CHO细胞表达牛传染性病气管炎病毒gD蛋白及其亚单位疫苗的制备和应用的制作方法

本发明涉及一种稳定高效分泌表达牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白的cho细胞系及牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白亚单位疫苗的制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。

背景技术：

牛传染性鼻气管炎(infectiousbovinerhinotracheitis，ibr)是由牛传染性鼻气管炎病毒(infectiousbovinerhinotracheitisvirus，ibrv)引起的一种急性、热性、接触性传染病，它以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征。该病毒还可引起母牛生殖系统损害，导致流产、死胎等，有时还会引发肠炎、小牛脑炎、眼结膜炎和角膜炎等。该病对奶牛的产奶量、牛群的肥育率及繁殖力均有较大的影响，并且急性的ibr呼吸道感染可继发牛致命性细菌性肺炎。该病于20世纪50年代初最早报道于美国，但目前在世界范围内流行。我国1980年首次从新西兰进口种牛中发现此病，目前在大部分省份的奶牛、黄牛和水牛均有ibrv感染。流行病学调查显示，我国14个养牛主要省份ibrv平均感染率为33.3％，给我过养牛业造成巨大的经济损失。

ibrv基因组由一个长独特区(ul,106kb)和一个短独特区(us,l0kb)及us区两侧的重复序列irs和trs组成，ibrv基因组为双股线性dna分子，约138kb。整个基因组编码33个结构蛋白和15个非结构蛋白，其中四个糖蛋白gb、gc、gd和ge是ibrv的主要抗原，而gd蛋白是病毒粒子表面和病毒感染细胞的主要分子，是ibrv的主要结构蛋白，同时也是ibrv复制的必需基因，是刺激机体产生中和抗体的主要糖蛋白，它不但能诱导体液免疫，也能诱导细胞免疫，因此gd是制备ibrv检测抗原和疫苗的首选基因。

cho细胞是1957年美国科罗拉多大学theodoret.puck博士从一成年雌性仓鼠卵巢中分离获得的，为上皮贴壁型细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。相对于其他的表达系统，cho细胞有如下优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养，且培养体积能达到1,000l以上，可以大规模生产。

cho细胞类型较多，如：dg44、dxb11、cho-k1和cho-s等。自20世纪80-90年代开始，工业上较早使用的是dhfr(二氢叶酸还原酶缺陷型)基因扩增筛选系统，宿主细胞株为dg44。当细胞培养基内含有甲氨蝶呤(methotrexate，mtx)时，二氢叶酸还原酶被抑制，再通过反馈调节，使得该基因进行扩增，且其上下游100-1,000kb范围内的基因都会随之扩增，因此将目的基因插入此位点范围内即可得到扩增。现在很多单抗生产的体系依然是dg44的dhfr体系。gs(谷氨酰胺合成酶)扩增系统，其以cho-k1为宿主细胞，是近些年发展的一种新型基因扩增筛选系统，它比dhfr系统有明显的优越性，目前在国际上得到了广泛的认可和使用。其原理是gs在atp水解提供能量的同时，利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺。在缺乏谷氨酰胺的培养基中加入gs抑制剂甲硫氨酸亚砜亚铵(l-methioninesulfoximine，msx)，可使gs基因及与之相连的目的基因得到有效扩增，从而达到提高目的基因表达水平的目的。该系统的优点主要：(1)不需要基因缺陷型的cho-k1细胞株作为宿主细胞；(2)cho-k1细胞更强壮，易于培养；(3)在培养基中无需加入谷氨酰胺，避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，且有效提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。

本发明成功构建并筛选了稳定高效分泌表达牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白的cho细胞株，克服了表达牛传染性鼻气管炎病毒gd囊膜糖蛋白对细胞毒性作用。该细胞株表达gd蛋白水平高、易于纯化、生产，并且低剂量的gd蛋白抗原能在牛体内诱导产生高水平的免疫反应。该细胞株表达抗原所制备的疫苗可为牛传染性鼻气管炎病毒的预防提供新型、高效的预防制剂，它将对我国乃至世界范围内牛传染性鼻气管炎病毒的预防控制发挥重要作用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种可大规模工业化生产的牛传染性鼻气管炎病毒的亚单位疫苗的制备方法和应用。

本发明提供了一种cho细胞分泌表达牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白及亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)将牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白基因克隆到真核表达载体中得到含有牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白编码基因的重组质粒；2)再将含有牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白编码基因的重组质粒转染至cho细胞中；3)通过培养、筛选、驯化2)中所述的cho细胞株得到高度表达的细胞株；4)发酵培养3)中所述的细胞株，纯化后得到重组牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白。

本发明的技术方案中，优选的，所述含有牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白编码基因的重组质粒是先将牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白编码基因进行密码子优化，然后克隆到真核表达载体中，得到重组质粒。

本发明的技术方案中，优选的，所述牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白编码基因如seqidno.1所示。

本发明的技术方案中，优选的，所述牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白为(a)或(b)的蛋白质：(a)由seqidno.2所示的氨基酸组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白抗原性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的技术方案中，所述含有牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白基因的真核表达载体可以为pee6.4、pee12.4、pgl4.13、pcdna3.1，优选的，真核载体为pee12.4。

本发明的技术方案中，所述cho细胞可以为dg44、dxb11、cho-k1、cho-s细胞株，优选的，所述高度表达的菌株为悬浮稳定高效表达牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白的cho-k1细胞株。

本发明的技术方案中，优选的，所述重组亚单位疫苗所用佐剂为isa201vg。

本发明的技术方案中，优选的，所述重组牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白与佐剂isa201vg按体积比46:54混合乳化。

本发明还提供了一种重组牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白和牛传染性鼻气管炎病毒重组亚单位疫苗在制备及相关诊断试剂中的应用。

本发明构建并筛选了悬浮稳定高效分泌表达牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白的cho细胞株，该细胞株表达gd蛋白产量高、易于纯化、易于大规模生产，且表达的牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白抗原能对牛免疫诱导产生良好的免疫反应；由该重组gd蛋白制备的亚单位疫苗具有以下优点：1.大规模生产、供量充足、质控容易；2.安全性高、免疫原性好；3.批次间稳定；4.生产成本低。

附图说明

图1表示pee12.4-opti-gd质粒图谱。图1为实施例2得到的质粒图谱，表示质粒的构建，通过ecori及hindiii两个酶切位点将优化后的ibrv-gd基因序列插入质粒pee12.4。

图2表示pee12.4-opti-gd双酶切鉴定结果：1是dnamarker：10kbladder；2-6均是pee12.4-opti-gd双酶切电泳结果。

图3表示摇瓶发酵单克隆细胞株ibrv-gd蛋白的表达水平：通过westernblotting检测摇瓶发酵不同单克隆细胞株培养上清蛋白的表达量，细胞株顺序分别为1e1、1g2、2a2、2c2、p，其中p是纯化后的蛋白(浓度为100ng/μl)，所有样品上样量均为5μl。

图4表示镍柱亲和层析纯化细胞株2a2、2c2表达的ibrv-gd蛋白的sds-page检测结果：m是marker。图4为实施例6所得的结果，表示利用高表达ibrv-gdcho-k1细胞株2a2、2c2发酵后产生的蛋白，镍柱亲和层析纯化后，通过sds-page检测蛋白的纯度及蛋白含量。

图5表示elisa检测重组牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白亚单位疫苗免疫后抗体效价结果。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明试剂及药品的来源列单如下：

cho-k1细胞来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库中国科学院上海生命科学研究所细胞库；

细胞培养基和血清均购自美国gibcom公司；

真核表达载体pee12.4购自上海林渊生物科技有限公司；

lipofectamineltx购自美国thermofisher公司；

甲硫氨酸亚砜亚铵((l-methioninesulfoximine，msx))购于sigma公司；

bca蛋白质定量试剂盒购自美国thermofisher公司；

isa201vg购自法国赛比克公司。

实施例1：牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白密码子优化及pee12.4-opti-gd重组质粒构建

通过对牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白核苷酸序列进行密码子优化，得到opti-gd序列，如seqidno.2所示，该工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例2：pee12.4-opti-gd重组质粒构建

2.1pcr扩增目的片段opti-gd

2.1.1pcr反应

(1)引物设计及合成

上游引物:5’-cggaagcttgccgccaccatgctgcctaccccagctccaag-3’

下游引物:5’-ggcgaattcttagtgatggtgatggtgatgt-3’

(2)加样体系50μl，如下表所示：

pcr扩增程序：

2.1.2pcr产物进行胶回收

(1)标记好样品收集ep管、吸附柱以及收集管；

(2)称取标记好的空的ep管重量，并记录数值；

(3)将单一的目的dna条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5ml离心管中；

(4)向步骤(3)中的1.5ml离心管中加入600μlpcbuffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(5)柱平衡：向吸附柱cb2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μl平衡液bl，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱cb2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱cb2放入收集管中；

(7)向吸附柱中加入600μl漂洗液pwbuffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2放入收集管中；

(8)重复步骤(7)；

(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；

(10)将吸附柱cb2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlelutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱cb2，盖上离心管盖子，保留离心管中的dna样品；

(12)将步骤11中的dna样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收dna片段。

2.2pcr产物及载体双酶切反应

(1)标记好需要用到的1.5mlep管，在1.5mlep管中按照下表进行加样、混匀：50μl反应体系

(2)将步骤(1)中的1.5mlep管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。

双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的dna片段，方法同1.2.1中pcr产物胶回收。

2.3连接反应

(1)准备洁净的1.5mlep管若干，做好标记，置于ep管架上待用。

(2)在1.5mlep管按照下表进行加样、混匀。

(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；

(4)取出步骤(3)中ep管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；

(5)取出步骤(4)中的ep管，置于4℃保存。

2.4转化反应

(1)将10μl连接反应液快速加入100μl感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；

(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；

(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μl液体lb培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；

(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μl上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；

(6)观察转化结果。

2.5质粒抽提与双酶切鉴定

2.5.1质粒抽提

(1)用10μl移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的lb液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；

(2)将菌液移至1.5mlep管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；

(3)向步骤(2)的ep管中加入250μl质粒提取试剂p1buffer，彻底悬浮菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μlp2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μlp3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(8)向吸附柱中心加入500μlbufferdw1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(9)向吸附柱中心加入500μlwashsolution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μlelutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中dna溶液。

2.5.2双酶切鉴定

(1)标记好需要用到的1.5mlep管，按照下表进行加样：20μl反应体系

(2)将步骤(1)中的ep管20μl反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。

(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图2。如图2所示，经双酶切后，插入片段的大小约为1000bp,与ibrv-gd实际长度相近。

(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。

2.6无内毒素质粒大提

2.6.1无内毒素质粒提取

(1)测序正确的克隆接种至100ml含氨苄抗性的培养基中，于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养15h；

(2)将步骤(1)中培养的菌液转移至50ml离心管中，室温8,000rpm/min、离心5min，收集菌体，弃掉上清培养基；

(3)向步骤(2)的离心管中加入8ml溶液p1，用移液器充分重悬菌体；

(4)向步骤(3)的离心管中加入8ml溶液p2，立即温和颠倒离心管6-8次，室温静置5min；

(5)向步骤(4)的离心管中加入8ml溶液p4，立即上下颠倒6-8次，充分混匀至溶液出现白色絮状沉淀，室温放置10min左右。8,000rpm/min室温离心5-10min，使白色沉淀离至管底；

(6)将步骤(5)中上清液全部小心移入过滤器cs1中，慢慢推柄过滤器，滤液收集在干净的50ml离心管中；

(7)柱平衡：向吸附柱cp6中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5ml的平衡液bl，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(8)向步骤(6)滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱cp6中。室温8,000rpm/min离心2min，倒掉收集管中液体，将吸附柱cp6重新放入同一个收集管中；

(9)向步骤(8)吸附柱cp6中加入10ml漂洗液pw，室温8,000rpm/min离心2min，弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(10)重复操作步骤(9)一次；

(11)向步骤(10)吸附柱cp6中加入3ml无水乙醇，室温8,000rpm/min离心2min，倒掉废液；

(12)将步骤(11)吸附柱cp6重新放回收集管中，室温8,000rpm/min离心5min。将吸附柱cp6开盖，置于室温放置数分钟晾干；

(13)将步骤(12)中吸附柱放入干净的50ml离心管中，在吸附膜中央加入1-2ml缓冲液tb，室温静置5min，室温8,000rpm/min离心2min，将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管，测浓度，-20℃保存。

(14)取1-2μl所得到的质粒dna溶液进行琼脂糖凝胶电泳并保存电泳结果数据。

实施例3：pee12.4-opti-gd重组质粒转染cho-k1细胞与单克隆筛选的建立

3.1cho-k1细胞转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；dmem/f12(含10％血清，1％双抗)、dmem/f12与pbs置于37℃水浴锅预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mlpbs洗细胞一次，并弃去pbs。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2ml0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mldmem/f12(含10％血清，1％双抗)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用dmem/f12(含10％血清，1％双抗)重新悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至2×10⁵个/ml，取2ml混匀的细胞加入到六孔板，六孔板放置到37℃，5％co2细胞培养箱中孵育过夜。

(8)取出步骤(7)细胞培养皿，观察细胞状态：当细胞交汇度达到80％-90％时即可开始转染，转染前将培养基换成无抗生素无血清的dmem/f12，2ml/孔。

(9)稀释质粒：用opti-mem稀释质粒，125μlopti-mem中加入2.5μg质粒，然后加入2.5μlplus，混匀，室温静置5min。

(10)稀释lipofectamineltx：125μlopti-mem中加入9μllipofectamineltx，然后加入2.5μlplus，轻轻混匀，室温静置5min。

(11)将步骤(10)和步骤(11)混合物轻轻混匀。室温放置5min，然后逐滴加入六孔板中均匀分布。

(12)将六孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养4-6h。

(13)换液：弃掉上清培养基，加入2mldmem/f12(含10％血清1％双抗)，将六孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。

3.2加压筛选

转染后24h开始加压：从37℃培养箱中取出六孔板细胞，弃去上清培养基，加入2mldmem/f12(含10％血清+25μmmsx)，加压7d，中间观察细胞，死细胞多换液。

3.3单克隆筛选

(1)加压筛选至阴性对照细胞基本死光时，约7days，开始单克隆筛选。

(2)取出六孔板，弃掉培养基，pbs洗一次，然后加入300μl0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，加入2mldmem/f12(含10％血清+25μmmsx)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。

(3)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。

(4)用dmem/f12(含10％血清+25μmmsx)重新悬浮细胞，计数。

(5)铺板：稀释细胞至5个/ml，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％co2细胞培养箱中孵育4-6h。

(6)记录单个细胞的孔。

(7)待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，pbs洗一次，加入100μl0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，加入2mldmem/f12(含10％血清+25μmmsx)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞液转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养、冻存。

实施例4：cho-k1细胞株驯化成悬浮培养

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；dmem/f12(含10％血清，25μmmsx)置于37℃水浴锅中预热至37℃。

(2)从37℃培养箱中取出细胞(10cm细胞培养皿)，弃去上清培养基，用预温的8mlpbs洗细胞一次，并弃去pbs。

(3)每个10cm细胞培养皿加入1-2ml0.25％trypsin-edta，室温消化2min左右，显微镜下观察细胞皱缩变圆，并呈单个细胞。

(4)加入4mldmem/f12(含10％血清，25μmmsx)终止消化反应，并用移液枪将细胞吹散。

(5)将消化好的细胞转移至15ml离心管中，常温离心，200g，5min。

(6)用100％dmem/f12(含10％血清，25μmmsx)悬浮细胞，计数。

(7)稀释细胞至5×10⁵个细胞/ml接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％co2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(8)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(9)每隔24h计数细胞密度及活力。

(10)待第一代细胞培养一次后细胞存活率达到94-97％时进行第二代培养。

(11)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；100％dmem/f12(含10％血清，25μmmsx)，ex-cell302置于co2细胞培养箱中预热至37℃。

(12)从37℃培养箱中取出细胞转移至50ml离心管中，常温200g离心5min。

(13)将dmem/f12(含10％血清，25μmmsx)和ex-cell302按1：1混合，重新悬浮细胞，计数。

(14)稀释细胞至5×10⁵个细胞/ml接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％co2细胞培养箱中的轨道式振荡器上120rpm/min孵育过夜。

(15)生物安全柜台面用75％酒精擦拭消毒，紫外照射30min。

(16)每隔24h计数细胞密度及活力。

(17)第二代培养两次后得到的细胞存活率大于95％；第三至六代培养三次后得到的细胞存活率大于95％。7周后，细胞接种3天后繁殖三代，密度达到1×10⁶个细胞/ml，同时细胞存活率达到95％，该细胞被认为已经适应悬浮培养。接种密度降低到3×10⁵个/ml。

(18)经驯化，2a2株、2c2株都满足要求，这表明2a2株、2c2株都驯化成功。

实施例5：细胞摇瓶发酵

(1)传代培养基的配制：60％的cd-cho+40％的ex-cell302置于37℃水浴锅中预热至37℃。

(2)从co2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

(3)稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/ml接种30ml培养基于一个125ml摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％co2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

(4)每隔24h计数细胞密度及活力，测葡萄糖，当血糖低于2g/l的时候，添加葡萄糖到4g/l；每天取1ml样品，上清用于检测蛋白表达情况。

(5)补料(约第四天)：补充70g/lcb5，添加基础培养基的10％。

(6)第5天开始，将co2培养箱温度调整至32℃。

(7)第九天，补充70g/lcb5，添加基础培养基的10％。

(8)第十二天，收获细胞。

(9)如图3所示，2a2、2c2单克隆细胞株的蛋白表达量比较高，初步估算，其表达产量高达2-3g/l，适合大规模生产所需。

实施例6：蛋白纯化

(1)取geexcle填料4ml，用buffera(20mmnah2po4，500mmnacl，0.05％tween20，ph7.4)平衡5个柱体积；

(2)将4ml填料加入到细胞上清中，于滚瓶机上4℃混匀1h；

(3)将填料和细胞上清转移到空层析柱中，流穿细胞上清；

(4)洗涤：用含20mm咪唑的buffera洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。

(5)洗脱：用含100mm咪唑的buffera洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。

(6)洗脱：用含250mm咪唑的buffera洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。

(7)洗涤：用含500mm咪唑的buffera洗脱，每次3ml，于旋转混匀器上混匀15min，洗至考马斯亮蓝试剂无显色反应，取80μl留样检测。

(8)透析换液：将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1×pbs透析至少1,000倍，取80μl留样检测。

(9)蛋白纯化后的sds-page检测结果如图4所示，纯化后的蛋白纯度都能达到90％以上。

(10)蛋白浓度和纯度测定：采用bca法测定蛋白浓度，2a2、2c2单克隆细胞株蛋白得率都约为2-3g/l；采用hplc方法进一步检测蛋白纯度，纯度都能达到90％以上。

实施例7：疫苗制备与免疫实验

7.1疫苗制备

将适量cho-k1细胞表达的牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白加入到isa201vg佐剂中(体积比为46:54)，使蛋白终浓度为100μg/ml，乳化、质检合格后置于4℃保存。

7.2免疫实验

筛选4-5月龄小牛10头(ibrv抗原抗体阴性)，随机分成2组，每组5头，分为对照组与免疫组。对照组牛肌肉注射1mlpbs，免疫组牛肌肉注射由cho-k1细胞表达的gd蛋白制备的疫苗，每次1ml(100μggd蛋白/ml)，免疫2次，间隔3周加强免疫一次。分别在免疫前、二免前和二免后14天及21天采集血清，检测抗体效价。结果如图5所示，免疫组牛在二免后抗体相对效价达到35,000。

7.3elisa检测抗体效价

(1)包被：用包被液(50mm碳酸盐缓冲液，ph9.5)稀释纯化的gd蛋白至0.5μg/ml，在酶标板上每孔加入100μl，封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；

(2)洗涤：从冰箱取出酶标板后，放入洗板机中洗涤，洗涤液用pbst；

(3)封闭：每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；

(4)样品准备：按已知的信息和需要用量，用封闭液将血清进行适度稀释；

(5)洗涤：同(2)；

(6)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育1h；

(7)洗涤：同(2)；

(8)加二抗：每孔加入适度稀释的hrp标记的二抗100μl，37℃孵育0.5h；

(9)洗涤：同(2)；

(10)显色：避光条件下每孔加入100μl的tmb显色液，37℃孵育10min；

(11)终止：每孔加入50μl终止液(2mh2so4)，终止反应；

(12)检测：于450nm波长测定样品od值，分析数据；

(13)结果分析：判断抗体阳性的标准：p/n≥2.1，od450≥0.1。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

序列表

<110>浙江海隆生物科技有限公司

<120>cho细胞表达牛传染性鼻气管炎病毒gd蛋白及其亚单位疫苗的制备和应用

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1032

<212>dna

<213>密码子优化后的ibrvgd基因序列

<400>1

ctgcctaccccagctccaagggtgacagtgtacgtggacccccctgcctatcctatgcca60

agatacaactatacagagaggtggcacaccacaggccccatcccttccccatttgctgat120

ggcagggagcagcctgtggaggtgcggtacgccaccagcgccgctgcttgcgacatgctg180

gctctgatcgccgatccacaagtgggaaggaccctgtgggaggctgtgaggcggcacgct240

agggcctacaatgccacagtgatctggtataagatcgagtctggctgtgccagacctctg300

tactatatggagtacaccgagtgcgagccacgcaagcatttcggctactgtaggtatcgg360

acaccacccttctgggactcctttctggctggcttcgcctatcccaccgacgatgagctg420

ggcctgatcatggctgcccctgctagactggtggagggccagtacagacgcgctctgtat480

atcgacggcaccgtggcctacacagacttcatggtgtccctgccagctggcgactgctgg540

ttcagcaagctgggagctgctaggggatatacctttggcgcttgtttcccagccagagat600

tacgagcagaagaaggtgctgcgcctgacctatctgacacagtactatccccaggaggct660

cacaaggccatcgtggactactggtttatgaggcatggcggcgtggtgcctccatacttc720

gaggagagcaagggctatgagccacctccagctgctgatggaggatctcctgctccacct780

ggcgacgatgaggctagggaggacgagggagagacagaggatggagctgctggaagggag840

ggaaacggaggaccaccaggaccagagggcgatggagagtctcagaccccagaggctaat900

ggaggagctgagggagagccaaagcctggaccatctccagacgctgataggccagaggga960

tggccttccctggaggctatcacccatcctccacccgctcctgccacaccacatcaccat1020

caccatcactaa1032

<210>2

<211>343

<212>prt

<213>ibrvgd蛋白序列

<400>1

leuprothrproalaproargvalthrvaltyrvalaspproproalatyrprometproargtyrasntyr

15101520

thrgluargtrphisthrthrglyproileproserprophealaaspglyarggluglnprovalgluval

2530354045

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5055606570

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120125130135140

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170175180185

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190195200205210

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215220225230235

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240245250255

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260265270275280

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285290295300305

gluprolysproglyproserproaspalaaspargprogluglytrpproserleuglualailethrhis

310315320325

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330335340