定法，包括在本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那些，也可以用来评价这些细胞和表达本文所述的CAR的细胞。

递送时程

在一个实施方案中，递送除Cas系统的组分(例如，本文所述的Cas9分子组分和/或gRNA分子组分)之外的一种或多种核酸分子(例如，DNA分子)。在一个实施方案中，与递送Cas系统的一种或多种组分的相同时间递送核酸分子。在一个实施方案中，在递送Cas系统的一种或多种组分之前或之后(例如，小于约30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、1天、2天、3天、1周、2周或4周)递送核酸分子。在一个实施方案中，通过与递送Cas系统的一种或多种组分(例如，Cas9分子组分和/或gRNA分子组分)不同的手段递送核酸分子。可以通过本文所述的任何递送方法递送核酸分子。例如，可以通过病毒载体(例如，整合缺陷型慢病毒)递送核酸分子，并且可以例如通过电穿孔递送Cas9分子组分和/或gRNA分子组分，从而可以减少核酸(例如，DNA)引起的毒性。在一个实施方案中，核酸分子编码治疗性蛋白，例如，本文所述的蛋白质。在一个实施方案中，核酸分子编码RNA分子，例如，本文所述的RNA分子。

组分的双模式或差异性递送

分别递送Cas系统的组分(例如，Cas9分子组分和gRNA分子组分)并且更具体地，通过不同模式递送诸组分，可以例如通过改善组织特异性和安全性，增强性能。在一个实施方案中，通过不同模式或如本文中有时称作差异性模式，递送Cas9分子和gRNA分子。如本文所用，不同或差异性模式指对主体组分分子(例如，Cas9分子、gRNA分子、模板核酸或酬载)赋予不同药效动力学特性或药代动力学特性的递送模式。例如，递送模式可以例如，在选择的区室、组织、或器官中导致不同的组织分布、不同的半寿期或不同时间分布。

一些递送模式，例如，通过在细胞中或后代细胞中(例如，通过自主复制或插入细胞核酸中)持续存在的核酸载体递送，导致更持续的组分表达和组分存在。例子包括病毒递送(例如，腺相关病毒或慢病毒递送)。

通过举例，可以通过就所递送组分在身体或特定区室、组织或器官中的所得半寿期或持续性而言有差异的模式，递送组分(例如，Cas9分子和gRNA分子)。在一个实施方案中，可以通过这种模式递送gRNA分子。可以通过导致其持久性较小或对身体或特定区室或组织或器官的暴露量较少的模式，递送Cas9分子组分。

更一般地，在一个实施方案中，第一递送模式用来递送第一组分并且第二递送模式用来递送第二组分。第一递送模式赋予第一药效动力学或药代动力学特性。第一药效动力学的特性可以例如是组分或编码组分的核酸在身体、区室、组织或器官中的分布、持久性或暴露量。第二递送模式赋予第二药效动力学或药代动力学特性。第二药效动力学的特性可以例如是组分或编码组分的核酸在身体、区室、组织或器官中的分布、持久性或暴露量。

在一个实施方案中，第一药效动力学或药代动力学特性，例如，分布、持久性或暴露量比第二药效动力学或药代动力学特性更有限。

在一个实施方案中，选择第一递送模式以优化(例如，最小化)药效动力学或药代动力学特性，例如，分布、持久性或暴露量。

在一个实施方案中，选择第二递送模式以优化(例如，最大化)药效动力学或药代动力学特性，例如，分布、持久性或暴露量。

在一个实施方案中，第一递送模式包括使用相对持久的元件，例如，核酸，例如，质粒或病毒载体，例如，AAV或慢病毒。从而载体相对持久，则从它们转录的产物将相对持久。

在一个实施方案中，第二递送模式包含相对短暂的元件，例如，RNA或蛋白质。

在一个实施方案中，第一组分包含gRNA，并且递送模式是相对持久的，例如，gRNA从质粒或病毒载体(例如，AAV或慢病毒)转录出来。这些基因的转录将具有轻微的生理学结果，因为这些基因不编码蛋白质产物并且gRNA不能够孤立起作用。第二组分(Cas9分子)以瞬时方式递送，例如作为mRNA或作为蛋白质递送，从而确保完整的Cas9分子/gRNA分子复合体仅短时间存在和有效。

另外，诸组分可以在不同的分子形式下递送或用彼此互补的不同递送载体递送以增强安全性和组织特异性。

使用差异性递送模式可以增强性能、安全性和疗效。例如，可以降低最终脱靶修饰的可能性。因为来自细菌衍生Cas酶的肽由MHC分子展示在细胞的表面上，所以通过持久性较低的模式递送免疫原性组分(例如，Cas9分子)可以降低免疫原性。两部分递送系统可以减轻这些缺点。

差异性递送模式可以用来递送诸组分至不同、但重叠的靶区域。活性复合体的形成在靶区域重叠外部最小化。因此，在一个实施方案中，通过产生第一空间(例如，组织)分布的第一递送模式递送第一组分，例如，gRNA分子。通过产生第二空间(例如，组织)分布的第二递送模式递送第二组分，例如，Cas9分子。在一个实施方案中，第一模式包含选自脂质体、纳米粒子(例如，聚合物纳米粒子)和核酸(例如，病毒载体)的第一元件。第二模式包含选自的第二元件。在一个实施方案中，第一递送模式包含第一靶元件，例如，细胞特异性受体或抗体，并且第二递送模式不含该元件。在一个实施方案中，第二递送模式包含第二靶元件，例如，第二细胞特异性受体或第二抗体。

在病毒递送载体、脂质体、或聚合物纳米粒子中递送Cas9分子时、存在递送到多种组织和在多种组织中有治疗活性的可能性，此时可能仅想要靶向单一组织。两部分递送系统可以解决这个难题并增强组织特异性。如果gRNA分子和Cas9分子包装在具有不同但重叠的组织嗜性的分别的递送载具中，功能完整的复合体仅在两种载体都靶向的组织中形成。

在一个方面，离体完成递送。

XIII.修饰的核苷、核苷酸和核酸

修饰的核苷和修饰的核苷酸可以存在于核酸(例如，尤其gRNA中)，还存在于其他形式的RNA(例如，mRNA、RNAi或siRNA)中。如本文所述的“核苷”定义为含有五碳糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物和有机碱(嘌呤或嘧啶)或其衍生物的化合物。如本文所述，“核苷酸”定义为还包含磷酸酯基团的核苷。

修饰的核苷和核苷酸可以包括以下一者或多者：

(i)改变(例如，替换)磷酸二酯主链键中一个或两个非连接性磷酸根氧(phosphate oxygens)和/或一个或多个连接性磷酸根氧；

(ii)改变(例如，替换)核糖的组分(例如，核糖上的2'羟基)；

(iii)用“去磷酸”接头完全替换磷酸酯部分；

(iv)(包括用非典型核碱基)修饰或替换天然存在的核碱基；

(v)替换或修饰核糖-磷酸酯主链；

(vi)修饰寡核苷酸的3’端或5'端，例如，移除、修饰或替换末端磷酸酯基团或缀合某部分、帽或接头；和

(vii)修饰或替换糖。

上文所列的修饰可以组合以提供可以具有二、三个、四个或更多个修饰的修饰的核苷和核苷酸。例如，修饰的核苷或核苷酸可以具有修饰的糖和修饰的核碱基。在一个实施方案中，修饰gRNA的每个碱基，例如，全部碱基均具有修饰的磷酸酯基团，例如，全部为硫代磷酸酯基团。在一个实施方案中，将单分子或模块化gRNA分子的全部或基本上全部磷酸酯基团替换为硫代磷酸酯基团。

在一个实施方案中，修饰的核苷酸(例如，具有如本文所述修饰的修饰的核苷酸)可以并入核酸，例如，“修饰的核酸”。在一些实施方案中，修饰的核酸包含一个、二个、三个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的核酸中至少5％(例如，至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或约100％的)位置是修饰的核苷酸。

未修饰核酸可能易遭(例如，细胞核酸酶)降解。例如，核酸酶可以水解核酸磷酸二酯键。因此，在一个方面，本文所述的修饰的核酸可以含有一个或多个修饰的核苷或核苷酸，例如，以针对核酸酶引入稳定性。

在一些实施方案中，当体内和离体引入细胞群体时，本文所述的修饰的核苷、修饰的核苷酸和修饰的核酸可以显示出减低的先天免疫应答。术语“先天免疫应答”包括对外源核酸(包括单链核酸，通常为病毒源或细菌源)的细胞性反应，这涉及诱导细胞因子(尤其干扰素)的表达和释放及细胞死亡。在一些实施方案中，本文所述的修饰的核苷、修饰的核苷酸、和修饰的核酸可以破坏大沟相互作用部分与核酸的结合。在一些实施方案中，当体内和离体引入细胞群体时，本文所述的修饰的核苷、修饰的核苷酸和修饰的核酸可以显示出减低的先天免疫应答，并且还破坏大沟相互作用部分与核酸的结合。

化学基团的定义

如本文所用，“烷基”意指呈直链或分枝的饱和烃基。烷基的例子包括甲基(Me)、乙基(Et)、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、叔-丁基)、戊基(例如，正戊基、异戊基、新戊基)等。烷基可以含有1至约20、2至约20、1至约12、1至约8、1至约6、1至约4、或1至约3个碳原子。

如本文所用，“芳基”指单环状或多环状(例如，具有2、3或4个稠环的)芳香烃，例如，苯基、萘基、蒽基、菲基、茚满基、茚基等。在一些实施方案中，芳基具有6至约20个碳原子。

如本文所用，“链烯基”指含有至少一个双键的脂族基团。如本文所用，“炔基”指含有2-12个碳原子并且特征在于具有一个或多个叁键的直链或分枝烃链。炔基的例子包括但不限于乙炔基、炔丙基和3-己炔基(hexynyl)。

如本文所用，“芳基烷基”或“芳烷基”指其中烷基氢原子由芳基替换的烷基部分。芳烷基包括其中多于一个氢原子已经由芳基替换的基团。“芳基烷基”或“芳烷基”的例子包括苄基、2-苯乙基、3-苯基丙基、9-芴基、二苯甲基和三苯甲基。

如本文所用，“环烷基”指具有3至12个碳的环状、双环、三环或多环非芳族烃基。环烷基部分的例子包括但不限于环丙基、环戊基和环己基。

如本文所用，“杂环基”指杂环系统的单价原子团。代表性杂环基包括而不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、吡咯啉基、哌嗪基、二氧杂环己基(dioxanyl)、二氧戊环基、二吖庚因基、氧氮杂环庚三烯基、硫杂吖庚因基和吗啉基。

如本文所用，“杂芳基”指杂芳环系统的单价原子团。杂芳基部分的例子包括但不限于咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、吡咯基、呋喃基、吲哚基、苯硫基吡唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基、喹啉基和蝶啶基。

磷酸盐主链修饰

磷酸酯基团

在一些实施方案中，可以通过将一个或多个氧替换为不同取代基，对修饰的核苷酸的磷酸酯基团修饰。另外，修饰的核苷酸，例如，修饰的核酸中存在的修饰的核苷酸，可以包括将未修饰磷酸酯部分完全替换为如本文所述的修饰的磷酸酯。在一些实施方案中，对磷酸酯主链的修饰可以包括导致不带电荷接头或具有非对称电荷分布的带电荷接头的改变。

修饰的磷酸酯基团的例子包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸盐、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸盐、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。在一些实施方案中，磷酸酯主链部分的一个非桥接磷酸根氧原子可以由以下任何基团替换：硫(S)、硒(Se)、BR3(其中R可以例如是氢、烷基、或芳基)、C(例如，烷基、芳基等)、H、NR2(其中R可以例如是氢、烷基或芳基)、或OR(其中R可以例如是烷基或芳基)。未修饰的磷酸酯基团中的磷原子是非手性的。但是，将一个非桥接氧替换为以上原子或原子团之一可能带给磷原子手性；也就是说这种方式修饰的磷酸酯基团中的磷原子是立体中心。立体定向性磷原子可以拥有“R”构型(本文称作Rp)或“S”构型(本文称作Sp)。

二硫代磷酸酯具有硫替换的两个非桥接氧。二硫代磷酸酯中的磷中心是非手性的，这排除了寡核糖核苷酸非对映异构体的形成。在一些实施方案中，对一个或两个非桥接氧的修饰还可以包括将非桥接氧替换为独立选自S、Se、B、C、H、N和OR(R可以例如是烷基或芳基)的基团。

也可以通过将桥接氧(即，将磷酸酯与核苷连接的氧)替换为氮(桥接氨基磷酸盐)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基膦酸酯)，修饰磷酸酯接头。替换可以任一个连接氧或在两个连接性氧处出现。

替换磷酸酯基团

可以将磷酸酯基团替换为不含磷的连接体。在一些实施方案中，可以将带电荷的磷酸酯基团替换为中性部分。

可以替换磷酸酯基团的部分的例子可以例如包括而不限于甲基膦酸酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛(thioformacetal)、甲缩醛(formacetal)、肟、亚甲亚氨基、亚甲基甲亚氨基(methylenemethylimino)、亚甲基肼基(methylenehydrazo)、亚甲基二甲肼基和亚甲氧基甲亚氨基。

替换核糖磷酸酯主链

也可以构建可以模拟核酸的支架，其中将磷酸酯接头和核糖糖替换为抗核酸酶的核苷或核苷酸替代物。在一些实施方案中，核碱基可以由代用主链系留。例子可以包括而不限于吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷代用物。

糖修饰

修饰的核苷和修饰的核苷酸可以含一个或多个对糖基团的修饰。例如，2'羟基(OH)可以用众多不同的“氧”或“脱氧”取代基修饰或替换。在一些实施方案中，对2'羟基的修饰可以增强核酸的稳定性，原因在于羟基可以不再去质子化以形成2'-醇盐离子。2'-醇盐可以通过对接头磷原子的分子内亲核性攻击，催化降解。

“氧”-2'羟基修饰的例子可以包括烷氧基或芳氧基(或，其中“R”可以例如是烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R可以例如是H或任选取代的烷基并且n可以是从0至20的整数，例如，从0至4、从0至8、从0至10、从0至16、从1至4、从1至8、从1至10、从1至16、从1至20、从2至4、从2至8、从2至10、从2至16、从2至20、从4至8、从4至10、从4至16和从4至20的整数。在一些实施方案中，“氧”-2'羟基修饰可以包括“锁”核酸(LNA)，其中2'羟基可以(例如，通过C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基桥)连接至相同核糖的4'碳，其中示例性桥可以包括亚甲基、丙烯、醚、或氨基桥；O-氨基(其中氨基可以例如是NH2；烷基氨基、二烷氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基、O(CH2)n-氨基(其中氨基可以例如是NH2；烷基氨基、二烷氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。在一些实施方案中，“氧”-2'羟基修饰可以包括甲氧乙基基团(MOE)、(OCH2CH2OCH3，例如，PEG衍生物)。

“脱氧”修饰可以包括氢(即脱氧核糖，例如，在部分双链的RNA的突出端部分处)；卤素(例如，溴、氯、氟、或碘)；氨基(其中氨基可以例如是NH2；烷基氨基、二烷氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-氨基(其中氨基可以例如是如本文所述的)、-NHC(O)R(其中R可以例如是烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；和烷基、环烷基、芳基、链烯基和炔基，其可以任选地例如用如本文所述的氨基取代。

糖基团还可以含有一个或多个拥有与核糖中相应碳相反的立体化学构型的碳。因此，修饰的核酸可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。核苷酸“单体”可以在糖上Γ位置具有α键，例如，α-核苷。修饰的核酸还可以包含在C-缺少核碱基的“非碱基”糖。也可以在糖原子的一种或多种组分处进一步修饰这些非碱基糖。修饰的核酸还可以包含一种或多种处于L形式的糖，例如L-核苷。

通常，RNA包括糖基团核糖，其是具有氧的5元环。示例性修饰的核苷和修饰的核苷酸可以包括而不限于将核糖中的氧替换(例如，替换为硫(S)、硒(Se)或亚烷基，例如，亚甲基或亚乙基)；添加双键(例如，以将核糖替代为环戊烯基或环己烯基)；核糖的缩环(例如，以形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的扩环(例如，以形成具有附加碳或杂原子的6元环或7元环，例如，还具有磷酰胺酯主链的失水己糖醇、阿卓糖醇、甘露糖醇、环己烷基、环己烯基和吗啉代)。在一些实施方案中，修饰的核苷酸可以包含多环形成(例如，三环；和“非锁”形式，如乙二醇核酸(GNA)(例如，R-GNA或S-GNA，其中核糖替换为连接于磷酸二酯键的乙二醇单位)、苏糖核酸(TNA，其中核糖替换为α-L-苏戊呋喃糖基(threofuranosyl)-(3'-→2'))。

核碱基上的修饰

本文所述的修饰的核苷和修饰的核苷酸(可以并入修饰的核酸中)可以包含修饰的核碱基。核碱基的例子包括但不限于腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、和尿嘧啶(U)。可以修饰或完全替换这些核碱基，以提供可以并入修饰的核酸中的修饰的核苷和修饰的核苷酸。核苷酸的核碱基可以独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶类似物。在一些实施方案中，核碱基可以例如包含碱基的天然存在和合成衍生物。

尿嘧啶

在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。具有修饰的尿嘧啶的示例性核碱基和核苷包括而不限于假尿苷(ψ)、嘧啶(pyridin)-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s²U)、4-硫代-尿苷(s⁴U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟-尿苷(ho⁵U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m³U)、5-甲氧基-尿苷(mo⁵U)、尿苷5-氧乙酸(cmo⁵U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo^U)、5-羧甲基-尿苷(cm⁵U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧羟甲基-尿苷(chm⁵U)、5-羧羟甲基-尿苷甲基酯(mchm⁵U)、5-甲氧羰基甲基-尿苷(mcm⁵U)、5-甲氧羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm⁵s²U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm⁵s²U)、5-甲氨基甲基-尿苷(mnm⁵U)、5-甲氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm⁵s²U)、5-甲氨基甲基-2-硒-尿苷(mnm⁵se²U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm⁵U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm⁵U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm\s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(xcm⁵U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(Trn⁵s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m⁵U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(ιτι¹ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m⁵s²U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m¹s⁴ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m³V)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m⁵D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷(acp³U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷、5-(异戊烯氨基甲基)尿苷(inm⁵U)、5-(异戊烯氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm⁵s²U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m⁵Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψπι)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s²Um)、5-甲氧羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm⁵Um)、5-氨甲酰基-2′-O-甲基-尿苷(ncm⁵Um)、5-羧甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm⁵Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m³Um)、5-(异戊烯氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm⁵Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2'-F-阿糖尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-阿糖尿苷、5-(2-羰基甲氧乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷、吡唑并[3,4-d]嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤。

胞嘧啶

在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的胞嘧啶。具有修饰的胞嘧啶的示例性核碱基和核苷包括而不限于5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷(m³C)、N4-乙酰基-胞苷(act)、5-甲酰基-胞苷(f⁵C)、N4-甲基-胞苷(m⁴C)、5-甲基-胞苷(m⁵C)、5-卤代-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-羟甲基-胞苷(hm⁵C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞苷、吡咯并假异胞苷、2-硫代-胞苷(s2C)、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷、1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、5-甲基-zebularine、5-氮杂-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖西丁(k²C)、α-硫代-胞苷、2'-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2'-O-二甲基-胞苷(m⁵Cm)、N4-乙酰基-2'-O-甲基-胞苷(ac⁴Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞苷(m⁴Cm)、5-甲酰基-2'-O-甲基-胞苷(f⁵Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞苷(m⁴2Cm)、1-硫代-胞苷、2'-F-阿糖胞苷、2'-F-胞苷和2'-OH-阿糖胞苷。

腺嘌呤

在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的腺嘌呤。具有修饰的腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括而不限于2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤素-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤素-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-2-氨基-嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-去氮杂-2,6-二氨基嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m¹A)、2-甲基-腺嘌呤(m²A)、N6-甲基-腺苷(m⁶A)、2-甲基硫基-N6-甲基-腺苷(ms²m⁶A)、N6-异戊烯基-腺苷(i⁶A)、2-甲基硫基-N6-异戊烯基-腺苷(ms²i⁶A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(io⁶A)、2-甲基硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(ms²io⁶A)、N6-甘氨酰氨甲酰基-腺苷(g⁶A)、N6-苏氨酰氨甲酰基-腺苷(t⁶A)、N6-甲基-N6-苏氨酰氨甲酰基-腺苷(m⁶t⁶A)、2-甲基硫基-N6-苏氨酰氨甲酰基-腺苷(ms²g⁶A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m⁶2A)、N6-羟基正缬氨酰氨甲酰基-腺苷(hn⁶A)、2-甲基硫基-N6-羟基正缬氨酰氨甲酰基-腺苷(ms²hn⁶A)、N6-乙酰基-腺苷(ac⁶A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2′-O-甲基-腺苷(Am)、N⁶,2′-O-二甲基-腺苷(m⁵Am)、N⁶-甲基-2′-脱氧腺苷、N6,N6,2′-O-三甲基-腺苷(m⁶2Am)、1,2′-O-二甲基-腺苷(m¹Am)、2′-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2'-F-阿糖-腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-阿糖-腺苷和N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。

鸟嘌呤

在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的鸟嘌呤。具有修饰的鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括而不限于肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m¹I)、丫苷(imG)、甲基丫苷(mimG)、4-去甲基-丫苷(imG-14)、异丫苷(imG2)、怀丁苷(wybutosine)(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟怀丁苷(OHyW)、欠修饰的羟怀丁苷(OHyW*)、7-去氮杂-鸟苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preQ0)、7-氨基甲基-7-去氮杂-鸟苷(preQi)、古细菌苷(archaeosine)(G⁺)、7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-去氮杂-鸟苷、6-硫代-7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m⁷G)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m¹G)、N2-甲基-鸟苷(m²G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m²2G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m^2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟苷(m^2,2,7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2′-O-甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m3/4m)、N2,N2-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m²2Gm)、1-甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m¹Gm)、N2,7-二甲基-2′-O-甲基-鸟苷(m^2,7Gm)、2′-O-甲基-肌苷(Im)、1,2′-O-二甲基-肌苷(m¹Im)、O⁶-苯基-2'-脱氧肌苷、2′-O-核糖基鸟苷(磷酸酯)(Gr(p))、1-硫代-鸟苷、O⁶-甲基-鸟苷、O⁶-甲基-2'-脱氧鸟苷、2'-F-阿糖-鸟苷和2'-F-鸟苷。

修饰的gRNA

在一些实施方案中，修饰的核酸可以是修饰的gRNA。在一些实施方案中，gRNA可以在3'端修饰。在这个实施方案中，gRNA可以在3’端U核糖修饰。例如，U核糖的二个端羟基可以氧化成醛基和核糖环同步开放以产生修饰的核苷，其中U可以是未修饰的或修饰的尿苷。

在另一个实施方案中，3’端U可以用2'3'环状磷酸盐修饰，其中U可以是未修饰的或修饰的尿苷。在一些实施方案中，gRNA分子可以含有可以(例如，通过并入本文所述的一个或多个修饰的核苷酸)稳定化对抗降解的3'核苷酸。在这个实施方案中，例如，可以将尿苷替换为修饰的尿苷，例如，5-(2-氨基)丙基尿苷和5-溴尿苷、或替换为本文所述的任何修饰的尿苷；可以将腺苷和鸟苷替换为修饰的腺苷和鸟苷，例如，替换为在8-位置的修饰，例如，8-溴鸟苷，或替换为本文所述的任何修饰的腺苷或鸟苷。在一些实施方案中，去氮杂核苷酸，例如，7-去氮杂-腺苷，可以并入gRNA。在一些实施方案中，O-和N-烷基核苷酸，例如，N6-甲基腺苷，可以并入gRNA。在一些实施方案中，可以并入糖修饰的核糖核苷酸，例如，其中2'OH-基团由选自以下的基团替换：H、-OR、-R(其中R可以例如是甲基、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、卤素、-SH、-SR(其中R可以例如是烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氨基(其中氨基可以例如是NH2；烷基氨基、二烷氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基、或氨基酸)；或氰基(-CN)。在一些实施方案中，磷酸酯主链可以如本文所述那样修饰，例如，用硫代磷酸酯基团。在一些实施方案中，gRNA的突出端区域中的核苷酸可以各自独立地是修饰的或未修饰的核苷酸，包括但不限于2'-糖修饰的核苷酸，如，2-F 2'-O-甲基、胸苷(T)、2'-O-甲氧乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2'-O-甲氧乙基腺苷(Aeo)、2'-O-甲氧乙基-5-甲基胞苷(m⁵Ceo)及其任意组合。

在一个实施方案中，RNA分子(例如，gRNA分子)的单链突出端中一个或多个或全部核苷酸均是脱氧核苷酸。

可以通过现有技术已知或如本文所述的方法评价候选Cas分子，例如，Cas9分子、候选gRNA分子、候选Cas9分子/gRNA分子复合体和候选CRISPR系统。例如，Jinek等人,SCIENCE 2012；337(6096):8 16-821中描述了用于评价Cas9分子的核酸内切酶活性的示例性方法。

实施例

实施例1：测定法

向导选择

使用人参考基因组和用户定义的目的基因组区域(例如，基因、基因的外显子、非编码性调节区等)，以计算机进行初始向导选择，以鉴定目的区域中的PAM。对于每个鉴定的PAM，进行分析并报告统计结果。将gRNA分子进一步选择并基于本领域已知的多种标准排序。随后对gRNA分子如本文所述那样测试如本文所述的切割效率和插入/缺失形成。

在整个实施例部分，在以下实验中，使用sgRNA分子或dgRNA分子。除非另外指明，否则，提到针对导引结构域的CRxxxxx标识符的实验使用dgRNA样式。除非另外指明、否则在使用dgRNA分子的情况下，gRNA包含：

crRNA：[导引结构域]-[SEQ ID NO:6607]

tracr(trRNA)：SEQ ID NO:6660。

除非另外指明，否则在使用sgRNA分子的实验中，使用以下序列：

[导引结构域]-[SEQ ID NO:6601]-UUUU

转染HEK-293_Cas9GFP细胞供初步向导筛选

转染表达Cas9GFP的HEK293细胞(HEK-293_Cas9GFP)用于初步筛选靶特异性crRNA。在这个实施例中，设计靶特异性crRNA并使用(例如，如本文所述的)确定的标准(包括计算机模拟脱靶检测)，对初步筛选进行选择。将选择的crRNA化学合成并以96孔样式递送。用包含SEQ ID NO:6607的旗杆区的靶crRNA按照与SEQ ID NO:6660的茎干(stock)trRNA的1:1比率转染HEK-293-Cas9GFP细胞。根据生产商的方案(DharmaFECT Duo、GE LifeSciences；或RNAiMax、LifeTechnologies)使用脂质体转染技术，介导转染。在脂质体转染后24小时裂解转染的细胞并且借助T7E1测定法和/或下一代测序法(NGS；下文)检测裂解物内部的编辑作用(例如，切割)。

T7E1测定法

T7E1测定法用来检测基因组DNA中Cas9切割DNA后通过非同源末端接合(NHEJ)产生的突变事件如插入、缺失和置换(参见Cho等人,Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.Nature Biotechnology.2013；31,230–232)。

通过PCR扩增已经靶向供CRISPR/Cas9切割的基因组DNA区域，在95℃变性10分钟，并且随后通过每秒0.5℃从95℃下降到25℃来再复性。如果扩增的区域内部存在突变，则DNA组合以形成异源双链体。将再复性的异源双链体随后用T7E1(New England Biolabs)在37℃消化1小时。T7E1核酸内切酶识别DNA错配、异源双链体和形成切刻的双链DNA，并且在这些位点产生双链断口。使用片段分析仪分析所得到的DNA片段并且定量以确定切割效率。

用于中靶切割效率和插入/缺失形成的下一代测序(NGS)和分析

为了确定基因组中编辑(例如，切割)靶位置的效率，利用深度测序鉴定由非同源末端接合所引入的插入和缺失的存在。

首先在靶位点周围设计PCR引物并PCR扩增目的基因组区域。根据生产商的方案(Illumina)进行额外的PCR，以增加用于测序的必需的化学作用。扩增子随后在Illumina MiSeq仪上测序。在消除具有低质量评分的那些读段后，读段随后与人类参考基因组(例如，hg38)比对。从含有定位到参考基因组的读段的所得文件(BAM文件)中，选择与目的靶区域重叠的读段，并且相对于含有插入或缺失的读段数，计算野生型读段数。编辑百分数随后定义为具有插入或缺失的读段总数对读段(包括野生型)总数。为了确定编辑引起的插入和/或缺失样式，选出比对的具有插入/缺失的读段并且加总具有给定插入/缺失的读段的数目。该信息随后展示为一个列表以及以代表每种插入/缺失的频率的直方图的形式可视化。

RNP生成

向Cas9蛋白添加crRNA和trRNA(用于dgRNA)或嵌合gRNA(用于sgRNA)导致活性Cas9核糖核蛋白复合体(RNP)的形成，所述复合体介导与crRNA指定的靶区域结合和所靶向的基因组DNA的特异性切割。通过将trRNA和crRNA载入Cas9，形成这种复合体，据信这造成Cas9的构象变化，从而引起其结合并切割dsDNA。

将crRNA和trRNA分别在95°变性2分钟，并允许达到室温。将Cas9蛋白(10mg/ml)添加至5X CCE缓冲液(20mM HEPES，100mM KCl，5mM MgCl2，1mM DTT，5％甘油)，向所述缓冲液添加trRNA和crRNA(在独立的反应中)并在37℃孵育10分钟，因而形成活性RNP复合体。通过电穿孔和其他方法，将该复合体递送入多种类型的细胞，包括HEK-293细胞和CD3+ T细胞。

递送RNP至T细胞

CD3+ T细胞由包含CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒T细胞的多个T细胞群体组成。这些细胞可以从全血或从白细胞提取法样品分离。可以通过使用Cas9介导的编辑作用，工程化患者的T细胞，修饰T细胞以特异性靶向癌细胞和具有较小免疫原性。这个实施例描述在T细胞中用来递送Cas9 RNP(例如，靶向B2M的Cas9 RNP)的基本方法。将仅需要改变RNP中的导引性crRNA，以针对不同T细胞靶(例如，本文提供的那些靶中的任一者)调整这个方案。

首先使用市售试剂盒(例如，EasySep^TM人T细胞分离试剂盒，Stem Cell Technology)从白细胞单采物(leukopak)富集T细胞。将富集的T细胞等分处理并冷冻(10x10⁶个/小瓶)供未来使用。随后根据需要解冻小瓶，并通过在T细胞培养基(RPMI 1640，FBS，L-谷氨酰胺，非必需氨基酸，丙酮酸钠，HEPES缓冲液，2-巯基乙醇和任选地IL2)中添加3:1比率CD3/CD28珠(Dyn珠，Life Technologies)或使用ImmunoCult Human CD3/CD28 T细胞激活物(Stem Cell Technologies)，使其活化。如本文所述那样产生RNP并添加至约50,000-100,000个重悬于P3缓冲液中的CD3+ T细胞并使用Amax核转染程序EO-115进行核转染。将T细胞培养基在核转染后立即添加至细胞并培养24小时或更长时间。

实施例2：编辑B2M

在稳定表达Cas9的HEK-293细胞中使用靶向B2M的gRNA进行编辑的结果

表9中和图1中总结了靶向B2M的gRNA的切割效率的NGS分析结果。这些结果显示，多种向导RNA分子能够介导高效率编辑B2M基因座。图14中显示如按照HEK细胞中编辑％(随后按CD34+细胞中编辑％)排序的居先gRNA分子，连同1)CD34+细胞中如NGS所测量的编辑％结果，和2)CD3+ T细胞中如流式细胞术所测量的B2M丢失％的结果。如图14中所示，如通过流式细胞术所测量，三种dgRNA分子(例如，包含CR00442、CR00444和CR00455的导引结构域的dgRNA分子)显示在CD3+ T细胞中大于40％编辑作用。

表9：HEK-293 Cas9GFP中如通过NGS所测定的dgRNA-CRISPR系统对B2M的编辑。gRNA根据HEK细胞中编辑％排序。

B2M表达的流式细胞分析

开发了基于流式的测定法以监测形成和递送RNP后的编辑效率。β-2-微球蛋白(B2M)是呈递在全部有核细胞表面上的MHC I类(HLA-1类)复合体的基本组分。MHC I类向免疫系统呈递内源(例如，自身和非自身)肽。使用检测B2M表达的流式细胞分析，测试一系列靶向B2M的crRNA。从这个初始筛选中，鉴定到显示5-25％之间恒定编辑作用的crRNA。

用APC缀合的抗人B2M(BioLegend，目录号316312)、PE缀合的抗人HLA-A、B、C(BioLegend，目录号311405)和碘化丙啶(0.5mg/ml，稀释至1/1000)标记悬浮状态的细胞。建立适宜对照(例如，分别是同种型-APC、同种型-PE、PE-抗HLA，分别是APC-抗B2M)。随后在流式细胞仪上运行样品。在这个实施例中，如通过表面标志物染色所评估的B2M表达丢失提示Cas9介导的编辑作用(例如，切割)。图14中报告结果。

实施例3：在T细胞中(包括CAR-T细胞中)编辑TCR和/或PD-1

表10列示了编辑TCRα基因和PD-1基因的gRNA导引结构域。将gRNA分子如下文所述那样作为sgRNA生成，其从5’至3’包含所示的导引结构域-SEQ ID NO:6601-(U)7。

表10：针对TCRα和PD-1的gRNA导引结构域

将正向和反向DNA寡核苷酸克隆入慢病毒载体的U6启动子下游，所述寡核苷酸编码了包含上文表10中所列的导引结构域的gRNA分子。使用标准方法，简而言之，将载体用BBSI在37℃消化1小时。使用PCR-纯化试剂盒(Qiagen)纯化载体。gRNA正向和反向DNA寡核苷酸由IDT(Integrated DNA Technologies)合成，同时添加BBSI位点突出端(正向寡聚物5’为ACCG，并且反向寡聚物5’为AAAC)。使用IDT双链体缓冲液，通过加热直至95℃并允许其在室温冷却下来，使寡聚物复性。随后使用NEB快速连接试剂盒，将复性的寡聚物连接至已切割和纯化的载体。该载体还含有在EF1-α启动子下游的编码Cas9和mCherry报道分子的核酸(使用CAS9下游的T2A序列表达mCherry)。使用包装系统(Cellecta目录编号CPCP-K2A)包装慢病毒。对于全部CRISPR病毒生产物，将病毒浓缩200倍。在96孔平底平板中，将1E5Jurkat细胞铺种在100ul RPMI 10％FBS培养基中。将50ul浓缩的病毒直接添加至每个孔。随后，添加病毒24小时后，向细胞添加100ul培养基。通过添加新培养基以维持细胞于0.5e6个细胞/mL，每3天传代，培养细胞。病毒转导后7天测量TCR的表达。使用来自ebioscience的与APC缀合的抗CD3ε抗体克隆OKT3(目录编号17-0037-42)，检测TCR。将1E5细胞与2ul抗体孵育20分钟，通过流式细胞术分析(BD Fortessa)。使用Flow Jo软件分析数据。首先对mCherry阳性细胞设门控，以检测CRISPR/Cas9阳性细胞。分析这个群体的TCR损失。图2中显示结果。这些结果显示，靶向TCR-α的gRNA能够引起Jurkat细胞中表达的表面TCR丢失。

使用靶向TCR-α的gRNA产生TCR^-原代T细胞

遵循上文所示的方法以评估原代T细胞中的编辑作用和TCR丢失情况，附带以下修饰。在96孔平底平板中10ul T细胞培养基里使用3:1dyna珠抗CD3/CD28，在第0天活化1E5原代T细胞。在第1天，添加50ul编码(如上文所述的)gRNA和Cas9/mCherry的慢病毒。通过每2天添加新鲜培养基以维持5E5个细胞/ml的浓度，将T细胞培养12天。在引入慢病毒后第6天和第12天如上文所述那样测量TCR的丢失。图3中显示结果。这些结果显示，靶向TCR-α的gRNA能够引起原代T细胞中表达的表面TCR丢失。

使用靶向PDCD1的gRNA产生PD1^-原代T细胞

使用编码表10中列出的针对PD-1的gRNA分子的慢病毒载体，如上文描述那样评定对PD-1基因座的编辑和PD-1表达的丢失。如上文所述评估原代T细胞中的TCR敲除情况那样进行实验，例外是在第5天，用3:1dyna珠抗CD3/CD28重新刺激培养的细胞以驱动PD-1表达增加，从而能够更好检测蛋白质。图4中报告结果。这些结果显示，靶向PD-1(PDCD1)的本发明gRNA分子导致原代T细胞中的PD-1表达高效率丢失。

使用RNP编辑原代T细胞中的PD-1或TCR

使用Cas9/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合体测试对原代T细胞中TCR或PD-1的编辑作用。通过混合20ug CAS9(PNA bio)和20ug包含TRAC-8的导引结构域或PD1-6的导引结构域的化学合成的sgRNA(TriLink biotech)并在室温孵育15分钟，产生RNP。使用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi)从Leukopak PBMC分离T细胞，随后用3:1CD3/CD28dyna珠(invtrogen)活化。活化后48小时，将2E5T细胞(不移除珠的情况下)以300g离心6分钟并重悬于20ul Optimem中，并且添加RNP复合体及混合。随后，将细胞转移入1mm电穿孔杯(BTX)并且使用BTX ECM830仪，按250V持续500微秒和1个脉冲进行冲击。将细胞返回其T细胞培养基并培养5天，之后分析。图5显示培养7天后，如通过流式细胞术检测到的TCR或PD-1表达的直方图。这些结果显示，作为RNP引入时，靶向TCRα和PD-1的gRNA有效产生TCR阴性或PD1阴性T细胞。

TCR阴性CAR T细胞

测定靶向TRAC基因座的gRNA分子在经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞中编辑并导致TCR阴性表型的能力。在第0天，在T细胞培养基中用3:1 CD3/CD28 dyna珠活化按5E5个细胞/ml的浓度，活化原代T细胞。在第1天，使用慢病毒颗粒，使T细胞工程化以表达CD19 CAR。使用慢病毒颗粒(慢病毒，如WO2012/079000中所述)以MOI 5-，使T细胞工程化以表达CD19 CAR。在第2天，将T细胞用包含Cas9蛋白和gRNA分子的RNP电穿孔，所述gRNA分子包含TRAC-1或TRAC-8的导引结构域。在第4天往后，每2天给T细胞补充新鲜培养基以维持5E5个细胞/ml的浓度。在T细胞培养的第11天，计数T细胞，并且根据生产商方案，添加来自Miltenyi biotech的CD3微珠。LD磁柱(Miltenyi)用来进行正向选择。如图6中所示，可以富集约40-50％为TCR阴性的T细胞群体以产生纯度大于98％的TCR阴性CART细胞的分离群体。

TCR阴性CART细胞的活性

在标准培养条件下培养T细胞，附带以下修改。在第2天，将T细胞用包含靶向TCRα(TRAC-1或TRAC-8)的gRNA的RNP，如上文“使用RNP编辑原代T细胞中的PD-1或TCR”中所述那样电穿孔，或用编码所述gRNA和Cas9/mCherry的慢病毒，如上文“使用靶向TCR-α的gRNA产生TCR^-原代T细胞”中所述那样转导。在第11天，添加上文“TCR^-CAR T细胞”中描述的TCR^-细胞纯化物。将分离的TCR阴性细胞与表达萤光素酶的CD19⁺NALM6(B-ALL细胞)或CD19^-K562(CML细胞)细胞共培养，并且评估TCR^-CART细胞特异性杀伤CD19⁺细胞的能力。在图7中显示结果(％细胞溶解)，并且结果显示，(通过慢病毒转染或RNP转染)包含靶向TCR的gRNA的TCR阴性CD19 CART细胞能够特异性杀伤CD19⁺细胞。

实施例4：使用二种gRNA分子切除B2M

为了检验二种结合相同基因的gRNA分子切除靶基因大片段的能力，我们使细胞暴露于二种gRNA分子。在每个实验中，除了据预测与距CR00442的结合位点约10至约6000碱基对存在的靶位点结合的第二gRNA分子之外，还使用CR00442。图8显示基于二个gRNA分子靶位点之间的碱基对数目预测的切除产物大小。实验如上文进行，其中crRNA分子包含所示gRNA分子(例如，CR00442)的导引结构域并且trRNA转染入工程化以稳定表达Cas9的HEK293细胞。在24小时收集细胞裂解物并对其进行PCR。图9-11显示这些实验的结果。如图9中所示，与CR00438、CR00439、CR00440、CR00445或CR00446配对的CR00442显示与40-65个碱基对的预期切除产物相对应的DNA片段范围。预期以产生小于20碱基对的切除产物的gRNA分子对未产生可检测的切除产物，如通过PCR所测量。如图10和图11中所示，当预期切除产物具有约4000个碱基对(图10)或约6000个碱基对(图11)时，许多向导对产生编辑作用>10％的预期切除。这些结果显示了使用二种gRNA分子从宿主基因或基因组切除巨大部分DNA的可行性，并且提供了失活基因或基因产物的替代性方案。

实施例5：在HEK和原代人CD3+细胞中编辑TRAC

根据本文所述的方法在HEK中(gRNA递送至稳定表达Cas9的细胞)和在原代CD3+ T细胞中(通过电穿孔法递送gRNA/Cas9 RNP)测试含有dgRNA分子的CRISPR系统的编辑作用，所述dgRNA分子包含针对TRAC的序列的导引结构域。同样，通过流式细胞术分析编辑后TCR的表面表达。简而言之，在电穿孔后第3-5天，用针对CD3(OKT3，eBioscience)和/或TCR-α/β(IP26#，Biolegend)的抗体对编辑的CD3+细胞染色。相对于未编辑的对照，(通过碘化丙啶排除作用鉴定)的活细胞中CD3或TCR-α/β的表达用来测定RNP编辑的频率。

表11中报告结果。全部平均编辑％均通过NGS测量并且基于至少3次实验。gRNA分子依据HEK细胞中的编辑％排序。图12显示如根据HEK细胞中的％编辑排序的针对TRAC的居先gRNA分子，连同显示原代人CD3+ T细胞中如通过TCR表面表达丢失所测量的编辑％的流式细胞术数据。

还分析了CD3+ T细胞中编辑后所形成的插入/缺失。表11中显示含有移码突变的已编辑细胞的％(“平均FS编辑％)。由于TRAC基因座产生表达的蛋白质，可能的是，3bp缺失或插入可能不导致TRAC破坏和降解。相反，移码突变(1-2bp插入/缺失)将造成随后进行编辑的序列不在阅读框内并多半导致无义介导的降解。值得注意地，HEK细胞和CD3+ T细胞之间经常存在编辑％的巨大差异，即T细胞中的编辑％一般小于HEK细胞中观察到的情况。这些差异可跨多份样品(包括Jurkat细胞和原代T细胞的不同供体源)重现(未显示)。不受理论约束，可能的一个解释如下：TCR基因座在T细胞和Jurkat细胞中发生重排，但在HEK细胞中不重排。实际上，无论供体、所用引物或编辑后收获细胞用于分析的天数如何，对T细胞或Jurkat细胞的NGS测序试验始终失败或质量不佳(未显示)。因此，原代T细胞中更可靠地测量编辑％可以是在蛋白质水平敲除(例如，依据流式细胞术时TCR丢失)。

表11.

接下来在源于3名不同供体的原代人CD3+ T细胞测试原代人T细胞中使用系统的编辑作用，其中所述系统包含靶向TRAC的gRNA。如图15中所示，编辑％(如通过流式细胞术所测定的TCR丢失)跨全部供体始终如一。这些数据显示，某些gRNA分子与Cas9组合时能够在TCR-α亚单位内部产生导致T细胞表面上TCR表达丢失的插入/缺失。编辑效率独立于供体，因此显示这种方法的广泛适用性。

实施例6：编辑HEK细胞中的TRBC1和TRBC2

根据本文所述的方法在HEK(gRNA递送至稳定表达Cas9的细胞)和CD3+ T细胞(gRNA和Cas9作为RNP递送)中测试含有dgRNA分子的CRISPR系统的编辑作用，所述dgRNA分子包含针对TRBC1和TRBC2的序列的导引结构域。表12中报告结果。全部平均编辑％均通过NGS测量并且基于至少3次实验。图13显示如根据HEK细胞中的％编辑排序的针对TRBC1和TRBC2的居先gRNA分子，连同显示原代人CD3+ T细胞中如通过TCR表面表达丢失所测量的编辑％的流式细胞术数据。

表12.

这些数据显示，某些gRNA分子与Cas9组合时能够在TCR-β亚单位内部产生导致T细胞表面上TCR表达丢失的插入/缺失。

实施例7：在HEK细胞和原代人CD3+ T细胞中编辑PDCD1

根据本文所述的方法在HEK(gRNA递送至稳定表达Cas9的细胞)和CD3+ T细胞(gRNA和Cas9作为RNP递送)中测试含有dgRNA分子的CRISPR系统的编辑作用，所述dgRNA分子包含针对PDCD1的序列的导引结构域。

表13中报告HEK细胞中编辑作用的结果。全部平均编辑％均通过NGS测量并且基于至少3次实验。图16显示如根据HEK细胞中的％编辑排序的针对PDCD1的居先gRNA分子。图16还显示使用抗PD-1抗体(ceBioJ105，eBioscience)，如通过流式细胞术所测量时PD-1表达丢失的细胞的％。简而言之，用StemCell ImmunoCult活化原代人CD3+ T细胞，始于第0天。在第3天，将含有所示dgRNA的RNP电穿孔入细胞(Neon；1600V，10毫秒，3个脉冲)。转染后2天(第5天)，用抗CD3/CD28 Dyna珠刺激细胞(1:3细胞:珠比率)。在第10日评估PD-1表达。

表13.

接下来，在原代人CD3+ T细胞中分析包含dgRNA分子的RNP对PDCD1的编辑作用，如通过NGS所测量，其中所述dgRNA分子包含所示的CRxxxx ID的导引结构域，并且通过流式细胞术测定PD-1表面表达的丢失，如本文所述。在图18报告结果。几种gRNA分子显示良好的编辑作用和PD-1丢失情况。随后在来自三位不同供体的CD3+ T细胞中测试这些相同的向导。在图19报告数据。如所示，包含CR00852、CR00828、CR00870、CR00848、CR00855和CR00838的导引结构域的gRNA显示至少2位供体之间编辑作用大于50％。

实施例8：在原代人CD3+ T细胞中同时和依次敲除TRAC和B2M

将原代人CD3+ T细胞活化并用含有针对B2M(CR000442)和/或TRAC(CR000984)的gRNA的RNP电穿孔。简而言之，将靶向B2M和/或TRAC的RNP按以下比率电穿孔入CD3+ T细胞：仅B2M RNP；仅TRAC RNP；B2M RNP+TRAC RNP；0.5X B2M RNP+0.5X TRAC RNP；0.5X B2M RNP+1X TRAC RNP；1X B2M RNP+0.5X TRAC RNP；无RNP。这允许我们确定多种量的RNP(1个或2个靶)对细胞活力和所靶向基因的编辑效率的影响。通过流式细胞术评估细胞的TCR表达和B2M表达。图17A-17D中显示结果。这些结果显示，可以通过电穿孔将靶向二个独立靶的RNP同时递送至CD3+ T细胞，对活力无不利影响或无损任一种向导的编辑效率。另外，在两个靶均成功地高频率编辑的CD3+ T细胞，从而产生CD3^-B2M^-群体。

接下来，通过同时或依次引入含有针对B2M和TRAC的dgRNA的RNP，评估编辑两种靶B2M和TRAC的影响。对于这个实验，使用包含CR000442的导引结构域的dgRNA以靶向B2M并且使用包含CR000984的导引结构域的dgRNA以靶向TRAC，如上文所述那样产生RNP。简而言之，将CD3+ T细胞解冻，活化3天(来自StemCell Technologies的Immunocult CD3/CD28T细胞激活物)。在第3天和第4天(依次)或第3天(同时)，对细胞进行电穿孔以引入RNP，并将其维持直至递送后第5天(第9天)，此时通过FACS(随后，裂解细胞后，通过NGS)评估B2M和/或TCR的表达。在整个电穿孔和电穿孔后过程期间，T细胞在活化试剂存在中维持。通过FACS评估B2M和TCR的表达(使用1:200稀释的抗B2M克隆2M2或抗CD3克隆OKT3)。随后裂解细胞并通过NGS评估对所靶向基因座的编辑作用。在图25和图26报告结果。这些结果表明，依次和同时靶向B2M和TRAC产生了相似的双重敲除频率。

实施例9：编辑FKBP1A

如上文所述，在工程化以表达Cas9的HEK293细胞中用靶向FKBP1A基因的dgRNA分析对FKBP1A的编辑作用。图21、图22和图23中报告数据，包括编辑％和移码(FS)编辑％。基于这些结果，依据最高FS编辑百分数鉴定头15种gRNA分子。图23中报告这些gRNA分子，包括其导引结构域。接下来，使用包含双重向导RNP分析CD3+ T细胞中对FKBP1A的编辑作用，所述的双重向导包含鉴定的针对FKBP1A的导引结构域。细胞，RNP和全部方法均如上文所述那样形成和进行。图24中报告结果。

为了深入挖掘先前实验，在原代人T细胞中再次测试包含最高效编辑gRNA的导引结构域的gRNA。图52显示对FKBP1A基因座的基因组编辑作用，其因采用含有dgRNA样式的靶向FKBP1A的所示gRNA的RNP电穿孔人原代T细胞产生(如上所述)。指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数。结果展示了能够以高移码编辑比例(>65％)实现高编辑效率(>80％)的gRNA亚类。图53显示用于编辑原代人T细胞的每种靶向FKBP1A的gRNA的前5个最频繁观察到的序列变化(插入/缺失)。

实施例10：编辑CIITA

如上文实施例1中所述，在工程化以表达Cas9的HEK293细胞中用靶向CIITA基因的dgRNA分析对CIITA的编辑作用。下表24中报告数据，包括编辑％和移码(FS)编辑％。

表24.使用包含如所示的针对CIITA的导引结构域的dgRNA时，在稳定表达Cas9的HEK293细胞中如通过NGS所测量的编辑％(N＝3)和移码编辑(FS)％。gRNA分子在表中依据编辑％排序。

接下来，如实施例1中所述，在CD3+原代人T细胞中评估具有最高编辑％的CIITA gRNA分子的编辑作用。表32中显示结果。

表32.作为RNP递送至CD3+ T细胞的靶向CIITA的dgRNA分子的编辑％和移码编辑％(如通过NGS所测量)

接下来，在原代人T细胞中评估与靶向CIITA的gRNA分子亚类对应的编辑作用和MHC II类分子表达丢失。简而言之，培养制备原代人T细胞并使用CD3/CD28珠刺激(DynaBeads Invitrogen目录号111.41D)按珠对细胞比3:1活化之。在第2天，使用Neon电穿孔仪按三个不同的RNP浓度(0.3uM、1.0uM和3.0uM；形成RNP后稀释)，将RNP电穿孔入T细胞，所述RNP由预复合于(使用上文描述的crRNA序列和tracr序列)包含所示导引结构域的dgRNA分子的化脓性链球菌Cas9组成。在第5天和第7天，如通过流式细胞术所评估，依据HLA-DR表达丢失评估编辑％。来自第5天和第7天的结果相当。图37中显示在第5天T细胞中的编辑％(例如，呈CD3⁺和HLA^-DR^-的细胞的％)。如所示，在测试的最高浓度，包含CR02991、CR02993和CR03007的dgRNA分子的RNP各自产生>50％编辑作用，如依据HLA-DR表面染色丢失所测量。如下文显示，观察到gRNA CR002961缺少编辑作用归因于实验方案中的错误。当实验重复时(数据在39图中显示)，包含gRNA CR002961的RNP导致剂量反应性水平的HLA-DR表达减少。

对另一组靶向CIITA的gRNA分子重复上文描述的实验。图38显示这个实验的结果，对CIITA基因座的基因组编辑作用因采用含有靶向CIITA基因座的所示gRNA的RNP电穿孔人原代T细胞产生。指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数(移码编辑％)。底部小图中详细显示了前5个最频繁观察到的序列变化。这些数据显示，靶向CIITA的gRNA能够在原代人T细胞中以直至74％移码编辑作用实现>90％编辑作用。

使用第三组靶向CIITA的grNA在多种RNP浓度再次进行该实验。图39显示如通过使用抗HLA-DR试剂的流式细胞术所测量，原代人T细胞中由包含针对CIITA的所示dgRNA(编号表示导引结构域的CR00xxxx标识符)的RNP按所示浓度电穿孔后第3天的编辑％。编辑％代表相对于未采用向导RNA的电穿孔的细胞中的表达，采用CIITA向导部分电穿孔的细胞中细胞表面处HLA-DR的表达。如上文提到，这个实验中确认了gRNA CR002961的活性。图40显示，指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数(移码编辑％)。这些数据显示，确定了能够在原代人T细胞中以直至87％移码编辑作用(CR002967)实现>85％编辑作用的另一组靶向CIITA的gRNA。图41中显示了用于编辑原代人T细胞的每种靶向CIITA的gRNA的前5个最频繁观察到的序列变化。

使用不同组的靶向CIITA的gRNA再次进行实验，并且与来自先前实验的表现最好的gRNA(CR0002967)比较。图42显示了如通过使用抗HLA-DR试剂的流式细胞术所测量，原代人T细胞中由包含针对CIITA的所示dgRNA(数字表示导引结构域的CR00xxxx标识符)的RNP按所示浓度电穿孔后第3天的编辑％。图42显示插入或缺失的频率(插入/缺失％)和使用这些gRNA时导致编码性序列移码的这些编辑的百分数(移码编辑％)。图44显示原代人T细胞中靶向CIITA的这些gRNA中每一者的前5个最频繁观察到的序列变化(插入/缺失)。这些数据证实了包含dgRNA CR002967的RNP的高编辑作用/移码/HLA-DR丢失并且额外地鉴定到在原代人T细胞中导致高编辑作用(>90％)和高移码突变(>80％)的其他靶向CIITA的gRNA。

实施例11：在BCMA CAR T细胞中编辑TCR(TRAC)和B2M

表25：用于流式细胞术的试剂

表26：T细胞培养基组分

在工程化以表达BCMA CART的T细胞中评估对同种异体T细胞靶的编辑，和已编辑细胞的功能。如图27中示意性描述那样制备这些实验中使用的T细胞，包括TCR^-B2M^-/BCMA CAR⁺ T细胞。简而言之，利用Ficoll，通过使用离心方法，从人血分离PBMC。使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec#130-096-535)，从这些PBMC(Hemacare)分离总T细胞。将这些细胞等分并使用CRYOSTOR CS10介质(Biolife Solution-210102)冷冻，及储存在液氮中。随后将这些冷冻的细胞等分样在37度水浴中解冻20秒并且然后转移至含10ml预温T细胞培养基的50ml锥形管并在24度以300转/分钟离心5-10分钟，以移除冷冻介质并用预温的T细胞培养基重悬。随后将细胞转移至24孔培养皿并按珠对细胞比3:1添加CD3/CD28珠(DynaBeads Invitrogen目录号111.41D)活化之。活化后第1天，将包含编码CAR BCMA-13(来自上表23的139112)的序列的慢病毒以感染复数(MOI)5转导入这些细胞。UTD(未转导的细胞)未用病毒处理。活化后第4天，随后使用BTX(设置：1000V/0.6毫秒/1个脉冲)，用含有或不含向导RNA的RNP电穿孔每种条件250,000个细胞的CAR BCMA-13T细胞或未转导的T细胞。为了产生RNP，将包含针对TRAC和B2M的tracr RNA和crRNA的dgRNA分子共同在95℃加热2分钟并逐渐冷却达到室温，此时将它们在37℃与Cas9蛋白和5X CCE缓冲液孵育10分钟。CR000985(序列：CCGAAUCCUCCUCCUGAAAG(SEQ ID NO:5593))的导引结构域用于TRAC编辑，并且CR000442(序列：GGCCACGGAGCGAGACAUCU(SEQ ID NO:5496))的导引结构域用于B2M编辑。在每种情况下，使用具有crRNA序列：[导引结构域]-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:6607)和tracr序列：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU(SEQ ID NO:6660)的dgRNA。在电穿孔后，将细胞返回到24孔平板中的0.5ml T细胞培养基。电穿孔后两天，每隔一天分割细胞以维持细胞处于0.5百万个/ml。电穿孔后五天，使用FlowJo软件，通过流式细胞术(BD Fortessa)分析100,000个细胞。将100,000个细胞等分到圆底96孔平板的每个孔。将细胞从每份样品取出，抽吸以使其从珠解离，并且通过使用96孔板磁体移除珠，并随100ul含0.5％BSA(Miltenyi-目录号130-091-376)的FACS缓冲液(Miltenyi MACS缓冲液，目录号130-092-987)一起离心以洗涤细胞。细胞随后与稀释于100ul FACS缓冲液中的不同抗体在冰上孵育30分钟。随后用200ul FACS缓冲液洗涤细胞两次。随后将细胞重悬于150ul FACS缓冲液中并在5激光Fortess流式细胞仪(Becton Dickenson)上试验。通过使用抗CD3-PercpCy5.5(Ebiosciences 45-0037-42)检测TCR的表达并通过使用抗B2M-APC(316312 Biolegend)检测B2M的表达。通过生物素酰化蛋白质L染色，随后链霉亲和素-PE(016-110-084 Jackson Immuno Research)染色，评价CAR的细胞表面表达。通过使用抗CD4-V450(48-0047-42 Ebiosciences)染色CD4或使用抗CD8-alexa700(300920 Biolegend)染色CD8，检测T细胞。图28中显示TCR(使用抗CD3-PercpCy5.5)和B2M(使用抗B2M-APC)的表达。经BCMA CAR BCMA-13转导的T细胞显示为“CAR”。未转导的细胞指示为“UTD”。经Cas9电穿孔、但无向导RNA的细胞显示为“无向导”。在图28的下半小图中显示使用抗CD4-V450的CD4染色，以验证丢失CD3染色归因于TCR丢失并且不归因于T细胞丢失。这些结果显示同时引入针对B2M和TRAC的CRISPR系统可以用来以高产率产生缺少TCR表达和B2M表达的T细胞群体，CAR转导的群体中72％的T细胞呈TCR和B2M染色阴性。接下来，在图28所评估的CAR+细胞亚群中评价对TRAC和B2M的编辑作用。图29中显示结果。简而言之，通过对左侧小图的CAR+细胞设门控(使用生物素酰化蛋白质L，随后使用链霉亲和素-PE染色)或不对CAR设门控情况下(总T细胞；右小图)时，分析来自图28的细胞。CAR+群体和总T细胞群体中编辑水平相似，这表明CAR表达不影响编辑效率。

接下来，通过分析PE通道，分析图28的细胞的CAR表达。如图30中所示，在细胞接受向导RNA(TRAC和B2M)和不接受向导RNA的那些细胞(无向导)中CAR阳性细胞百分数相似，这表明TCR和B2M编辑作用不影响CAR表达。UTD表示未转导的细胞。CAR表示经BCMA CAR转导的细胞。

接下来，评估T细胞响应于BCMA(CAR分子的靶抗原)而增殖的能力。简而言之，将细胞如上述制备，解冻并与表达BCMA(KMS11(高)、RPMI8226(低))或不表达BCMA(Nalm6)的细胞共培养。经CAR BCMA-13转导的T细胞显示为“BCMA CAR”。未转导的细胞指示为“UTD”。经Cas9但无向导RNA电穿孔的细胞显示为“无向导”。用含有B2M向导和TCR向导的RNP电穿孔的细胞显示为“B2M+TCR”。25,000个未处理(irraduated)的靶肿瘤细胞与T细胞按1:1比率共培养4天，随后进行流式细胞分析。相对于3000个计数珠(Life technology，目录号C36950)，依据CD4+细胞加CD8+细胞的数目，确定T细胞(用抗CD4-V450和抗CD8-alexa700染色)的数目。如图31中所示，经BCMA CAR慢病毒转导的两个细胞群体均显示响应于表达BCMA的两个细胞类型而增殖，在4天共培养后，接受含有靶向B2M和TRAC的gRNA分子的RNP的细胞群体显示更高的T细胞计数。如图32中所示，当分别评估CAR+CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞的增殖时，结果相似，CAR⁺(通过用生物素酰化蛋白质L随后链霉亲和素-APC-efluor780染色而设门的)T细胞响应于两种表达BCMA的细胞类型而增殖。认为前述书面说明书足以使本领域技术人员实施本发明成为可能。

实施例12：使用靶向TCR或B2M的RNP分析RNP浓度影响和插入/缺失样式和产生CIITA-/B2M-/TCR-CAR T细胞

方法

利用Ficoll，通过使用离心方法，从人血(Hemacare)分离PBMC。使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec#130-096-535)，从这些PBMC分离总T细胞。将这些细胞等分并冷冻。这些冷冻的细胞等分样随后解冻并使用CD3/CD28珠(DynaBeads Invitrogen目录号111.41D)按珠对细胞比3:1活化。在珠活化后第2天或第3天，从培养物取出200,000个细胞用于电穿孔。使用Cas9蛋白对RNA(crRNA和tracRNA)的1:2摩尔比，形成用于T细胞基因组编辑的RNP复合体。将100μM crRNA和100μM tracrRNA分别在95℃变性2分钟并冷却至室温。在终体积5μL中，将浓度5.9μg/μL的1.4μL Cas9蛋白(NLS-Cas9-NLS)与1.6μL Cas9缓冲液(20 mM Tris，pH 8.0；200mM KCL，10mM MgCL2)混合并在室温与1μL 100μM tracrRNA混合。接着，添加1μL 100μM crRNA，混合并在37℃孵育10分钟。如果电穿孔步骤期间添加多于一种RNP，则使用上文方法分别装配具有靶向不同基因的crRNA的每种RNP，随后通过添加Cas9缓冲液合并起来，以获得用于不同条件的不同RNP终浓度。对于“三重编辑作用”，即同时添加3种靶向不同基因的RNP，各图中提供RNP量的详情。装配的RNP随后与10ul T缓冲液(Neon Transfection System 10ul试剂盒)中的200,000个细胞混合。使用Transfection System 10μL试剂盒(MPK1096)按照1600V、10毫秒、3个脉冲，用Neon电穿孔仪进行电穿孔。对于CIITA，电穿孔后3天通过流式细胞术测量细胞表面HLA-DR表达的丢失，定量编辑作用。将细胞用抗CD3(PerCP-Cy5.5)、抗HLA-DR-V450和活/死细胞染料e780(APC-Cy7)染色并通过流式细胞术分析。电穿孔后3天，使用抗CD3抗体(PerCP-Cy5.5)，通过流式细胞术测量细胞表面CD3ε表达的丢失，定量对TRAC的编辑作用。电穿孔后4天，使用抗B2M抗体-APC(316312Biolegend)，使用流式细胞术，依据细胞表面表达的丢失，测量对B2M的编辑作用。为了评价上述制备的T细胞中因基因编辑产生的编辑频率和序列变化，分离基因组DNA并进行测序。简而言之，将冷冻的细胞沉淀物解冻并使用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,69506)处理以分离基因组DNA。使用Titanium Taq PCR试剂盒(Clontech Laboratories,639211)和表27的引物，将洗脱的DNA用来进行PCR。

表27：PCR引物设计。

使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，28104)纯化PCR产物。纯化的PCR产物随后用于T7E1测定法以检测碱基对错配并确认基因编辑。对PCR扩增子进行标准Nextera NGS文库制备(Illumina)并在Illumina MiSeq测序仪上用配对的末端读段测序。将测序读段对参考基因组比对并且识别变体。

结果

首先，在多种Cas9(RNP)浓度评价靶向TRAC的gRNA对细胞表面TCR表达的影响。在CD3/CD28珠活化后第3天，用所示浓度(uM)的RNP对人原代T细胞电穿孔，所述RNP含有双重向导样式的所示gRNA。额外的向导编号表示gRNA的导引结构域的CRxxxxx标示符。通过抗CD3抗体染色并在电穿孔后3天通过流式细胞术分析评价TCR表达丢失(CD3 KO T细胞(％))。图33A显示，当电穿孔含有向导CR000961(961)、CR000978(978)、CR000984(984)、CR000992(992)、CR000985(985)和CR000960(gRNA1)和CR000979(gRNA8)的RNP时，CD3染色丢失。这些数据显示，用含有CR000961和CR000984的gRNA的RNP在0.2和0.3uM之间的RNP浓度实现了几乎最大的编辑作用(如通过CD3染色丢失所示)。其他gRNA在浓度1uM实现最大编辑作用。图33B显示，当电穿孔含有向导CR000991(991)、CR000992(992)、CR000993(993)和CR000978(978)的RNP时，CD3染色丢失。991和992几乎可重叠。这里再次，对于含有gRNA 991、992和993的RNP，在0.3uM的RNP浓度观察到最大编辑作用，而gRNA 978编辑％继续增加直至1.1uM。如图33C中所示，用靶向TRAC基因座的gRNA对T细胞电穿孔在靶向位点产生了高水平的插入/缺失形成(直至97％编辑)和据预测导致蛋白质表达丢失的高水平移码突变(直至78％)。接下来，通过下一代测序法评估在每种靶向的基因座处的突变(插入/缺失)。图34A和图34B显示用于编辑原代人T细胞的每种靶向TRAC的dgRNA的前5个最频繁观察到的序列变化。图A和图B是来自2个独立进行的电穿孔实验的结果。数据是来自三次重复PCR产物的平均数。这些数据显示采用相同递送技术，使用相同gRNA样式和RNP时，编辑样式跨多项试验始终一。

接下来，用靶向B2M的gRNA(双重向导样式)进行了相似的实验。首先评估RNP浓度的影响。在CD3/CD28珠活化后第2天，用所示浓度的含有所示gRNA的RNP对人原代T细胞电穿孔。向导编号表示导引结构域的CR00xxx标示符。在电穿孔后4天通过抗B2M抗体染色并通过流式细胞术分析评价B2M表达丢失(B2M阴性细胞)。结果在图35中报告并且显示：用gRNA 442在0.2uM并且对于gRNA 442和455在略高RNP浓度(0.4uM)实现>85％的编辑作用(如通过B2M表面表达丢失所分析)。如图36中所示，包含gRNA CR000444和CR000455的RNP在原代人T细胞中导致高水平的编辑作用和高水平的移码编辑作用。下半小图中显示由每种gRNA产生的前十个插入/缺失。数据是来自三次重复PCR产物的平均数。

接下来，在CART细胞中同时编辑TCR、B2M和CIITA，并评估这类CART细胞的功能。图45显示了这些实验所遵循以制备在B2M、TRAC和CIITA基因座编辑的原代人T细胞(三重编辑的细胞)的示意性方案。图46分别显示借助流式细胞术时，CD3ε、B2M和HLA-DR的细胞表面表达丢失％(分别作为TRAC、B2M和CIITA处编辑作用的指标)。如预期，仅用单一gRNA电穿孔的细胞显示仅预期的蛋白质丢失。用3种RNP处理的细胞(每种含有针对不同靶的gRNA的)中，来自每个群体的细胞显示每种靶蛋白丢失超过80％，以及B2M和TRAC二者丢失>80％，例外是最低浓度的靶向CIITA的gRNA(三重4)，与较高浓度的这种RNP递送至细胞时相比，其导致较低的HLA-DR丢失。图47显示对B2M、TRAC和CIITA基因座的基因组编辑作用，其因采用3种含有靶向B2M、TRAC和CIITA基因座的gRNA的RNP同时电穿孔人原代T细胞产生。括号中指出了插入或缺失的频率(插入/缺失％)并且显示导致编码性序列移码的这些编辑的百分数。图48、图49和图50分别显示在采用不同浓度的如图45的示意图中所示每种RNP同时编辑3个基因座(三重编辑)的背景下，在原代人T细胞中B2M基因座(对应于包含CR000442的gRNA)、TRAC基因座(对应于包含CR000961的gRNA)和在CIITA基因座(对应于包含CR002991的gRNA)处前10个最频繁观察到的序列变化。这些数据显示，本文所用的高效gRNA分子在原代人T细胞中以高效率敲除TRAC、CIITA和B2M并且产生了移植物抗宿主病能力降低(因TCR丢失)和宿主抗移植物病能力降低(因B2M和CIITA二者丢失)的T细胞，这代表走向市售同种异体T细胞产品的重要步骤。

接下来，评估gRNA分子样式的影响。针对TRAC(包含CR000961的导引结构域；上半小图)或B2M(包含CR00442的导引结构域；下半小图)的向导RNA按照单向导或双向导样式在具有或没有所示化学修饰(PS(5’端和3’端处的3个核苷酸是硫代磷酸酯)或OMePS(5’端和3’端处的3个核苷酸是2’-OMe和硫代磷酸酯)；对于双重向导RNA、crRNA和tracr RNA均包含这些修饰)时合成。将RNP按所示的浓度电穿孔入人原代T细胞。图51显示这些实验的结果：借助流式细胞术，通过分析CD3ε的细胞表面染色，评价TRAC编辑过程的编辑效率(上部)并且通过分析B2M蛋白的细胞表面染色，评价B2M编辑过程的编辑效率(下部)。如图51中所示，全部样式均能够在RNP浓度1uM实现高效率编辑，然而，相较于dgRNA样式，sgRNA样式能够在较低浓度维持高编辑效率(对于包含CR000961的导引结构域的gRNA，下至0.04uM；并且对于包含CR000442的导引结构域的gRNA，下至0.1uM)。对于靶向TRAC的gRNA，化学修饰在测试的RNP浓度不影响编辑效率。对于靶向B2M的gRNA，对sgRNA的化学修饰在测试的最低浓度影响编辑效率。而PS修饰的sgRNA在0.04uM RNP浓度具有最高编辑效率。

实施例13：基因组编辑FKBP1A后T细胞对免疫抑制的抗性和TCR^-/FKBP12^-CART细胞的功能评估

不受理论约束，如本文所述，认为另一种产生市售(“通用”)CART细胞的策略是减少或消除TCR表达(例如，以减少或抑制移植物抗宿主病)，和减少或消除免疫抑制剂(例如，mTor抑制剂)的靶表达。用与所述免疫抑制剂组合的这类编辑过基因组的CART细胞后续治疗患者将会在不抑制CART细胞功能(例如，CART细胞的抗肿瘤功能)的情况下，抑制宿主的免疫应答(例如，因而抑制宿主抗移植物反应)。为此目的，分析经编辑以使其呈TCR^-和FKBP12^-的T细胞的功能，包括在mTor抑制剂RAD001存在下分析。

方法：

在解冻后，分离的人T细胞用CD3/CD28珠按珠对细胞比3:1活化3天。随后使用Neon仪器用100ul tip试剂盒，以含有双重向导RNA分子(如所示，如上文这些实施例中所述)和Cas9蛋白的RNP电穿孔细胞。按以下方式制备RNP。将crRNA和trRNA(100uM各10ul)在独立的管中加热到至95℃持续二分钟并且随后在室温冷却5分钟。将Cas9蛋白(1.5mg/ml)、20uM trRNA，和20uM crRNA和17ul缓冲液(20mM Tris，PH 8.0，200nM KCI，10mM MgCI2)以总体积50ul合并并在37度孵育10分钟。RNP随后与100ul细胞按2百万细胞/mlT缓冲液(Invitrogen；目录号：MPK1096)的细胞计数混合。将100ul与RNP混合的细胞转移至Neon移液器吸头并且按照1600V、10毫秒、3个脉冲电穿孔。RNP处于终浓度3.3uM作为Cas9蛋白的指标。

电穿孔后，细胞随后随2ml T细胞培养基随珠按照3:1珠对细胞比一起转移入6孔平板。每两天添加新鲜的培养基。在电穿孔后第4天，将细胞去珠并按照0.5百万/孔的密度在96孔板中用100ul培养基再铺种，并且新鲜珠按照珠对细胞比1:1添加持续2小时。为了确定FKBP1A编辑作用的功能影响，将细胞随后用或不用2.5nM RAD001(如所示)处理3小时。通过流式细胞术检测S6的磷酸化，并且将其用作RAD001所致免疫抑制的指标。为了制备流式细胞术样品，将细胞离心并用FACS缓冲液(MACS运行缓冲液+0.5％sBSA)洗涤，用死/活染液(Zombie紫色可固定活力试剂盒，Biolegend，目录号423114)染色10分钟。随后将细胞用FACS缓冲液洗涤并用Cytofix/Cytoperm液(Becton Dickenson，目录号554714)固定过夜。随后将细胞用PBS洗涤两次并用Cytofix/Cytoperm液(Becton Dickenson，目录号554714)透化20分钟。随后将细胞用PBS洗涤两次并且在4度与PE缀合的抗磷酸化-S6抗体(磷酸化-S6核糖体蛋白Ser240/244(D68F8)兔mAb，Cell Signaling Technologies，目录号14236)孵育1小时。随后将细胞用PBS洗涤两次并使用FloJo-V10软件，通过流式细胞术在Becton Dickenson LSR Fortessa上分析。

图54显示mTor抑制剂RAD001存在或不存在下暴露于靶向FKBP1A的gRNA后S6磷酸化的结果。用含有靶向FKBP1A的向导序列(CR002086、CR002097、CR002122；分别显示为2086、2097和2112)的RNP或用阴性对照：442(靶向B2M的无关向导CR00442)；Cas9(无trRNA或crRNA的单独Cas9)；trRNA(tracer RNA，但无crRNA或Cas9蛋白)；Cas9+trRNA(Cas9和tracer RNA，但无crRNA)；EP(仅电穿孔的细胞)；无EP(仅细胞，无电穿孔)编辑T细胞。在电穿孔后，将细胞用2.5nM RAD001(上半小图)处理或未作处理(下半小图)并且通过流式细胞术分析S6磷酸化(pS6)评价对mTOR途径抑制作用的影响。Y-轴表示前向散射(FSC)并且X-轴表示pS6水平。通过高于同种型抗体染色的对照中所见的荧光水平(未显示)设门控，确定pS6阳性染色(设门迹线中显示)。在下半小图的曲线中显示从流式细胞术数据对S6磷酸化的定量。这些数据显示，编辑FKBP1A(和随后FKBP12蛋白质丢失)造成原代T细胞抵抗雷帕霉素类似物RAD001的抑制性影响。

接下来，产生TCR阴性和FKBP12阴性的CART细，并评价其功能。简而言之，利用Ficoll，通过使用离心方法，从人血分离PBMC。使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec#130-096-535)，从这些PBMC分离总T细胞。将这些细胞等分并冷冻。这些冷冻的细胞等分样随后解冻并使用CD3/CD28珠(DynaBeads Invitrogen目录号111.41D)按珠对细胞比3:1活化。活化后第1天，CAR BCMA-10病毒或CAR-CD19(CTL019)病毒按照MOI5用来转导这些细胞。UTD(未转导的细胞)未用病毒处理。活化后第4天，随后使用Neon电穿孔仪，用含有所示向导RNA或不含向导RNA(无向导)的RNP电穿孔CAR BCMA-10 T细胞或CAR-CD19 T细胞或未转导的T细胞。RNP如上述制备。对于TRAC编辑作用，使用单独或与如所示的靶向FKBP1A的向导联合的CR000961(指示为961)。对于FKBP1A编辑作用，使用CR0002097(指示为2097)或CR002097和CR002086组合(指示为2097+2086)。该RNP(或诸RNP)随后与100ul细胞按2百万细胞/mlT缓冲液(Invitrogen；目录号：MPK1096)的细胞计数混合。将100ul与RNP混合的细胞转移至Neon移液器吸头并且按照1600V、10毫秒、3个脉冲电穿孔。RNP处于终浓度3.3uM作为Cas9蛋白的指标。电穿孔后，细胞随后随2ml T细胞培养基随珠按照3:1珠对细胞比一起转移入6孔平板。每两天添加新鲜的培养基。电穿孔后五天，从培养物取出500,000个细胞(用于磷酸化-S6染色)或用于细胞表面标记物染色(例如，CD3)的50,000个细胞，并且使用FlowJo软件，通过流式细胞术(BD Fortessa)分析。通过使用抗CD3-PercpCy5.5(Ebiosciences 45-0037-42)检测TCR的表达。通过生物素酰化蛋白质L染色，随后链霉亲和素-PE(016-110-084Jackson Immuno Research)染色，评价CAR的细胞表面表达。通过使用抗CD4-V450(48-0047-42 Ebiosciences)染色CD4或使用抗CD8-APC(17-0087-42 eBiosciences)染色CD8，检测T细胞。

为了确定FKBP1A编辑作用的功能影响，在电穿孔后第4天，将细胞去珠并按照0.5百万/孔的密度在96孔板中用100ul T细胞培养基再铺种，并且新鲜珠按照珠对细胞比1:1添加持续2小时。将细胞随后用或不用2.5nM RAD001(如所示)处理3小时。通过流式细胞术检测S6的磷酸化。为了制备流式细胞术样品，将细胞离心并用FACS缓冲液(MACS运行缓冲液+0.5％sBSA)洗涤，用死/活染液(Zombie紫色可固定活力试剂盒，Biolegend，目录号423114)染色10分钟。随后将细胞用FACS缓冲液洗涤并用Cytofix/Cytoperm液(Becton Dickenson，目录号554714)固定过夜。随后将细胞用PBS洗涤两次并用Cytofix/Cytoperm液(Becton Dickenson，目录号554714)透化20分钟。随后将细胞用PBS洗涤两次并且在4度与PE缀合的抗磷酸化-S6抗体(磷酸化-S6核糖体蛋白Ser240/244(D68F8)兔mAb，Cell Signaling Technologies，目录号14236)孵育1小时。随后将细胞用PBS洗涤两次并使用FloJo-V10软件，通过流式细胞术在Becton Dickenson LSR Fortessa上分析。

为了检验来自已编辑CART细胞的细胞因子释放，在分析当日，效应细胞(已编辑/未编辑的CART或未转导的细胞)在培养基(RPMI，5％FCS，10mM Hepes，1x青/链霉素，1x谷氨酰胺)中解冻并且在细胞计数器上(Nexelcom)计数。这些细胞随后与30,000个表达BCMA(KMS11、RPMI8226)的靶细胞或表达CD19(Nalm6)的细胞按效应物:靶比率1:1共培养。在20小时后收获100ul共培养上清液。使用Meso Scale Discovery,Proinflammatory Panel 1目录号N05049A-1系统，根据生产商的操作方案，这些上清液随后用于测量释放的细胞因子IL-2和IFN-γ。

为了测量效应细胞(已编辑/未编辑的CART或未转导的细胞)的溶细胞能力，在分析当日，将细胞在培养基(RPMI，5％FCS，10mM Hepes，1x青/链霉素，1x谷氨酰胺)中解冻并且在细胞计数器上(Nexelcom)计数。这些细胞随后在96孔黑色透明底测定平板(Costar，目录号3904)中与30,000个稳定表达萤光素酶报道基因和表达BCMA(KMS11、RPMI8226)的靶细胞或表达CD19(Nalm6)的细胞按效应物:靶比率1:1共培养20小时。使用Bright-Glo底物(Promega，参考号E263B)在Perkin Elmer的EnVision多平板读数仪上测量萤光素酶信号。细胞杀伤作用从萤光素酶信号下降导出并如下计算：

靶细胞杀伤作用(％)＝100-(样品发光/平均最大发光)*100

对于T细胞增殖测定法，将如上制备的细胞解冻并与表达BCMA(KMS11、RPMI8226)的靶细胞或表达CD19(Nalm6)的细胞共培养。将照射的靶肿瘤细胞与编辑的或未编辑的CART细胞按效应子对靶比率1:1共培养4天，随后如上进行样品的CD4、CD8和CAR染色并在Becton Dickenson LSR Fortessa上进行流式细胞分析，并且用FloJo-V10软件分析。相对于3000个计数珠(Life technology，目录号C36950)，依据CD4+细胞加CD8+细胞的数目，确定T细胞(用抗CD4-V450和抗CD8-APC染色)的数目。通过CAR+细胞群体(用生物素酰化蛋白质L随后链霉亲和素-PE染色)设门，测定CAR+ T细胞的数目。

结果：

测定CART细胞响应于抗原暴露的细胞因子产生。使用靶向TRAC基因座的向导CR000961和/或靶向FKBP1A基因座的向导CR002097和CR002086(如分别通过cr961、2097和2086所示)，对CART细胞进行基因编辑。图55A和图55B分别显示来自已编辑/未编辑的CART细胞的干扰素γ释放和IL-2释放。这些数据显示，FKBP12和/或TCR因基因编辑而丢失不妨碍活化的CART细胞中产生细胞因子。图56显示已编辑/未编辑的CART细胞对抗原阳性癌细胞系的杀伤作用。这些数据显示，FKBP12和/或TCR因基因编辑而丢失不妨碍CART细胞的靶细胞杀伤能力。图57显示已编辑/未编辑的CART细胞响应于抗原暴露而增殖。这些数据显示，相对于用无向导处理的细胞，FKBP12因基因编辑而丢失不妨碍CART细胞的增殖能力。最后，研究已编辑的CART细胞抵抗雷帕霉素类似物RAD001所致免疫抑制的能力。图58中显示结果。这些数据显示，编辑FKBP1A(和随后FKBP12蛋白列丢失)造成CART细胞抵抗雷帕霉素类似物RAD001的抑制性影响。

实施例14：表达HLA-G:B2M融合蛋白

不受理论约束，认为已经致其TCR^-/B2M^-/CIITA^-的细胞可以由NK细胞视为外来并且被靶向以破坏。因此，在例如施用至癌症患者时，另外未修饰的TCR^-/B2M^-/CIITA^-同种异体CART细胞可能面临攻击风险。再次，不受理论约束，认为所述细胞上的HLA-G表达应当抑制任何NK细胞对该细胞的活性。因为一些形式的HLA-G需要B2M，对于其中已经减少或消除B2M表达的细胞，我们研究了HLA-G:B2M融合分子的表达情况。

如下合成HLA-G/B2M融合蛋白。从数据库获得β2微球蛋白和HLA-G氨基酸序列。已知HLA-G的HLA-G1同工型与B2M在细胞表面形成复合体。为了(例如，在B2M-细胞中)重构这种复合体，β2微球蛋白N端融合多肽与HLA-G1连接。另外，B2M通过甘氨酸/丝氨酸(G4S)n接头(SEQ ID NO:6629)与HLA-G1连接。按以下顺序设计氨基酸序列以产生该融合蛋白：B2M序列–(G4S)3-HLA-G1(“(G4S)3”作为SEQ ID NO:6594公开)。针对哺乳动物细胞表达，借助方法(Thermo Fisher Scientific Inc)对融合蛋白的核苷酸序列进行密码子优化。优化的DNA由Genescript合成。将合成的DNA通过PCR扩增(NEB，热启动高保真DNA聚合酶，目录编号：M0493L)并通过Gibson Assembly(NEB，目录编号：E2611L)亚克隆至pELPS载体。亚克隆序列由Genewiz测序进一步验证。

使用LentiX-293T细胞产生HLA-G-B2M病毒或HLA-G病毒。使用脂质转染胺2000(Invitrogen)，用HLA-G-B2M或HLA-G慢病毒DNA质粒连同包装质粒DNA(pRSV.REV(Rev表达质粒)、pMDLg/p.RRE(Gag/Pol表达质粒)、pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒))转染细胞。在转染后12小时更换培养基。添加新鲜培养基至细胞并且更换培养基后30小时收获上清液。使用LentiX浓缩器，将病毒浓缩并等分待冷冻。使用supT1细胞滴定病毒。将含有病毒的上清液的连续稀释物与20,000个SupT1细胞孵育3天。转导后24小时添加新鲜的培养基。收获细胞并用FACS缓冲液洗涤并与抗HLA-G-PE抗体(335906 Biolegend)孵育，并且使用BD Fortess和flowJo软件分析细胞。

图59显示用编码上文所述HLA-G:B2M融合物的核酸转导SupT1细胞的结果。通过慢病毒转导，将HLA-G/B2M融合蛋白引入SupT1细胞。通过流式细胞术检测HLA-G的细胞表面表达。浅灰色直方图表示未转导的细胞中PE通道的背景荧光。深灰色直方图表示来自HLA-G/B2M转导的细胞中PE通道的荧光。这表明HLA-G:B2M融合蛋白在T细胞中的成功表达和表面定位。

实施例15：在HEK-293(Cas9)细胞中编辑CD3-ε(CD3E)

化学合成包含所示导引结构域的dgRNA分子，并且在HEK-293细胞中通过如实施例1中所述的NGS评估编辑作用。表28中显示编辑实验的结果。这个实施例显示，作为RNP递送时，靶向CD3E的gRNA分子能够按照3％至超过75％的频率编辑靶基因座。几种gRNA分子能够编辑超过50％的细胞，包括在超过50％的细胞中产生移码突变。

表28：HEK-293(Cas9)细胞中针对CD3E的dgRNA的编辑％和移码编辑％

实施例16：评价Cas9变体

在CD34+造血干细胞中评价

在原代人造血干细胞(HSC)中，我们通过测量14种纯化的化脓性链球菌Cas9(SPyCas9)蛋白敲除β-2-微球蛋白(B2M)基因的效率，评价这些蛋白。这些蛋白质分成3组：第一组由改善选择性的SPyCas9变体组成(Slaymaker等人,2015,Science 351:84(e1.0、e1.1和K855A)；Kleinstiver等人,2016,Nature 529:490(HF))。第二组由具有不同数目和/或位置的SV40核定位信号(NLS)和6x组氨酸标签(His6)(SEQ ID NO:10795)或8x组氨酸标签(His8)(SEQ ID NO:10796)的携带或不带可剪切TEV位点的野生型SPyCas9和具有二个半胱氨酸置换(C80L、C574E)的SPyCas9蛋白组成，已经报告所述半胱氨酸置换使Cas9稳定以进行结构研究(Nishimasu等人,2014,Cell 156:935)。第三组由不同方法产生的相同重组SPyCas9组成(图60)。通过FACS和下一代测序法(NGS)测定B2M敲除。

方法

材料

1.Neon电穿孔仪器(Invitrogen,MPK5000)

2.Neon电穿孔试剂盒(Invitrogen,MPK1025)

3.crRNA(与SEQ ID NO:6607融合的CR00441的导引结构域(SEQ ID NO:5495))

4.tracrRNA(SEQ ID NO:6660)

5.Cas9储存缓冲液：20mM Tris-Cl，pH 8.0，200mM KCl，10mM MgCl2

6.骨髓衍生的CD34+HSC(Lonza，2M-101C)

7.细胞培养基(Stemcell Technologies，含StemSpam CC-100的StemSpam SFEM II)

8.FACS洗涤缓冲液：含2％FCS的PBS

9.FACS封闭缓冲液：每mL PBS，添加0.5ug小鼠IgG，150ug Fc block，20uL FCS

10.Chelex悬液：含10％Chelex 100(bioRad，目录号142-1253)的H2O

11.抗B2M抗体：Biolegend，目录号316304

方法

遵循Lonza的建议解冻和培育细胞，每2-3天添加培养基。在第5天，按照200x g持续15分钟沉淀细胞，用PBS洗涤一次，用来自NEON试剂盒的T缓冲液按照2x10⁴个/uL重悬细胞，置于冰上。用Cas9储存缓冲液稀释Cas 9蛋白至5mg/ml。用H2O复溶crRNA和tracrRNA至100uM。通过将CAS 9蛋白、crRNA和tracrRNA各自0.8uL与0.6uL Cas9储存缓冲液混合，在室温孵育10分钟，产生核糖核蛋白(RNP)复合物。将7uL HSC与RNP复合物混合二分钟并将全部10uL转移入Neon移液器吸头，按照1700V，20毫秒和1个脉冲进行电穿孔。在电穿孔后，将细胞立即转移入在37℃，5％CO2的24孔平板孔的孔，该孔含有预校准的1ml培养基。电穿孔后72小时，收获细胞供FACS分和NGS分析。

FACS：从24孔平板的每个孔取出250uL细胞至96孔U型底平板的孔并使细胞沉淀。用2％FCS(胎牛血清)-PBS洗涤一次。向细胞添加50uL FACS封闭缓冲液并在冰上孵育10分钟，添加1uL FITC标记的B2M抗体并孵育30分钟。用150uL FACS洗涤缓冲液洗涤一次，随后用200uL FACS洗涤缓冲液再洗涤一次。将细胞重悬于200uL FACS缓冲液中供FACS分析。

NGS样品制备，从24孔平板的每个孔转移250uL细胞悬液至1.5ml微量离心管，添加1mL PBS并且使细胞沉淀。添加100uL Chelex悬液，在99℃孵育8分钟并涡旋混合10秒，随后在99℃孵育8分钟，涡旋混合10秒。通过在10,000x g离心3分钟，将树脂沉淀下来，并且上清液裂解物用于PCR。取出4uL裂解物并使用Titanium试剂盒(Clonetech，目录号639208)并遵循生产商的说明，用b2m引物(b2mg67F：CAGACAGCAAACTCACCCAGT(SEQ ID NO:10807)；b2mg67R：CTGACGCTTATCGACGCCCT(SEQ ID NO:10808))进行PCR反应。使用以下PCR条件：1个循环：98℃，5分钟；30循环：95℃15秒、62℃15秒和72℃1分钟持续；和最后1个循环：72℃3分钟。PCR产物用于NGS。

统计结果：通过FACS确定的B2M KO细胞百分数和通过NGS确定的插入/缺失百分数用来评价CAS 9切割效率。实验以Cas9作为固定效应设计。每个实验在供体内部嵌套(nested)，作为嵌套随机效应。因此，混合线性模型应用于分析FACS和NGS数据。

结果

为了归一化实验性变化和供体变化，我们将每种蛋白质的相对活性对iProt105026作图，原始设计是具有二个分布于野生型SPyCas9侧翼的SV40 NLS和在蛋白质C端的His6标签(SEQ ID NO:10795)(图60)。统计分析显示，与参考Cas9蛋白iProt105026相比、iProt106331、iProt106518、iProt106520和iProt106521在敲除HSC中的B2M方面无显著差异，而测试的其他变体(PID426303、iProt106519、iProt106522、iProt106545、iProt106658、iProt106745、iProt106746、iProt106747、iProt106884)在敲除HSC中的B2M方面高度显著不同于参考iProt105026。我们发现将His6标签(SEQ ID NO:10795)从C端移至N端(iProt106520)不影响蛋白质的活性(图60)。仅当一个NLS置于蛋白质的C末端时，它才足以维持活性(iProt106521相对于iProt106522，图60)。相比来自过程2和3的那些蛋白质。从过程1纯化的蛋白质具有恒定较高的敲除效率(iProt106331相对于iProt106545和PID426303，图60)。通常而言，具有已报告的改进选择性的SPyCas9变体不如野生型SPyCas9有效(iProt106745、iProt106746和iProt106747，图60)。有趣地，iProt106884不切割靶位点。这与Kleinstiver等人的报告相符：这种变体未切割哺乳动物细胞中至多20％的合理的靶位点(Kleinstiver等人,2016,Nature 529:490)。最后，具有二个半胱氨酸置换的Cas9变体(iProt106518)维持高水平的酶活性(图60)。

T细胞中的评价

方法

这些实验中使用了表29中所示的不同化脓性链球菌Cas9变体。图60中还显示这些结构。

表29：Cas9变体(NLS＝SV40 NLS；Cas9＝化脓性链球菌Cas9野生型，括号中示出任何突变；Cas9e1.1(如Slaymaker等人,2015,Science 351:84中所述)；GGS＝甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)。

利用Ficoll(GE Healthcare目录号17-1440-03)，通过使用离心方法，从人血(从Hemacare/ALL Cells获得)分离PBMC。使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec#130-096-535)，从这些PBMC分离总T细胞。将这些细胞等分，使用CRYOSTOR CS10介质(Biolife Solution-210102)冷冻，并储存在液氮中。随后将这些冷冻的细胞等分样在37℃水浴中解冻20秒并且然后转移至50ml锥形管的10ml预温T细胞培养基中并在24℃以300转/分钟离心5-10分钟，以移除冷冻介质并用预温的T细胞培养基重悬。随后通过使用CD3/CD28珠(DynaBeads Invitrogen目录号111.41D)按珠对细胞比3:1，在维持细胞浓度为0.5百万个/ml时活化这些细胞，并且使用CD3/CD28珠(DynaBeads Invitrogen目录号111.41D)按照珠对细胞比3:1以0.5百万个/ml的细胞浓度活化这些细胞。

在珠活化后第3天，每次电穿孔使用200,000个细胞。使用Cas9蛋白对RNA(crRNA和tracRNA)的1:2摩尔比，形成用于T细胞基因组编辑的RNP复合体。将100μM crRNA([导引结构域]-[SEQ ID NO:6607])和100μM tracrRNA(SEQ ID NO:6660)分别在95℃变性2分钟并冷却至室温。在终体积5μL中，将浓度5.9μg/μL的1.4μL Cas9蛋白与1.6μL反应缓冲液(20mM Tris，pH 8.0；200mM KCL，10mM MgCl2)混合并在室温与1μL 100μM tracrRNA混合。接着，添加1μL 100μM crRNA，混合并在37℃孵育10分钟。用于B2M的导引结构域是CR000442，并且用于TRAC的导引结构域是CR000961。这些RNP在较高浓度用来产生RNP连续稀释物的样品。这些RNP稀释物随后用来与10ul T缓冲液(Neon Transfection System 10ul试剂盒)中的200,000个细胞混合。使用Transfection System 10μL试剂盒(MPK1096)按照1600V、10毫秒、3个脉冲，用Neon电穿孔仪进行电穿孔。细胞在无抗生素的T细胞培养基中培养。将细胞从每份样品取出，抽吸以使其从珠解离，并且通过使用96孔板磁体移除珠，并随100ul含0.5％BSA(Miltenyi-目录号130-091-376)的FACS缓冲液(Miltenyi MACS缓冲液，目录号130-092-987)一起离心以洗涤细胞。细胞随后与稀释于100ul FACS缓冲液中的不同抗体在冰上孵育30分钟。随后用200ul FACS缓冲液洗涤细胞两次。随后将细胞重悬于150ul FACS缓冲液中并在BD 5激光Fortess上试验。通过使用抗CD3-PercpCy5.5(Ebiosciences 45-0037-42)检测TCR的表达并通过使用抗B2M-APC(316312Biolegend)检测B2M的表达。使用FlowJo软件分析流式细胞术数据。

结果

当RNP以高浓度产生并且随后稀释至所需浓度时，产生低浓度RNP并且最高编辑效率完全续存。使用B2M向导CR00442，在原代T细胞中测试6种不同的Cas9蛋白的编辑效率。在按照所示RNP浓度(X-轴)进行RNP电穿孔后3天，使用细胞表面检测，通过B2M蛋白的流式细胞术测量编辑效率，并且在图61中显示结果(Y-轴；B2M编辑％)。测试的不同Cas9蛋白由其“iprot”ID编号指示(参见图60和表)。图61中显示结果。这些数据显示，全部这些Cas9变体均有活性，但是Cas9蛋白106521、106518和106154(也称作105026)在T细胞中显示较高活性，如它们在较低RNP浓度时活性更大所佐证。接下来，如所示，使用靶向B2M的向导CR00442(图62，左小图)或靶向TRAC的向导CR000961(图62，右小图)，通过使用如X-轴上所示的不同RNP浓度，测试二种不同Cas9蛋白106884或106154(也称作105026)的编辑效率。通过使用CD3ε抗体测量B2M(图62，左小图)或TCR(图62，右小图)的细胞表面表达丢失，通过流式细胞术测量编辑效率(编辑％)。

实施例17：脱靶评价

T细胞培养和CRISPR/Cas9基因组编辑作用

使用标准Ficoll密度梯度离心方法，从人血(HemaCare，目录号PB000)分离外周血单核细胞细胞(PBMC)。遵循生产商的推荐，使用人细胞用泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，目录号130-096-535)，从PBMC分离总T细胞并储存在-80℃。将T细胞解冻并遵循生产商的推荐，使用T细胞扩充和活化用Dyna珠人T-激活物CD3/CD28(Thermo Fisher Scientific，目录号11131D)按照3:1珠对细胞数目比率活化。在37℃，5％CO2在无抗生素的完全T细胞培养基(含L-谷氨酰胺的RPMI 1640，Lonza，目录号12-702F；10％FBS，GE HyClone，目录号SH30071；200mM L-谷氨酰胺，GE HyClone，目录号SH30034.01；10mM非必需氨基酸，GE HyClone，目录号13-114E；100mM丙酮酸钠，Invitrogen，目录号11360-070；1M HEPES缓冲液，GE HyClone，目录号17-737E和55mM 2-巯基乙醇，Invitrogen，目录号21985-023)中培养T细胞3天，之后进行基因组编辑。

使用Cas9蛋白对gRNA(crRNA和tracRNA)的1:2摩尔比，形成用于T细胞基因组编辑的RNP复合体。浓度100μM的化学合成的crRNA([导引结构域]-[SEQ ID NO:6607])和浓度100μM的tracr(SEQ ID NO:6660)分别在95℃变性2分钟并冷却至室温。在5μ缓冲液(20mM Tris，pH 8.0；200mM KCL，10mM MgCl2)的终体积中，将Cas9蛋白(NLS-Cas9-NLS-His6(“His6”作为SEQ ID NO:10795公开)；iPROT105026；NLS＝SV40 NLS；Cas9＝wt S.Py Cas9)首先与tracrRNA在室温混合并且随后与crRNA混合并在37℃孵育5分钟。所用的Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA的终浓度分别是10μM、20μM和20μM。通过离心收集珠活化的T细胞并按照20x10⁶个/mL的细胞密度重悬于Neon电穿孔试剂盒T缓冲液(Invitrogen；目录号MPK1096)中。通过温和抽吸，将5μL RNP与10μL T细胞混合并在室温孵育5分钟。将RNP T细胞混合物转移入10μL Neon电穿孔针探头(tip probe)。使用Neon转染系统(Invitrogen；MPK5000S)，使用以下条件：3个1600伏/10毫秒脉冲，进行电穿孔。进行重复的10μL电穿孔反应。随后将电穿孔的T细胞立即转移入96孔平板中200μL预温，无抗生素的完全T细胞培养基中并在37℃，5％CO2孵育2天。随后使用无抗生素的完全T细胞培养基，将T细胞按1:1体积稀释并转移至24孔平板并在37℃，5％CO2培养另外4-7天。同时，类似地培养RNP未处理的活化的T细胞以充当未处理的对照样品。随后通过离心收集T细胞并遵循生产商的建议，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen，目录号69506)从1-2百万个细胞分离基因组DNA。对包含CR00442、CR00444、CR000961和CR000984的导引结构域序列的gRNA进行基因组编辑，每种gRNA产生二份处理的副本和一份未处理的副本。

计算机模拟鉴定潜在的gRNA脱靶基因座

对于gRNA CR00442、CR00444、CR000961和CR000984，使用BFAST序列比对程序(版本0.6.4f，Homer等人,PLoS One,2009,4(11),e7767,PMID:19907642)，使用允许至多5个核苷酸错配的标准参数，通过将gRNA前间区序列的20个核苷酸与人类基因组参考序列(版本GRCh38)比对，鉴定潜在的脱靶基因座。将鉴定的基因座过滤到仅含有5’毗邻于Cas9规范5’-NGG-3’PAM序列(即5’-脱靶基因座-PAM-3’)的位点。使用BEDTools脚本(版本2.11.2，Quinlan和Hall,Bioinformatics,2010 26(6):841-2,PMID:20110278)，具有5个核苷酸错配的位点针对RefSeq基因注释(Pruitt等人,Nucleic Acids Res.,2014 42(Database issue):D756-63,PMID:24259432)进一步过滤到仅含有注释为外显子的基因座。表30中显示对每种gRNA鉴定的潜在脱靶基因座的计数。

表30.显示对gRNA CR00442、CR00444、CR000961和CR00098所鉴定的具有0、1、2、3和4个核苷酸错配的计算机模拟脱靶基因座的计数和RefSeq外显子内部的5个核苷酸错配。

定向扩增潜在脱靶位点的PCR引物设计

使用Primer3(版本2.3.6，Untergasser等人,Nucleic Acids Res.,2012 40(15):e115,PMID:22730293)，使用针对gRNA前间区序列位于扩增子中心情况下长度大约160-300bp的扩增子尺寸范围的默认参数，设计了靶向对gRNA CR00442、CR00444、CR000961和CR00098鉴定的潜在脱靶基因座(和中靶基因座)的PCR扩增子。针对人类基因组参考序列(版本(build)GRCh38)进行BLAST序列检索(版本2.2.19，Altschul等人,J Mol Biol.,1990,215(3):403-10,PMID:2231712)，核验所得的PCR引物对和扩增子序列的唯一性。弃去产生多于一个扩增子序列的引物对并重新设计。表31提供对每种gRNA设计的成功引物对的计数。

Illumina测序文库制备、定量和测序

利用生产商的推荐，使用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂盒(Thermo Fisher，目录号P7581)，定量来自RNP处理的(2个重复/gRNA)和未处理的(1个重复/gRNA)T细胞样品的基因组DNA。使用二个依次PCR反应，对每份样品产生靶向各个脱靶基因座(和中靶基因座)的Illumina测序文库。使用通用Illumina测序相容性序列加尾的靶特异性PCR引物(如上设计)，第一PCR扩增靶基因座。第二PCR向第一PCR扩增子添加附加的Illumina测序相容性序列，包括能够实现测序期间多重测序(multiplexing)的样品条形码。PCR1在终体积10μL中进行，每个反应含有6ng gDNA(等同于大约1000个细胞)、终浓度0.25μM的PCR1引物对(Integrated DNA Technologiess)和1x终浓度Q5热启动主混合物(New England BioLabs，目录号102500-140)。PCR1左侧引物是5’加尾的(即5’尾-靶特异性左引物-3’)，具有序列5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:10810)，并且右侧引物是5’加尾的(即5’-尾-靶特异性右引物-3’)，具有序列5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID NO:10811)。在热循环仪上使用以下循环条件进行PCR1：1个循环：98℃1分钟；25个循环：98℃10秒，63℃20秒和72℃30秒；1个循环：72℃2分钟。随后将PCR1利用无核酸酶的水(Ambion，目录号AM9932)1:100稀释并作为向PCR2的输入使用。PCR2在终体积10μL中进行，每个反应含有有2μL稀释的PCR1产物、终浓度0.5μM的PCR2引物对(Integrated DNA Technologiess)和1x终浓度Q5热启动主混合物(New England BioLabs，目录号102500-140)。使用的PCR2左侧引物序列是5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTC-3’(SEQ ID NO:10812)并且使用的PCR2右侧引物序列是5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG-3’(SEQ ID NO:10813)，其中NNNNNNNN指作为标准Illumina测序法组成部分的用于样品多重测序的8个核苷酸条形码序列。在热循环仪上使用以下循环条件进行PCR2：1个循环：72℃3分钟；1个循环：98℃2分钟；15个循环：98℃10秒，63℃30秒，和72℃2分钟。遵循生产商的建议，使用Agencourt AMPure XP珠(Beckman Coulter，目录号A63882)，净化PCR2扩增子，现在为有效的Illumina测序文库。随后使用Power SYBR Green PCR主混合物(Life Technologies，目录号4367660)和Illumina测序文库末端特异性引物对(正向引物序列5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(SEQ ID NO:10814)和反向引物序列5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’(SEQ ID NO:10815))，使用标准qPCR定量方法对净化的Illumina测序文库定量。Illumina测序文库随后等摩尔汇集并且遵循生产商的建议使用MiSeq试剂试剂盒v3(Illumina，目录号MS-102-3003)，在MiSeq仪(Illumina，目录号SY-410-1003)上以300碱基配对末端读段进行Illumina测序。对每个基因座产生最小1000倍序列覆盖率。独立进行处理样品和未处理样品的PCR、净化、汇集和测序，以避免处理样品和未处理样品之间交叉污染或从其中产生PCR扩增子的任何可能性。

Illumina测序数据QC和变体分析

使用默认参数，Illumina MiSeq分析软件(MiSeq报告者，版本2.6.2，Illumina)用来产生扩增子特异性FASTQ测序数据文件(Cock等人,Nucleic Acids Res.2010,38(6):1767-71,PMID:20015970)。随后通过内部开发的变体分析产品线处理FASTQ文件，所述产品线由使用标准Perl脚本包装器连接在一起的一系列公用软件包组成。使用的工作流程分成五个阶段。

阶段1，PCR引物和中靶和脱靶序列QC：对于中靶位点和脱靶位点，使用BLAST检索(版本2.2.29+，Altschul等人,J Mol Biol.,1990,215(3):403-10,PMID:2231712)，将20个核苷酸gRNA前间区序列加PAM序列和靶特异性PCR引物序列(左侧和右侧，无额外Illumina测序)与人类基因组参考序列(版本GRCh38)比对。标出中靶位点和脱靶位点连同多个基因组位置。

阶段2，测序仪文件解压缩：使用gzip脚本(版本1.3.12)，将Illumina测序仪生成的FASTQ.GZ文件解压缩成FASTQ文件，并且计算每个文件的读段数。从进一步分析排除无读段的文件。

阶段3，序列读段比对和质量修整：使用BWA-MEM比对程序(版本0.7.4-r385,Li和Durbin,Bioinformatics,2009,25(14):1754-60,PMID:19451168)使用‘硬修剪法’修整Illumina序列读段的3’端和低质量碱基，将FASTQ文件中的测序读段与人类基因组参考序列(版本GRCh38)比对。使用SAMtools脚本(版本0.1.19-44428cd，Li等人,Bioinformatics,200925(16):2078-9,PMID:19505943)，将BAM文件格式(Li等人,Bioinformatics,2009 25(16):2078-9,PMID:19505943)的所得已比对读段转化成FASTQ文件，随后使用BWA-MEM比对程序，将FASTQ文件再次对人类基因组参考序列(版本GRCh38)比对，这次不作‘硬修剪’。

阶段4，变体(SNP和插入突变)分析：处理已比对读段的BAM文件，使用VarDict变体识别器(开发者ZhangWu Lia修改的版本1.0‘Cas9 aware’，Lai等人,Nucleic Acids Res.,2016,44(11):e108,PMID:27060149)，等位基因频率检测限设定为>＝0.0001以鉴定变体(SNP和插入/缺失)。Cas9 aware VarDict识别器基于公用软件包，但能够将因变体事件的比对区域内重复序列而生成的不明确变体识别移向gRNA前间区序列中位于PAM序列5’侧3个碱基的潜在Cas9核酸酶切割位点。SAMtools脚本用来计算每个样品扩增子的读段覆盖率，以确定中靶位点和脱靶位点是否按照>1000倍序列覆盖率覆盖。标出序列覆盖率<1000倍的位点并生成更多测序数据。

阶段5，dbSNP过滤和处理/未处理的示差分析：将鉴定的变体针对dbSNP(版本142，Shery等人,Nucleic Acids Res.2001,29(1):308-11,PMID:11125122)中存在的已知变体(SNP和插入/缺失)过滤。进一步过滤已处理样品中的变体以排除：1)未处理的对照样品中鉴定的变体；2)VarDict链偏倚为2:1的变体(其中支持参考序列的正向读段计数和逆转读段计数均衡，但对非参考变体识别不均衡)；3)位于潜在Cas9切割位点周围100bp窗口外部的变体；4)处于潜在Cas9切割位点周围100bp窗口范围内的单核苷酸变体。最后，仅考虑潜在Cas9切割位点的100bp窗口中合并INDEL频率>2％(超过大约20个细胞中有编辑作用)的位点。使用允许针对基因组参考序列可视检查读段比对结果的Integrative Genome Viewer(IGV版本2.3，Robinson等人,Nat Biotechnol.2011,9(1):24-6,PMID:21221095)，进一步在读段比对层级检验潜在的有效编辑位点。经鉴定具有潜在脱靶活性的位点经完整的实验室(始于PCR)和分析过程第二次再处理。

中靶和脱靶分析结果

gRNA CR00442、CR00444、CR000961和CR000984的中靶位点均在两份处理的生物学重复中在预期的Cas9切割位点显示稳健的编辑作用，平均变体频率分别是96％、84％、81％和98％。在任何未处理的对照样品中未观察到编辑作用。表31显示鉴定和表征的脱靶位点的数目。未表征的位点在PCR引物设计或PCR扩增方面无效并且目前仍接受研究。

gRNA CR00442：gRNA CR00442的中靶位点在两份处理的生物学重复中在预期的Cas9切割位点显示稳健的编辑作用，平均INDEL频率是96％。未处理的对照样品中未观察到编辑作用。表31显示表征的脱靶位点的数目。未表征的位点在PCR引物设计或PCR扩增方面无效并且目前仍接受研究。对潜在脱靶位点的表征在拟议Cas9切割位点周围100bp窗口中鉴定到gRNA CR00442的二个微弱脱靶位点，平均INDEL频率为3.7％和4.4％。一个位点相对于中靶gRNA前间区序列(5’-GGCaACaGAGCGAGACAaCT-PAM-3’，PAM＝GGG(SEQ ID NO:10816))具有3个错配并且位于第19号染色体上锌指蛋白440基因(ZNF440)的内含子1中远离外显子1大约0.9kb的碱基对位置11,815,253-11,815,275处。第二位点相对于中靶gRNA前间区序列(5’-GGCgACaGAaCGAGACATCT-PAM-3’，PAM＝CGG(SEQ ID NO:10817))也具有3个错配并且位于第6号染色体上的上皮细胞转化序列2癌基因样基因(ECT2L)的内含子9中远离外显子9大约2kb的碱基对位置138,856,234-138,856,256处。对两个位点的人工检查显示环绕拟议Cas9切割位点的作为Cas9介导双链断口非同源末端接合DNA修复之特征的常见INDEL样式。两个位点的再扩增和测序产生相似的结果。不清楚在任一个所鉴定位点的编辑作用是否对基因表达或细胞活力造成任何有害作用，需要进一步分析。

gRNA CR00444：gRNA CR00444的中靶位点在两份处理的生物学重复中在预期的Cas9切割位点显示稳健的编辑作用，平均INDEL频率是84％。未处理的对照样品中未观察到编辑作用。表31显示成功表征的脱靶位点的数目。未表征的位点在PCR引物设计或PCR扩增方面无效并且目前仍接受研究。迄今在检查的位点未观察到gRNA CR00444的明显脱靶活性。但是，如表31显示，仍存在二个尚未表征的位点，一个位点具有4个错配，位于基因间区内，并且另一个位点具有5个错配，位于非编码性发动蛋白1假基因46基因(DNM1P46)的外显子4内。基于这些位点中的高错配数目，预计这些位点将多半不显示任何明显编辑作用，然而需要进一步分析证实这点。

gRNA CR000961：gRNA CR000961的中靶位点在两份处理的生物学重复中在预期的Cas9切割位点显示稳健的编辑作用，平均INDEL频率是81％。未处理的对照样品中未观察到编辑作用。表31显示成功表征的脱靶位点的数目。未表征的位点在PCR引物设计或PCR扩增方面无效并且目前仍接受研究。对潜在脱靶位点的表征在拟议Cas9切割位点周围100bp窗口中鉴定到gRNA CR000961的一个微弱脱靶位点，平均INDEL频率为5.5％。该位点相对于gRNA前间区序列(5’-AaAGTCaCaCAGCTGGTACA-PAM-3’，PAM＝TGG(SEQ ID NO:10818))具有3个错配并且位于第11号染色体上含有双皮质素结构域的蛋白质1基因(DCDC1)的内含子12中离外显子13大约0.6kb的碱基对位置31,102,920-31,102,942处。对该位点的人工检查显示环绕拟议Cas9切割位点的作为Cas9介导双链断口非同源末端接合DNA修复之特征的常见INDEL样式。该位点的再扩增和测序产生相似的结果。不清楚在该位点的编辑作用是否对基因表达或细胞活力造成任何有害作用，然而需要进一步分析。

gRNA CR000984：gRNA CR000984的中靶位点在两份处理的生物学重复中在预期的Cas9切割位点显示稳健的编辑作用，平均INDEL频率是98％。未处理的对照样品中未观察到编辑作用。表31显示成功表征的脱靶位点的数目。未表征的位点在PCR引物设计或PCR扩增方面无效并且目前仍接受研究。对脱靶位点的表征未在检查的位点鉴定到gRNA CR000984的明显脱靶活性。但是，如表31显示，仍存在一个尚未表征的位点。该位点具有5个错配并位于未表征的非编码性长RNA(LOC440896)的外显子中。基于高错配数目，预计该位点将多半不显示任何明显编辑作用，然而需要进一步分析证实这点。

表31.显示了对gRNA CR00442、CR00444、CR000961和CR000984鉴定的潜在脱靶位点总数、成功表征的脱靶位点数目和有效脱靶位点数目的计数。

GUIDE-Seq命中验证结果

使用对计算机鉴定的位点描述的相同方法，在RNP处理的和未处理的T细胞中表征了利用GUIDE-seq法(Tsai等人,Nat Biotechnol.2015,33(2):187-97,PMID:25513782)所鉴定的潜在脱靶基因座。GUIDE-Seq鉴定到gRNA CR00442的2个潜在位点、CR00444的1个潜在位点和gRNA CR000984的1个潜在位点。未鉴定到gRNA CR000961的有效位点。对全部潜在GUIDE-seq位点的靶测序分析显示在RNP处理的受测T细胞中无显著活性(未显示)。

通过插入分析评估脱靶编辑作用

基于寡聚物插入的测定法(参见，例如，Tsai等人,Nature Biotechnology.33,187–197；2015)用来确定由靶向B2M、TRAC、TRBC2、PDCD1、CIITA和FKBP1A的Cas9切割的基因组潜在脱靶位点。在上文实施例1描述的表达Cas9的HEK293细胞中筛选总计34种靶向B2M(5)、TRAC(9)、TRBC2(2)、PDCD1(8)、FKBP1A(5)或CIITA(5)的向导RNA(修饰或未修饰的包含所示导引结构域的双重向导RNA，如所示)，并且结果在图63和图64中图示。该测定法在预期的靶序列检测到高效率编辑。对包含CR00444的导引结构域或CR00441的导引结构域的靶向B2M的gRNA未观察到脱靶编辑作用，并且使用包含CR00442的导引结构域的靶向B2M的gRNA，仅检测到效率很低的单一脱靶编辑作用。结果显示，对于包含CR00961、CR00978、CR00984、CR00991和CR00992的导引结构域的靶向TRAC的gRNA，每者对靶序列产生高效率编辑作用，而在任何脱靶位置不产生编辑作用。同时，对包含CR00902的导引结构域的靶向PDCD1的gRNA未检测到脱靶编辑作用。相对于在这个测定法中展示潜在脱靶编辑的gRNA分子，深度测序将会用来确定潜在位点是否真正为Cas9切割的脱靶位点。再次，将在T细胞中评估任何潜在脱靶编辑作用的存在和频率。

实施例18：在原代人CD3+细胞中编辑CD3δ和CD3γ

根据本文所述的方法在原代CD3+ T细胞中(通过电穿孔法递送gRNA/Cas9 RNP)测试含有dgRNA分子的CRISPR系统的编辑作用，所述dgRNA分子包含针对CD3δ和CD3γ的序列的导引结构域。通过流式细胞术分析编辑后CD3的表面表达。简而言之，在电穿孔后第7天，用针对CD3的抗体(OKT3，BioLegend)对编辑的CD3+细胞染色。相对于未编辑的对照，活细胞(使用7AAD排阻作用鉴定)中CD3的表达用来测定RNP编辑的频率。图65和图66中报告结果，所述结果包含显示原代人CD3+ T细胞中如通过CD3表面表达丢失所测量的编辑％的流式细胞术数据。值得注意地，包含CR005334的导引结构域的dgRNA导致98％的CD3丢失。

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