一种细胞原位电穿孔装置及使用方法与流程

本发明是关于一种细胞原位电穿孔装置及使用方法，属于电穿孔领域。

背景技术：

电穿孔是一种通过施加外部脉冲电场使细胞膜产生跨膜电压，当细胞跨膜电压超过一定阈值后，细胞膜表面形成可恢复的微孔从而将外源物质导入细胞的一项细胞转染或细菌转化的方法。电穿孔具有无细胞毒性、成本低和转染效率较高等优点，目前电穿孔已经广泛应用于生物学研究，现有的绝大多数商用化电穿孔仪均采用的是平行电极来穿孔电极之间细胞的方案，如将细胞放置在相距几毫米的平行电极之间或使细胞在平行电极之间流过，但是都存在一个共同问题，即只能处理悬浮状态的细胞，若转染贴壁细胞则需要将细胞消化重悬到电穿孔缓冲液中，这种方案不仅操作繁琐，而且消化细胞对贴壁细胞的活性也有影响，尤其是对原代细胞。

针对传统方法中贴壁细胞需要消化才能电穿孔的不足，现有技术公开了一种微电极阵列芯片来原位转染贴壁生长的细胞，在多培养皿底部布置插指电极，然后将细胞直接培养在培养皿底部，直接通过培养皿底部的电极施加电脉冲从而将电极上方及电极间隙区域的细胞转染，但这些电极往往需要采用昂贵的微加工技术制作，且细胞和电极直接接触，电极上和电极附近的细胞会受到电解水产生的热量及pH值改变等伤害，且电场分布显著不均匀，会进一步影响细胞转染效果。

为避免细胞直接接触电极或离电极很近受到的伤害，Garcia-Sanchez等人开发出一款采用PCB作为电极的非接触式原位电穿孔的装置，电极悬于细胞上方跟细胞不直接接触从而避免电穿孔时水电解等带来的伤害，然而该方法仍然存在电场分布不均匀的问题，无法对贴壁生长的细胞实现高效均匀的电穿孔转染。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种可以实现细胞高效均匀转染的细胞原位电穿孔装置及使用方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种细胞原位电穿孔装置，其特征在于，该电穿孔装置包括基板及至少两个电极对，其中，每一所述电极对均包括交叉设置的第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极为阴阳极相对设置；所述基板上固定设置所述电极对，相邻两所述电极对的第一电极和第二电极相互嵌套设置，所述电极对均电连接一外部电脉冲发生器，所述电脉冲发生器通过空间编码方式向所述电极对依次施加电脉冲；所述基板底部两端分别向内延伸设置一凸起结构；所述凸起结构使得所述电穿孔装置支撑在培养皿底部的细胞上方，使所述电极对正对细胞进行电穿孔。

优选地，所述基板采用绝缘材料进行制作，绝缘材料为玻璃材料、绝缘高分子聚合物材料或印刷电路板。

优选地，所述第一电极和第二电极均采用插指电极，所述插指电极采用金属或导电聚合物材料。

优选地，所述第一电极和第二电极均采用电极阵列，每一所述电极阵列均包括一外框、两个以上的导线和两个以上的电极；每一所述外框的一端均平行设置两个以上的所述导线的一端，每一所述导线上均串联设置一个以上的所述电极。

优选地，所述电极采用圆形、方形或矩形的平面电极。

优选地，或当所述基板采用印刷电路板时，所述电极采用圆形、方形或矩形的平面电极，所述电极为印刷电路板的通孔或焊盘。

优选地，每一所述第一电极和第二电极的插指宽度均为150微米，相邻插指之间的间隙距离均为250微米，所述电极对和培养皿底部的间距均为400微米。

优选地，所述空间编码方式为所述电脉冲发生器依次向空间位置分布不同的所述电极对施加电脉冲，且施加电脉冲的时间间隔为1us～10s。

优选地，所述凸起结构的高度为0.01～1mm。

一种基于细胞原位电穿孔装置的使用方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将电穿孔装置放置在已经培养细胞的培养皿中，使每一电极对均正对培养皿底部的细胞生长处，并将待转染物质和电穿孔缓冲液浸没细胞及每一电极对；

2)若细胞为贴壁细胞，则直接进入步骤3)；若细胞为悬浮细胞，则待悬浮细胞均沉降到培养皿底部后再进入步骤3)；

3)将每一电极对均分别连接电脉冲发生器，电脉冲发生器向每一电极对依次分别施加电脉冲进行电穿孔；

4)电穿孔完成后将电穿孔装置移出培养皿，将培养皿中的电穿孔缓冲液替换成细胞培养基，并将电穿孔后的培养皿放入细胞培养箱中完成转染过程，完成转染后的电穿孔装置通过清洗吹干以备下次使用。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明由于依次向每一电极对施加电脉冲信号，叠加起来形成总体均匀电场分布，从而有利于实现均匀高效的电穿孔。2、本发明由于设置有凸起结构，使电极不直接接触细胞，减少了电穿孔过程中电极表面发生的水电解导致的气泡、pH值改变或焦耳热对细胞的伤害，有利于提高电穿孔过程中的细胞存活率。3、本发明的电穿孔装置可由PCB工艺制作，以PCB工艺制作的电穿孔装置可与电路控制系统连接，有利于实现高通量、自动化的基于电穿孔的基因功能筛选。4、本发明的电穿孔装置和培养皿可以拆卸，使电穿孔过程大大简化，且设备便于清洗，可以广泛应用于细胞生物学实验研究中。

附图说明

图1是本发明实施例1电穿孔装置的结构示意图；

图2是本发明实施例1电穿孔装置的结构分解示意图；

图3是本发明应用于贴壁细胞的使用流程示意图；

图4是本发明应用于悬浮细胞的使用流程示意图；

图5是本发明实施例2电穿孔装置的结构示意图；

图6是本发明实施例2电穿孔装置的结构分解示意图；

图7是常规电穿孔装置施加电脉冲后细胞表面的电场分布仿真示意图；

图8是常规电穿孔装置的电脉冲施加方式示意图；

图9是本发明的细胞原位电穿孔装置施加电脉冲后细胞表面的电场分布仿真示意图；

图10是本发明的细胞原位电穿孔装置的电脉冲施加方式示意图。

具体实施方式

以下结合附图来对本发明进行详细的描绘。然而应当理解，附图的提供仅为了更好地理解本发明，它们不应该理解成对本发明的限制。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”等仅仅是用于描述的目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

实施例1：

如图1～4所示，本发明的细胞原位电穿孔装置包括一基板1、至少两电极对2和一凸起结构3，其中，每一电极对2均包括交叉设置的一第一插指电极21和一第二插指电极22，且第一插指电极21和一第二插指电极22为阴阳极相对设置，本发明以两电极对2作为实施例进行详细说明。

基板1可以采用环形基板1，以此为例，不限于此。基板1上固定设置两电极对2，两电极对2的第一插指电极21和一第二插指电极22相互嵌套设置，且两电极对2均电连接一外部电脉冲发生器(图中未示出)，电脉冲发生器通过空间编码方式向两电极对2依次施加电脉冲。基板1底部两端分别向内延伸设置一凸起结构3。使用时本发明的细胞原位电穿孔装置放置在设置有细胞、用于细胞转染的待转染物质和电穿孔缓冲液的培养皿底部细胞生长处，使两电极对2正对细胞进行电穿孔。

在一个优选的实施例中，基板1可以采用绝缘材料进行制作，绝缘材料可以为玻璃材料、绝缘高分子聚合物材料或印刷电路板。

在一个优选的实施例中，电极对2数量本发明不做限制，电极对2的数量可以根据基板的面积进行确定，具体使用时电极对2能够覆盖住基板1的绝大多数面积即可。

在一个优选的实施例中，空间编码方式为电脉冲发生器依次向空间位置分布不同的两电极对2施加电脉冲，且施加电脉冲的时间间隔为1us～10s。

在一个优选的实施例中，每一第一插指电极21和一第二插指电极22均可以采用金属或导电聚合物材料。

在一个优选的实施例中，凸起结构3的高度为0.01～1mm。

实施例2：

本实施例与实施例1的结构基本相同，基板1上固定设置两电极对2，不同的是本实施例将实施例1的第一插指电极21和第二插指电极22可以替换成第一电极阵列23和第二电极阵列24，如图5～6所示，两电极对2的第一电极阵列23和第二电极阵列24相互嵌套设置，每一第一电极阵列23和第二电极阵列24均包括一外框25、两个以上的导线26和两个以上的电极27，每一外框25的一端均平行设置两个以上的导线26的一端，每一导线26上均串联设置一个以上的电极27，电极27的数量不做限定，具体根据基板1的面积进行确定。

在一个优选的实施例中，每一电极27均可以采用圆形、方形或矩形的平面电极，或，如果基板1采用印刷电路板，每一电极27可以为印刷电路板的通孔或焊盘。

下面以实施例1的细胞原位电穿孔装置详细说明本发明的使用方法：

1)将本发明的细胞原位电穿孔装置放置在已经培养细胞的培养皿中，使两电极对2正对培养皿底部的细胞生长处，并将待转染物质和电穿孔缓冲液浸没细胞及两电极对2。

2)若细胞为贴壁细胞，则直接进入步骤3)；若细胞为悬浮细胞，则待悬浮细胞均沉降到培养皿1底部后再进入步骤3)。

3)将两电极对2分别连接电脉冲发生器，电脉冲发生器向两电极对2依次施加电脉冲进行电穿孔。

4)电穿孔完成后将本发明的细胞原位电穿孔装置移出培养皿，将培养皿中的电穿孔缓冲液替换成细胞培养基，并将电穿孔后的培养皿放入细胞培养箱中完成转染过程，完成转染后的细胞原位电穿孔装置通过清洗吹干以备下次使用。

如图7～8所示为通用Comsol软件仿真常规电穿孔装置放置在培养皿里的电场分布，其中，电极的插指宽度为150微米，相邻插指之间的间隙距离为250微米，电极和培养皿底部的间距为400微米，当常规电穿孔装置被施加电脉冲时，细胞所在的区域(离底部2微米高处)电场呈现明显的高低起伏变化，因此当强电场区域内的细胞被转染时，弱电场区域内的细胞因电场强度不够而未被转染，若持续增大电压提高弱电场区域的场强，则可能导致强电场区域的场强过高而导致细胞被直接裂解。

如图9～10所示为通用Comsol软件仿真本发明的细胞原位电穿孔装置放置在培养皿里的电场分布，其中，每一第一插指电极21和第二插指电极22的插指宽度均为150微米，相邻插指之间的间隙距离均为250微米，电极对2和培养皿底部的间距均为400微米，采用本发明的细胞原位电穿孔装置所提出的空间编码方式向电极对2分别依次施加电脉冲，电极对2分别产生的脉冲因电极嵌套设置的缘故，位置上有一个平移，电极对2产生的强电场区域刚好是电极对2产生的弱电场区域，反之亦然，生成的强电场区域和弱电场区域的叠加效果使细胞表面的电场分布更加均匀，进而使细胞转染更加均匀。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。