本发明属于医药技术领域，具体涉及一种具有抗血栓活性的纯化寡糖化合物或其同系化合物的混合物及其药学上可接受的盐，其制备方法和用途。
背景技术：
包括缺血性卒中、冠心病、静脉血栓栓塞等的血栓性疾病是最主要的人类致死性病因。纤溶、抗凝、抗血小板等抗血栓药物是临床药物预防和治疗血栓性疾病的基础手段，但是现有抗血栓药物均存在共性缺陷：出血倾向和严重出血危险。降低出血倾向和出血危险是新型抗血栓药物研发的核心目标。近年来的研究发现，内源性凝血途径与病理性血栓形成密切相关，而可能并非止血功能所必须，因此，内源性凝血因子抑制剂已成为低出血倾向抗血栓药物研究的重点方向。其中，凝血因子xiia、xia及ixa抑制剂的临床前及临床试验研究已陆续展开。内源性因子x酶复合物(xase)是内源性凝血途径上的末位和限速的酶活位点，其选择性抑制剂具有重要的潜在临床应用价值。
岩藻糖化糖胺聚糖(fucosylatedglycosaminoglycan,fg)是迄今仅见于棘皮动物中的一种具有特殊化学结构及药理活性的糖胺聚糖，其具有类似硫酸软骨素主链，并存在岩藻糖基(fucosyl,fuc)侧链取代的糖胺聚糖类似物(yoshidaet.al,tetrahedronlett,1992,33:4959-62；
本发明人此前对天然fg的化学解聚以及解聚产物的化学及药理学特性进行系统的研究。例如，中国发明专利cn101724086b公开了fg的过氧化解聚法，所得解聚产物可抑制血栓形成而出血倾向显著降低，但该方法所得产物因其末端结构复杂而难以进一步分离纯化。
现已发现，常规方法从棘皮动物体壁提取获得的天然fg中通常还含有分子量分布与天然fg相近的葡聚糖、岩藻聚糖(fucan)和/或含氨基己糖的多糖类化合物。这些混杂于天然fg中的多糖类成分难以通过凝胶层析、超滤法甚至离子交换色谱法去除干净。本发明人进行的比较研究显示，采用上文文献所述技术方法，从棘皮动物体内提取所得的天然fg提取物中通常还含有质量比约10％～20％的其它多糖类成分。由于这些多糖类成分均可被过氧化解聚，因此天然fg的过氧化解聚产物的寡糖组成相当复杂。
中国发明专利cn103214591a公开了fg的脱酰脱氨基解聚法，该方法可选择性裂解d-乙酰氨基半乳糖(galnac)-(β1→4)-d-葡萄糖醛酸(d-glca)糖苷键，获得含有还原性末端为2,5-脱水塔罗糖基(antal)的解聚产物，其所得解聚产物中的寡糖同系物均由3m个单糖残基组成(m为自然数，后文同此定义)。脱酰脱氨基解聚法不能解聚混杂于天然fg中葡聚糖和岩藻聚糖，经脱酰脱氨基解聚处理后，这些不能解聚的多糖杂质可以容易地通过凝胶色谱或超滤法除去。天然fg的脱酰脱氨基解聚产物具有更规则的结构特征，其所含寡糖可以得到进一步的分离纯化(cn104370980a)。研究显示，天然fg脱酰脱氨基解聚所得同系寡糖物化合物中，九糖(nonasaccharide,nsac)是具有强效抑制xase活性的最小结构片段(procnatlacadsciusa.2015；112(27):8284-9)。
本发明人已获授权的发明专利申请cn201310099800公开了天然fg的β-消除解聚法，该方法是在非水溶剂中碱处理fg羧酸酯而选择性裂解d-galnac-(β1→4)-d-glca糖苷键，由此获得非还原端为不饱和的δ4,5-己糖醛酸基(δua)的解聚产物，所述解聚产物是一系列寡糖化合物的混合物。类似地，由于β-消除解聚法具有很好的糖苷键选择性，其不能解聚天然fg提取物中含有的其它类型的多糖类化合物，因此有利于去除fg提取物中的非fg类多糖杂质成分。
但是，与发明专利申请cn103214591a所述脱酰脱氨基解聚法所得解聚产物不同，尽管cn201310099800所述β-消除法解聚产物的非还原端相对规则，但其还原性端的组成却相对复杂：所述还原端糖基既包括“-d-galnac”，也包括l-fuc-(α1→3)取代的“-4-d-glca”。由于还原端结构相对复杂，从所述解聚产物中分离获得纯化寡糖存在较大的技术难度，因此一般选择直接使用以混合物形式存在的解聚产物。
药学领域技术人员容易理解，纯化寡糖的化学结构纯净、质量控制水平更高，因而可具有更高的应用价值。显然，对于天然fg的解聚产物而言，其末端结构的规则程度可显著影响制备纯化寡糖化合物的技术可行性。
理论上，β-消除解聚法可选择性裂解“-d-galnac-(β1→4)-d-glca-”糖苷键，其所得解聚产物的还原性末端应当为“-d-galnac”残基，且所得解聚产物中的寡糖同系物一般应当由3m个单糖残基组成。发明专利申请cn201310099800公开的天然fg的β-消除解聚产物中存在一定量的还原端为“-[l-fuc-(α1→3)]-d-glca-”的寡糖化合物，表明在其所述条件下进行的β-消除反应的过程中，应当还存在一定的副反应，特别是，其解聚产物的还原端的糖基受到了一定程度的破坏。
通过对天然fg的β-消除反应条件的进一步研究，本发明人发现采用还原剂将天然fg的还原性末端的糖基还原成糖醇基，其羧酸酯化产物可在专利zl201310099800所述的碱性非水溶剂中发生β-消除反应，但其解聚产物中也含有一定量的以“-d-glca-”残基为还原性末端的寡糖化合物，根据解聚产物的hpgpc分析并以面积归一化法计算，以-d-glca为还原性末端的寡糖化合物可占寡糖化合物总量的约10％～30％，其结果与相同条件下的末端未还原的天然fg的解聚产物近似。其研究显示，将天然fg的还原性末端的糖基还原成糖醇并不影响fg羧酸酯的β-消除反应的进行，但也不能减少解聚产物的还原端糖基的破坏。
在发明专利申请cn201310099800进行β-消除反应所述的碱性非水溶剂中直接加入还原剂(如硼氢化钠)，结果发现天然fg羧酸酯的β-消除反应可正常进行。出乎意料的是，其所得产物的还原性末端基本上均为乙酰氨基半乳糖醇基(-3-d-galnac-ol)；而以“-3-d-glca(-ol)”残基为还原性末端的寡糖化合物的含量则显著降低，以hpgpc面积归一化法计算，其含量均可低于约5％，甚至低于hpgpc检测限，由此，其所得解聚产物中的同系寡糖化合物可具有更为规则的末端化学结构特征：所述同系寡糖化合物均由3m个单糖残基组成；其非还原端的糖基为“l-fuc-(α1-3)-δua-1-”而还原性端糖基为“-3-d-galnac-ol”。
采用还原剂存在下的碱性非水有机溶剂中的β-消除反应以及色谱分离技术，本发明人首次从fg的β-消除解聚产物中分离纯化出一系列化学结构新颖的“纯化寡糖化合物”。所述纯化寡糖化合物存在共同的化学结构特征是：所述纯化寡糖均由3m个单糖残基组成，其非还原端结构为“l-fuc-(α1-3)-δua-1-”、还原性端糖基为“-3-d-galnac-ol”。
本发明人经过进一步研究发现，含3m个单糖残基的寡糖可以通过还原端的“去皮反应”失去一个单糖残基，由此产生“含(3m-1)个单糖残基”的寡糖，这些寡糖的还原端均为“-d-glca”。通过对fg羧酸酯的β-消除反应条件的深入研究，本发明人还惊奇发现：
在上文所述的非水碱性反应溶液中加入少量强碱(如naoh)水溶液，所述含有3m个单糖残基且以“-3-d-galnac”为还原性末端的fg寡糖极易发生“去皮反应”并失去末端“-d-galnac”糖基。出乎意料的是，由所述“去皮反应”产生的还原性末端为“-d-glca”的寡糖化合物(其含有(3m-1)个单糖残基)却“出乎意料地”难以发生进一步的“去皮反应”。因此，改进fg羧基酯在非水溶剂中的碱处理条件，可以在β-消除法裂解d-galnac-(β1→4)-d-glca糖苷键之后，进一步通过还原性末端的“去皮反应”使解聚产物失去末端的“-3-d-galnac”糖基，由此可以获得具有新颖和规则化学结构特征的寡糖同系物。
hpgpc色谱分析及nmr结构分析显示，在无水有机溶剂中，强碱处理fg羧酸酯使之发生“β-消除解聚”，继而向反应液中加入少量强碱水溶液使β-消除解聚产物进一步发生“去皮反应”，其解聚产物所含同系寡糖化合物可以具有非常规则的化学结构，即：所述同系寡糖化合物均由(3m-1)个单糖残基组成；所述同系寡糖化合物的非还原端的糖基均为“l-fuc-(α1-3)-δua-1-”，而其还原端糖基则均为c3位存在l-fuc取代的“-4-d-glca”。
天然fg羧酸酯经“β-消除”和“去皮反应”处理所得的寡糖同系物具有更为规则的化学结构特征，因此易于被进一步分离纯化并获得一系列纯化寡糖化合物。所述系列纯化寡糖化合物的共同结构特征是：所述寡糖化合物均含有(3m-1)个单糖残基；其非还原端均为“l-fuc-(α1-3)-δua-1-”；其还原端均为“-4-[fuc-(α1-3)]-d-glca”。
综上所述可见，本发明通过进一步改善天然fg羧酸酯的β-消除条件，可以分别获得化合物结构(特别是还原端糖基结构)更为规则的fg解聚产物：其一，是还原端为“-d-galnac-ol”的解聚产物，其二，是还原端为“-d-glca”的解聚产物。由于解聚产物的末端结构更为规则，本发明首次公开了从这些解聚产物中分离获得的来源于天然fg的纯化寡糖化合物。通过对这些纯化寡糖的特定化学基团的结构修饰，本发明还进一步公开了不同系列的fg寡糖化合物的衍生物。
此外，通过对fg寡糖化合物抗凝活性、对内源性因子xase的抑制活性及其肝素辅因子ii(hc-ii)依赖的抗凝血酶(即活性凝血因子iia)活性的构效关系研究，本发明人还发现：
对于还原端为“-d-galnac-ol”、含3m个单糖残基的fg寡糖同系物而言，其强效的抑制内源性凝血因子xase的最简结构片段为九糖(nsac)；对于还原端为“-d-glca”、含(3m-1)个单糖残基的fg寡糖同系物而言，其强效的抑制内源性凝血因子xase的最简结构片段为八糖(octasaccharide,osac)；全部纯化寡糖化合物还存在不同强度的hc-ii依赖的抗凝血酶活性和体外抗凝活性，并且具有抑制实验动物病理模型中的动静脉血栓形成的药理活性。
由于本发明所述纯化寡糖化合物及其结构修饰所得的寡糖衍生物均具有抑制凝血因子活性以及显著的抗凝和抗血栓活性，因此，这些寡糖化合物具有潜在的预防和/或治疗血栓性疾病的应用价值。
总体上，本发明首次公开了通过“β-消除解聚”或“β-消除解聚+末端去皮反应”获得化学结构(特别是还原端糖基结构)更为规则的天然fg解聚产物的技术方法，以及通过所述方法获得的均一性结构的fg寡糖同系物。本发明还首次公开了具有非还原端不饱和己糖醛酸基结构的纯化的fg寡糖化合物、其结构修饰的衍生物以及它们的混合物。由于所述寡糖化合物具有抗凝和抗血栓活性，本发明还公开了所述寡糖化合物及其混合物在预防和/或治疗血栓性疾病的药物制备中的用途。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有抗凝和抗血栓活性的纯化寡糖化合物、其制备方法、含有所述纯化寡糖化合物或寡糖混合物以及其药学上可接受的盐的药物组合物，以及所述寡糖化合物、寡糖混合物及其药物组合物在预防和/或治疗血栓性疾病的药物制备中的用途。
本发明首先提供一种具有抗血栓活性，特别是具有抑制内源性凝血因子xase的活性，的寡糖化合物及其药学上可接受的盐，所述寡糖化合物具有式(i)所示通式结构：
式(i)中，
r1、r2、r3、r4、r5任选为相互独立的-h或-so3h；
r6任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基；
r7任选为-h、-so3h、c2-c5酰基；
r8任选为式(ii)、式(iii)或式(iv)所示基团：
其式(ii)、式(iii)和式(iv)中，
r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7均同上定义；
r9和r10任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基；
r11任选为-nhr12或-or13，其中，r12和r13任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基；
n是任选为0或1～8的自然数。
本发明所述的具有式(i)所示通式结构的寡糖化合物是指“纯化寡糖化合物”。一般而言，所述“纯化寡糖化合物”的纯度均不低于95％。举例来说，采用分析型高效凝胶色谱法(hpgpc)分析，例如，采用安捷伦高效液相色谱仪及凝胶色谱柱，并采用通用型的示差检测器(rid)检测，按照面积归一法计算，所述纯化寡糖化合物的纯度一般不低于95％。
在本发明所述式(i)结构的寡糖化合物中，一种优选的寡糖化合物是r8为式(ii)所示基团的化合物，即，所述寡糖化合物具有式(v)所示通式结构：
式(v)中，
r1、r2、r3、r4、r5任选为相互独立的-h或-so3h；
r6任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基；
r7任选为-h、-so3h、c2-c5酰基；
r9任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基；且
n是任选为0或1～8的自然数。
在更为优选的式(v)结构的化合物中，其r1＝-h；r2＝r3＝r4＝r5＝-so3h；
在另一种更为优选的式(v)结构的化合物中，其r1＝r3＝r4＝r5＝-so3h；r2＝-h。
在本发明所述式(i)结构的寡糖化合物中，另一种优选的寡糖化合物是其r8为式(iii)所示基团的化合物，即所述寡糖化合物具有式(vi)所示通式结构：
式(vi)中，
r1、r2、r3、r4、r5任选为相互独立的-h或-so3h；
r6任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基；
r7任选为-h、-so3h、c2-c5酰基；
r10任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基；且
n是任选为1～8的自然数。
类似地，在更为优选的式(vi)结构的化合物中，其r1＝-h；r2＝r3＝r4＝r5＝-so3h；
另一种更为优选的式(vi)结构的化合物中，其r1＝r3＝r4＝r5＝-so3h；r2＝-h。
在本发明所述式(i)结构的寡糖化合物中，再一种优选的寡糖化合物是其r8为式(vii)所示基团的化合物，即所述寡糖化合物具有式(vii)所示通式结构：
式(vii)中，
r1、r2、r3、r4、r5任选为相互独立的-h或-so3h；
r6任选-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基；
r7任选为-h、-so3h、c2-c5酰基；
r11任选为-nhr12或-or13，其中，r12和r13任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基；且
n是任选为0或1～8的自然数。
类似地，在更为优选的式(vii)结构的化合物中，其r1＝-h；r2＝r3＝r4＝r5＝-so3h；
另一种更为优选的式(vii)结构的化合物中，其r1＝r3＝r4＝r5＝-so3h；r2＝-h。
本领域技术人员容易理解，分离纯化本发明所述寡糖化合物的技术难度可随寡糖聚合度的增加而增大。因此，在本发明上述式(i)、(v)、(vi)、或(vii)所示结构的寡糖化合物中，其优选的寡糖化合物是，n任选为1、2、3或4。
本发明所述纯化寡糖化合物中存在硫酸酯基取代基和/或游离羧基，因此可以与药学上可接受的无机和/或有机离子结合成盐。一般来说，本发明所述寡糖化合物的药学上可接受的盐可任选为碱金属盐、碱土金属盐或有机铵盐。
优选的本发明所述寡糖化合物的药学上可接受的盐是钠盐、钾盐或钙盐。
本领域技术人员容易理解，将同系物形式的本发明所述纯化寡糖化合物，例如，将上文所述式(v)所示化合物的同系物、或式(vi)所示化合物的同系物、或(vii)所示化合物的同系物混合起来，即可获得具有特定结构类型的同系寡糖化合物的混合物。特别地，根据本说明书后文所述的本发明化合物的制备方法，本发明还可以通过特定的技术方法获得化学结构(特别是还原端糖基结构类型)更为规则的同系物形式的fg寡糖混合物。
为此，本发明还提供一种具有抗血栓活性，特别是具有抑制内源性凝血因子x酶的活性的寡糖混合物及其药学上可接受的盐，其所述寡糖混合物由上述式(i)寡糖化合物的同系物组成；并且，组成所述寡糖混合物中的式(i)寡糖化合物的r8同为式(ii)所示基团、或者同为式(iii)所示基团、或者同为式(iv)所示基团。具体地说，以摩尔比计，r8为式(ii)所示基团的式(i)结构寡糖化合物在所述混合物中所占的比例不低于95％；或者r8为式(iii)所示基团的式(i)寡糖化合物在所述混合物中所占的比例不低于95％；或者r8为式(iv)所示基团的式(i)寡糖化合物在所述混合物中所占的比例不低于95％。
在本发明所述寡糖混合物中，一种优选的寡糖混合物是具有上文式(v)所示通式结构的同系寡糖化合物的混合物。一种更为优选的本发明所述寡糖混合物是式(v)所示结构的同系寡糖化合物的混合物，且其r1＝-h；r2＝r3＝r4＝r5＝-so3h；在另一种更为优选的式(v)所示结构的同系寡糖化合物的混合物中，其r1＝r3＝r4＝r5＝-so3h；r2＝-h。
在本发明所述寡糖混合物中，另一种优选的寡糖混合物则是具有式(vi)所示通式结构的同系寡糖化合物的混合物。类似地，在更为优选的式(vi)所示结构的同系寡糖化合物的混合物中，其r1＝-h；r2＝r3＝r4＝r5＝-so3h；而另一种更为优选的式(vi)所示结构的同系寡糖化合物的混合物中，其r1＝r3＝r4＝r5＝-so3h；r2＝-h。
在本发明所述寡糖混合物中，再一种优选的寡糖混合物则是具有式(vii)所示通式结构的同系寡糖化合物的混合物。类似地，一种更为优选的式(vii)所示结构的同系寡糖化合物的混合物中，其r1＝-h；r2＝r3＝r4＝r5＝-so3h；而另一种更为优选的式(vii)所示结构的同系寡糖化合物的混合物中，其r1＝r3＝r4＝r5＝-so3h；r2＝-h。
对于上文所述本发明之寡糖化合物以及寡糖混合物，本发明还进一步提供所述化合物及其混合物的制备方法。
首先，本发明提供一种所述式(i)所示结构的寡糖化合物及其药学上可接受的盐的制备方法。所述制备方法是以棘皮动物来源的岩藻糖化糖胺聚糖(fg)为反应起始物，任选采用如下方法解聚：
酯化fg羧基，并在强碱及还原剂存在下的无水有机溶剂中使fg羧基酯发生“β-消除反应”并解聚，而解聚产物的还原端的-d-乙酰氨基半乳糖基(-d-galnac)均被还原剂还原成糖醇(-d-galnac-ol)，由此获得同系寡糖化合物的混合物；或者
酯化fg羧基，并在强碱存在下的无水有机溶剂中使fg发生“β-消除反应”并解聚，继而通过添加碱性水溶液使解聚产物发生端基“去皮反应”失去还原端的-d-galnac，获得还原端为-d-葡萄糖醛酸基(-d-glca)的同系寡糖化合物的混合物。
由所述“β-消除解聚和端基还原”或“β-消除解聚和去皮反应”所得的同系寡糖化合物的混合物均通过分离纯化并任选进行结构修饰获得所需的纯化寡糖化合物。
特别地，本发明所述寡糖化合物的制备方法是一种制备具有式(i)所示结构、且其r8为上文式(ii)所示基团的寡糖化合物的方法。所谓“具有式(i)所示结构、且其r8为式(ii)所示基团的寡糖化合物”实际上等同于上文定义的式(v)所示结构的寡糖化合物。
所述式(v)所示结构的寡糖化合物制备方法是“β-消除解聚+端基还原”法，所述方法是在强碱及还原剂存在下，在无水有机溶剂中使羧酸酯化的fg发生“β-消除反应”而裂解其“d-galnac-(β1→4)-glca”糖苷键，且其解聚产物的还原端-d-galnac被还原剂还原成-d-galnac-ol，由此获得末端结构相对规则的同系寡糖化合物的混合物，继而通过分离纯化、并任选对特定取代基进行结构修饰以获得所需的纯化寡糖化合物。其具体步骤包括：
(a)将天然fg转变为季铵盐形式，并在有机溶剂中，将所述fg季铵盐中的d-glca上的羧基全部或部分转化为羧酸酯；
(b)在存在还原剂的有机溶剂中，以强碱处理步骤(a)所述羧酸酯化的fg季铵盐使之发生β-消除解聚，且使解聚产物的还原端的-d-galnac被还原成-d-galnac-ol，由此获得末端结构相对规则的同系寡糖化合物的混合物；
(c)将步骤(b)所得同系寡糖化合物的混合物转变为碱金属盐形式，并在水溶液中，碱水解同系寡糖化合物的羧酸酯，获得含游离羧基的同系寡糖化合物的混合物；
(d)采用层析法分离纯化步骤(c)所得寡糖混合物所含的同系寡糖化合物；
(e)任选对步骤(d)所得的纯化寡糖化合物进行进一步的结构修饰。
所述步骤(a)～(e)如路线图1所示：
路线图1
路线图1中：
naturalfg1为棘皮动物来源的天然fg，其为一系列同系多糖类化合物的混合物；
fgammoniumsalt2是季铵盐形式的fg；
fgesterammoniumsalt3是fg中d-glca上的羧基被部分或全部酯化的产物，其以季铵盐形式存在；
dfgesterammoniumsalt4是fg羧酸酯发生β-消除反应生成的解聚产物，其还原端糖基-d-galnac可被存在于反应液中的还原剂还原生成reduceddfgesterammoniumsalt5；
reduceddfg6是以碱金属盐形式存在的5的羧酸酯基水解产物；解聚产物4、5和6均为同系寡糖化合物的混合物；
purifiedoligosaccharide7是从解聚产物6中分离获得的纯化寡糖；而纯化寡糖8则为7任选进行取代基结构修饰的所得的纯化寡糖。
路线图1所述化学结构中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r9和n均同上文式(i)定义；x是均值在约40～80范围内的自然数；y是在约0～15范围内的自然数；-coox为羧酸酯和/或羧酸的季铵盐。
路线图1中，由所示天然fg的化学结构可见，其具有类似硫酸软骨素的主链结构，并且存在硫酸酯化的l-fuc侧链取代基。一般来说，天然fg可以理解为由“三糖结构单元”{-4)-[l-fucs-(α1-3)]-d-glca-(β1-3)-d-galnacs-(β1-}顺次连接而成的多糖类化合物(式中，fucs和galnacs分别表示硫酸酯化的fuc和硫酸酯化的galnac)。一般来说，天然fg通常含有均值约40～80个所述三糖结构单元(约略地说，x的均值在约40～80范围内)。
天然fg盐的存在形式取决于其提取纯化的工艺路线。一般而言，所述fg以碱金属或碱土金属盐(例如其钠盐、钾盐或钙盐等)的形式存在。为实现后续步骤中的有机溶剂中的化学反应，所述步骤(a)将天然fg转化为季铵盐形式(路线图1之2)。
天然fg的季铵盐转化可任选采用本领域熟知的技术方法进行。举例来说，所述季铵盐转化可采用季铵盐沉淀法，所述方法是向fg的碱金属或碱土金属盐的水溶液中加入过量的有机铵盐类化合物，由此形成水不溶性的fg季铵盐可容易地从所述水溶液中沉淀出来；此外，也可采用离子交换树脂将fg的碱金属盐或碱土金属盐交换成h型fg，继而采用碱性有机铵中和所述h型fg亦可获得fg季铵盐。
如路线图1所示步骤(a2)是将fg季铵盐(2)中d-glca残基上的羧基全部或部分转化为羧酸酯(3)。fg的羧基酯化反应的目的是使之易于发生β-消除反应。羧基形式存在的glca较难发生β-消除解聚反应，而其羧酸酯则由于酯基的电子效应使之易于发生β-消除反应。
一般来说，所述fg中的glca的羧基酯化反应是在有机溶剂中，如二甲基甲酰胺(dmf)或dmf与低级醇、酮和/或醚的混合溶剂中，使所述fg中的glca羧基与化学计量的卤代烃反应，可容易地获得不同酯化程度的所需的fg羧酸酯。所述fg羧酸酯的酯化程度是指酯化反应后生成的羧酸酯基的摩尔数与酯化反应前的游离羧基的摩尔数的比值；所述卤代烃可任选为不限于：c1-c6直链或支链、饱和或不饱和、取代或未取代的脂族烃基；或取代或未取代的c7-c12芳族烃基等。本申请人在另一项发明专利申请cn201110318704.x公开了fg羧基酯衍生物的制备方法，此将该发明专利申请的全文作为参考文献结合到本说明书中。
路线图1所示步骤(b)是使fg羧酸酯发生β-消除解聚(b1)获得解聚产物4，而解聚产物4的还原端-d-galnac可被还原剂还原成-d-galnac-ol(b2)并获得解聚产物5。
如前文所述，cn201310099800公开了天然fg的β-消除解聚法，所述方法可以获得非还原端为不饱和的δua的解聚产物，但其解聚产物的还原端糖基的结构类型相对复杂：所述还原端糖基既包括“-d-galnac”，也包括l-fuc取代的“-d-glca”。由于还原端结构类型复杂，从所述解聚产物中分离获得纯化寡糖较为困难，因此一般选择直接使用混合物形式存在的解聚产物。理论上，β-消除解聚法可选择性裂解“d-galnac-(β1→4)-d-glca”糖苷键，所得解聚产物的还原端为“-d-galnac”残基。采用cn201310099800所述β-消除解聚法制备的天然fg的解聚产物中存在一定量的还原端为“-d-glca”的寡糖化合物，表明在其所述反应条件下还存在一定的副反应，特别是，一定量的解聚产物的还原端的糖基受到了破坏。此将专利申请cn201310099800的全文作为参考文献结合到本说明书中。
本领域技术人员容易理解，纯化寡糖的化学结构纯净、质量控制水平更高，因而可具有更高的应用价值。通过对天然fg的β-消除反应条件的进一步研究，本发明人惊奇发现：
采用还原剂(如硼氢化钠)将天然fg的还原端的糖基还原成糖醇，其羧酸酯化产物可在碱性非水溶剂中发生β-消除反应，但根据解聚产物的hpgpc图谱分析，以-d-glca为还原性末端的寡糖化合物可占寡糖化合物总量的约10％～30％(面积归一化法计算)，其结果与相同条件下的末端未还原的天然fg的解聚产物近似。此结果表明，末端还原并不影响fg羧酸酯的β-消除反应的进行。
进一步研究显示，向所述碱性非水溶剂中直接加入还原剂(如硼氢化钠)，天然fg羧酸酯的β-消除反应亦可正常进行。出乎意料的是，其所得产物的还原性末端基本上均为-3-d-galnac-ol，而还原端为-3-d-glca-ol的寡糖化合物含量甚微(含量均可低于约5％，甚至低于hpgpc检测限)。此结果表明，解聚产物的末端还原可以有效避免碱性条件下的还原端糖基破坏，由此可以实现解聚产物的还原端结构相对规则。
本领域内技术人员容易理解，由于反应液中存在还原剂(如硼氢化钠)，β-消除解聚生成的解聚产物的末端糖基可以被迅速还原成糖醇。一方面，还原端糖基被还原成糖醇并不影响己糖醛酸酯进一步发生β-消除反应的发生；另一方面，解聚产物中的末端糖基被还原成糖醇后可以有效避免碱性条件下的还原端糖基的破坏和降解。因此，在还原剂存在下进行fg羧酸酯的β-消除解聚可以获得化学结构更为规则的解聚产物。
所述“化学结构更为规则”是指：(1)解聚产物中所含的同系寡糖化合物均由3m个单糖残基组成；(2)所述同系寡糖化合物的非还原端糖基均为“l-fuc-(α1-3)-δua-1-”而其还原性端糖基均为“-3-d-galnac-ol”。
由此，所述步骤(b)的技术特征是在还原剂存在的条件下进行所述β-消除解聚反应，所述β-消除反应条件是在非水溶剂中采用强碱处理fg羧酸酯。由于步骤(a)所述fg羧酸酯化的反应溶液即为非水溶剂，因此，所述羧酸酯化反应完成后，其反应液无需进行进一步的处理而直接用于进行步骤(b)所述的β-消除解聚反应。
步骤(b)所述还原剂是那些可以将还原端糖基还原成糖醇的化合物，例如硼氢化钠；还原剂的用量与解聚产物的生成量相关。本领域技术人员可以理解，为保证解聚产物的得率和结构均一性，该反应中一般应采用化学计量学上的过量还原剂。另一方面，步骤(b)所述强碱一般可任选为低级醇钠、二氮杂二环等。
路线图1所示步骤(c)是将fg的β-消除解聚所得同系寡糖混合物5转变为碱金属盐，其方法是可任选采用向反应溶液中添加饱和的无机盐(如氯化钠)水溶液来实现；其所述碱水解同系寡糖化合物羧酸酯，一般可选用无机碱水溶液(例如0.05m～1m的naoh或koh)处理即可实现，由此可以获得含游离羧基的同系寡糖混合物6；
路线图1所示步骤(d)是分离纯化寡糖混合物并获得一系列纯化的寡糖化合物7。一般而言，步骤(d)所述采用层析法分离纯化寡糖化合物是指采用凝胶层析法和/或离子交换层析法进行寡糖化合物的纯化，所述凝胶层析法和/或离子交换层析法为本领域技术人员所熟知的方法。此外，所述凝胶层析法和/或离子交换层析法还可以任选联用超滤法、盐析法等技术方法以提高所述分离纯化的效率。
路线图1所示步骤(e)是任选对步骤(d)所得的寡糖化合物7进行进一步的结构修饰，由此获得寡糖化合物8。所述化合物8即r8为式(ii)所示基团的式(i)结构的寡糖化合物，其等同于上文式(v)所示寡糖化合物。其中：
将寡糖化合物7进行季铵盐转化，继而采用本领域常规技术方法可以在有机溶剂中与卤代烃反应可以容易地获得r6为c1-c6脂族烃基或c7-c12芳基的式(v)寡糖化合物。
采用cn103214591a及相关文献(procnatlacadsciusa.2015；112(27):8284-9)所述的肼解法，则可以脱除寡糖化合物7中d-galnac上的乙酰基，获得去乙酰化的寡糖化合物，此即r7为-h的式(v)寡糖化合物。所述去乙酰化寡糖化合物与酸酐或et3n.so3反应可以获得n-再酰化或再硫酸化的寡糖化合物，即r7为c2-c5酰基或-so3h的式(v)所示寡糖化合物。
此外，对于寡糖化合物7还原端-d-galnac-ol上的c1位的醇羟基，可以任选在酸性条件下与醇类化合物反应生成末端烷基化产物。本领域技术人员容易理解，通过所述烷基化反应可以获得r9为取代或未取代的c1-c6脂族烃基或c7-c12芳基的式(v)化合物。
显然，组合使用上述结构修饰方法则可获得本发明定义的各种结构的式(v)所示寡糖化合物。
对于路线图1所示制备方法，一种优选的实施方案是：
其步骤(a)所述fg季铵盐为n,n-二甲基-n-[2-[2-[4(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基]乙氧基]乙基]苯甲铵盐，即苄索铵盐(benzethonium)；所述有机溶剂为二甲基甲酰胺(dmf)或dmf-乙醇混合物；所述羧酸酯为其苄酯；所述全部或部分转化为羧酸酯是指混合物3的羧基酯化程度在约30％至约100％的范围内；
步骤(b)所述有机溶剂为dmf或dmf-乙醇混合物；所述还原剂为硼氢化钠；所述强碱为乙醇钠。
步骤(c)中，所述将季铵盐混合物转变为碱金属盐是指向反应液中加入饱和氯化钠水溶液，由此将所得寡糖同系物5转变成钠盐形式；所述水溶液中的碱水解是指在浓度为0.05m～1m的naoh水溶液中水解同系寡糖化合物的羧酸酯；
步骤(d)所述层析法包括但不限于凝胶色谱层析法和/或离子交换色谱法；
步骤(e)所述进一步的结构修饰包括但不限于：寡糖化合物中的d-葡萄糖醛酸基(glca)和不饱和己糖醛酸基(δua)上的羧基酯化；d-乙酰氨基半乳糖基(galnac)脱乙酰化并任选再酰化或再硫酸化；还原端糖醇(d-galnac-ol)的烷基化。
已知不同物种来源的天然fg的硫酸酯化形式可存在差异。其中，见于报道的fg侧链l-fuc的硫酸酯化形式包括其2,4-二硫酸酯(l-fuc2s4s)、3,4-二硫酸酯(l-fuc3s4s)、3-硫酸酯(l-fuc3s)和4-硫酸酯(l-fuc4s)以及无硫酸酯基取代；见于报道的主链中的d-galnac硫酸酯化形式则包括其4,6-二硫酸酯(d-galnac4s6s)、4-硫酸酯(d-galnac4s)、6-硫酸酯(d-galnac6s)和无硫酸酯基取代。并且，一些天然fg中可同时存在不同硫酸酯化形式的l-fucs和/或d-galnacs，而另一些天然fg所含l-fucs和/或d-galnacs的硫酸酯化形式则相对规则和单一(参见：pominvh.mardrugs.2014,12,232-54)。
由所述式(v)寡糖化合物的制备方法可见，其所述步骤均不影响糖基上硫酸酯基的稳定性，因此所得寡糖化合物的硫酸化形式取决于天然fg的硫酸化形式。显然，对于硫酸化形式相对规则的天然fg而言，其β-消除解聚产物中的寡糖化合物的类型相对较少，相同聚合度的寡糖化合物的化学结构相同，由此可以容易地制备本发明所述的纯化寡糖化合物。
例如，从stichopusvariegatus(花刺参)、bohadschiaargus(蛇目白尼参)以及stichopusmonotuberculatus等棘皮动物体壁中提取纯化的天然fg中，其侧链岩藻糖基主要为l-fuc2s4s，而其主链中的氨基己糖主要为d-galnac4s6s。因此，这些天然fg适合用于制备式(viii)所示寡糖化合物及其药学上可接受的盐，所述化合物实际上是一种r1＝r3＝r4＝r5＝-so3h、且r2＝-h的式(v)寡糖化合物。
式(viii)中，其r6、r7、r9均同上文定义。
从holothuriascabra(糙海参)、holothuriafuscopunctata(象牙参)、stichopushorrens(糙刺参)以及pearsonotheiagraeffei(革皮氏参)等棘皮动物体壁中提取的天然fg中，其侧链岩藻糖基主要为l-fuc3s4s，而其主链中的氨基己糖主要为d-galnac4s6s。因此，这些天然fg适合用于制备式(ix)所示寡糖化合物及其药学上可接受的盐，所述化合物实际上是一种r1＝-h、且r2＝r3＝r4＝r5＝-so3h的式(v)寡糖化合物。
式(ix)中，其r6、r7、r9均同上文定义。
另一种本发明所述寡糖化合物的制备方法是制备具有式(i)所示结构、且其r8为上文式(iii)或式(iv)所示基团的寡糖化合物的方法。所谓“具有式(i)所示结构且其r8为上文式(iii)或式(iv)所示基团的寡糖化合物”实际上等同于上文定义的式(vi)或式(vii)所示的寡糖化合物。所述制备方法是“β-消除解聚+去皮反应”法：在不含还原剂的有机溶剂中使羧酸酯化的天然fg发生β-消除解聚，继而通过“去皮反应”使fg解聚产物失去还原端d-galnac残基，由此获得还原端为-d-glca的同系寡糖化合物的混合物。所述方法的具体步骤包括：
(a)将天然fg转变为季铵盐形式，继而在有机溶剂中，将fg季铵盐中d-glca上的羧基全部或部分转化为羧酸酯；
(b)在无水有机溶剂中，以强碱处理所述的fg羧酸酯使之发生β-消除解聚，继而通过加入少量强碱水溶液使解聚产物进一步发生“去皮反应”以失去还原端-d-galnac残基，由此获得还原端为-d-glca同系寡糖化合物的混合物；
(c)将步骤(b)所得寡糖混合物转变为其碱金属盐，继而在水溶液中碱水解同系寡糖化合物的羧酸酯，获得含游离羧基的同系寡糖化合物的混合物；
(d)层析法分离纯化步骤(c)所述寡糖混合物中的寡糖化合物；
(e)任选对步骤(d)所得的纯化寡糖化合物进行进一步的结构修饰。
该方法所述步骤(a)～(e)所述处理的产物如路线图2所示：
路线图2
路线图2中：
naturalfg1、fgammoniumsalt2、fgesterammoniumsalt3和dfgesterammoniumsalt4均同路线图1所述；
dfgesterammoniumsalt5是解聚产物4经“去皮反应”失去末端-d-galnac形成的还原端为-d-glca的解聚产物。dfg6是以碱金属盐形式存在的5的羧酸酯基水解产物。解聚产物4、5和6均为同系寡糖化合物的混合物；
purifiedoligosaccharide7是从解聚产物6中分离获得的纯化寡糖；而纯化寡糖8和9则为7任选进行取代基结构修饰的所得的纯化寡糖。
路线图2所述化学结构中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r10、r11和n均同上文式(i)定义；x、y和–coox均同路线路1中的定义。
路线图2之步骤(a)所示天然fg的其季铵盐转化以及fg的羧基酯化均与前文“路线图1”所述方法相同。
路线图2所示步骤(b)是使fg羧酸酯发生β-消除解聚(b1)生成解聚产物4(其中含少量产物5)，继而通过“去皮反应”去除4的还原端-d-galnac残基(b2)获得解聚产物5。
如前文所述，cn201310099800公开的天然fg的β-消除解聚产物中既存在还原端为-d-galnac的寡糖化合物，也存在一定量的还原端为“-d-glca-”的寡糖化合物，其原因可能与β-消除解聚产物的还原端糖基的破坏有关。由于还原端结构相对复杂，从该解聚产物中分离纯化寡糖的难度较高。
本领域内技术人员已知，强碱条件下的“去皮反应(peelingreaction)”可以使一些多糖类化合物(如纤维素等)逐个失去还原端的单糖残基(whistlerrl,etal.alkalinedegradationofpolysaccharides.advancesincarbohydratechemistry.1958,13:289–329)。实际上，本发明人已发现，天然fg在cn201310099800所述条件下解聚，其所得产物中存在一定量的含不饱和小分子化合物的副产物，其与见于报道的去皮反应的还原端糖基的破坏产物近似。鉴于cn201310099800公开的天然fg的β-消除反应是在强碱条件下进行的，因此可以推断，解聚产物中的还原端为“-d-glca-”的寡糖化合物的生成可能与解聚产物的“去皮反应”相关。
本领域技术人员可以理解，向β-消除解聚的反应液中添加还原剂使解聚产物的末端还原成糖醇有利于避免“去皮反应”的发生；另一方面，在可控条件下利用fg的β-消除解聚的“去皮反应”，也有可能获得一系列以“-d-glca”还原端的fg寡糖。据此，通过对fg羧酸酯的β-消除反应条件的进一步研究，本发明人惊奇发现：
(1)在上文所述碱性非水溶液中加入少量强碱(如naoh)水溶液，还原端为“-d-galnac”的fg寡糖极易发生“去皮反应”并失去所述还原端糖基；出乎意料的是，还原性末端为“-d-glca”的fg寡糖化合物却难以发生类似的“去皮反应”。
(2)hpgpc色谱分析及nmr结构分析显示，在无水有机溶剂中，强碱处理fg羧酸酯使之发生“β-消除解聚”，继而向反应液中加入少量强碱水溶液使β-消除解聚产物进一步发生“去皮反应”，其解聚产物所含“同系寡糖化合物”可以具有非常规则的化学结构，即：所述同系寡糖化合物均由(3m-1)个单糖残基组成；所述同系寡糖化合物的非还原端的糖基均为“l-fuc-(α1-3)-δua-1-”，而其还原端糖基则均为c3位存在l-fucs取代的“-4-d-glca”。
(3)天然fg羧酸酯经β-消除解聚和去皮反应处理所得的寡糖同系物经进一步的分离纯化可获得一系列“纯化寡糖化合物”，这些纯化寡糖化合物可以具有共同的化学结构特征：所述寡糖化合物含有(3m-1)个单糖残基；其非还原端均为“l-fuc-(α1-3)-δua-1-”；其还原端均为“-4-[l-fuc-(α1-3)]-d-glca”。
由此，所述步骤(b)中，首先是在不含还原剂的非水溶剂中采用强碱处理fg羧酸酯使之发生β-消除解聚(路线图2之b1)获得解聚产物4(其中可含有少量寡糖5)。类似地，由于fg羧基酯化的反应溶剂为非水溶剂，其反应液无需进一步处理而直接用于进行步骤(b)所述的β-消除解聚反应。一般来说，步骤(b)所述强碱可任选为低级醇钠、二氮杂二环等。
路线图2所示步骤(b)还进一步通过“去皮反应”将解聚产物4完全转变为解聚产物5(路线图2之b2)，其方法是向所述β-消除反应液中加入少量强碱水溶液。一般来说，所述强碱水溶液可任选为0.25m～2m的naoh、koh或饱和的ca(oh)2水溶液；所述“少量”强碱水溶液是指添加相当于反应液总体积约1/5～1/10的强碱水溶液。
路线图2所示步骤(c)是将解聚产物5转变为碱金属盐并水解其羧酸酯，其技术方法均同路线图1所述方法；
类似地，如路线图2所示步骤(d)所示，寡糖化合物6的混合物经分离纯化后可获得一系列纯化的寡糖化合物7。一般而言，所述纯化方法是指采用凝胶层析法和/或离子交换层析法，并且可以任选联用超滤法、盐析法等技术方法以提高所述分离纯化的效率。
同样，步骤(e)是任选对步骤(d)所得寡糖化合物7进行进一步的结构修饰，由此获得r8为纯化寡糖化合物8或9。其中：
所述寡糖化合物8实际上等同于上文所述式(vi)寡糖化合物，而化合物9实际上等同于上文所述式(vii)寡糖化合物。
将寡糖化合物7进行季铵盐转化，继而采用本领域常规技术方法可以在有机溶剂中与卤代烃反应可以获得r6为取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基的寡糖化合物；
采用肼解法可以脱除寡糖化合物7中d-galnac上的乙酰基，获得脱乙酰化的寡糖化合物。所述脱乙酰化寡糖化合物又可以与酸酐或et3n.so3反应获得n-再酰化或再硫酸化的寡糖化合物，即r7为c2-c5酰基或-so3h的式(vi)或式(vii)寡糖化合物。
寡糖化合物7还原端-d-glca可以任选在酸性条件下与醇类化合物反应生成末端烷基化产物，由此获得r10任选为取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基的的式(vi)化合物。
寡糖化合物7还原端的-d-glca的c1位醛基可以在有机胺存在下将还原性末端还原氨基化，其反应是有机胺与末端糖基的c1位醛基反应生成席夫碱，后者在还原剂存在下被还原成次级胺，由此可以获得r11为-nhr12的式(vii)化合物(9)。
寡糖化合物7还原端的-d-glca的c1位醛基可任选采用还原剂如硼氢化钠还原成-d-glca-ol糖醇，而且，其-d-glca-ol还可以进一步任选在酸性条件下与醇类化合物反应生成末端烷基化产物，由此可以获得r11为-or13，r13任选为-h、取代或未取代的c1-c6烃基或c7-c12芳基的式(vii)化合物(9)；
显然，组合使用上述结构修饰方法可以获得本发明定义的各种特定结构的式(vi)或式(vii)所示寡糖化合物。
对于路线图2所示的制备方法，一种优选的实施方案是：
其步骤(a)所述fg季铵盐为苄索氯铵铵盐；所述有机溶剂为dmf或dmf-乙醇混合物；所述羧酸酯为其苄酯，所述全部或部分转化为羧酸酯是指化合物3的羧基酯化程度在约30％至约100％的范围内；
步骤(b)所述有机溶剂为dmf或dmf-乙醇混合物，所述强碱为乙醇钠；
步骤(c)所述将季铵盐混合物转变为碱金属盐是指向反应液中加入饱和氯化钠水溶液，由此将所得寡糖同系物转变成钠盐形式；所述水溶液中的碱水解是指在浓度为0.05m～1m的naoh水溶液中水解同系寡糖化合物的羧酸酯；
步骤(d)所述层析法包括但不限于凝胶色谱层析法和/或离子交换色谱法；
步骤(e)所述进一步的结构修饰包括但不限于：寡糖化合物中d-glca和δua上的羧基酯化；d-galnac脱乙酰化并任选再酰化或再硫酸化；还原端-d-glca的c1位半缩醛的烷基化、还原、还原氨基化或还原烷基化。
类似地，路线图2所述寡糖化合物的制备方法中，其所得寡糖化合物的硫酸化形式也取决于天然fg的硫酸化形式。
因此，stichopusvariegatus、stichopushorrens以及stichopusmonotuberculatus等棘皮动物来源的天然fg适合用于制备式(x)和式(xi)所示寡糖化合物及其药学上可接受的盐，所述化合物实际上是一种r1＝r3＝r4＝r5＝-so3h、且r2＝-h的式(vi)和式(vii)寡糖化合物。
式(x)和式(xi)中，其r6、r7、r10和r11均同上文定义。
而holothuriascabra、holothuriafuscopunctata以及pearsonotheiagraeffei等棘皮动物来源的天然fg则适合用于制备式(xii)和式(xiii)所示寡糖化合物，所述化合物实际上是一种r1＝-h、且r2＝r3＝r4＝r5＝-so3-的式(vi)和式(vii)寡糖化合物。
式(xii)和式(xiii)中，其r6、r7、r10和r11均同上文定义。
显然，本发明所述技术条件下进行天然fg的β-消除反应还可以用于制备化学结构更为规则的fg类寡糖化合物的混合物。
为此，本发明进一步提供一种本发明所述寡糖混合物及其药学上可接受的盐的制备方法。其中：(1)所述混合物由本说明书定义的式(i)所示结构的寡糖化合物的同系物组成，且所述式(i)结构的同系寡糖化合物中的r8同为式(ii)、同为式(iii)、或者同为式(iv)所示基团。具体地说，以摩尔比计，r8同为式(ii)、同为式(iii)或同为式(iv)所示基团的式(i)寡糖化合物在所述混合物中所占的比例不低于95％。(2)所述制备方法以天然fg为反应起始物，任选在强碱和还原剂存在下使fg羧酸酯发生“β-消除解聚”和端基“还原反应”获得同系寡糖化合物的混合物；或者在强碱存在下使fg羧酸酯发生“β-消除解聚”和端基“去皮反应”获得同系寡糖化合物的混合物。然后，通过后处理并任选进行进一步的取代基结构修饰获得所需分子量分布的寡糖混合物。
如前文所述，按照路线图1所示步骤(a)～(c)处理天然产物fg可以获得非还原端为l-fucs-(α1-3)-δua-1-、还原端为-d-galnacs的同系寡糖混合物。类似地，在本发明所述寡糖混合物的制备方法中，其中一种方法是：在强碱和还原剂存在下使fg羧酸酯发生“β-消除解聚”和端基“还原反应”获得同系寡糖化合物的混合物；其所得寡糖混合物含有的同系寡糖化合物具有上文定义的式(i)所示通式结构，且其r8为上文定义的式(ii)所示基团。所述方法的具体步骤包括：
(a)将天然fg转变为季铵盐形式，并在有机溶剂中将所得fg中己糖醛酸残基上的羧基全部或部分转化为羧酸酯；
(b)有机溶剂中，在还原剂及强碱存在下，使fg羧酸酯使之发生β-消除解聚和端基还原反应，由此获得还原端为-d-galnac-ol的同系寡糖化合物的混合物；
(c)将步骤(b)所得寡糖混合物转变为碱金属盐，并在水溶液中碱水解同系寡糖化合物的羧酸酯，获得含游离羧基的同系寡糖化合物的混合物并进行适当的后处理；
(d)任选对步骤(d)所得的化寡糖混合物进行进一步的取代基结构修饰。
在一种优选的实施方案中：
其步骤(a)所述季铵盐为苄索铵盐；所述有机溶剂为dmf或dmf-乙醇混合物；所述羧酸酯为苄酯；所述“全部或部分转化为羧酸酯”是指fg中羧基酯化程度在约30％至约100％的范围内。
其步骤(b)所述有机溶剂为dmf或dmf-乙醇混合物；所述还原剂为硼氢化钠；所述强碱为乙醇钠。
其步骤(c)所述将季铵盐混合物转变为碱金属盐是指向反应液中加入饱和氯化钠水溶液将所得寡糖同系物转变为钠盐形式；所述水溶液中的碱水解是指在浓度为0.05m～1m的naoh水溶液中水解寡糖化合物的羧酸酯。
如前文所述，按照本领域现有技术方法制备的天然fg中通常还含有一定量的分子量分布近似于fg的岩藻聚糖、糖原以及含氨基己糖的多糖。这些多糖类成分经上述步骤(a)和步骤(b)处理后，其分子量变化较小。因此，在步骤(c)所述后处理步骤中，选用超滤法、透析法或凝胶层析法可以容易地除去这些多糖类杂质。
如上文路线图1所示，经β-消除解聚和末端还原处理所得的解聚产物还可能具有更宽的分子量分布(路线图1所示的寡糖混合物6中，其n值可以是约0-15整数)，因此，在步骤(c)所述后处理步骤中，选用超滤法、透析法或凝胶层析法处理还可以去除较高聚合度的寡糖以及小分子化合物，由此获得所需分子量分布的寡糖混合物。
其步骤(d)所述进一步的取代基结构修饰包括但不限于：寡糖化合物中的d-glca和不饱和δua上的羧基酯化；d-galnac脱乙酰化并任选再酰化或再硫酸化；还原端d-galnac-ol的c1位羟基烷基化。
显然，与发明专利zl201310099800所述寡糖混合物相比，本发明所述r8同为式(ii)基团的同系寡糖混合物的化学结构更为规则。前者所含寡糖化合物中，约10％-30％的寡糖化合物的还原端结构为d-glca(或其衍生物)，其余寡糖化合物的还原端结构为d-galnac(或其衍生物)；而本发明所述寡糖混合物所含寡糖化合物的还原端则均为d-galnac(或其衍生物)，不含或仅含微量的约还原端为d-glca(或其衍生物)的寡糖化合物。
此外，由上文所述可见，按照路线图2所示步骤(a)～(c)处理天然产物fg可以获得非还原端为l-fucs-(α1-3)-δua-1-、还原端为-d-glca的同系寡糖混合物。因此，在本发明所述寡糖混合物的制备方法中，其另一种方法是：在强碱存在下使fg羧酸酯发生“β-消除解聚”和端基“去皮反应”获得同系寡糖化合物的混合物；其所得寡糖混合物含有的同系寡糖化合物具有本发明说明书定义的式(i)所示通式结构，且其r8为上文定义的式(iii)或式(iv)所示基团。所述方法的具体步骤包括：
(a)将天然fg转变为季铵盐形式，并在有机溶剂中将所得fg己糖醛酸残基上的羧基全部或部分转化为羧酸酯。
(b)在无水有机溶剂中，采用强碱处理fg羧酸酯使之发生β-消除解聚，继而通过加入少量强碱水溶液使fg解聚产物进一步发生“去皮反应”并失去还原端的-d-galnac残基，由此获得还原端为-d-glca的同系寡糖化合物的混合物。
(c)将步骤(b)所得寡糖混合物转变为碱金属盐，并在水溶液中，碱水解寡糖混合物中的羧酸酯基，获得含游离羧基的同系寡糖化合物的混合物并进行适当的后处理。
(d)任选对步骤(c)所得的寡糖混合物进行进一步的取代基结构修饰。
在一种优选的实施方案中：
其步骤(a)所述季铵盐苄索铵盐；所述有机溶剂dmf或dmf-乙醇混合物；所述羧酸酯为苄酯；所述fg羧酸酯的羧基酯化程度在约30％至约100％的范围内。
其步骤(b)所述有机溶剂为dmf或dmf-乙醇混合物；所述强碱为乙醇钠；所述少量强碱水溶液是指相当于反应液总体积约1/5至1/10体积的1m～2m的naoh水溶液；
步骤(c)所述将季铵盐混合物转变为碱金属盐的方法是指向反应液中加入饱和氯化钠水溶液，由此将所得寡糖同系物转变为钠盐形式；所述水溶液中的碱水解是指在浓度为0.05m～1m的naoh水溶液中水解同系寡糖化合物的羧酸酯基。类似地，所述后处理可以任选采用凝胶色谱、超滤和/或透析法除去未解聚的大分子多糖类杂质、并去除聚合度较高的寡糖化合物以及小分子杂质，由此获得所需分子量范围的寡糖混合物。
其步骤(d)所述进一步的结构修饰包括但不限于：寡糖化合物中的d-glca和δua上的羧基酯化；d-galnac脱乙酰化并任选再酰化或再硫酸化；还原端-d-glca的c1位半缩醛的烷基化、还原、还原氨基化或还原烷基化。
类似地，与发明专利zl201310099800所述寡糖混合物相比，本发明所述r8同为式(iii)或式(iv)所示基团寡糖混合物的化学结构更为规则。前者所含寡糖化合物中，约10％-30％的寡糖化合物的还原端结构为d-glca(或其衍生物)，其余寡糖化合物的还原端结构为d-gal-nac(或其衍生物)；而本发明所述寡糖混合物所含寡糖化合物的还原端则均为d-glca(或其衍生物)，不含或仅含微量的约还原端为d-galnac(或其衍生物)的寡糖化合物。
显然，采用s.variegatus、s.horrens以及s.monotuberculatus等棘皮动物来源的天然fg为起始物，按照本发明所述寡糖混合物制备方法可以制备上文所述式(viii)、式(x)和式(xi)所示的同系寡糖化合物的混合物。采用h.scabra、h.fuscopunctata以及p.graeffei等棘皮动物来源的天然fg为起始物，按照本发明所述寡糖混合物制备方法则可以制备上文所述式(ix)、式(xii)和式(xiii)所示的同系寡糖化合物的混合物。
现有资料显示，在一种含l-fuc2s4s侧链取代基的天然fg的脱酰脱氨基解聚所得同系寡糖物化合物中，其九糖(nonasaccharide,nsac)是具有强效抑制因子xase活性的最小结构片段(zhaolyetal.,pnas,2015,112:8284-8289.)。本发明人对本发明所述纯化寡糖的抑制内源性因子xase(人及实验动物来源的因子xase)活性进行构效关系研究，结果发现：
(1)本发明所述寡糖类化合物具有选择性的抑制内源性因子xase的活性。一般地，采用体外酶活系统检测，本发明所述寡糖化合物抑制因子xase的ic50值可在约5～200ng/ml的范围内。所述选择性抑制内源性因子xase的活性是指这些寡糖化合物在其显著抑制xase的浓度下，在有或无抗凝血酶(at)存在下，对凝血因子iia、xa、xiia等凝血因子以及血小板的活性无显著影响，但可存在一定强度的肝素辅因子ii(hc-ii)依赖的iia抑制活性。
(2)对于含3m个单糖基且非还原端为δua、还原端为-d-galnac-ol的系列寡糖化合物而言，强效抑制xase活性的最小结构片段也是九糖(nonasaccharide,nsac)。其结果表明，非还原端和还原端的糖基结构变化对其抑制因子xase活性影响较小。
(3)对于含(3m-1)个单糖残基且还原端为-d-glca(-ol)的系列寡糖化合物而言，强效抑制因子xase活性的最小结构片段则为八糖(octasaccharide,osac)，其结果提示，上述nsac中的还原端-d-galnac-ol可能并非其强效抑制因子xase活性的必须结构。
(4)总体上，聚合度不低于osac的本发明所述寡糖化合物均具有强效的内源性因子xase抑制活性(其ic50值均低于约100ng/ml)；聚合度更高的寡糖活性略有增强。
(5)在本发明所述寡糖化合物中，其六糖或五糖在较高浓度下对内源性xase也可以具有一定的抑制活性，尽管其活性强度相对较弱；此外，所述六糖和五糖还具有一定强度的肝素辅因子ii(hc-ii)依赖的iia抑制活性。
(6)本发明所述寡糖化合物中，取代基结构修饰能显著影响寡糖化合物的理化性质，例如水溶性及油水分配系数，而对其抑制凝血因子活性和抗凝抗血栓活性的影响一般较小。
(7)本发明所述寡糖化合物可具有显著的抑制内源性凝血途径的抗凝血活性，以延长人质控血浆的活化部分凝血活酶时间(aptt)计，其倍增aptt所需的药物浓度一般在约2～18μg/ml范围内。而本发明所述寡糖类化合物对外源性凝血无显著影响。
(8)在实验动物的病理模型中，本发明所述寡糖化合物可以显著抑制的动静脉血栓形成。例如，本发明人的研究显示，在多种实验动物模型中，以血栓重量计，皮下注射(sc)或静脉注射(sc)约2mg/kg～20mg/kg剂量的本发明化合物(如九糖或八糖)对实验性(如下腔静脉结扎所致)静脉血栓形成的抑制率可达70％～100％，且在等效抗血栓剂量下，所述寡糖化合物对出血时间和出血量的影响可显著低于临床使用的低分子肝素类药物。
(9)本发明所述寡糖混合物具有类似于纯化寡糖化合物的抑制内源性因子xase活性以及抗凝抗血栓活性。
综上所述可见，本发明所述寡糖化合物及其混合物均具有显著的抗凝抗血栓活性，且当寡糖聚合度不低于八糖时，本发明所述寡糖化合物及其混合物均为具有良好的选择性的内源性因子xase抑制剂。现有研究资料显示，内源性凝血途径与病理性血栓形成密切相关，而可能并非生理性止血所必须，选择性的内源性凝血途径抑制剂可抑制病理性血栓形成，而出血倾向可以得到有效降低。由于因子xase是内源性凝血途径的末位和限速的酶活位点，内源性因子xase已成为低出血倾向的抗凝抗血栓药物研发所关注的药物靶点。
鉴于本发明所述寡糖以及寡糖混合物具有显著的抗凝抗血栓活性，这些寡糖及寡糖混合物应当具有预防和/治疗血栓疾病的临床应用价值。为此本发明进一步提供含有所述寡糖或寡糖混合物的药物组合物。
首先，本发明提供一种具有抗血栓活性的药物组合物，所述药物组合物含有有效抗血栓剂量的本发明所述寡糖化合物或者它们的药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂。其中，所述寡糖化合物是指具有本发明书定义的式(i)所示结构的化合物。
鉴于本发明所述寡糖类化合物的理化性质，本发明所述药物组合物优选制备成胃肠外给药剂型，例如注射用水溶液或临用前配制成注射用水溶液的冻干制剂，也可以是经呼吸道给药的喷雾剂，或者是经皮给药的透皮贴剂、膏剂或凝胶剂等。
本发明所述寡糖类化合物一般可具有良好的水溶性，易于配制水溶液；由于活性成分的分子量较低，可通过超滤法去除病原微生物及热原物质；其水溶液和/或冻干制剂可选择的药用赋形剂可包括调节溶液渗透压和/或ph值的无机盐如氯化钠、缓冲盐，优选不含助溶剂和/或表面活性剂。对于临用前配制注射液的冻干粉针剂而言，除所述无机盐和/或缓冲盐外，还可以选择采用甘露糖等有助于制剂成型的药学上可接受的赋形剂。
一般来说，寡糖类化合物的口服生物利用度相对有限，但本发明所述寡糖化合物(特别是取代基结构修饰所得寡糖)的胃肠道给药仍可具有一定的药效活性。因此本发明所述药物组合物亦可制备成本领域技术人员熟知的胃肠道给药剂型，例如片剂、胶囊剂等。
本领域技术人员可以理解，对于特定制剂形式的药物组合物而言，所述寡糖化合物及其药学上可接受的盐的有效抗血栓剂量与其剂型、给药途径以及患者的体重及生理状态等因素相关。一般而言，在本发明所述药物组合物的单位制剂形式中，所述寡糖活性成分的含量约在5mg～100mg的范围内；在优选的药物组合物的单位制剂形式中，所述寡糖活性成分的含量可在约20mg～80mg的范围内。
类似地，本发明还提供一种具有抗血栓活性的药物组合物，所述药物组合物含有有效抗血栓剂量的本发明所述寡糖混合物或者其药学上可接受的盐以及药学上可接受的赋形剂。
对于含本发明所述寡糖混合物的药物组合物而言，其给药途径相关的制剂剂型及剂量选择均与上述含寡糖化合物的药物组合物近似。例如：其优选的给药途径为胃肠外给药，特别是皮下注射给药或静脉注射给药；其优选的制剂形式为注射用水溶液或冻干粉针剂；在优选的药物组合物的单位制剂形式中，所述寡糖活性成分的含量可在约20～100mg的范围内。
本发明所述寡糖化合物、寡糖混合物及其药学上可接受的盐具有强效的抗凝抗血栓活性，可以用于血栓性疾病的预防和治疗，例如血栓形成性心血管疾病、血栓性脑血管病、肺静脉血栓、周围静脉血栓、深静脉血栓、周围性动脉血栓等，为此，本发明还提供所述寡糖化合物和/寡糖混合物及其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防血栓性疾病的药物中的应用，所述血栓性疾病包括但不限于静脉血栓形成、动脉血栓形成和/或缺血性心脑血管疾病。
类似地，本发明还提供含有所述寡糖化合物和/寡糖混合物及其药学上可接受的盐的药物组合物在制备治疗和/或预防血栓性疾病的药物中的应用，所述血栓性疾病包括但不限于静脉血栓形成、动脉血栓形成和/或缺血性心脑血管疾病。
缩略语：
附图说明
图1.化合物a1～a4的hpgpc图
图2.化合物a1的1hnmr谱图及归属
图3.化合物a2的13cnmr谱图及归属
图4.化合物a3的13c-1hhsqc谱图及归属
图5.化合物a1的q-tofms谱图及归属
图6.化合物b1的1hnmr谱图及归属
图7.化合物b2的13cnmr谱图及归属
图8.化合物b3的13c-1hhsqc谱图及归属
图9.化合物b2的q-tofms谱图与归属
图10.化合物b6-b8的hpgpc图谱
图11.混合物c1的13cnmr谱图及归属
图12.混合物d1的hplc图谱
图13.混合物d1的13cnmr谱图及归属
图14.a2和d1对小鼠下腔静脉血栓形成的影响
图15.a2和d1对小鼠出血量的影响
具体实施方式
以下实施例是对本发明内容的详细说明，但并不限制本发明的范围。
【实施例1】
化合物a1、a2、a3、a4和a5的制备：l-2,4-二硫酸岩藻糖基-(α1→3)-l-4-脱氧-threo-己-4-烯吡喃糖醛酸基-(α1→3)-{-d-n-乙酰基-2-脱氧-2-氨基-4,6-二硫酸半乳糖基-(β1→4)-[l-2,4-二硫酸岩藻糖基-(α1→3)]-d-葡萄糖醛酸基-(β1→3)}(n+1)-d-n-乙酰基-2-脱氧-2-氨基-4,6-二硫酸化半乳糖醇(n＝0,1,2,3和4；六糖、九糖、十二糖、十五糖和十八糖)
1.1材料
svfg，stichopusvariegatus来源的天然fg(钠盐)。其按文献方法(zhaolyetal.,pnas,2015,112:8284-8289)制备,纯度98％(hpgpc,面积归一化法)，重均分子量(mw)约70kda。
苄索氯铵、氯化苄、dmf、氢氧化钠、氯化钠和乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。
sephadexg10,medium(50-100μm),gehealthcare；bio-gelp-6/p-2gel,fine(45-90μm),bio-rad；bio-gelp-10gel,medium(90-180μm),bio-rad；hplc色谱仪，安捷伦1200/1260系列色谱仪。
1.2方法
(1)svfg的季铵盐转化：取2.0gsvfg溶于30ml去离子水；另取5.0g苄索氯铵溶于80ml去离子水。搅拌下，用苄索氯铵溶液滴定svfg溶液得白色沉淀。所得沉淀用55ml去离子水洗涤三遍，真空干燥获得svfg季铵盐5.34g。
(2)svfg的羧基酯化：将步骤(1)所得svfg季铵盐置于圆底烧瓶中，加26mldmf溶解后，加入0.769ml氯化苄，35℃下搅拌中反应24h；静置使反应液降至室温(25℃)。取样检测产物1hnmr并计算fg的羧基酯化程度为约41％；
(3)还原剂存在下的β-消除解聚：向步骤(2)所述反应液中加入新配制的8.9ml0.08m乙醇钠-乙醇溶液(含0.4mnabh4)，搅拌反应30min。
(4)解聚产物的钠盐转换与羧酸酯水解：向步骤(3)所述反应液中加入35ml饱和nacl溶液和284ml无水乙醇，4000rpm×10min离心得沉淀。所得沉淀溶解于90ml水中，加入1.5ml6mnaoh溶液，室温下搅拌反应30min后，滴加6mhcl中和反应液(ph～7.0)。反应液以0.45μm滤膜过滤，所得过滤液以g10凝胶柱层析脱盐并冻干，获得解聚产物dsvfg(depolymerizedsvfg)共1.059g(得率53％)。
(5)化合物a1～a5分离纯化：取1gdsvfg以10ml0.2mnacl溶解，上样于bio-gelp-10凝胶柱(
(6)波谱分析：1h-/13c-及2d-nmr检测采用brukerdrx800mhz核磁共振仪，谱宽16025.6hz，采集时间2.0447s，脉冲宽度9.5s，弛豫时间1s，扫描32次。样品浓度为(10～15)g/l，检测前用重水反复冻干三次；esi-q-tofms采用microtof-qiiesi-ms(bruker,germany)质谱仪分析。质谱条件为毛细管电压2500v，喷雾器电压0.6bar，干燥气流速4.0l/min，干燥气温度+180℃，m/z扫描范围50～3000。数据采用brukercompassdata-analysis4.0(bruker-daltonics,germany)软件进行分析。
1.3结果
(1)按所述方法获得化合物a135mg、a245mg、a355mg、a435mg、a520mg，hpgpc法检测其纯度约99％。寡糖化合物a1～a5的hpgpc图如附图1所示。
(2)化合物a1～a5结构解析：寡糖化合物a1的1hnmr谱图及归属如附图2所示；化合物a2的13cnmr谱图及归属如附图3所示；化合物a3的13c-1hhsqc谱图及归属如图4所示；化合物a1的q-tofms谱图及归属如附图5所示；化合物a1～a2的1h/13cnmr信号归属分别见表1和2。
根据1h-/13c-及2d-nmr及q-tofms分析，化合物a1～a5的化学结构为l-fuc2s4s-(α1,3)-δua-(α1,3)-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-glca-(β1,3)}n+1-d-galnac4s6s-ol，其中n＝1、2、3、4和5，也就是说，化合物a1-a5分别是六糖、九糖、十二糖、十五糖和十八糖，其结构式为：
其a1中，n＝1；a2中，n＝2；a3中，n＝3；a4中，n＝4；a5中，n＝5。
表1.化合物a1的1h/13cnmr信号归属及耦合常数(ppm,hz)
注：ra表示还原端d-galnac-ol；du和df表示δua和连接于δua的l-fuc。
表2.化合物a2的1h/13cnmr信号归属(ppm,hz)
注：表中ra、ru和rf分别表示还原端的galnac-ol、近还原端的d-glca和l-fuc糖基；du、da和df分别表示δua、与δua相连的d-galnac以及连接δua的l-fuc。
【实施例2】化合物b1、b2、b3、b4和b5的制备：l-3,4-二硫酸岩藻糖基-(α1,3)-l-4-脱氧-threo-己-4-烯吡喃糖醛酸基-(α1,3)-{d-n-乙酰基-2-脱氧-2-氨基-4,6-二硫酸半乳糖基-(β1,4)-[l-3,4-二硫酸化岩藻糖基-(α1,3)-]d-葡萄糖醛酸基-(β1,3)}n-d-n-乙酰基-2-脱氧-2-氨基-4,6-二硫酸化半乳糖-[l-3,4-二硫酸化岩藻糖基-(α1,3)-]-d-葡萄糖醛酸醇(n＝0、1、2、3和4，五糖、八糖、十一糖、十四糖和十七糖)。
2.1材料
hsfg，holothuriafuscopunctata(象牙参)来源的天然fg(钠盐)；其按文献方法(zhaolyetal.,pnas,2015,112:8284-8289),纯度98％(hpgpc法)，重均分子量(mw)约50kda。
苄索氯铵、氯化苄、dmf、氢氧化钠、硼氢化钠、氯化钠和乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。
sephadexg10/g25，medium(50-100μm)，gehealthcare；bio-gelp-12gel,fine(45-90μm),bio-rad；bio-gelp-10gel，medium(90-180μm)，bio-rad；1200/1260系列hplc色谱仪，安捷伦。
2.2方法
(1)hsfg的季铵盐转化：取3.5ghsfg，同实施例1之1.2(1)所述方法处理获得hsfg季铵盐10.3g。
(2)hsfg的羧基酯化：同实施例1之1.2(2)所述方法处理hsfg季铵盐获得hsfg羧酸酯，取样检测1hnmr，计算所得产物的羧基酯化程度为约44％；
(3)hsfg的β-消除解聚与末端去皮反应：向步骤(2)所得反应液中加入新配制的16.7ml0.08m的乙醇钠乙醇溶液，室温下搅拌反应30min后，加入2.5ml2mnaoh溶液并在60℃下搅拌反应30min。
(4)解聚产物的钠盐转换、羧酸酯基水解与末端还原：向步骤(3)所述反应液中顺次加入67ml饱和nacl溶液，536ml无水乙醇，4000rpm×10min离心；所得沉淀溶解于120ml水中，加6mnaoh溶液1.0ml，室温下搅拌反应30min；加入nabh4至终浓度约0.1m，室温下搅拌反应30min，然后滴加6mhcl使反应液中和(ph～7.0)。反应液以0.45μm滤膜过滤，滤过液经30kda超滤膜包超滤；超滤液浓缩后采用g25凝胶柱层析脱盐并冻干，由此获得解聚产物dhsfg1.53g(得率43.7％)。
(5)化合物b1～b5分离纯化：将步骤(4)所述1gdhsfg溶于10ml0.2mnacl，上样于bio-gelp-10凝胶柱(
(6)波谱分析：同实施例1之1.2(6)所述方法，采用brukerdrx800mhz核磁共振仪检测1h-/13c-及2d-nmr，采用microtof-qiiesi-ms(bruker,germany)质谱仪分析esi-q-tofms。检测数据采用brukercompassdata-analysis4.0(bruker-daltonics,germany)软件进行分析。
2.3结果
(1)按所述方法获得化合物b154mg、b2177mg、b3154mg、b486mg、b557mg，hpgpc法检测其纯度均>99％。
(2)化合物b1～b5结构解析：寡糖化合物b1的1hnmr谱图如附图6所示；化合物b2的13cnmr谱图及归属如附图7所示；化合物b3的13c-1hhsqc谱图及归属如附图8所示；化合物b2的q-tofms谱图及归属如附图9所示；化合物b1～b2的1h/13cnmr信号归属分别见表3和4。
结合1h-/13c-/2d-nmr及q-tofms分析，化合物b1～b5的化学结构为l-fuc3s4s-(α1,3)-l-δua-(α1,3)-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc3s4s-(α1,3)]-d-glca-(β1,3)}n-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc3s4s-(α1,3)]-d-glca-ol(其中n＝0、1、2、3和4)。也就是说，化合物b1～b5分别是五糖、八糖、十一糖、十四糖和十七糖。其化学结构式为：
其b1中，n＝0；b2中，n＝1；b3中，n＝2；b4中，n＝3；b5中，n＝4。
表3.化合物b1的1h/13cnmr信号归属及耦合常数(ppm,hz)
注：表中ru、du分别为还原端的d-glca-ol和非还原端的δua；rf、df分别为连接于还原端d-glca-ol和δua的l-fuc糖基。a为d-galnac。
表4.化合物b2的1h-/13c-nmr信号归属(ppm,hz)
注：表中ra表示近还原端的galnac，表中ru、du分别为还原端的d-glca-ol和非还原端的δua；rf、df分别为连接于还原端d-glca-ol和δua的l-fuc糖基。
【实施例3】化合物b6、b7、b8的制备：l-3,4-二硫酸岩藻糖基-(α1,3)-l-4-脱氧-threo-己-4-烯吡喃糖醛酸基-(α1,3)-{d-n-乙酰基-2-脱氧-2-氨基-4,6-二硫酸半乳糖基-(β1,4)-[l-3,4-二硫酸化岩藻糖基-(α1,3)-]d-葡萄糖醛酸基-(β1,3)}n-d-n-乙酰基-2-脱氧-2-氨基-4,6-二硫酸化半乳糖-(β1,4)-[l-3,4-二硫酸化岩藻糖基-(α1,3)-]-d-葡萄糖醛酸(n＝0、1和2)。
3.1材料：
hsfg，holothuriafuscopunctata(象牙参)来源的fg钠盐，来源同实施例2之2.1所述。
苄索氯铵、氯化苄、dmf、氢氧化钠、氯化钠和乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。
3.2方法：
(1)hsfg的季铵盐转化：同实施例2之2.2(1)所述方法，以3.5ghsfg制备获得hsfg季铵盐9.55g。
(2)hsfg的羧基酯化：同实施例2之2.2(2)所述方法制备获得羧基酯化hsfg，1hnmr检测其羧基酯化程度为约44％；
(3)hsfg的β-消除解聚：向步骤(2)所得反应液中加入新配制的0.08m的乙醇钠-乙醇溶液16.0ml，室温下搅拌反应30min。
(4)解聚产物的钠盐转换与羧酸酯基水解：向步骤(3)所得反应液中加入饱和氯化钠溶液67ml和入无水乙醇536ml，4000rpm×10min离心；所得沉淀溶解水(125ml)后，加1.05ml6mnaoh溶液，室温下搅拌反应30min后，滴加6mhcl使之中和(ph～7.0)。反应液以0.45μm滤膜过滤，滤过液再经30kda的超滤膜包超滤，超滤液经g25凝胶柱层析脱盐并冻干，获得解聚产物dhsfg’1.623g(得率46.4％)。
(5)化合物b6～b8分离纯化：取1g解聚产物dhsfg’以10ml0.2mnacl溶解后上样于bio-gelp-10凝胶柱(
(6)波谱分析：同实施例1之1.2(6)所述方法，采用brukerdrx800mhz核磁仪检测1h-/13c-及2d-nmr，microtof-qiiesi-ms(bruker,germany)质谱仪分析q-tofms。检测数据采用brukercompassdata-analysis4.0(bruker-daltonics,germany)软件进行分析。
3.3结果
(1)按3.2所述步骤处理，获得化合物b647mg、b755mg、b835mg，hpgpc法检测其纯度均>99％(面积归一化法计算)。
(2)化合物b6～b8结构解析：化合物b6～b8的hpgpc图谱如附图10所示。结合1h-/13c-/2d-nmr及q-tofms分析，化合物b6、b7和b8为l-fuc3s4s-(α1,3)-l-δua-(α1,3)-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc3s4s-(α1,3)]-d-glca-(β1,4)}n-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc3s4s-(α1,3)]-d-glca(其中n＝0、1和2,即五糖、八糖和十一糖)。其化学结构式为：
其b6中，n＝0；b7中，n＝1；b8中，n＝2。
【实施例4】化合物a6、a7和a8的制备：l-fuc2s4s-(α1,3)-[6-me-δua-(α1,3)]-{d-gal-nac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)-]-d-6-me-glca-(β1,4)}2-d-galnac4s6s-ol、l-fuc2s4s-(α1,3)-l-δua-(α1,3)-{d-galns4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)-]-d-glca-(β1,3)}2-d-galns4s6s-ol和l-fuc2s4s-(α1,3)-[6-me-δua-(α1,3)]-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)-]-d-6-methyl-glca-(β1,3)}2-d-1-me-galnac4s6s-ol
4.1材料
化合物a2，其制备方法和化学结构如实施例1所述。
硫酸肼、水合肼、et3n.so3([et3n-so3h]cl,n,n-diethyl-n-sulfoethanammoniumchloride)均为市售分析纯试剂。
4.2方法与结果
(1)化合物a6的制备：取化合物10mga2溶于0.5ml水中，经dowex50x8氢型阳离子交换树脂柱转换为h+型，洗脱液用四丁基氢氧化铵中和后冻干，得a2四丁基铵盐19mg。将所得a2四丁基铵盐溶于1ml二甲基亚砜(dmso)，加入15μl2m三甲基硅重氮甲烷(tmsd)，室温下反应60min后，加入15μl乙酸去除剩余的tmsd，4℃下加无水乙醇4ml，4000rpm×30min离心，沉淀加1ml水溶，经dowex/r50w×850-100(na+型)交换树脂转化为钠型。所得产物以sephadexg-10柱脱盐并冻干得a68.35mg。同实施例1之1.2(6)所述方法检测1h-/13c-和2d-nmr确认化合物a6(δua上的甲酯基信号位于3.70ppm处)的结构为l-fuc2s4s-(α1,3)-[6-methyl-δua-(α1,3)]-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)-]-d-6-methyl-glca-(β1,4)}2-d-galnac4s6s-ol，其结构式为：
(2)化合物a7的制备：取化合物a210mg，加入2.5mg硫酸肼和0.25ml水合肼，氮气保护下，105℃下搅拌反应15h；向反应液中加入0.5ml16％nacl溶液和3ml无水乙醇，4000rpm×20min离心，所得沉淀以10ml水溶后以500-1000da透析袋透析，截留液冻干得脱乙酰化产物8mg。以实施例1之1.2(6)所述方法检测nmr图谱确认脱乙酰化产物(2.0ppm处的ac甲基信号消失，galnh2的2位h信号出现在3.0ppm处)的化学结构为：
将a2脱乙酰化产物溶于1ml水，加入36mgna2co3并加热至55℃，分别于开始反应后的0、5和10h加入et3n.so315mg，55℃下搅拌反应15h，然后向反应溶液中加入1ml16％nacl溶液和8ml无水乙醇，4000rpm×20min离心；收集沉淀以10ml水溶，然后以500-1000da的透析袋透析，透析截留液经冻干得n-硫酸化产物a76.8mg。
同实施例1之1.2(6)所述方法检测1h-/13c-和2d-nmr确认化合物a7的化学结构为l-fuc2s4s-(α1,3)-l-δua-(α1,3)-{d-galns4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)-]-d-glca-(β1,3)}2-d-gal-ns4s6s-ol，其结构式为：
(3)化合物a8的制备：取20mg化合物a2以dowex50x8氢型阳离子交换树脂为催化剂，加入5ml甲醇溶液，氮气保护下加热回流过夜，过滤除去树脂，滤液旋蒸以除去溶剂，得a2的c1位羟基烷基化产物，该产物经dowex50x8阳离子交换树脂柱转换为h+型，洗脱液用四丁基氢氧化铵中和后冻干，得a2的c1位羟基烷基化产物的四丁基铵盐37mg。所得产物以2mldmso溶解，再加入30μl2mtmsd，室温下反应60min后加入30μl乙酸去除剩余的tmsd，4℃下加入2ml16％nacl溶液和8ml无水乙醇，4000rpm×30min离心，所得沉淀以2ml水溶，经dowex/r50w×850-100(na+型)交换树脂柱转化为钠型。所得产物以sephadexg-10柱脱盐并冻干得a813.5mg。
同实施例1之1.2(6)所述方法检测1h-/13c-和2d-nmr确认化合物a8(δua甲酯的甲基信号位于3.70ppm，还原端甲基信号位于3.23ppm)的结构为l-fuc2s4s-(α1,3)-[6-methyl-δua-(α1,3)]-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)-]-d-6-methyl-glca-(β1,3)}2-d-1-methyl-gal-nac4s6s-ol，其结构式为：
类似地，亦可选择c2-c6的直链或支链烷烃或烯烃相应的醇，按照本实施例的方法，制备获得相应的羟基烷基化产物a8’
【实施例5】化合物b9、b10和b11的制备：l-fuc2s4s-(α1,3)-l-δua-(α1,3)-d-gal-nac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-glca-(β1,3)-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-β1-bn-glca、l-fuc2s4s-(α1,3)-l-6-me-δua-(α1,3)-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-6-me-δua-glca-(β1,3)-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-β1-bnz-6-me-glca和l-fuc2s4s-(α1,3)-l-δua-(α1,3)-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-glca-(β1,3)}2-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-1-deoxy-1-amino-glca-ol-n-4-benzoicethylester
5.1材料
以svfg为原料按照实施例2所述制备十一糖(b3’)，按照实施例3所述制备八糖(b7’)。
4-氨基苯甲酸乙酯、四丁基氢氧化铵、二氯甲烷、吡啶、乙酸酐、苯甲醇、三氟化硼乙醚等均为市售分析纯试剂。
5.2方法与结果
(1)化合物b9的制备取40mg化合物b7’溶于4ml水中，经dowex50x8氢型阳离子交换树脂柱转换为h+型，洗脱液用四丁基氢氧化铵中和后冻干，得b7’四丁基铵盐80mg。取所得b7’四丁基铵盐，加入8ml吡啶和8ml乙酸酐，在100℃下搅拌反应30min，室温下用氮气吹干，将残留物溶于4ml二氯甲烷，加入128μl苯甲醇，在0℃下滴加三氟化硼乙醚(bf3oet2)20μl，加热回流36h，加水终止反应，振荡静置后取ch2cl2层并挥干ch2cl2；室温下向残留物中加入4ml0.02m甲醇钠-甲醇溶液，搅拌反应10min脱去乙酰基；挥干甲醇后，经dowex50x8氢型阳离子交换树脂柱转换为h+型，洗脱液用氢氧化钠中和，经bio-gelp6分离纯化，合并含糖样品，浓缩以sephadexg-10柱脱盐并冻干，得到化合物b924mg。
同实施例1之1.2(6)所述方法检测1h-/13c-和2d-nmr确认化合物b9(苄基-ch2信号位于4.6ppm，苯环信号位于7.3ppm)的结构为l-fuc2s4s-(α1,3)-l-δua-(α1,3)-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-glca-(β1,3)-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-1-benzyl-glca-ol，其结构式为：
(2)化合物b10的制备：取化合物b910mg溶于0.5ml水中，经dowex50x8氢型阳离子交换树脂柱转换为h+型，洗脱液用四丁基氢氧化铵中和后冻干，得b9四丁基铵盐19mg。将所得b9四丁基铵盐溶于1ml二甲基亚砜(dmso)，加入15μl2m三甲基硅重氮甲烷(tmsd)，室温下反应60min后，加入15μl乙酸去除剩余的tmsd，4℃下加无水乙醇4ml，4000rpm×30min离心，沉淀加1ml水溶，经dowex/r50w×850-100(na+型)交换树脂转化为钠型。所得产物以bio-gelp-6纯化，以sephadexg-10柱脱盐并冻干得b108.35mg。
同实施例1之1.2(6)所述方法检测1h-/13c-和2d-nmr确认化合物b10(羧基酯甲基信号位于约3.7ppm，苄基-ch2信号位于4.6ppm，苯环信号位于7.3ppm)的结构为l-fuc2s4s-(α1,3)-l-6-methyl-δua-(α1,3)-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-6-methyl-δua-glca-(β1,3)-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-β-1-benzyl-6-methyl-glca，其结构式为：
(3)化合物b11的制备取4-氨基苯甲酸乙酯330mg溶于80μl冰醋酸与甲醇的混合溶液中(1:9)，另加入氰基硼氢化钠70mg溶解，化合物b3’20mg溶于2ml水，与该混合溶液，60℃恒温水浴中反应4h，加2ml氯仿萃取，水相经bio-gelp10柱层析纯化，经sephadexg-10柱脱盐并冻干即得化合物b11约14mg。
同实施例1之1.2(6)所述方法检测1h-/13c-和2d-nmr确认化合物b11(乙酯基的-ch3和-ch2信号分别位于1.3ppm和4.3ppm，苯环信号分为两组，分别位于6.78ppm和7.68ppm)的结构为l-fuc2s4s-(α1,3)-l-δua-(α1,3)-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-glca-(β1,3)}2-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-1-deoxy-1-amino-glca-ol-n-4-benzoicethylester，其结构式为：
类似地，把苯甲醇换成相应的c8-c12芳烃醇(例如对甲基苯甲醇、对戊基苯甲醇)，按照本实施例b9的制备方法，得到具有对应c8-c12芳烃基的系列衍生物b9’；把4-氨基苯甲酸乙酯换成4-氨基-(c8-c12)芳烃甲酸酯(例如4-氨基-苯甲酸丙酯、4-氨基-苯甲酸戊酯)，按照本实施例b11的制备方法，得到具有对应c8-c12芳烃基的系列衍生物b11’。
【实施例6】寡糖混合物c1的制备
6.1材料
svfg，来源同实施例1所述。
苄索氯铵、氯化苄、dmf、氢氧化钠、硼氢化钠、氯化钠和乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。sephadexg-50(medium,50-100μm),gehealthcare产品。
6.2方法
(1)svfg的季铵盐转化：取svfg70g溶于1l水；另取苄索氯铵175g溶于2.8l水。搅拌下用苄索氯铵溶液滴定svfg溶液，滴定完成后，离心，沉淀用去离子水洗涤三次后真空干燥得svfg季铵盐210g。
(2)svfg的羧基酯化：将步骤(1)所得svfg季铵盐溶于1.020ldmf，加29ml氯化苄，35℃下搅拌反应24h后，静置使反应液降至室温(25℃)，取样检测1hnmr谱图并计算fg的羧基酯化程度为约46％；
(3)还原剂存在下的svfg的β-消除解聚：向步骤(2)所述反应液中加入333ml含0.4mnabh4的新配制的0.08m的乙醇钠乙醇溶液，室温下搅拌反应30min。
(4)后处理：向步骤(3)所得反应溶液中加入1.333l饱和氯化钠溶液和10.7l无水乙醇，4000rpm×10min离心，所得沉淀溶于5l水并加入40ml6mnaoh溶液，室温下反应30min后，滴加6mhcl中和反应液(ph～7.0)。所得产物顺次经0.1m2的10kda和3kda的超滤膜包(millipore)超滤以去除大分子及小分子杂质，获得寡糖混合物c135g。
(5)波谱分析：实施例1之1.2(6)所述方法检测1h-/13c-/2dnmr谱图。
6.3结果
(1)按所述方法获得寡糖混合物c135g，得率50％；
(2)hpgpc分析显示，c1中含六糖、九糖、十二糖、十五糖、十八糖和二十一糖分别为14.2％、23.1％、24.1％、16.0％、8.9％、5.1％。
(3)寡糖混合物c1的13cnmr谱图及归属如附图11所示。寡糖混合物c1的1hnmr中，5.4～5.7ppm范围内可见三组较强的信号峰，其中位于5.77ppm的信号峰是位于寡糖混合物c1的非还原端δua的4位h信号。位于5.6ppm和5.43ppm处的信号分别是近还原端糖链内l-fuc2s4s的端基氢信号以及连接于非还原端δua的l-fuc2s4s的端基氢信号。
经对还原性末端的信号分析，特别是-d-galnac4s6s-ol与-d-glca-ol的c1位(-ch2)的碳信号分析，还原端结构为-d-galnac4s6s-ol的寡糖化合物的含量大于95％。
结合13c-nmr及2d-nmr分析，c1是由结构为l-fuc2s4s-(α1,3)-l-δua-(α1,3)-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc2s4s-(α1,3)]-d-glca-(β1,3)}n-d-galnac4s6s-ol(n为自然数)的同系寡糖化合物组成，其中n为1～7的化合物含量之和约为95％。
【实施例7】寡糖混合物d1和d2的制备
7.1材料
hsfg，其来源如实施例2所述。
苄索氯铵、氯化苄、dmf、dmso、tmsd、氢氧化钠、硼氢化钠、氯化钠和乙醇等所用试剂均为市售分析纯试剂。截留分子量为30kda、10kda、3kda的超滤膜包(0.5m2)，merkmillipore。
7.2方法
(1)hsfg的季铵盐转化：取330ghsfg加4.9l水溶解；另取825g苄索氯铵加13.2l水溶解，所得溶液在搅拌下加入到hsfg溶液中，4000rpm离心10min，沉淀用9l去离子水洗涤三遍，真空干燥得hsfg季铵盐804g。
(2)hsfg的羧基酯化：将步骤(1)所得hsfg季铵盐置于30l反应釜中，加3.9ldmf溶解。35℃下，加入97ml氯化苄，搅拌反应24h后，静置使反应液降至室温(25℃)。取样检测1hnmr并计算产物的羧基酯化程度为约46％；
(3)hsfg的β-消除解聚与末端去皮反应：向步骤(2)所述反应液中加入1.3l新配制的0.08m乙醇钠-乙醇溶液，室温下搅拌反应30min后，向反应液中加入2.5ml2mnaoh溶液并在60℃下搅拌反应90min。
(4)后处理：向步骤(3)所述反应溶液中加入5.36l饱和氯化钠溶液和57l无水乙醇，4000rpm×10min离心，所得沉淀溶解于14.5l水中，加入122ml6m的naoh溶液，室温下搅拌反应30min，然后加入54.3gnabh4，室温下继续搅拌反应30min；滴加6mhcl中和反应液(ph～7.0)。所得反应液以0.45μm滤膜过滤，过滤液依次使用0.5m2的30kda(取透过液)、10kda(取透过液)以及3kda(取截留液)超滤膜包(密理博产品)超滤并冻干，由此获得寡糖混合物d1(98.7g)。[注：经检测，30kda超滤膜超滤所得截留液中所含未解聚的大分子组分中含有岩藻聚糖和含氨基己糖的杂多糖]
(5)d1羧基甲酯化：取寡糖混合物d120g溶于300ml水中，搅拌下加入800ml6.25％苄索氯铵溶液，静置后4000rpm×10min离心，沉淀用300ml去离子水洗涤三遍后真空干燥，得d1季铵盐58g。将所得d1季铵盐溶于5.8ldmso中，加入87ml2mtmsd，室温下搅拌中反应60min后加入87ml乙酸以去除剩余的tmsd；搅拌中顺次加入5.9l饱和氯化钠溶液和63l95％乙醇，4000rpm×30min离心，所得沉淀溶解于2l去离子水中，经3kda超滤膜包超滤脱盐，截留液冻干得d2(16.3g)。
(6)波谱分析：同实施例1之1.2(6)所述方法检测1h-/13c-及2d-nmr。
7.3结果
(1)寡糖混合物d1得率与化学组成分析
按所述方法获得寡糖混合物d198.7g，得率约为30％；
hpgpc分析(附图12)显示d1中含五糖、八糖、十一糖、十四糖、十七糖、二十糖分别为4.3％、17.1％、18.0％、16.3％、14.1％、11.1％。五糖～二十九糖的总含量为约96.0％。
寡糖混合物d1的13c-nmr谱图如附图13所示。d1的1h-nmr中，5.685ppm处有较强信号，此为δua的4位氢。5.0～5.6ppm呈现三组较强的信号峰(5.283,5.201和5.030ppm)，其分别为连接于d-glca、δua和d-glca-ol的l-fuc3s4s的α-端基氢信号。通过对还原端糖基的端基碳氢信号分析，d1中还原端糖基为-d-glca-ol的寡糖化合物含量大于95％。
结合13c-及2d-nmr分析可见，混合物d1是由结构为l-fuc3s4s-(α1,3)-l-δu-(α1,3)-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc3s4s-(α1,3)]-d-glca-(β1,3)}n-d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc3s4s-(α1,3)]-d-glca-ol(n为自然数)的同系寡糖化合物的混合物。
(2)寡糖混合物d2得率与化学组成分析
按所述方法获得寡糖混合物d216.3g，得率约为80％；
hpgpc分析显示其中含五糖、八糖、十一糖、十四糖、十七糖、二十糖分别为3.34％、16.71％、17.03％、17.25％、13.78％、12.25％；
与d1的1hnmr谱图相比，d2的1hnmr中新增了连接于己糖醛酸(醇)的甲(酯)基信号，分别位于3.7ppm和3.2ppm。结合1h-/13c-及2d-nmr分析可见，混合物d2是由结构为l-fuc3s4s-(α1,3)-l-6-me-δua-(α1,3)-{d-galnac4s6s-(β1,4)-[l-fuc3s4s-(α1,3)]-d-6-me-glca-(β1,4)}n-d-galnac4s6s-(α1,3)-[l-fuc3s4s-(α1,3)]-d-6-me-glca-ol(n为自然数)的同系寡糖化合物的混合物。其中，n＝1～9的化合物含量之和约为96％。
【实施例8】抗凝及凝血因子抑制活性分析
8.1材料
样品：寡糖化合物a1～a8、b1～b11、寡糖混合物c1、d1、d2，按实施例1～7所述方法制备。
对照品：依诺肝素钠注射液(lmwh,mw3500～5500da,赛诺菲-安万特产品)；
试剂：凝血质控血浆(047b-d024a)、活化部分凝血活酶时间(aptt)、凝血酶原时间(pt)测定试剂盒，均为德国tecogmbh公司产品；因子viii检测试剂盒、肝素辅因子ii(hcii)、at依赖的抗因子iia检测试剂盒、at依赖的抗因子xa检测试剂盒、凝血酶(因子iia)、凝血酶底物cs01(38)、kk底物cs31(02)均为hyphenbiomed公司(法国)产品；因子viii(fviii)，bayerhealthcarellc公司(德国)产品；adp，chronolog公司(美国)产品；枸橼酸钠、水合氯醛、生理盐水，均为市售试剂。
仪器：xs105电子天平、fe20ph计，mettlertoledo产品；hh-4恒温水浴锅，巩义市予华产品；vor76x-6旋涡振荡器，海南其林贝尔产品；spectrafuge-24d907386离心机，labnet产品；mc-4000血凝仪，ticogmbh公司(德国)产品；microplaterederelx808酶标仪，bio-tek公司产品；chronolog-700型血小板聚集仪，chrono-log公司(美国)产品。
8.2方法
(1)样品溶液配制：寡糖化合物a1～a8、b1～b11和寡糖混合物c1、d1、d2均以tris-hcl缓冲液溶解并稀释到所需的系列溶度。
(2)抗凝活性检测：90μl人质控血浆加入样品或10μl对照品溶液混均后，按照aptt和pt试剂盒说明书所述方法，以mc-4000血凝仪检测凝血时间(aptt和pt)。
(3)凝血因子抑制活性分析：
xase抑制活性分析：联用因子viii及因子viii检测试剂盒，参考试剂盒说明书和文献方法进行检测。具体地说，96孔板中，各孔分别加入30μl受试品溶液、对照品溶液或tris-hcl缓冲液(阴性对照)后，顺次加入30μlfviii(2iu/ml)，30μlr2(60nmfixa，含fiia、pc/ps、ca2+)，振板混合，37℃孵育2min；然后加入30μlr1(50nmfx，含直接凝血酶抑制剂)，振板混合，37℃孵育1min；再加入30μlr3(fxa生色底物sxa-11，约8.4mm)，酶标仪检测405nm处吸光值(od405)，以30s为间隔连续检测7.5min。根据od405变化值计算xase活性以及受试样品抑制xase的ic50值。
at依赖的xa抑制活性分析：采用肝素anti-fxa试剂盒检测。96孔板中加入30μl样品、对照品溶液或tris-hcl缓冲液(阴性对照)后，加入30μl1iu/mlat溶液，混匀并在37℃下孵育1min，再加入30μl8μg/mlfxa溶液，混匀并在37℃下孵育1min，最后加入预热的30μl1.25mmxa生色底物sxa-11，酶标仪检测od405。
at依赖的iia抑制活性分析：采用肝素anti-fiia试剂盒检测。96孔板中加入30μl样品、对照品溶液或tris-hcl缓冲液(阴性对照)后，加入30μl1iu/mlat溶液，振板混匀在37℃下孵育2min；加入30μl24iu/mlfiia溶液，振板混匀在37℃下孵育2min后，加入预热的30μl1.25mmfiia特异性生色底物cs-01(38)，振板混匀，酶标仪检测od405并计算各样品抑制iia的ic50值。
hc-ii依赖的iia抑制活性分析：加入30μl样品、对照品溶液或tris-hcl缓冲液(阴性对照)后，加30μl1μmhcii溶液，37℃下孵育2min；再加入30μl20nih/mlfiia，37℃下孵育1min；最后加入预热的30μl4.5mmfiia生色底物cs-01(38)，酶标仪检测od405并计算各样品抑制fiia的ic50值。
数据处理：取复孔检测的od405均值作为各浓度受试品和对照品的检测值，以检测值对时间值的线性拟合的斜率(吸光值的变化率od405/min)表示凝血因子的酶活性；以阴性对照孔的凝血因子活性为100％，计算受试样品存在下的凝血因子活性(百分比)；以受试样品存在下的凝血因子活性对受试样品浓度作图，并按下式进行拟合，计算ic50值：
b＝(ic50)n/{(ic50)n+[i]n}
式中，b为受试样品存在下的凝血因子活性(百分比)，[i]为受试样品浓度，ic50为半数抑制浓度(抑制50％活性所需受试样品浓度)，n为hill系数。
(4)表面激活及血小板活性影响：
fxii激活活性检测：96孔板中分别加入30μl系列浓度样品及对照品溶液，再加入用含0.15mnacl的0.02mtris-hcl(ph7.4)缓冲液稀释4倍的人标准血浆30μl，37℃孵育2min后，加入30μl6mmkallikrein生色底物cs-31(02)，酶标仪检测od405值。
血小板激活活性检测：采集健康志愿者抗凝血制备富血小板血浆(prp)和贫血小板血浆(ppp)，chronolog-700型血小板聚集仪、比浊法检测生理盐水溶解配制的系列浓度受试样品溶液的血小板诱导聚集活性。
8.3结果
(1)抗凝及凝血因子抑制活性：结果如表5所示。本发明所述寡糖化合物及其混合物具有显著的延长aptt活性，而不影响pt、tt，说明其可具有显著的抑制内源性凝血途径的抗凝血活性，而对外源性凝血无显著影响。本发明所述寡糖化合物及其混合物对因子xase有显著的抑制活性；在有或无抗凝血酶(at)存在下，对凝血因子iia、xa、xiia等凝血因子无显著影响，但可存在一定强度的肝素辅因子ii(hc-ii)依赖的iia抑制活性。
选择c2-c6的直链或支链烷烃或烯烃相应的醇按照实施例4，制备获得相应的羟基烷基化产物a8’。对这些系列衍生物活性进行研究发现，它们具有与a8类似的活性，即是具有延长aptt活性(倍增aptt凝血时间的药物浓度为7.0-10μg/ml)，而不影响pt、tt；对因子xase有显著的选择性抑制活性(ic50,50-100ng/ml)，对凝血因子iia、xa、xiia等凝血因子无显著影响，具有一定强度的肝素辅因子ii(hc-ii)依赖的iia抑制活性。
按照本实施例b9的制备方法，得到具有对应c8-c12芳烃基的系列衍生物b9’，按照本实施例b11的制备方法，得到具有对应c8-c12芳烃基的系列衍生物b11’。它们分别具有与b9和b11类似的活性，倍增aptt凝血时间的药物浓度为6.0-9μg/ml，而不影响pt、tt；对因子xase有显著的选择性抑制活性(ic50,40-110ng/ml)，具有一定强度的肝素辅因子ii(hc-ii)依赖的iia抑制活性。
表5.寡糖化合物及寡糖混合物的抗凝以及凝血因子抑制活性
注：#,>128μg/ml；##,>5000ng/ml
(2)表面激活与血小板活性影响：
xii激活活性分析：在不高于100μg/ml浓度范围内，全部寡糖化合物和寡糖混合物均无显著的xii激活活性；
血小板激活活性分析：在不高于50μg/ml浓度范围内，全部寡糖化合物和寡糖混合物均无显著的血小板激活活性；
【实施例9】抗血栓活性与出血影响
9.1材料
a2的制备如实施例1所示、d1的制备如实施例7所示。
对照品：低分子肝素(lmwh)，sanofi-aventis公司(法国)产品，批号4sh69。
试剂：水合氯醛(水合三氯乙醛)，国药集团化学试剂有限公司；生理盐水，昆明南疆制药有限公司。
实验动物：sd大鼠，250～350g体重，雄性，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证编号scxk(湘)2011-0003；新西兰兔由昆明医科大学提供，scxk(滇)2011-0004，用于制作兔脑粉浸出液。
9.2方法
9.2.1抗静脉血栓形成实验
分组与给药：大鼠随机分为8组，每组8只。实验分组及各组动物的给药剂量为，(1)生理盐水(ns)对照组；(2)lmwh4.0mg/kg组；(3)a22.5mg/kg组；(4)a2组5.0mg/kg；(5)a210mg/kg组；(6)d12.5mg/kg组；(7)d15.0mg/kg组；(8)d110mg/kg组。各组大鼠经背部皮下注射(sc.)给药，给药体积均为1ml/kg。给药1h后进行造模实验。
兔脑粉浸出液制备：新西兰兔处死后，立即取出兔脑，按文献方法(thrombhaemost,2010,103(5):994-1004)制备兔脑粉浸出液，-20℃下储存备用。
兔脑粉浸出液诱导下腔静脉血栓形成：大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉(300mg/kg)，沿腹中线纵向剪开腹壁，移开内脏，分离下腔静脉及其分支，于下腔静脉的左肾静脉下缘穿过结扎线，结扎左肾静脉之下的下腔静脉分支。股静脉注射2％兔脑粉浸出液(1ml/kg)，20秒后，结扎左肾静脉下缘结扎线。术后将内脏放回腹腔，医用纱布(生理盐水浸润)覆盖，20min后，在结扎线下2cm处用止血钳夹闭血管，纵向剖开血管，取出血栓，测量血栓长度并称量血栓湿重，50℃干燥24h后称取干重。
数据处理与统计：应用spss软件整理、分析数据，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。不同组的数据正态性检验采用one-samplek-s检验，方差齐性检验采用levene检验，若数据符合正态分布，方差齐，则应用one-wayanova判断其显著性，反之则采用two-independent-samplestest判断其显著性。
9.2.2出血倾向检测
分组与给药：小鼠随机分为10组，每组8只。实验分组及各组动物的给药剂量为，(1)生理盐水(ns)对照组；(2)lmwh4.0mg/kg组；(2)lmwh20mg/kg组；(3)lmwh100mg/kg组；(4)a25mg/kg组；(5)a225mg/kg组；(6)a2125mg/kg组；(7)d15mg/kg组；(8)d125mg/kg组；(10)d1125mg/kg组。各组大鼠经背部皮下注射(sc.)给药，给药体积均为10ml/kg。
试验方法：各实验组皮下给药60min后，将小鼠置于小鼠固定器中，剪尾法剪去尾尖5mm，将鼠尾浸入盛有40ml纯净水(37℃)的烧杯中，从剪断鼠尾流出第1滴血起开始计时，并不停搅拌，60min时，取下烧杯放置60min后，紫外分光光度计检测溶液吸光度(od540)。
另取健康小鼠全血，以不同体积小鼠全血加入40ml纯净水中，搅拌均匀后静置60min，同法检测溶液吸光度(od540)并绘制体积-吸光度曲线作为计算出血量的标准曲线。以标准曲线计算各实验组小鼠的出血量。
数据处理与统计：应用spss软件整理、分析数据，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。不同组的数据正态性检验采用one-samplek-s检验，方差齐性检验采用levene检验，若数据符合正态分布，方差齐，则应用one-wayanova判断其显著性，反之则采用two-independent-samplestest判断其显著性。
9.3结果
(1)抗血栓活性：如附图14所示，结果表明，实验剂量下的a2和d1均具有显著的抗血栓活性，在5mg/kg～10mg/kg下，其血栓形成抑制率均可达到70％以上。
(2)出血倾向影响：如附图15所示，等效抗血栓剂量的等倍数高剂量给药下，a2和d1给药组的出血量均显著低于lmwh给药组。
【实施例10】a3药物组合物冻干粉针剂制备
10.1材料
化合物a3，按照实施例1所述方法制备的纯化十二糖化合物。
nacl，市售，药用级；无菌注射用水；2ml中硼硅玻璃管制注射用瓶，milliporepellicon2超滤系统(merkmillipore)，virtisultra35el冷冻干燥机。
10.2处方
10.3制备工艺
(1)工艺路线：称取2倍处方量的a3(40g)与nacl(8g)，加注射用水1.0l溶解，搅拌溶解完全后，采用millipore超滤装置以截留分子量为10kda超滤膜包除去热原。无菌环境下，0.22μm膜过滤除菌后，将所得溶液灌装于容量2ml的西林瓶，每瓶0.5ml，灌装过程监测装量，半压塞，置中试型冷冻干燥机(美国virtis)的干燥箱内，按设定的冻干过程进行冻干，压塞，出箱，轧盖，检验。
(2)冻干过程：
预冷：将样品进箱，降隔板温至-25℃，保持1h，降温至-45℃，保持3h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至40pa。
升华：1h匀速升温至-30℃，保持2h；2h匀速升温至-20℃，保持6h，真空保持40～30pa。
干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持30～20pa；0.5h升温至10℃，保持3h，真空保持30～20pa；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。
10.4结果
按所述制剂工艺制备获得a3冻干制剂合格品1960支，成品合格率约98％。经检查，其冻干饼外观规整；无菌、热源及不溶性微粒检查均合格；水分检测结果显示其含水量低于约3％，装量检测结果显示其装量均在计划装量的95～115％的范围内。
【实施例11】d1药物组合物冻干粉针剂制备
11.1材料
寡糖混合物d1，按照实施例7所述方法制备。
nacl，市售，药用级；无菌注射用水；2ml中硼硅玻璃管制注射用瓶，milliporepellicon2超滤系统(merkmillipore)；冻干机(lyo-20m2)，上海东富龙科技股份有限公司。
11.2处方
11.3制备工艺
(1)工艺过程：称取20倍处方量的d1(1000g)与nacl(180g)，加注射用水20l溶解，搅拌溶解完全后，采用millipore超滤装置以截留分子量为10kda超滤膜包除去热原。无菌环境下，0.22μm膜过滤除菌后，将所得溶液灌装于容量2ml的西林瓶，每瓶0.5ml，灌装过程监测装量，半压塞，置生产型冷冻干燥机(lyo-20m2,上海东富龙)的干燥箱内，按设定的冻干过程进行冻干，压塞，出箱，轧盖，经检验合格，得成品。
(2)冻干过程
预冷：样品进箱，降隔板温至-25℃，保持1h；降温至-45℃，保持3h；冷阱降至-50℃，开始抽真空至40pa。
升华：1h匀速升温至-30℃，保持2h；2h匀速升温至-20℃，保持6h，真空保持40～30pa。
干燥：2h升温至-5℃，保持2h，真空保持30～20pa；0.5h升温至10℃，保持3h，真空保持30～20pa；0.5h升温至40℃，保持4h，真空抽至最低。
11.4结果：
按所述制剂工艺制备获得d1冻干制剂合格品17,600支，成品合格率约88％。
外观/性状：本品为白色疏松块状物。
装量检查：重量法检查均符合规定。
无菌检查：取本品适量，依法检查(《中国药典》2015年版四部1101)。检查结果表明，本批次样品均符合注射剂质量要求。
热原检查：取本品，制成每1ml中含d13.5mg的溶液，依法(《中国药典》2015年版四部1142)检查，结果表明，本批次样品符合注射剂热原检查的质量要求。