表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用的制作方法

本发明涉及一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用。动物生物制品学领域，
背景技术：
：鸡马立克氏病(Marek’sdisease,MD)，是由鸡马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)引起的一种鸡马立克氏病(Marek`sDisease，MD)是由鸡疱疹病毒引起鸡的一种最常见的淋巴细胞增生性疾病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和各内脏器官的淋巴样细胞浸润、增生和肿瘤形成为特征。本病早在1907年由匈牙利的兽医病理学家马立克首先发现，并在1961年命名为马立克氏病。现在世界各主要养鸡国家和地区均有流行，在我国也是经济意义上最重要的禽病之一，对我国养鸡生产造成严重威胁和巨大的经济损失。马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)属于细胞结合性疱疹病毒B群。病毒有两种存在形式，即裸体粒子(核衣壳)和有囊膜的完整病毒粒子。前者病毒核衣壳呈六角形，直径为85～100nm，有严格的细胞结合性，离开细胞致病性即显著下降和丧失，在外界环境中生存活力很低，主要见于肾小管、法氏囊、神经组织和肿瘤组织中。大多数裸体病毒粒子存在于细胞核中，偶见于细胞浆或细胞外液中。后者主要存在于细胞核膜附近或者核空泡中，直径130～170nm，主要见于羽毛囊角化层中，多数是有囊膜的完整病毒粒子，非细胞结合性，可脱离细胞而存在，对外界环境抵抗力强，在本病的传播方面起重要作用。1975年Bulow和Biggs采用间接免疫荧光试验、琼脂凝胶免疫沉淀反应及病毒中和试验，把MDV和相关病毒(HVT)分为三种血清型，随后这种分类方法由Lee所建立的MDV型特异性单克隆抗体所证实。根据MDV的三种血清型，目前商品化MDV疫苗分为致弱的Ⅰ型CVI988/Rispens株、无致病性的Ⅱ型SB1株和Ⅲ型火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey，HVT)FC126株。致弱的Ⅰ型CVI988/Rispens株对MD保护效果好，但其作为严格的细胞结合型病毒，必须液氮保存运输，极大的增加了疫苗成本。HVT可以冻干保存，节约了疫苗成本，但其对MD的保护力较弱，因此提高HVT的免疫效力十分必要。Ross将血清Ⅰ型MDV的GB基因插入到HVT基因组的TK基因，但构建的重组病毒在体内的增殖能力变弱。(RossLJ,BinnsMM,TyersP,PastorekJ,ZelnikV,ScottS:ConstructionandpropertiesofaturkeyherpesvirusrecombinantexpressingtheMarek'sdiseasevirushomologueofglycoproteinBofherpessimplexvirus.TheJournalofgeneralvirology1993,74(Pt3):371-377.)，而疫苗毒的增殖能力又和保护力紧密相关(GimenoIM,WitterRL,HuntHD,ReddySM,ReedWM:BiocharacteristicssharedbyhighlyprotectivevaccinesagainstMarek'sdisease.AvianPathol2004,33(1):59-68.)。因此，构建正常增殖且具有更高保护力的HVT非常有必要。疫苗是防制畜禽疾病的重要手段之一，目前大多重要的家禽传染病都可用相应的疫苗作有效的预防。为了进一步降低生产成本，提高产品质量，禽用新型疫苗的研究迫在眉睫。随着分子生物学技术的日臻完善，以改造病毒核酸结构为手段的疫苗，如基因缺失株疫苗、插入突变株、病毒活载体疫苗等得到了极大的发展，其中病毒活载体疫苗以生产使用方便，价格低廉，且安全性、稳定性及免疫力较强等方面优势，成为研究的热点。相对于其它病毒载体(如禽痘病毒、禽腺病毒、新城疫病毒等)，鸡马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)作为最有潜力的疫苗载体，其突出的优点体现在：MDV是严格的细胞结合型病毒，构建的载体疫苗不受母源抗体的干扰，克服了众多活病毒载体疫苗的缺陷；MDV分子大小为180kb左右，能够容纳较大片段基因的插入，而不影响重组病毒的稳定性；MDV疫苗适合早期免疫，对多数病毒特别是免疫抑制性病毒疫苗的研发带来了曙光。基于HVT构建病毒活载体疫苗不仅具有上述优点，还可以实现一苗两防、一苗多防，具有广阔的市场前景。技术实现要素：本发明的目的是为提供了一种嵌合火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey,HVT)rHVT-GB，其实际上是在血清Ⅲ型马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)HVT的基础上，将血清Ⅰ型MDVGB(glycoproteinB，MDV1-GB)基因的表达盒重组到HVT中，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB；本发明同时还为利用rHVT-GB为载体，构建能够表达其它禽类病原保护性抗原基因(如新城疫病毒F基因、传染性喉气管炎的GB基因和传染性法氏囊的VP2基因)的病毒活载体疫苗，该疫苗不仅可以预防MD，同时还能够预防其它禽类疫病。本发明的技术方案1.一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于该表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒被命名为一种重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey)rHVT-GB株，该毒株已于2017年01月11日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.13400。2.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的构建，其特征在于：将血清Ⅰ型MDV的GB基因表达盒重组到HVT基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的位于HVT087-HVT088基因之间的US2区域，该表达盒的基因序列如SeqIDNo:1所示。3.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组毒株在鸡体中诱导抗马立克氏病的保护性免疫中的应用。4.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于该重组毒株作为生产毒株在动物疫苗株的应用。5.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将该重组病毒作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒中的应用。6.本发明所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其于将新城疫病毒的F基因表达盒重组到rHVT-GB基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间，其中F基因表达盒的启动子序列如SeqIDNo:2所示；F基因序列如SeqIDNo:3所示；PolyA序列如SeqIDNo:6所示，构建获得的重组病毒被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey)rHVT-GB-NDVF株，该毒株已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.13399。7.本发明所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其于重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF株在鸡中诱导抗马立克氏病和鸡新城疫的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。8.本发明所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其于重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。9.本发明所述特征在的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将鸡传染性喉气管炎病毒的GB基因表达盒重组到rHVT-GB基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间，ILTV-GB基因表达盒的启动子序列如SeqIDNo:2所示，GB基因序列如SeqIDNo:4所示，PolyA序列如SeqIDNo:6所示；获得被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey)rHVT-GB-ILTVGB株，该毒株已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.13398。10.本发明所述一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-ILTVGB株在鸡中诱导抗马立克氏病和鸡传染性喉气管炎的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。11.本发明所述一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-ILTVGB株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。12.本发明所述一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于将鸡传染性法氏囊病毒的VP2基因表达盒重组到rHVT-GB基因组中，重组位点为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间,VP2基因表达盒的启动子序列如SeqIDNo:2所示，VP2基因序列如SeqIDNo:5所示，PolyA序列如SeqIDNo:6所示；获得被命名为重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey)rHVT-GB-IBDVVP2株，该毒株已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.13397。13.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-IBDVVP2株在鸡中诱导抗鸡马立克氏病和传染性法氏囊病的保护性免疫中的应用、并作为生产毒株在相应动物疫苗中的应用。14.本发明所述的一种表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的应用，其特征在于其中重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-IBDVVP2株作为病毒载体构建新的重组疫苗病毒的应用。本发明具体实施方式1.毒株的构建：(1)本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-GB)，其实际上是将血清Ⅰ型MDV的GB基因(MDV1-GB)重组到火鸡疱疹病毒基因组中，获得了一种全新的重组嵌合火鸡疱疹病毒rHVT-GB，该病毒通过将由启动子控制下的MDV1-GB基因(MDV1-GB基因表达盒)插入到HVT基因组中，rHVT-GB可以对鸡MD起到比HVT更好的免疫保护作用。该重组病毒的DNA序列模式图如附图1所示，具体如下：在本发明中，发明人将含有MDV1-GB基因表达盒插入HVT基因组中，插入的区域为HVT基因组中病毒生长非必需的区域US区域(在HVT基因组HVT087-HVT088基因之间)。为了达到上述的目的，发明人首先构建了用来同源重组的重组质粒，该重组质粒含有US2基因两侧的同源序列，以HVT基因组为模板进行扩增，扩增后的左右臂序列通过酶切位点克隆入PUC18中，克隆后的含有左右臂的重组质粒命名为PHVT-DS。然后由血清Ⅰ型MDV弱毒CVI988株基因组(GenBank:DQ530348.1)为模板扩增获得了含MDV1-GB基因表达盒，扩增后的MDV1-GB表达盒通过PACI酶切位点克隆入PHVT-DS中，克隆鉴定成功的质粒即为用来将MDV1-GB重组进HVTUS2区域的重组质粒，该质粒命名为PHVT-DS-MDV1-GB。利用重组质粒(PHVT-DS-MDV1-GB)与HVT基因组共转染CEF，待出现蚀斑后，将细胞传一代，留一半液氮冻存，另一半超声破碎后利用有限稀释法稀释病毒传至96孔细胞培养板中(做好稀释梯度，使每孔平均仅含有1个蚀斑或少于1个蚀斑)，待蚀斑出现后，挑选仅含有1个蚀斑的孔进行传代，1个孔传平行的2个孔。待蚀斑出现后，其中1个孔利用间接免疫荧光(利用抗MDV-GB的单抗进行筛选)检测重组病毒，如果为阳性，对应的另1个孔的病毒则含有重组病毒，经过多轮纯化后，进行毒种保存鉴定，该病毒被命名为一种重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB株，并于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为：CGMCCNo.13400。(2)同时，本发明利用rHVT-GB为载体平台，分别表达了新城疫病毒(NDV)的F基因、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因。上述重组病毒的DNA序列模式图如附图2、图3和图4所示。具体方案如下：在本发明中，发明人将含有NDVF基因、ILTV-GB基因和IBDV-VP2基因表达盒分别插入rHVT-GB基因组中，插入的区域为HVT(GenBank:AF291866.1)基因组的HVT065和HVT066之间。为了达到上述的目的，发明人首先构建了用来同源重组的重组质粒，NDVF基因由人工合成，为了考虑效力性，合成的F基因型属于NDV基因Ⅶd亚型，同时，考虑到安全性，将其F基因裂解位点的氨基酸序列人为改造为GRQGRL，符合弱毒株的特征；ILTV-GB基因参考了疫苗株(GenBank:JN580317.1)GB序列；IBDV-VP2基因参考NCBI序列(GenBank:HG974565.1)，上述F基因、GB基因和VP2基因均由商业公司合成。启动子参考了疱疹病毒(Muridherpesvirus1strainSmith)的启动子序列，终止序列为真核表达载体中常用的PolyA终止序列。具体构建方法如下：按常规方法提取HVT病毒基因组DNA，根据Genebank中发表的HVT-FC126株(GenBank:AF291866.1)的全基因序列，扩增左同源臂扩增左同源臂连接至PMD19-Tsimple载体，构建成质粒PMD19-L。设计引物扩增启动子，将启动子克隆入PMD19-L中，构建成质粒PMD19-L-PRO。然后设计引物扩增VP2基因，将VP2基因克隆入PMD19-L-PRO中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2。设计引物扩增PolyA(以pCMVbeta质粒为模板,GenBank:U02451)，将PolyA克隆入PMD19-L-PRO-VP2中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA；最后设计引物扩增右同源臂，克隆入质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA，构建成最终的重组质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R，该质粒用来将IBDV-VP2重组到rHVT-GB基因组中的HVT065和HVT066之间。在构建PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R的过程中，VP2基因两端设计了NotI酶切位点，利用此酶切位点可以将NDV-F和ILTV-GB基因克隆入PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R，分别构建重组质粒PMD19-L-PRO-F-PolyA-R和PMD19-L-PRO-GB-PolyA-R。参考rHVT-GB的构建方法，分别将PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R、PMD19-L-PRO-F-PolyA-R和PMD19-L-PRO-GB-PolyA-R重组质粒与rHVT-GB基因组共转染CEF，借助间接免疫荧光技术利用有限稀释法克隆重组病毒，利用该方法分别获得重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey)rHVT-GB-NDVF株、重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey)rHVT-GB-ILTVGB株和重组火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey)rHVT-GB-IBDVVP2株，该三株病毒已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号分别为为：CGMCCNo.13399，CGMCCNo.13398和CGMCCNo.13397。2.重组病毒的验证将rHVT-GB、rHVT-GB-NDVF、rHVT-GB-ILTVGB、rHVT-GB-IBDVVP2和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，分别用抗MDV1-GB、NDV-F、ILTV-GB和IBDV-VP2的单抗或血清进行间接免疫荧光鉴定，结果表明，rHVT-GB中的MDV1-GB基因、rHVT-GB-NDVF中的MDV1-GB和NDV-F基因、rHVT-GB-ILTVGB中的MDV1-GB和ILTV-GB以及rHVT-GB-IBDVVP2中的MDV1-GB和IBDV-VP2都获得了良好的正确表达。3.疫苗制备发明人将上述重组病毒制备成疫苗，以方便进行免疫操作，进一步的，发明人将重组病毒应用于鸡的免疫保护实验中。rHVT-GB对鸡预防MD的免疫保护效力评价1日龄SPF鸡免疫rHVT-GB后，免疫后7日分别接种1000PFU病毒量的鸡马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)Md5超强毒株(ATCC，VR-987)，rHVT-GB免疫组疫苗保护指数为75，明显优于HVT免疫组(保护指数为55)。rHVT-GB-NDVF对鸡预防ND免疫保护效力评价1日龄SPF鸡免疫rHVT-GB-NDVF，免疫后21日各肌肉注射新城疫病毒强毒北京株0.5ml(含105EID50，中国兽医药品监察所，CVCCAV1611)，观察14d，rHVT-GB-NDVF对ND的保护率达到90％。rHVT-GB-ILTVGB对ILT免疫保护效力评价1日龄SPF鸡免疫rHVT-GB-ILTVGB，免疫后21日，鸡各气管内注射鸡传染性喉气管炎强毒北京株0.2ml(含104EID50，CVCCAV中国兽医药品监察所)，攻毒后观察10d，rHVT-GB-ILTVGB对ILT保护率达到100％。rHVT-GB-IBDVVP2对鸡预防IBD免疫保护效力评价1日龄SPF鸡免疫rHVT-GB-IBDVVP2，21日龄每只点眼攻击IBDVBC6/85株(中国兽医药品监察所，CVCCAV7)10个MID，72小时后剖检法氏囊，观察法氏囊病变。rHVT-GB-IBDVVP2免疫组保护17只。HVT-GB免疫组和攻毒对照组法氏囊均发生病变(法氏囊出现浆膜呈胶冻样或有不同程度的出血)，rHVT-GB-IBDVVP2可以对IBD形成良好的保护。综上所述，本发明提供了一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT-GB)，其实际上是将血清Ⅰ型MDVGB基因的表达盒重组到HVT中，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB，该病毒同时也是一种良好的马立克氏病疫苗，作为疫苗，相比HVT，rHVT-GB可以对MD起到更好的免疫保护作用。本发明同时利用rHVT-GB为载体，构建能够表达其它禽类病原保护性抗原基因(新城疫病毒F基因、传染性喉气管炎的GB基因和传染性法氏囊的VP2基因)的病毒活载体疫苗，获得3个重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF株、rHVT-GB-ILTVGB株和rHVT-GB-IBDVVP2株。将上述3个重组病毒制备疫苗，不仅可以预防MD，同时各自还能够有效预防其它禽类疫病。附图说明图1为rHVT-GB基因组示意图；MDV1-GB表达盒插入HVT基因组中的US2区域，插入位点为基因HVT087和HVT088之间。图2为MDV1-GB表达盒在HVT基因组中整合位点示意图；删除线加黑序列上游部分为基因HVT087，删除线加黑序列下游部分为基因HVT088(US2)，删除线部分为MDV1-GB取代的HVT序列。图3为NDV-F/ILTV-GB/IBDV-VP2表达盒整合位点示意图；加黑序列上游部分为HVT065,加黑序列下游部分为HVT066，删除线部分为NDV-F/ILTV-GB/IBDV-VP2表达盒取代的HVT序列。图4为rHVT-GB-NDVF基因组示意图；NDV-F表达盒插入HVT基因组中，插入位点为基因HVT065和HVT066之间。图5为rHVT-GB-ILTVGB基因组示意图；ILTV-GB表达盒插入HVT基因组中，插入位点为基因HVT065和HVT066之间。图6为rHVT-GB-IBDVVP2基因组示意图；IBDV-VP2表达盒插入HVT基因组中，插入位点为基因HVT065和HVT066之间。本发明涉及生物材料资源信息本发明构建的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB株、rHVT-GB-NDVF株、rHVT-GB-ILTVGB株和rHVT-GB-IBDVVP2株等四株病毒已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号分别为为：CGMCCNo.13400，CGMCCNo.13399、CGMCCNo13398.和CGMCCNo.13397；鸡马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus)Md5株(ATCC，VR-987)购自美国菌种保藏中心(Americantypeculturecollection,ATCC)；鸡新城疫病毒(Newcastlevdiseaseirus)强毒北京株(CVCCAV1611)、鸡传染性喉气管炎病毒Infectious北京株(CVCCAV22)和鸡传染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus)BC6/85株(CVCCAV7)请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p142、137和135。本发明的积极意义本发明涉及表达血清Ⅰ型马立克氏病病毒GB基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用，本发明提供了一种嵌合火鸡疱疹病毒(Herpesvirusofturkey,HVT)rHVT-GB，其实际上是在血清Ⅲ型马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)HVT的基础上，将血清Ⅰ型MDVGB(glycoproteinB，MDV1-GB)基因的表达盒重组到HVT中，获得了一种全新的重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB，该病毒同时也是一种良好的马立克氏病疫苗，通过将由启动子控制下的MDV1-GB基因插入到HVT基因组中，作为疫苗，相比HVT,rHVT-GB可以对鸡马立克氏病(Marek’sdisease,MD)起到更好的免疫保护作用。相对于血清Ⅰ型MD疫苗，HVT可以冻干保存，大大节约了运输储藏成本。HVT除了能够预防MD外，其还是优良的病毒载体，但HVT本身作为MD疫苗，对MD的保护能力较弱，本发明构建的嵌合病毒rHVT-GB，大大增强了对MD的免疫保护能力。本发明同时利用rHVT-GB为载体，构建能够表达其它禽类病原保护性抗原基因(如新城疫病毒F基因、传染性喉气管炎的GB基因和传染性法氏囊的VP2基因)的病毒活载体疫苗，该疫苗不仅可以预防MD，同时还能够预防其它禽类疫病。实施例以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明请求保护的技术方案构成限制。实施例1——嵌合病毒rHVT-GB的构建1.重组质粒PHVT-DS的构建首先构建用来同源重组的重组质粒，该重组质粒含有US2基因两侧的同源序列，引物(序列7、序列8、序列9和序列10)；以HVT基因组为模板进行扩增，扩增后的左右臂序列通过酶切位点克隆入PUC18中，克隆后的含有左右臂的重组质粒命名为PHVT-DS。2.PHVT-DS-MDV1-GB的构建由血清Ⅰ型MDV弱毒CVI988株基因组(GenBank:DQ530348.1)为模板扩增获得了含MDV1-GB基因表达盒，具体如下：设计引物(序列11和序列12)扩增MDV血清Ⅰ型GB基因表达盒(MDV1-GB表达盒)：以CVI988基因组为模板，进行扩增，扩增后的MDV1-GB表达盒通过PACI酶切位点克隆入PHVT-DS中，克隆鉴定成功的质粒即为用来将MDV1-GB重组进HVTUS2区域的重组质粒，该质粒命名为PHVT-DS-MDV1-GB。HVT-US2leftsense：5-GATgaattcACATCGGGCCACGTTCCGCC-329(序列7)；HVT-US2leftantisense：5-ATAGTCGACttaattaaGATGAGCTGACGTGTGGAAT-337(序列8)。HVT-US2rightsense：5-ATCgtcgacACTAATATGGGCACACCCAC-329(序列9)；HVT-US2rightantisense：5-ATCaagcttTGGCCCATCTAGGTGATTAT-329(序列10)。MDV1-GB-F:cggTTAATTAAgacctcccttggccatgatgaatgg36(序列11)；MDV1-GB-R:ccgTTAATTAAagaaggaaagcatcgagcaatcac36(两端加入了PACI酶切位点，序列12)。3.重组病毒的构建利用重组质粒(PHVT-DS-MDV1-GB)与HVT基因组共转染CEF，待出现蚀斑后，将细胞传一代，留一半液氮冻存，另一半超声破碎后利用有限稀释法稀释病毒传至96孔细胞培养板中(做好稀释梯度，使每孔平均仅含有1个蚀斑或少于1个蚀斑)，待蚀斑出现后，挑选仅含有1个蚀斑的孔进行传代，1个孔传平行的2个孔。待蚀斑出现后，其中1个孔利用间接免疫荧光(利用抗MDV-GB的单抗进行筛选)检测重组病毒，如果为阳性，对应的另1个孔的病毒则含有重组病毒，经过多轮纯化后，进行毒种保存鉴定，该病毒株被命名为重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB株(CGMCCNo.13400)。实施例2——重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF、rHVT-GB-ILTVGB和rHVT-GB-IBDVVP2的构建利用rHVT-GB为载体平台，分别表达了新城疫病毒(NDV)的F基因、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的GB基因和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)的VP2基因。具体构建方法如下：1.重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF、rHVT-GB-ILTVGB和rHVT-GB-IBDVVP2株的构建按常规方法提取HVT病毒基因组DNA，根据Genebank中发表的HVT-FC126株(GenBank:AF291866.1)的全基因序列，扩增左同源臂，扩增左同源臂连接至PMD19-Tsimple载体，构建成质粒PMD19-L。设计引物(序列15和序列16)扩增启动子，将启动子克隆入PMD19-L中，构建成质粒PMD19-L-PRO。然后设计引物(序列17和序列18)扩增VP2基因，将VP2基因克隆入PMD19-L-PRO中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2。设计引物(序列19和序列20)扩增PolyA，将PolyA克隆入PMD19-L-PRO-VP2中，构建成质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA；最后设计引物HVT-R-F(序列21)和HVT-R-R(序列22)扩增右同源臂，克隆入质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA，构建成最终的重组质粒PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R，该质粒用来将IBDV-VP2重组到rHVT-GB基因组中的HVT065和HVT066之间。在构建PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R的过程中，VP2基因两端设计了NotI酶切位点，利用此酶切位点可以将NDV-F和ILTV-GB克隆入PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R，分别构建重组质粒PMD19-L-PRO-F-PolyA-R和PMD19-L-PRO-GB-PolyA-R。参考rHVT-GB的构建方法，分别将PMD19-L-PRO-VP2-PolyA-R、PMD19-L-PRO-F-PolyA-R和PMD19-L-PRO-GB-PolyA-R重组质粒与rHVT-GB基因组共转染CEF，借助间接免疫荧光技术利用有限稀释法克隆重组病毒，利用该方法分别获得重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF(CGMCCNo.13399)、rHVT-GB-ILTVGB(CGMCCNo.13398)和rHVT-GB-IBDVVP2(CGMCCNo.13397)。HVT-L-F:5-GTTCCTTGAAATGCCGACAACTCTAAAAACGGTATTCG-338(序列13)；HVT-L-R:5-GCTAGCGCGGCCGCGAATTCGTTTAATGTTAGTTTATT-338(下游引物5’端含有NheI/NotI/EcoRI酶切位点，序列14)；PRO-F:-GGGGAATTCACTAGTGGATCCCCCAACTCCGCCCGTTTTATGACTAGA-348(EcoRI，序列15)；PRO-R:5-AAATTGCGGCCGCCTGCAGCGAGGAGCTCTGCGTTCTACGGTGGT-345(NotI，序列16)Vp2-F:5-aatGCGGCCGCTCTAGAACTCGTCGATCGCAGCGATGACAAACCTGCAAG-350(NotI，序列17)；Vp2-R:5-GGCGCTAGCAAGCTTACCTCCTTATAGCCCGGATTATGTCTTTGAAGCCA-350(HindIII/NheI，序列18),polyA-F:5-AATAAGCTTGATCTAGAGCGGCCGCGG-327(HindIII，序列19)；polyA-R:5-AATGCTAGCGTCGACTCTAGAGGATCCG-328(SalI/NheI，序列20)，HVT-R-F:5-GGCGGTCGACAATTATTTTATTTAAT-326(序列21)；HVT-R-R:5-GGCGCTAGCCTAGTGTTTCAATTAT-325(序列22)实施例3——重组病毒的验证1.rHVT-GB重组病毒将50PFU病毒量的rHVT-GB和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，PBS洗1次，rHVT-GB和HVT接种孔中分别加入0.5mL(1:100稀释)MDV1-GB单抗，放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mLFITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，细胞蚀斑出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，结果表明MDV1-GB基因能够良好的正确表达。2.rHVT-GB-NDVF重组病毒将50PFU病毒量的rHVT-GB-NDVF和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，PBS洗1次，rHVT-GB-NDVF和HVT接种孔中加入0.5mL(1:100稀释)MDV1-GB单抗，另外rHVT-GB-NDVF和HVT接种孔中加入0.5mL抗NDV-F小鼠血清。放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mLFITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，rHVT-GB-NDVF接种孔中细胞蚀斑，加入MDV1-GB单抗或抗NDV-F小鼠血清后均出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，表明MDV1-GB基因和NDV-F基因均能够良好的正确表达。3.重组病毒rHVT-GB-ILTVGB将50PFU病毒量的rHVT-GB-ILTVGB和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，PBS洗1次，rHVT-GB-ILTVGB和HVT接种孔中加入0.5mL(1:100稀释)MDV1-GB单抗，另外rHVT-GB-ILTVGB和HVT接种孔中加入0.5mL抗ILTV-GB小鼠血清。放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mLFITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，rHVT-GB-ILTVGB接种孔中细胞蚀斑，加入MDV1-GB单抗或抗ILTV-GB小鼠血清后均出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，表明MDV1-GB基因和ILTV-GB基因均能够良好的正确表达。4.rHVT-GB-IBDVVP2重组病毒将50PFU病毒量的rHVT-GB-IBDVVP2和HVT接种于12孔细胞培养板上。培养出现明显蚀斑后，将生长液倒掉，用冷的丙酮:乙醇(3:2)固定液固定10min，PBS洗1次，rHVT-GB-IBDVVP2和HVT接种孔中加入0.5mL(1:100稀释)MDV1-GB单抗，另外rHVT-GB-IBDVVP2和HVT接种孔中加入0.5mL抗IBDV-VP2小鼠血清。放置于37℃恒温培养箱中反应1h，用PBS清洗3次，每孔加上0.5mLFITC标记抗鼠IgG荧光抗体，放置于37℃恒温生化培养箱中反应1h，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察，rHVT-GB-IBDVVP2接种孔中细胞蚀斑，加入MDV1-GB单抗或抗IBDV-VP2小鼠血清后均出现了特异性绿色荧光，而对照组HVT感染CEF细胞后无荧光，表明MDV1-GB基因和IBDV-VP2基因均能够良好的正确表达。实施例4——重组病毒制备疫苗将重组病毒接种鸡胚成纤维细胞，制备种子病毒；用转瓶进行扩大培养，接种密度为每1cm2面积接种1000PFU的重组病毒，接种后约50小时，有70％以上单层细胞出现典型的细胞病变(CPE)时，倒去培养液，加入适量胰酶消化液，在室温下消化10min左右，细胞单层出现疏松拉网接近脱离瓶壁现象时，立即加入与消化液等量的含10％牛血清的营养液，停止消化。轻轻摇动转瓶，使细胞全部脱离瓶壁，离心收集的细胞用超声波裂解后加入适量SPGA稳定剂，摇匀后分装冻干。实施例5——rHVT-GB疫苗对鸡预防MD的免疫保护效力评价80只1日龄SPF鸡，随机分成4组，第1组接种rHVT-GB，免疫剂量为4000PFU/只，第2组接种HVT,免疫剂量为4000PFU/只。第3组为攻毒对照组(非免疫攻毒)，第4组为空白对照组(非免疫非攻毒组)。7日龄时，1、2、3组鸡只经腹腔分别接种1000PFU病毒量的鸡马立克氏病超强毒Md5株，四组鸡在70日龄时全部剖杀，统计结果。以免疫鸡攻毒保护指数(PI)作为评价疫苗免疫效力的指标。攻毒前死亡的鸡只判定为非特异性死亡，不计入试验鸡数。对攻毒后死亡及试验结束存活的鸡只计数并逐一剖检，详细记录各试验组MD病变阳性鸡只数，对MD病变可疑鸡只采取病料进行病理学检查。MD阳性鸡是指由MD导致死亡鸡、具有眼观MD肿瘤病变鸡只以及眼观MD肿瘤病变可疑而组织病理学检验为MD病理变化的鸡只。试验疫苗的免疫效力用保护指数(PI)表示，其中：统计结果见表1，攻毒对照组出现100％的MD特异性病变。HVT免疫组出现45％的MD特异性病变，包括前期的MD特异性死亡，疫苗保护指数为55；rHVT-GB免疫组疫苗保护指数为75，明显优于HVT免疫组。表1rHVT-GB对SPF鸡的免疫保护效果实施例6——rHVT-GB-NDVF疫苗对鸡预防ND免疫保护效力评价80只1日龄SPF鸡，随机分成4组,第1组接种rHVT-GB-NDVF，免疫剂量为4000PFU/只，第2组接种rHVT-GB，免疫剂量为4000PFU/只，第3组为攻毒对照组(非免疫攻毒组)，第三组为空白对照(非免疫非攻毒)组。免疫后21日，1、2、3组鸡各肌肉注射新城疫北京株强毒0.5ml(含105EID50)，观察14d，rHVT-GB-NDVF保护率达到90％。表2rHVT-GB-NDVF对SPF鸡的免疫保护效果组别试验动物数攻毒用毒株ND发病或死亡保护率(％)rHVT-GB-NDVF疫苗免疫组20NDV(北京株)290rHVT-GB疫苗免疫组20NDV(北京株)200攻毒对照组-20NDV(北京株)200空白对照组-20-0-实施例7——rHVT-GB-ILTVGB疫苗对ILT免疫保护效力评价80只1日龄SPF鸡，随机分成4组,第1组接种rHVT-GB-ILTVGB疫苗，免疫剂量为4000PFU/只，第2组接种rHVT-GB疫苗，免疫剂量为4000PFU/只，第3组为攻毒对照组(攻毒对照组)，第三组为空白对照(非免疫非攻毒)组。免疫后21日，1、2、3组鸡各气管内注射鸡传染性喉气管炎强毒株0.2ml(含104EID50)，观察10d，rHVT-GB-ILTVGB保护率达到100％。表3rHVT-GB-ILTVGB对SPF鸡的免疫保护效果组别试验动物数攻毒用毒株ILT发病数保护率(％)rHVT-GB-ILTVGB疫苗免疫组20ILTV(北京株)0100rHVT-GB疫苗免疫组20ILTV(北京株)200-攻毒对照组20ILTV(北京株)200空白对照组-20-0-实施例8——rHVT-GB-IBDVVP2疫苗对鸡预防IBD免疫保护效力评价80只1日龄SPF鸡，随机分成4组,第1组接种rHVT-GB-IBDVVP2，免疫剂量为4000PFU/只，第2组接种rHVT-GB，免疫剂量为4000PFU/只，第3组为攻毒对照组(非免疫攻毒组)，第三组为空白对照(非免疫非攻毒)组。21日龄每只点眼攻击BC6/85株10个MID，72小时后剖检法氏囊，观察法氏囊病变。rHVT-GB-IBDVVP2免疫组保护17只。第2组(rHVT-GB免疫组)和第3组(攻毒对照组)法氏囊均发生病变(法氏囊出现浆膜呈胶冻样或有不同程度的出血)。表4rHVT-GB-IBDVVP2对SPF鸡的免疫保护效果组别试验动物数攻毒用毒株IBD病变数保护率(％)rHVT-GB-IBDVVP2疫苗免疫组20IBDVBC6/85株385rHVT-GB疫苗免疫组20IBDVBC6/85株200-攻毒对照组20IBDVBC6/85株200-空白对照组20-0-序列表　　<110>北京邦卓生物科技有限公司　　<120>表达血清Ⅰ型MDVGB基因的HVT构建及其作为病毒活载体表达外源基因的应用　　<130>　　<160>22　　<170>Patentinversion3.5　　<210>1　　<211>3870　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：构建rHVT-GB所用MDV1-GB表达盒序列　　<400>1gacctcccttggccatgatgaatggttggagatggtaaaatcggcatcaagtgatgtagc060tcgtagacgtaaaatgtatgcagagcgtttaacaaagaagtccctagcgagtctggataa120atgtattaccgaacaaagacatgaactagaaaaaatgttgcgtgtgaatgtatatggcga180agtattgatagactcttatacggcattattcaatgggttccgttccaggaaaagattatt240ggaagcggttaaaaattgctgtgcaaacatcattgataatcgtaatagtgacgatgcatt300tgatgctcatcggttcatgcaaacatcattactgaaacacagaatagatcctgctatgct360tccaagtctcactcacaaattttttcaacttgtgaatggaccgatgtttagtcacgatag420acatcggttcgcccagccgtcgaatacagcattatattttagtgttgaaaatgtagggct480gcttcctcacttaaaggaggaaatggctcgattcatgtttcatagcagtagaaaaacaga540ttggaccgtcagtaagtttagagggttttatgactttagcactatagataatgtaactgc600ggcccatcgcatggcttggaaatatatcaaagaactgatttttgcaacagctttattttc660ttctgtatttaaatgtggcgaattgcacatctgtcgtgccgacagtttgcagatcaacag720caatggagactatgtatggaaaaatggaatatatataacatatgaaaccgaatatccact780tataatgattctggggtcagaatcaagcacttcagaaacgcaaaatatgactgcaattat840tgatacagatgttttttcgttgctttattctattttgcagtatatggcccccgttacggc900agatcaggtgcgagtagaacagattaccaacagccacgcccccatctgacccgtccaata960ttcttgtgtccctgcattttatctcacacaatttatgaacagcatcattaagatcatctc1020actatgcactattttaggcggaattgcatttttttccttatagttattctatatggtacg1080aactcatctccgagtacccaaaatgtgacatcaagagaagttgtttcgagcgtccagttg1140tctgaggaagagtctacgttttatctttgtcccccaccagtgggttcaaccgtgatccgt1200ctagaaccgccgcgaaaatgtcccgaacctagaaaagccaccgagtggggtgaaggaatc1260gcgatattatttaaagagaatatcagtccatataaatttaaagtgacgctttattataaa1320aatatcattcagacgacgacatggacggggacgacatatagacagatcactaatcgatat1380acagataggacgcccgtttccattgaagagatcacggatctaatcgacggcaaaggaaga1440tgctcatctaaagcaagataccttagaaacaatgtatatgttgaagcgtttgacagggat1500gcgggagaaaaacaagtacttctaaaaccatcaaaattcaacacgcccgaatctagggca1560tggcacacgactaatgagacgtataccgtgtggggatcaccatggatatatcgaacggga1620acctccgtcaattgtatagtagaggaaatggatgcccgctctgtgtttccgtattcatat1680tttgcaatggccaatggcgacatcgcgaacatatctccattttatggtctatccccacca1740gaggctgccgcagaacccatgggatatccccaggataatttcaaacaactagatagctat1800ttttcaatggatttggacaagcgtcgaaaagcaagccttccagtcaagcgtaactttctc1860atcacatcacacttcacagttgggtgggactgggctccaaaaactactcgtgtatgttca1920atgactaagtggaaagaggtgactgaaatgttgcgtgcaacagttaatgggagatacaga1980tttatggcccgtgaactttcggcaacgtttatcagtaatacgactgagtttgatccaaat2040cgcatcatattaggacaatgtattaaacgcgaggcagaagcagcaatcgagcagatattt2100aggacaaaatataatgacagtcacgtcaaggttggacatgtacaatatttcttggctctc2160gggggatttattgtagcatatcagcctgttctatccaaatccctggctcatatgtacctc2220agagaattgatgagagacaacaggaccgatgagatgctcgacctggtaaacaataagcat2280gcaatttataagaaaaatgctacctcattgtcacgattgcggcgagatattcgaaatgca2340ccaaatagaaaaataacattagacgacaccacagctattaaatcgacatcgtctgttcaa2400ttcgccatgctccaatttctttatgatcatatacaaacccatattaatgatatgtttagt2460aggattgccacagcttggtgcgaattgcagaatagagaacttgttttatggcacgaaggg2520ataaagattaatcctagcgctacagcgagtgcaacattaggaaggagagtggctgcaaag2580atgttgggggatgtcgctgctgtatcgagctgcactgctatagatgcggaatccgtcact2640ttgcaaaattctatgcgagttatcacatccactaatacatgttatagccgaccattggtt2700ctattttcatatggagaaaaccaaggaaacatacagggacaactcggtgaaaacaacgag2760ttgcttccaacgctagaggctgtagagccatgctcggctaatcatcgtagatattttctg2820tttggatccggttatgctttatttgaaaactataattttgttaagatggtagacgctgcc2880gatatacagattgctagcacatttgtcgagcttaatctaaccctgctagaagatcgggaa2940attttgcctttatccgtttacacaaaagaagagttgcgtgatgttggtgtattggattat3000gcagaagtagctcgccgcaatcaactacatgaacttaaattttatgacataaacaaagta3060atagaagtggatacaaattacgcgtttatgaacggtttggccgaattgtttaacggtatg3120ggtcaggtagggcaagctataggcaaagttgtagtaggggctgccggtgcaatcgtatct3180accatatctggtgtctctgctttcatgtcaaatccctttggggctttggcaatcggttta3240atcattatagcaggactcgtggctgcatttttagcatatcgttatgtaaacaagcttaaa3300agcaatccaatgaaagccctttatcctatgacaacagaagtgcttaaggcacaggcaacg3360cgtgagttgcatggcgaggaatcagatgatttggaacgaacatctattgatgaaagaaaa3420ttagaagaagctagagaaatgataaaatatatggcgttagtctccgcggaagaacgccac3480gagaaaaaactgcggagaaagaggcgaggcactaccgccgttctatcggaccacctggca3540aaaatgaggattaaaaatagtaaccctaaatatgataagttacctactacatattcagac3600tcagaagatgatgctgtgtaagtgggcactattatatttgaactgaataaaacgcataga3660gcatgatatggtttactcatttattgcgagatataaagcatattcaatacgatatattgc3720gaacgtgatgctaaaaacatagctccctgtattattgatgcgccatcatttgattaataa3780atacatcgacgccggcatcactggtgcggtgtataccagctacggcgctagcattcatgg3840tatcccgtgattgctcgatgctttccttct3870　　<210>2　　<211>1391　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：构建重组火鸡疱疹病毒rHVT-GB-NDVF、rHVT-GB-ILTVGB和rHVT-GB-IBDVVP2所用启动子序列　　<400>2aactccgcccgttttatgactagaaccaatagtttttaatgccaaatgcactgaaatccc060ctaatttgcaaagccaaacgccccctatgtgagtaatacggggactttttacccaatttc120ccaagcggaaagccccctaatacactcatatggcatatgaatcagcacggtcatgcactc180taatggcggcccatagggactttccacatagggggcgttcaccatttcccagcatagggg240tggtgactcaatggcctttacccaagtacattgggtcaatgggaggtaagccaatgggtt300tttcccattactggcaagcacactgagtcaaatgggactttccactgggttttgcccaag360tacattgggtcaatgggaggtgagccaatgggaaaaacccattgctgccaagtacactga420ctcaatagggactttccaatgggtttttccattgttggcaagcatataaggtcaatgtgg480gtgagtcaatagggactttccattgtattctgcccagtacataaggtcaatagggggtga540atcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgcgtcaatagggactttccattggg600ttttgcccagtacataaggtcaataggggatgagtcaatgggaaaaacccattggagcca660agtacactgactcaatagggactttccattgggttttgcccagtacataaggtcaatagg720gggtgagtcaacaggaaagtcccattggagccaagtacattgagtcaatagggactttcc780aatgggttttgcccagtacataaggtcaatgggaggtaagccaatgggtttttcccatta840ctggcacgtatactgagtcattagggactttccaatgggttttgcccagtacataaggtc900aataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgagtcaatagggac960tttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtcaatgggtttttcc1020cattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttccagccaattt1080aattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaa1140cgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttctcgagcc1200aatacacgtcaatgggaagtgaaagggcagccaaaacgtaacaccgccccggttttcccc1260tggaaattccatattggcacgcattctattggctgagctgcgttctacgtgggtataaga1320ggcgcgaccagcgtcggtaccgtcgcagtcttcggtctgaccaccgtagaacgcagagct1380cctcgctgcag1391　　<210>3　　<211>1662　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：NDV-F基因序列　　<400>3atgggctccaaaccttctaccaggatcccagcacctctgatgctggtcacccggattatg060ctgatattaggctgtattcgttcgacaagctctcttgacggcaggcctcttgcagctgca120ggaattgtagtaacaggagataaggcagtcaatgtatacacctcgtctcagacagggtca180atcatagtcaagttgctcccgaatatgcccagggataaggaggcgtgtgcgaaagcccca240ttagaggcatataacagaacactgactactttgctcactcctcttggcgactccatccgc300aagattcaagggtctgtgtccacgtctggaggagggagacaggggcgccttataggtgct360gttattggcagtgtagctcttggggttgcaacagcggcacagataacagcagctgcggcc420ctaatacaagccaacaagaatgctgccaacatccttcggcttaaggagagcattgctgca480accaatgaagctgtgcatgaagtcaccgacggattatcacaactatcagtggcagttggg540gagatgcagcagtttgtcaatgaccagtttaataatacggcgcgagaattggactgtata600aaaatcacacaacaggttggtgtagaactcaacctatacctaactgaattgactacagta660ttcgggccacagatcacctctcctgcattaactcagctgaccatccaggcactttataat720ttagctggtggcaatatggattacttattaactaagttaggtatagggaacaatcaactc780agctcattaattggtagcggcctgatcactggttaccctatactgtatgactcacagact840caactcttgggcatacaagtgaatttgccctcagtcgggaacttaaataatatgcgtgcc900acctatttggagaccttatctgtgagtacaaccaaaggatatgcctcagcacttgtcccg960aaagtagtgacacaagtcggttctgtgatagaagagcttgacacctcacactgtatagag1020tccgatctggatttatattgtactagaatagtgacattccccatgtccccaggtatttat1080tcctgtttgagcggcaacacatcagcttgcatgtattcaaagactgaaggcgcactcact1140acgccgtatatggcccttaaaggctcagttattgccaattgtaagataacaacatgtaga1200tgtacagaccctcctggtatcatatcgcaaaattatggagaagctgtatccctgatagat1260agacattcgtgcaatgtcttatcattagacgggataactctgaggctcagcggagaattt1320gatgcaacttatcaaaagaacatctcaatactagattctcaagtcatcgtgacaggcaat1380cttgatatatcaaccgaacttggaaacgtcaacaattcaatcagcaatgccttggataag1440ttggcagaaagcaacagtaagatagaaaaagtcaatgtcagattaaccagcacatctgct1500ctcattacctatattgttctaactgtcatttctctatttttcggtgcacttaatctgggt1560ttagcgtgttacctgatgtacaaacagaaggcacaacaaaagaccttgctatggcttggg1620aataatgcccttgatcagatgagagccactacaagagcatga1662　　<210>2　　<211>2652　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：ILTV-GB基因序列　　<400>4atgcaatcctacatcgccgtgaacattgacatggctagcttgaaaatgctgatctgcgtg060tgcgtggcaatcctgatcccatctaccctatctcaagattcacacggaattgctggaata120atagaccctcgtgatacagccagcatggatgttggaaaaatctctttctccgaagccatt180gggtcgggggcaccgaaagaaccccagattagaaacagaatttttgcgtgctcatctcca240actggcgccagtgttgcgaggcttgcccagccacgacattgtcaccgacatgccgattcg300actaacatgactgaaggaattgccgtagtcttcaagcaaaacattgccccgtacgtcttt360aatgtgactctatactataaacatataaccacagttactacgtgggcattattctcaaga420ccccaaataacaaatgagtacgtgaccagggttccaatagactatcatgaaattgtcagg480attgatcgatcgggagaatgctcatccaaagcaacgtatcataaaaatttcatgtttttt540gaagcttacgacaatgatgaagcagaaaaaaaattgcccctggttccatcactgttaaga600tcaactgtctccaaggcgtttcatacaactaactttactaagcgacatcaaaccctggga660taccgaacgtctacatcggtcgactgtgttgtggaatatctacaggctagatctgtatac720ccgtatgattactttggaatggcgacaggtgatacagtagaaatttctcctttttatacc780aaaaacacgaccggaccaaggcgtcacagtgtctacagagactatagatttctcgaaatc840gcaaattatcaagtcagggatttggaaaccggacaaataagaccccctaaaaaaagaaac900tttctaacagatgaacaattcactataggctgggatgcaatggaagaaaaggaatctgta960tgtactctcagtaaatggattgaagtcccggaagcagttcgtgtttcgtacaaaaacagt1020taccacttttcacttaaagatatgactatgacgttctcgtccggaaaacaaccttttaac1080atcagcaggcttcatttggctgaatgcgttcctaccatagcctcggaggccatagatggc1140atctttgccagaaagtatagttcgactcatgtccgttctggggacatcgaatactatctc1200ggtagtggcggatttctgatcgcatttcagaaactcatgagccatggcttggctgaaatg1260tacctagaagaggcacaaagacaaaatcatctcccgagagggagagagcgtcgccaagcc1320gcaggtcgccgcacggcgtcgctgcagtctggacctcagggtgatagaattactacccac1380agttctgcaacatttgccatgttacaatttgcatacgacaaaatccaagcccatgttaac1420gagcttatcggaaatttgttggaagcgtggtgtgagcttcagaaccgccaactgattgta1500tggcatgagatgaagaaactaaacccgaactcactgatgacatctttgttcggacaacct1560gtaagcgccaggctattgggagacatcgtagcggtatcaaaatgtatagaaattccaatc1620gaaaatattaggatgcaggattccatgcgcatgccaggggacccaaccatgtgctatacc1680agaccagtacttattttcaggtattcgtcctcccctgagtcacagttttctgcgaactca1740acagaaaaccacaatcttgacatattaggccaactcggagaacataatgaaattttacaa1800gggcggaatttgatagaaccatgcatgatcaatcacagacggtactttctgttgggagaa1860aactaccttctttacgaagactatacatttgttagacaagtaaatgcttccgagatcgaa1920gaagtgagcatattcatcaacttgaacgccactatactagaagatttggactttgtgccc1980gtcgaagtatacactcgcgaggaactcagagatactgggactttaaactatgatgatgtg2040gtcagatatcaaaatatttataacaaaaggttcagagacattgacactgtaatacgtgga2100gataggggagatgcaatctttagagcaatagcagatttttttggcaacactcttggagaa2160gtaggaaaggcattgggaactgtagtgatgacagccgcggcagcagtaatttctacagta2220tctggcatcgcctcatttctttctaacccgttcgccgcactcggaattgggatagcggtg2280gtggtgagcattattttaggactgctggcgttcaaatatgtaatgaacctgaaatcaaac2340ccagttcaggttctgttcccaggcgcagttcccccggccggaactcctccacgaccctct2400agacgttactacaaggatgaggaggaggttgaggaggatagtgatgaggacgacaggata2460cttgccaccagagttctgaaaggccttgagcttctacacaaggatgaacagaaagctcga2520agacagaaagcgcggttttctgcttttgctaaaaatatgagaaacctatttcgcagaaaa2580ccccgaaccaaggaagatgactaccccctgctcgaatacccttcgtgggcagaagaaagc2640gaagacgaataa2652　　<210>5　　<211>1359　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：IBDV-VP2基因序列　　<400>5Atgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatg060Ccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtca120Gagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgtctttttc180Cctggattccctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactac240Aagttcgatcagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagctacaactactgcaga300Ctagtgagtcggagtctcacagtgaggtcaagcacactccctggtggcgtttatgcacta360Aacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactgacagatgttagc420tacaatgggttgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattgggaatgtcctggta480ggggaaggggtcactgtcctcagcctacccacatcatatgatcttgggtatgtgaggctt540ggtgaccccattcccgctatagggcttgacccaaaaatggtagctacatgcgacagcagt600gacaggcccagagtctacaccataactgcagccgatgattaccaattctcatcacagtac660caaccaggtggggtaacaatcacactgttctcagccaacattgatgctatcacaagcctc720agcattgggggagagctcgtgtttcaaacaagcgtccaaggccttgtactgggcgccacc780atctaccttataggctttgatgggactgcggtaatcaccagagctgtagccgcagataat840gggctgacggccggcaccgacaatcttatgccattcaatcttgtcattccaaccaatgag900ataacccagccaatcacatccatcaaactggagatagtgacctccaaaagtggtggtcag960gcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatccatggtggc1020aactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacagga1080tccgtcgttacggtcgctggggtgagtaacttcgagctgattccaaatcctgaactagca1140aagaacctggttacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaactacacaaaattg1200atactgagtgagagggaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacact1260gattttcgtgagtacttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcagga1320gcatttggcttcaaagacataatccgggctataaggagg1359　　<210>6　　<211>232　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：PolyA序列　　<400>6tctagagcggccgcggggatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaacca060Caactagaatgcagtgaaaaaaatgctctatttgtgaaatttgtgatgctattgctttat120ttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcatcttatgt180ttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttcggatcctctagagtcgac232　　<210>7　　<211>29　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增后US2基因左右臂序列的引物HVT-US2leftsense<400>7GATgaattcACATCGGGCCACGTTCCGCC-329　　<210>8　　<211>37　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增后US2基因左右臂序列的引物HVT-US2leftantisense<400>8ATAGTCGACttaattaaGATGAGCTGACGTGTGGAAT-337　　<210>9　　<211>29　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增后US2基因左右臂序列的引物HVT-US2rightsense　　<400>9　　ATCgtcgacACTAATATGGGCACACCCAC-329；　　<210>10　　<211>29　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增后US2基因左右臂序列的引物HVT-US2rightantisense<400>10ATCaagcttTGGCCCATCTAGGTGATTAT-329　　<210>11　　<211>36　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：MDV1-GB基因上游引物MDV1-GB-F<400>11cggTTAATTAAgacctcccttggccatgatgaatgg36　　<210>12　　<211>36　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：MDV1-GB基因的下游引物MDV1-GB-R<400>12ccgTTAATTAAagaaggaaagcatcgagcaatcac（两端加入了PACI酶切位点）36　　<210>13　　<211>38　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增左同源臂上游引物HVT-L-F　　<400>13　　gttccttgaaatgccgacaactctaaaaacggtattcg38　　<210>14　　<211>38　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增左同源臂下游引物HVT-L-R　　<400>14　　GCTAGCGCGGCCGCGAATTCgtttaatgttagtttatt(下游引物5’端含有NheI/NotI/EcoRI酶切位点)38　　<210>15　　<211>48　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增启动子的上游引物PRO-F　　<400>15　　GGGGAATTCACTAGTGGATCCCCCAACTCCGCCCGTTTTATGACTAGA(EcoRI)48　　<210>16　　<211>45　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增启动子的下游引物PRO-R　　<400>16　　AAATTGCGGCCGCCTGCAGCGAGGAGCTCTGCGTTCTACGGTGGT(NotI)45　　<210>17　　<211>50　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增Vp2基因的上游引物Vp2-F　　<400>17　　aatGCGGCCGCTCTAGAACTCGTCGATCGCAGCGATGACAAACCTGCAAG(NotI)50　　<210>18　　<211>50　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增VP2基因的下游引物Vp2-R　　<400>18　　GGCGCTAGCAAGCTTACCTCCTTATAGCCCGGATTATGTCTTTGAAGCCA(HindIII/NheI)50　　<210>19　　<211>27　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增polyA的上游引物polyA-F　　<400>19　　AATAAGCTTGATCTAGAGCGGCCGCGG(HindIII)27　　<210>20　　<211>28　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增polyA的下游引物polyA-R　　<400>20　　AATGCTAGCGTCGACTCTAGAGGATCCG(SalI/NheI)28　　<210>21　　<211>26　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增右同源臂的上游引物HVT-R-F　　<400>21　　GGCGGTCGACaattattttatttaat26　　<210>22　　<211>32　　<212>DNA　　<213>人工序列　　<223>对人工序列的描述：扩增右同源臂的下游引物HVT-R-R　　<400>22　　GGCGCTAGCctagtgtttcaattat254当前第1页1 2 3