本发明涉及多肽合成
技术领域：
，尤其涉及一种缩宫素的制备方法。
背景技术：
：缩宫素又称催产素，是一种子宫收缩药，临床用于催产、引产、防治产后出血和产后复旧不全，并有促进泌乳作用。目前，国内的缩宫素原料药基本上自猪或牛下丘脑垂体后叶中提取，效价160IU/ml，效价低，并且动物来源的产品存在生物安全性风险，同时存在加压素等杂质，难以被纯化除去。人工合成缩宫素的方法主要包括固相合成法和液相合成法，目前，缩宫素合成方法主要有液相法和Fmoc固相法。其中，中国发明专利ZL2010102549195公布了一种液相合成缩宫素的方法:该方法用金属钠/液氨法脱去保护基，然后，用空气氧化法形成二硫键，收率25％，未见生物效价报道；中国发明专利(专利号ZL2005101123565)公布了一种固相合成缩宫素的方法:该方法以RinkAmide树脂为固相载体，Fmoc保护氨基酸为单体，其中半胱氨酸采用Fmoc-Cys(Trt)-OH，使用哌啶作为脱帽试剂，依次逐个合成了保护缩宫素氨基酸序列，然后，将肽链从树脂上切割下来，乙醚沉淀切肽溶液获得还原性缩宫素后，在偏碱性溶液中(pH7-8)用空气、或双氧水进行氧化，形成二硫键，收率21％，未见报道效价；中国发明专利(ZL201210256922X)公布了一种固相合成缩宫素的方法:该方法以RinkAmide树脂为固相载体，Fmoc保护氨基酸为单体，其中N末端半胱氨酸采用Boc-Cys(Trt)-OH，使用哌啶作为脱帽试剂，依次逐个合成了保护缩宫素氨基酸序列，然后，将肽链从树脂上切割下来，乙醚沉淀切肽溶液获得未环化的缩宫素后，在偏碱性溶液中用空气、或双氧水进行氧化，形成二硫键，其收率33％，未见报道效价。这些缩宫素固相合成法的共同点是：1)环化反应均采用空气氧化法、或双氧水氧化法形成二硫键，收率最高为33％；2)N末端氨基在未保护(游离)状态下进行环化反应；3)脱帽试剂均采用易制毒化学品哌啶；4)未见报道缩宫素的生物效价、或可参考的生物效价。综上所述，使用易制毒化学品哌啶、乙醚等，难以掌控的反应条件(如金属钠/液氨等)；现有技术中缩宫素的合成方法反应步骤多，产率、纯度不能满足需求。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种工艺简单、成本低，产率高的缩宫素合成方法。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种缩宫素的制备方法，包括以下步骤：1)以CTC树脂为固相载体，将氨基酸保护单体Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，，和Boc-Cys(Trt)-OH在缩合剂和碱性条件下依次进行缩合反应，得到第一中间体；脱帽试剂为哌嗪溶液，所述第一中间体的氨基酸序列为：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-OH；2)以Fmoc-Pro-Leu-OH，Gly-NH2，BOP，HOBt为原料，合成Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2，用二乙胺脱去Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2上的Fmoc得到第二中间体；所述第二中间体的氨基酸序列为：H-Pro-Leu-Gly-NH2；3)将步骤1)中合成的第一中间体和步骤2)中合成的第二中间体进行缩合反应，得到缩宫素前体1，所述缩宫素前体的氨基酸序列为：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2；4)用碘脱去所述步骤3)中得到的缩宫素前体1中Cys上的Trt，形成二硫键，得到缩宫素前体2；所述缩宫素前体2的氨基酸序列为：5)将步骤4)中得到的缩宫素前体2切肽后得到具有式I所示结构的缩宫素；所述步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。优选的，步骤1)中所述的哌嗪溶液的溶剂为DMF，所述的哌嗪溶液浓度为0.1～1M。优选的，所述步骤1)中CTC树脂的取代度为0.6～0.9mmol/g。优选的，所述步骤1)中每种氨基酸保护单体在反应体系中的浓度为树脂取代度的1.95～2.05当量。优选的，所述步骤1)中缩合剂为O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；所述的缩合剂在反应体系中的浓度为缩合反应中对应氨基酸保护单体的0.95-1当量。优选的，所述步骤1)中提供碱性条件的碱为N,N-二异丙基乙胺，所述N,N-二异丙基乙胺为缩合反应对应氨基酸保护单体的1～1.5当量。优选的，所述步骤3)中第二中间体为第一中间体的1.02～1.5当量。优选的，所述步骤3)中缩合反应用缩合剂为叠氮磷酸二苯酯或二环己基碳二亚胺-1-羟基苯并三唑或二环己基碳二亚胺-3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮。所述的缩合剂在反应体系中的浓度为缩合反应中第二中间体的0.95-1当量优选的，所述步骤4)中的碘为单质碘；所述碘的物质的量为缩宫素前体物质的量的5～10当量，所述碘在反应体系中的浓度为0.1M～0.5M。优选的，所述步骤5)中切肽用试剂为含TIS的三氟乙酸溶液。本发明的有益效果：本发明提供了一种缩宫素的制备方法，未使用任何剧毒或易制毒化学品，也未使用任何有安全隐患的工艺。本发明以CTC树脂为固相载体，采用多肽固相合成法合成第一中间体，多肽液相合成法合成第二中间体，然后再将两个中间体缩合得到缩宫素前体，将所述缩宫素前体依次环化和切肽，得到缩宫素粗品。本发明提供的制备方法简化了缩宫素的制备步骤，所述的固相合成载体CTC树脂可以回收使用，极大降低了缩宫素的生产成本，本发明结合了固相合成和液相合成的优点，具有较高的合成效率和产率；而且本发明制备得到的缩宫素具有较高的纯度。另外本申请所述的制备方法中用哌嗪溶液代替哌啶溶液作为脱帽试剂，易于购买、运输和储存，且哌嗪不属于受控制的易制毒化学品，方便企业的物料管理。实施例结果表明，本发明提供的方法制备得到的缩宫素纯度高达99％以上，产率高达46.5％，生物效价高达560IU/mg以上。附图说明：图1是实施例1中第一中间体的RP-HPLC图；图2是第一中间体高酸裂解样品的ESI-MS图；图3是Fmoc-Pro-OSu的RP-HPLC图；图4是Fmoc-Pro-Leu-OH的RP-HPLC图；图5是Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2的RP-HPLC图；图6是第二中间体的RP-HPLC图；图7是第二中间体的ESI-MS图；图8是缩宫素前体1的RP-HPLC图；图9是缩宫素前体1高酸裂解样品的ESI-MS图；图10是缩宫素前体2的RP-HPLC图；图11是缩宫素粗品的RP-HPLC图；图12是缩宫素纯品的RP-HPLC图；图13是缩宫素的ESI-MS图；图14是实施例2中的第一中间体的HPLC图。具体实施方式在本发明权利要求书和说明书中出现物质的英文缩写对应的中文名称见表1。表1本发明中出现物质的英文缩写对应的中文名称英文缩写中文名称Fmoc9-芴甲氧羰基Trt三苯甲基HOBt1-羟基苯并三唑Boc叔丁氧羰基tBu叔丁基TFA三氟乙酸TIS三异丙基硅烷DIEAN,N-二异丙基乙胺HBTUO-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯IPA异丙醇DMFN,N-二甲基甲酰胺Gly甘氨酸Leu亮氨酸Pro脯氨酸Asn门冬酰胺Gln谷氨酰胺Cys半胱氨酸Ile异亮氨酸Tyr酪氨酸THF四氢呋喃DCC二环己基碳二亚胺HOOBt3-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮TEA三乙胺HOSuN-羟基琥珀酰亚胺DMSO二甲基亚砜本发明提供了一种缩宫素的制备方法，包括以下步骤：1)以CTC(0.8-1.0mmol/g,100-200mesh)树脂为固相载体，将氨基酸保护单体Boc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH在缩合剂和碱性条件下依次进行缩合反应，得到第一中间体；脱帽试剂为哌嗪溶液，所述第一中间体的氨基酸序列为：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-OH；2)以Fmoc-Pro-Leu-OH，Gly-NH2，BOP，HOBt为原料，合成Boc-Pro-Leu-Gly-NH2，用二乙胺脱去Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2上的Fmoc得到第二中间体；所述第二中间体的氨基酸序列为：H-Pro-Leu-Gly-NH2；3)将步骤1)中合成的第一中间体和步骤2)中合成的第二中间体进行缩合反应，得到缩宫素前体1，所述缩宫素前体1的氨基酸序列为：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2；4)用碘脱去所述步骤3)中得到的缩宫素前体1中Cys上的Trt，形成二硫键，得到缩宫素前体2；所述缩宫素前体2的氨基酸序列为：5)将4)中得到的缩宫素前体2切肽后得到具有式I所示结构的缩宫素；式I所述步骤1)和步骤2)之间无时间顺序限定。在本发明中，以CTC树脂为固相载体，采用固相合成法制备氨基酸序列为Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-OH的第一中间体，具体为：在CTC树脂固相载体上，将氨基酸保护单体在缩合剂和碱性条件下依次进行缩合反应得到第一中间体。在本发明中，所述CTC树脂的取代度优选为0.6～1.0mmol/g，更优选为0.7～0.9mmol/g，最优选为0.72～0.81mmol/g。具体的所述缩合反应优选为：以所述CTC树脂作为固相载体，共价连接N末端氨基酸保护单体Boc-Cys(Trt)-OH，去掉保护基(即脱帽)后得到Cys(Trt)-树脂；将氨基酸保护单体Fmoc-Asn(Trt)-OH与所述Cys(Trt)-树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂，脱帽反应后，得到Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂)；依次在Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂上连接保护氨基酸单体Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH，得到Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂。将Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂中的多肽链从树脂上切割后，得到第一中间体。在本发明中，所述N末端氨基酸保护单体Boc-Cys(Trt)-OH的浓度优选为CTC树脂取代度的1.95～2.05当量，更优选为2当量；所述脱帽用脱帽剂为哌嗪，所述哌嗪优选以哌嗪溶液的形式加入，所述哌嗪溶液的溶剂优选的为DMF，所述的哌嗪溶液浓度优选的为0.1～1M，更优选的为0.58M；所述哌嗪溶液的体积优选为按树脂的质量计算，每g树脂8ml脱帽试剂；所述脱帽的时间优选的为10～30min，更优选的为20min。本发明在获得Cys(Trt)-树脂后，优选向得到的反应溶液中添加第二氨基酸保护单体Fmoc-Asn(Trt)-OH与Cys(Trt)-树脂进行缩合反应，得到Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂。在本发明中，所述缩合反应用缩合剂优选为O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)；所述的缩合剂在反应体系中的浓度优选为Fmoc-Asn(Trt)-OH的0.95～1当量，更优选为0.95当量。在本发明中，所述缩合反应优选在碱性条件下进行，所述碱性条件优选由N,N-二异丙基乙胺(DIEA)提供，所述DIEA在反应体系中的浓度优选为氨基酸保护单体Fmoc-Asn(Trt)-OH的1～1.5当量，更优选为1.2～1.4当量。在本发明中，所述缩合反应用脱帽试剂优选为哌嗪，所述哌嗪优选以哌嗪溶液的形式加入，所述哌嗪溶液的溶剂优选的为DMF，所述的哌嗪溶液浓度优选的为0.1～1M，更优选的为0.58M；所述哌嗪溶液的体积按树脂的质量计算，每g树脂8ml脱帽试剂；所述脱帽的时间优选的为10～30min，更优选的为20min。在本发明中，所述缩合反应的时间优选为1～4h，更优选为2h；本发明优选的在所述脱帽反应完成后进行缩合反应。本发明在获得Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂后，优选按照上述技术方案所述缩合反应方法，依次在Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂上连接氨基酸保护单体Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，，Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH后获得Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂，具体的反应条件在此不再赘述。在本发明中，第二中间体的合成采用液相合成法，具体以Fmoc-Pro-Leu-OH，Gly-NH2，BOP，HOBt为原料，合成Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2；再用二乙胺脱去Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2上的Fmoc，得到氨基酸序列为H-Pro-Leu-Gly-NH2的第二中间体。在本发明中，所述Fmoc-Pro-Leu-OH优选按照包括以下步骤的方法制备得到：将Fmoc-Pro-OH、HOSu和DCC进行羧基活化反应，得到Fmoc-Pro-OSu；将所述Fmoc-Pro-OSu与Leu和TEA进行肽偶联反应，得到Fmoc-Pro-Leu-OH。具体的，在本发明优选将Fmoc-Pro-OH和HOSu溶解于THF中冷浴，得到Fmoc-Pro-OH和HOSu混合溶液；将所述Fmoc-Pro-OH和HOSu混合溶液与DCC混合进行羧基活化反应，得到Fmoc-Pro-OSu。所述混合溶液中，Fmoc-Pro-OH的摩尔浓度优选的为150mM～500mM，更优选的为300mM。在本发明中，所述冷浴的时间优选为5～15min，更优选为10min；所述冷浴的温度优选为-5℃～4℃。所述Fmoc-Pro-OH、HOSu和DCC的摩尔比例优选的为1:(1.05～1.2):(1.05～1.2)，更优选的为1:1.1:1.1。在本发明中，所述羧基活化反应的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。所述羧基活化反应后，本发明除去反应液中的白色固体，对液相组分进行浓缩，得到Fmoc-Pro-OSu，本发明得到的Fmoc-Pro-OSu为膏状。本发明在获得Fmoc-Pro-OSu后，优选将Fmoc-Pro-OSu溶解于THF中得到Fmoc-Pro-OSu溶液；将Leu和TEA溶于DMSO中得到Leu碱性溶液；然后将所述Fmoc-Pro-OSu溶液和Leu碱性溶液混合，进行第一次肽偶联反应，得到Fmoc-Pro-Leu-OH。在本发明中，所述Fmoc-Pro-OSu、Leu和TEA的摩尔比例优选的为1:(1.05～1.2):(1.05～1.2)，更优选的为1:1.1:1.1。所述肽偶联反应的时间优选的为0.5～1.5h，更优选的为1h；所述Fmoc-Pro-OSu溶液的浓度摩尔优选的为0.6M；所述Leu碱性溶液的摩尔浓度优选的为0.6M。所述肽偶联反应后，本发明优选对得到的产物进行浓缩纯化，得到Boc-Pro-Leu-OH，本发明中所述浓缩纯化采用本领域常规的技术手段即可，无其他特殊要求。本发明在得到Fmoc-Pro-Leu-OH后，优选将所述Fmoc-Pro-Leu-OH和Gly-NH2进行第二次肽偶联反应，得到Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2。本发明优选将Fmoc-Pro-Leu-OH溶解于THF中，得到Fmoc-Pro-Leu-OH溶液；将肽偶联试剂苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)和HOBt溶解于Fmoc-Pro-Leu-OH溶液中，得到BOP，HOBt和Fmoc-Pro-Leu-OH混合溶液；将Gly-NH2.HCl溶解于DMF中，得到Gly-NH2.HCl溶液；将所述Gly-NH2.HCl溶液与BOP,HOBt和Fmoc-Pro-Leu-OH混合溶液混合进行第二次肽偶联反应，得到Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2。所述Fmoc-Pro-Leu-OH、Gly-NH2.HCl，TEA和BOP,HOBt的摩尔比例优选的为1:(1.05～1.2):(1.05～1.2):(1.05～1.2):(1.05～1.2)，更优选的为1:1.1:1.1:1.1:1.1。所述肽偶联反应的时间优选的为0.5～1.5h，更优选的为1h；所述Fmoc-Pro-Leu-OH溶液的浓度摩尔优选的为0.6M；所述Gly-NH2.HCl碱性溶液的摩尔浓度优选的为0.6M。所述第二次肽偶联反应后，本发明优选对所述第二次肽偶联反应的反应液进行浓缩和提纯处理，得到Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2，本发明中所述的产物的浓缩纯化采用本领域常规的技术手段即可，无其他特殊要求。本发明在获得Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2后，用二乙胺脱去Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2上的Fmoc得到第二中间体。本发明优选将Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2与二乙胺混合，进行多肽去保护反应，得到第二中间体H-Pro-Leu-Gly-NH2。在本发明中，所述溶液的摩尔浓度优选为0.1M-0.5M，更优选为0.3M。在本发明中，所述多肽去保护反应的时间优选的为20～40min，更优选的为30min。本发明在获得第一中间体和第二中间体后，将所述第一中间体和第二中间体进行缩合反应，得到缩宫素前体1，所述缩宫素前体1的氨基酸序列为：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2。在本发明中第二中间体的用量优选的为第一中间体的1.02～1.5当量，更优选的为1.2～1.4当量，最优选的为1.2当量。在本发明中，所述第一中间体和第二中间体缩合反应用的缩合剂优选为DPPA或DCC-HOBt或DCC-HOOBt。具体的，本发明优选将第一中间体和缩合剂溶于THF-DMF的混合溶剂进行冷浴，得到第一中间体溶液；将第二中间体溶于THF中，得到第二中间体溶液；将所述第一中间体溶液与第二中间体溶液混合，进行缩合反应得到缩宫素前体。在本发明中，所述冷浴的时间优选的为5～15min，更优选的为10min；所述冷浴的温度优选的为--5～4℃。所述THF-DMF的混合溶剂中THF与DMF的体积比优选的为3:1；所述第一中间体溶液中第一中间体氨基酸序列的摩尔浓度优选为0.15～0.6M，更优选为0.5M；所述第二中间体溶液中第二中间体氨基酸序列的浓度优选为0.4～0.5M，更优选为0.5M；所述第二中间体的用量优选的为第一中间体的1.02～1.5当量，更优选的为1.2当量。在本发明中，所述缩合反应的时间优选的为1～3h，更优选的为2h。所述第一中间体和第二中间体的缩合反应后，本发明优选对得到的缩合反应液进行浓缩纯化，得到宫缩素前体1。本发明中所述缩宫素前体的浓缩纯化采用本领域常规的技术手段即可，无其他特殊要求。本发明在得到缩宫素前体后，用碘脱去缩宫素前体1中的Trt，同时形成二硫键，得到环状缩宫素前体2。在本发明中所述的碘优选为单质碘，所述碘的物质的量优选的为缩宫素前体物质的量的3～10当量，更优选的为5当量。在本发明中，所述单质碘优选溶解于DMF中，得到碘溶液；将所述碘溶液与缩宫素前体1混合进行环化反应，形成二硫键，得到环状宫缩素前体2。在本发明中，所述碘溶液的浓度优选为0.1M～0.5M，更优选的为0.4M。在本发明中，所述环化反应的时间优选的为1～2h，更优选的为1.5h。本发明在得到环状缩宫素前体后，对所述环状宫缩素前体2进行切肽，得到具有式I所示结构的宫缩素：在本发明中，具体的切肽试剂常规切肽试剂TFA:TIS:H2O为95:2.5:2.5。多肽在切肽试剂中的浓度为0.2-1g/ml,优选的为0.4g/ml。本发明所述切肽后得到的是含缩宫素的TFA溶液，优选将所述含宫缩素的TFA溶液进行浓缩，得到缩宫素浓缩液。本发明优选在所述浓缩后，将得到的浓缩液与乙酸乙酯混合，过滤，收集固体产物，真空干燥后得到缩宫素粗品，所述缩宫素粗品冷藏保存。本发明中所述的乙酸乙酯的量为8ml/mmol,浓缩和真空干燥采用本领域常规的方法即可，无其他特殊要求。上述步骤中各浓缩温度为25℃，浓缩至浓缩液为稠状。本发明在得到缩宫素粗品后，优选的对所述缩宫素粗品进行反相液相色谱分离，得到纯化的缩宫素。在本发明中，所述液相分离的制备柱、反相硅胶、流动相等采用本领域常规选择即可，无其他特殊要求，具体的在本发明实施例中制备柱优选的为50mm制备柱，硅胶优选的为富士硅胶下面结合实施例对本发明提供的缩宫素的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1茚三酮试剂的配制：a溶液：(1)0.5g茚三酮溶于10ml无水乙醇；(2)80g苯酚溶于20ml无水乙醇；混合(1)和(2)。b溶液：配制1mM的KCN溶液，取2ml用吡啶稀释至100ml。Cys(Trt)-树脂的合成称25gCTC树脂于250ml固相合成反应器中，取20mmol,11.7gFmoc-Cys(Trt)-OH于150ml三角瓶中，100ml量筒量取DCM100ml加入三角瓶将其溶解，加DIEA15ml，摇匀，倒入反应器开始反应。反应1h时，加入DIEA15ml，甲醇20ml，反应15min，用抽滤装置抽去反应液，在反应器中加入200mlDMF，用抽滤装置抽去DMF，重复此步骤4次；量取230ml脱帽试剂哌嗪溶液，倒入反应器中，反应20min。随后，抽去反应液，在反应器中加入约200mlDMF，5min，用抽滤装置抽去DMF，重复此步骤4次。反应完全的检测：用玻璃滴管取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴两滴a液，一滴b溶液，在110℃干式加热器中加热3min，为深蓝色。Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂的合成得到Cys(Trt)-树脂后，向反应体系中添加第二氨基酸保护单体Fmoc-Asn(Trt)-OH、缩合剂HBTU和碱DIEA；缩合剂HBTU的浓度为氨基酸保护单体Fmoc-Tyr(tBu)-OH的0.95当量；DIEA的浓度优选的为Fmoc-Tyr(tBu)-OH的1.3当量；脱帽试剂为0.58M的哌嗪溶液，所述缩合反应的时间为3h。反应完全的检测：用玻璃滴管取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴两滴a液，一滴b溶液，在110℃干式加热器中加热3min，为深蓝色。获得Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂后，按照上述缩合反应方法，依次在Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂上连接氨基酸保护单体Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH后获得Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂。然后将保护多肽从树脂上切割下来，方法如下：加1％TFA/DCM溶液150ml，摇摆反应10min，收集反应液，重复5次，浓缩反应液，加10％柠檬酸溶液，析出白色固体，过滤，水洗至中性，真空干燥。得到第一中间体：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-OH，28.1g，16.5mmol纯度94.2％，收率82.5％。(RP-HPLC图见图1；其高酸裂解样品ESI-MS图见图2{m/zcalcd.for(C30H44N8O10S2)742.2；found743.2[M+H]+})第二中间体的合成合成Fmoc-Pro-OSu：称Fmoc-Pro-OH，100mmol，33.7g，HOSu110mmol，12.6g溶于500mlTHF中，冷浴10min，加入DCC110mmol，22.6g。反应2h，HPLC显示反应完全，过滤除去白色固体，浓缩，得膏状产物(RP-HPLC图见图3)。将膏状物用THF180ml溶解，另称Leu110mmol，14.5g，TEA110mmol，15ml用DMSO180ml搅拌30min，加入Fmoc-Pro-OSu的THF溶液中，反应1h，HPLC显示反应完全。浓缩除去THF，加0.5MHCl搅拌，调节pH至2，析出白色稠状固体，倒去上清液，用乙酸乙酯溶解白色稠状固体，饱和NaCl溶液洗三遍，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩至干，得到Fmoc-Pro-Leu-OH。(RP-HPLC图见图4)将Fmoc-Pro-Leu-OH用150mlTHF溶解，加入BOP110mmol，48.2g，HOBt110mmol，14.8g溶解后加入TEA110mmol，15ml，另称Gly-NH2.HCl110mmol，12.19g用DMF150ml溶解加入TEA110mmol，15ml，然后加入到以上溶液中，1h后，HPLC显示反应完全，浓缩除去THF，加0.1M盐酸溶液沉淀，得到白色固体，水洗至中性，真空干燥。(RP-HPLC图见图5)将Fmoc-Pro-Leu-Gly-NH2溶于300ml二乙胺，反应30min，TLC显示反应完全，浓缩至干少量，加石油醚析出，过滤，真空干燥，得到类白色固体65.8mmol18.7g，产率66％。(RP-HPLC图见图6，ESI-MS图见图7{m/zcalcd.for(C13H24N4O3)284.2；found285.1[M+H]+})。缩宫素粗品的合成取第一中间体10mmol，17g和HOBt11mmol，1.48g溶于20mlTHF，10mlDMF的混合溶剂，-5℃冷浴10min，另第二中间体12mmol，3.4g，溶于20mlTHF中，反应2h，HPLC检测反应完全。过滤除去白色固体，浓缩，加入0.1M盐酸溶液，析出类白色固体，过滤，水洗至中性。真空干燥，得产物缩宫素前体1：8.6mmol18.4g，产率86.3％，纯度92％。(RP-HPLC图见图8，ESI-MS图见图9{m/zcalcd.for(C43H64N12O12S2)1008.4；found1009.5[M+H]+})取250ml圆底烧瓶，称碘11g投入，加入DMF110ml。将肽链树脂倒入圆底烧瓶反应1.5h。加入冰冻的0.1％Na2S2O3·5H2O水溶液，析出白色固体，过滤，水洗，真空干燥，得到环状缩宫素前体2：8.0mmol13.1g，产率93％，纯度93％。(RP-HPLC图见图10)用切肽试剂(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5)切割，得到含有缩宫素粗品的TFA溶液。浓缩TFA溶液至少量，加入乙酸乙酯70ml，冷藏10h。过滤，真空干燥得缩宫素粗品6.6mmol，6.7g，纯度91％，收率83％。(RP-HPLC图见图11)缩宫素粗品的纯化称取0.5g缩宫素粗品用10ml0.1MNaH2PO4溶液溶解，加入乙腈使得乙腈的浓度为15％，然后用0.45μm微孔滤膜过滤。纯化条件与梯度：制备柱：DACHB-50，富士硅胶检测波长：220nm，流速：50ml/min；流动相：A0.1MNaH2PO4溶液，B50％乙腈/A，0-60min：30％B-50％B。收集纯度99％以上的收集液，25℃浓缩，脱盐，浓缩，冻干，纯化完6.6mmol，6.7g样品，得缩宫素3.07mmol，3g，产率46.5％。(RP-HPLC图见图12，ESI-MS图见图13{m/zcalcd.for(C43H64N12O12S2)1006.4；found1007.6[M+H]+})，按中国药典缩宫素效价测定法，测定效价560IU/mg。由以上实施例可知，本发明提供的缩宫素的制备方法，采用固相合成法合成第一中间体，液相合成法合成第二中间体，然后再将两个中间体缩合得到缩宫素，简化了缩宫素的制备步骤，降低了缩宫素制备成本；采用本发明所述的方法制备得到的缩宫素纯度高达99％以上，环化产率高达83％，纯化产率高达46.5％。生物效价高达560IU/mg。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。实施例2回收树脂合成第一中间体树脂回收将实施例1的树脂用DMF洗涤(200ml×3)，甲醇洗涤(200ml×3)，抽去滤液，真空干燥至树脂呈均匀流动状。另配置二氯亚砜的DCM溶液(二氯亚砜10ml，DCM＝200ml)，加入装有树脂的250ml固相合成反应器中，反应2h后，抽去反应液，DCM洗涤(200ml×6)。Cys(Trt)-树脂的合成取20mmol,11.7gFmoc-Cys(Trt)-OH于150ml三角瓶中，100ml量筒量取DCM50ml加入三角瓶将其溶解，加DIEA15ml，摇匀，倒入反应器开始反应。反应1h时，加入DIEA15ml，甲醇20ml，反应15min，用抽滤装置抽去反应液，在反应器中加入200mlDMF，用抽滤装置抽去DMF，重复此步骤4次；量取230ml脱帽试剂哌嗪溶液，倒入反应器中，反应20min。随后，抽去反应液，在反应器中加入约200mlDMF，5min，用抽滤装置抽去DMF，重复此步骤4次。反应完全的检测：用玻璃滴管取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴两滴a液，一滴b溶液，在110℃干式加热器中加热3min，为深蓝色。Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂的合成得到Cys(Trt)-树脂后，向反应体系中添加第二氨基酸保护单体Fmoc-Asn(Trt)-OH、缩合剂HBTU和碱DIEA；缩合剂HBTU的浓度为氨基酸保护单体Fmoc-Tyr(tBu)-OH的0.95当量；DIEA的浓度优选的为Fmoc-Tyr(tBu)-OH的1.3当量；脱帽试剂为0.58M的哌嗪溶液，所述缩合反应的时间为3h。反应完全的检测：用玻璃滴管取树脂于玻璃管中，加入异丙醇，vortex5秒钟，待树脂沉在玻璃管底后，倒去异丙醇，重复洗涤三次，茚三酮检验，在小试管中滴两滴a液，一滴b溶液，在110℃干式加热器中加热3min，为深蓝色。获得Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂后，按照上述缩合反应方法，依次在Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂上连接氨基酸保护单体Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Boc-Cys(Trt)-OH后获得Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-树脂。然后将保护多肽从树脂上切割下来，方法如下：加1％TFA/DCM溶液150ml，摇摆反应10min，收集反应液，重复5次，浓缩反应液，加10％柠檬酸溶液，析出白色固体，过滤，水洗至中性，真空干燥。得到第一中间体：Boc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-OH，15.0mmol，25.4g，纯度91.0％，收率75％。(RP-HPLC图见图14)。附图液相分析条件说明：图1，图8，图10，图14分析条件如下：分析条件：创新通恒LC3000型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mmA：3％ACN，0.1％TFA/水B:乙腈(HPLC)梯度0→30min，B80％→90％；λ＝210nm；流速＝1.00ml/min。图3，图4，图5分析条件如下：分析条件：创新通恒LC3000型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mmA：3％ACN，0.1％TFA/水B:乙腈(HPLC)梯度0→30min，B50％→90％；λ＝210nm；流速＝1.00ml/min。图6分析条件如下：分析条件：创新通恒LC3000型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mmA：3％ACN，0.1％TFA/水B:乙腈(HPLC)梯度0→30min，B5％→50％；λ＝210nm；流速＝1.00ml/min。图11，图12分析条件如下：分析条件：安捷伦1260型HPLC，Krosmail100-5C18column4.6*250mmA：0.1MNaH2PO4/H2O溶液B:50％乙腈/H2O(HPLC)梯度0→30min，B30％→60％；λ＝220nm；流速＝1.00ml/min。当前第1页1 2 3