本发明属于生物医药领域，本发明提供抗原性多肽，其可以用于产生能够结合pd-l1衍生的分子的抗体。本发明还涉及以高亲和力与pd-l1特异性结合的抗体或其功能性片段。本发明还提供了编码本发明抗体或其功能性片段的核酸分子，用于表达本发明抗体或其功能性片段的表达载体和宿主细胞，以及本发明抗体或其功能性片段的生产方法。本发明还提供了包含本发明抗体或其功能性片段的免疫缀合物以及药物组合物，以及使用本发明的抗体或其功能性片段增强t细胞的功能以上调细胞介导的免疫应答用于治疗t细胞功能失调性疾病的方法。
背景技术：
：程序性细胞死亡蛋白配体1(programmeddeath-ligand1,pd-l1)，又可称为分化簇274(clusterofdifferentiation274，cd274)或者b7同源蛋白1(b7homolog1，b7-h1)，属于肿瘤坏死因子超家族，是由290个氨基酸残基组成的i型跨膜糖蛋白，包含一个igv样区、一个igc样区、一个跨膜疏水区和一个30个氨基酸的胞内尾部,完整分子量为40kda1。pd-l1mrna在几乎所有组织中都有表达，但pd-l1蛋白只在少部分组织中持续表达，包括肝脏、肺脏、扁桃体以及免疫特赦组织如眼、胎盘等。pd-l1也表达于活化的t细胞，b细胞，单核细胞，树突状细胞，巨噬细胞等2。pd-l1的受体为pd-1，主要表达于cd4+t细胞、cd8+t细胞、nkt细胞、b细胞和活化的单核细胞等免疫细胞表面。pd-l1与pd-1结合可以启动pd-1胞浆区itim(免疫受体酪氨酸抑制作用模块)酪氨酸残基的磷酸化，促使酪氨酸磷脂酶与shp2结合，活化shp2,使下游syk和pi3k发生去磷酸化从而传递终止信号，限制抗原呈递细胞或者树突状细胞与t细胞的相互作用3。这种结合还可以进一步抑制t细胞的代谢，抑制抗凋亡蛋白bcl-x2的分泌，减少效应细胞因子il-2,ifn-r的分泌，诱导t细胞耗竭和凋亡，从而降低免疫t细胞参与的免疫应答，行使负性调节功能4。t细胞识别抗原并活化后会分泌ifn-r。t细胞来源的ifn-r会扩增和维持t细胞功能，比如上调mhc分子，增强目标细胞的抗原处理和呈递，促进t细胞分化。ifn-r同时也会诱导免疫炎症部位组织的pd-l1表达，防止过度免疫对组织造成伤害。ifn-r可以诱导常规上皮细胞，血管内皮细胞，髓样细胞，幼稚t细胞等细胞表面pd-l1的表达5,6。ifn-r诱导产生的干扰素调节因子1(irf-1)也可以与pd-l1转录起始位点前200bp和320bp处的干扰素调节因子结合位点结合，从转录水平调节pd-l17。pd-l1可以与t细胞表面的pd-1结合行使负调节功能，从而保护炎性部位。pd-l1的负性调控功能在肿瘤免疫中发挥着重要作用。2004年，konishi等率先在非小细胞肺癌病人的组织样本中发现pd-l1的表达，随后pd-l1被发现表达于各种肿瘤病人的组织中，包括胃癌，肺癌，肝癌，肝内胆管癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫颈癌，头颈鳞状细胞癌，鼻咽癌，食管癌，膀胱癌，肾细胞癌，皮肤癌，口腔鳞状细胞癌等8,9。细胞恶变过程中，由于基因突变、外源基因(病毒)表达或静止基因激活等原因会产生新的蛋白分子，这些蛋白质在细胞内降解后，某些降解的肽段可以表达于细胞表面，成为肿瘤抗原。免疫系统可以通过免疫监察识别肿瘤抗原并清除肿瘤细胞，而肿瘤细胞则利用pd-l1逃避免疫攻击。肿瘤部位pd-l1的表达可以通过多种途径保护肿瘤细胞免受伤害。肿瘤浸润淋巴细胞(til)分泌ifn-r可诱导肿瘤细胞及周围基质细胞表达pd-l1。而肿瘤细胞的pd-l1可以与til上pd-1结合，抑制til细胞的活化，并进一步导致其凋亡。体外实验证明，肿瘤细胞相关pd-l1可以增加肿瘤特异t细胞的调亡，而pd-l1单克隆抗体可以减弱这种作用。肿瘤相关pd-l1可以促进t细胞表达il-10，进一步抑制免疫反应。pd-l1不仅仅是pd-1的配体，他也可以作为受体传递反向的信号保护肿瘤细胞免受fas-fasl等其他抗肿瘤途径诱导的凋亡2。多种慢性和急性病毒也利用pd-l1信号逃避人体免疫检测。wang等发现hiv感染者骨髓来源的树突状细胞上pd-l1的表达明显上调，经过抗病毒感染，抑制hiv复制后，pd-l1的表达下调，同时伴随t细胞数目的上调10；chen等研究发现慢性hbv感染者的t淋巴细胞和树突状细胞上pd-l1的表达也上调11。病毒感染会诱导感染细胞高表达pd-l1，同时诱导cd8+t细胞表达pd-1，从而抑制t细胞作用，导致效应t细胞耗竭。技术实现要素：本发明的一个目的是，提供增强t细胞功能的相关靶点的抗体和所述抗体的功能片段，使用所述抗体或抗体功能片段增强t细胞的功能以上调细胞介导的免疫应答用于治疗t细胞功能失调性疾病的方法。为了实现上述目的，本发明的发明人做了深入研究，由此他们发现了特异性结合pd-l1并抑制pd-l1与pd-1结合，从而增强t细胞功能的抗体，即js003,本发明包括以下内容。一方面，本发明的抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列seqidno:7，8，9，13，14，15，19，20，21，22，23，24，28，29，30或所述序列之变体的重链cdr，和/或选自氨基酸序列seqidno:1，2，3，4，5，6，10，11，12，16，17，18，25，26，27或任何所述序列之变体的轻链cdr。在另一方面，本发明进一步提供了能够结合pd-l1的抗体或其功能性片段，其中所述重链cdr的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：hcdr1hcdr2hcdr3aseqidno:7seqidno:8seqidno:9bseqidno:13seqidno:14seqidno:15cseqidno:19seqidno:20seqidno:21dseqidno:22seqidno:23seqidno:24eseqidno:28seqidno:29seqidno:30和/或所述轻链cdr的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：在另一方面，本发明提供了能够结合pd-l1的抗体或其功能性片段，其重链cdr1、cdr2和cdr3以及轻链cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：在另一方面，本发明提供了能够结合pd-l1的抗体或其功能性片段，其包含选自氨基酸序列seqidno:33,35,37,38,40或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列seqidno:31,32,34,36,39或任何所述序列之变体的轻链可变区。在另一方面，本发明提供了能够结合pd-l1的抗体或其功能性片段，其为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。在另一方面，本发明提供了编码本发明的能够结合pd-l1的抗体或其功能性片段的分离的核酸分子，及包含所述核酸分子的表达载体或宿主细胞。在另一方面，本发明提供了能够结合pd-l1的抗体或其功能性片段，或编码其的核酸分子，或表达载体或宿主细胞在增强t细胞的功能以上调细胞介导的免疫应答用于治疗t细胞功能失调性疾病,如肿瘤，炎性疾病等疾病的药物中的用途。在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明所述的能够结合pd-l1的抗体或其功能性片段，编码本发明的能够结合pd-l1的抗体或其功能性片段的分离的核酸分子及表达载体或宿主细胞，或它们的任意组合，以及可药用的载体。在另一方面，本发明提供了一种免疫缀合物，其包含与治疗剂偶联的本发明所述的能够结合pcsk9的抗体或其功能性片段，优选地所述治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。附图说明图1人pd-l1的sds-page电泳图。图2elisa检测人pd-l1与pd-1的结合。图3facs检测人pd-l1与pd-1的结合。图4facs检测候选杂交瘤细胞抑制pd-l1与pd-1结合的效果。图5候选杂交瘤细胞的jurkat荧光素分析。图6嵌合抗体与人pd-l1的结合。图7嵌合抗体与293f细胞上pd-l1的结合。图8嵌合抗体抑制人pd-l1与293f细胞上pd-1的结合。图9嵌合抗体的jurkat荧光素分析。图10人源化抗体与人pd-l1的结合。图11人源化抗体与293f细胞上pd-l1的结合。图12人源化抗体抑制人pd-l1与293f细胞上pd-1的结合。图13人源化抗体的jurkat荧光素分析。图14体内实验检测人源化抗体对肿瘤生长抑制作用。具体实施方式除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用l-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。本发明提供了能够结合pd-l1的抗pd-l1抗体及其功能性片段。本发明的抗体或其功能性片段具有以下特性的至少一种：能够以高亲和力阻断pd-l1和pd-1的相互作用；能够与pd-l1以高特异性结合。本发明还提供了人源化抗pd-l1抗体及其功能性片段。所述人源化抗体由免疫小鼠产生的鼠源抗体经由计算机模拟设计并结合噬菌体展示技术而得到.在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。本发明的抗体可以是全长的(例如，igg1或igg4抗体)或可仅包含抗原结合部分(例如，fab、f(ab’)2或scfv片段)，或可以被修饰以影响功能。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗pd-l1抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(adcc)功能的抗体。在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(cdc)。本文所使用的术语“功能性片段”尤其是指抗体片段如fv、scfv(sc指单链)、fab、f(ab’)2、fab’、scfv-fc片段或者双抗体(diabody)、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，peg化”)(被称为fv-peg、scfv-peg、fab-peg、f(ab')2-peg或fab'-peg的聚乙二醇化片段)(“peg”为聚乙二醇)，所述片段具有egfr结合活性。优选地，所述功能片段将由其来源抗体的重或轻可变链的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于pd-l1，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种功能片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。本领域技术人员可以将编码本发明所述抗pd-l1抗体的dna分子克隆到载体中，进而转化宿主细胞。因此，本发明还提供了一种重组dna载体，其含有编码本发明所述抗pd-l1抗体的dna分子。优选地，所述重组dna载体是一种表达载体，本领域技术人员将所述抗体的dna分子克隆到表达载体中，转化宿主细胞，通过诱导表达获得抗体。本发明的表达载体含有编码抗pd-l1抗体的重链可变区、轻链可变区和/或恒定区的dna序列。然而，也可有分别构建两种表达载体，一种含有重链可变区和恒定区，另一种含有轻链可变区和恒定区，共同转染哺乳动物细胞。在一个优选的实施方案中，所述表达载体进一步含有启动子和编码分泌信号肽的dna序列，以及至少一种用于筛选的抗药基因。本发明所述宿主细胞可以为其为原核宿主细胞、真核宿主细胞或噬菌体。，所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞，可以为如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，如草地粘虫等昆虫细胞，如烟草等植物细胞，如bhk细胞、cho细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本发明所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选bhk细胞、cho细胞、nso细胞或cos细胞。本文使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如根据本发明的抗体、核酸分子、核酸分子组合和/或缀合物)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如pbs(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。根据本发明的药物组合物可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。在一个相关方面，本发明提供了为抗pd-l1抗体与第二治疗剂的组合的药物组合物。在一个实施方案中，所述第二治疗剂是有利地与抗pd-l1抗体组合的任意试剂。可有利地与抗pd-l1抗体组合的示例性试剂包括但不限于抑制pd-l1活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰pd-l1上游或下游信号转导的试剂。本文使用的术语“通过消除、抑制或降低pd-l1活性来预防或治疗疾病或病症”旨在表示由pd-l1表达所导致或者以pd-l1表达为症状/特征的疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自癌症或炎性疾病。本文使用的“治疗有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。一方面，本发明的抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列seqidno:7，8，9，13，14，15，19，20，21，22，23，24，28，29，30或所述序列之变体的重链cdr，和/或选自氨基酸序列seqidno:1，2，3，4，5，6，10，11，12，16，17，18，25，26，27或任何所述序列之变体的轻链cdr。在一些优选的实施方案中，所述抗体或其功能性片段的重链cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：hcdr1hcdr2hcdr3aseqidno:7seqidno:8seqidno:9bseqidno:13seqidno:14seqidno:15cseqidno:19seqidno:20seqidno:21dseqidno:22seqidno:23seqidno:24eseqidno:28seqidno:29seqidno:30和/或所述轻链cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：lcdr1lcdr2lcdr3aseqidno:1seqidno:2seqidno:3bseqidno:4seqidno:5seqidno:6cseqidno:10seqidno:10seqidno:12dseqidno:16seqidno:17seqidno:18eseqidno:25seqidno:26seqidno:27在一些优选的实施方案中，本发明抗体或其功能性片段的重链cdr1、cdr2和cdr3以及轻链cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列或其变体的组中的一组：在一些实施方案中，本发明抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列seqidno:33,35,37,38,40或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列seqidno:31,32,34,36,39或任何所述序列之变体的轻链可变区。在一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:33或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:31或其变体。在另一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:33或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:32或其变体。在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:35或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:34或其变体。在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:37或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:36或其变体。在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:38或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:36或其变体。在又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:40或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:39或其变体。本发明的抗体或其功能性片段可以是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。本发明的抗体或其功能性片段可以是人源化的。制备人源化抗体的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以通过将本发明的cdr序列转移至人抗体可变区中来制备本发明的人源化抗pd-l1抗体。所述人源化抗体不会产生抗抗体反应(aar)和人抗鼠抗体反应(hama)，不会因被抗抗体中和而被快速清除，并且具有免疫效应功能。在一些优选的实施方案中，本发明的人源化抗pd-l1抗体或其功能性片段包含选自氨基酸序列seqidno:33,35,37,38,40或任何所述序列之变体的重链可变区，和/或选自氨基酸序列seqidno:31,32,34,36,39或任何所述序列之变体的轻链可变区。在本发明人源化抗体或其功能性片段的一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:33或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:31或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:33或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:32或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的另一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:35或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:34或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的另一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:38或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:36或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:37或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:36或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:40或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:39或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:44或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:42或其变体。在本发明人源化抗体或其功能性片段的又一个优选的实施方案中，所述重链可变区为seqidno:48或其变体并且所述轻链可变区为seqidno:46或其变体。本发明还提供了编码本发明抗体或其功能性片段的分离的核酸分子。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含seqidno:43、47和/或45、49所示的核苷酸序列或其组合。本发明还提供了包含所述核酸分子的表达载体以及包含所述表达载体的宿主细胞。本发明提供了产生抗pd-l1抗体或其功能性片段的方法，其包括：在允许产生所述抗体或其功能性片段的条件下培养本发明的上述宿主细胞，以及回收因此产生的所述抗体或其功能性片段。在另一方面，本发明涉及包含与治疗剂缀合的本发明抗体或其功能性片段的免疫缀合物。所述治疗剂优选地为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。本发明还涉及包含本发明抗体或其功能性片段以及可药用载体的药物组合物。在另一方面，本发明提供了用于通过消除、抑制或降低pd-l1活性来预防或治疗疾病或病症的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的本发明抗体或其功能性片段，核酸，表达载体，宿主细胞，免疫缀合物或药物组合物。本发明还提供了本发明的抗体或其功能性片段、核酸、表达载体、宿主细胞、免疫缀合物或药物组合物在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途。提供了以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面，不应被解释为限制其范围。实施例1.克隆人pd-l1胞外结构区入真核表达质粒从义翘神州购买含有人pd-l1基因cdna序列的质粒hg10084-m,利用正向引物5’-gtacgctagccaccatgaggatatttgctgtc-3’，反向引物5’-gatcctcgagcgtgagtcctttcatttgg-3’，pcr扩增人pd-l1胞外片段。扩增片段经nhei和xhoi双酶切后，克隆到自主构建的真核表达质粒系统(pseccaga2ecd)中。以此质粒通过pei转染293e细胞，6天后，收集培养基上清液，通过亲和层析纯化人pd-l1胞外区蛋白。如图1所示，人pd-l1胞外区蛋白的sds-page电泳图。人pd-l1胞外区核苷酸序列：seqidno:41实施例2.elisa检测人pd-l1重组蛋白与pd-1的结合2.1生物素标记人pd-l1重组蛋白将人pd-l1重组蛋白与溶解于dmso中的生物素-xx-nhs以1：10比例混合，4摄氏度放置2小时，将反应混合物通过10kd的超滤柱以分离生物素标记的人pd-l1和游离的生物素。2.2elisa检测生物素标记人pd-l1与pd-1的结合为检验人pd-l1与pd-1的结合能力，在96孔酶标板上，铺板2μg/ml的pd-1在包被缓冲液中，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。然后加入含有2％牛奶的pbs溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后加入100μl不同浓度的生物素标记的人pd-l1，室温孵育1小时后用洗涤缓冲液冲洗3次，用洗涤缓冲液以1比10000倍稀释hrp-straptavidin，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入50μltmb底物溶液显色，室温反应8分钟后，以100μl2m的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。从图2可以看出，人pd-l1重组蛋白能特异性地与pd-1结合。实施例3.细胞水平检测pd-l1与pd-1的结合3.1构建293fpd-1稳转细胞株将构建的带puromycin筛选体系的pd-1全长序列的真核表达质粒通过pei转染至293f贴壁细胞中。转染24h后，通过puromycin(2μg/ml)进行筛选，直至形成293fpd-1稳转细胞库。同时通过有限稀释法，按每孔0.8个细胞，铺96孔板，15天后，挑选出293fpd-1单克隆，并进行传代，形成293fpd-1稳转细胞株。3.2生物素标记的人pd-l1与293fpd-1稳转细胞株的结合将不同浓度生物素标记的人pd-l1重组蛋白和293fpd-1稳转细胞混合，在37摄氏度孵育30分钟。以facsbuffer(20mmtris,100mmnacl,2mmca2+,1％fbs,ph7.4)洗脱3次后，加入straptavidinallophycocyanin(sa-apc，2μg/ml)在室温孵育30分钟。以facsbuffer洗脱3次后上细胞流式仪检测。如图3所示，pd-l1可以与293f细胞上的pd-1特异性的结合。实施例4.抗pd-l1鼠源抗体的制备4.1免疫动物将人pd-l1重组蛋白作为抗原与等量免疫佐剂(福氏佐剂)混合，取5只6周大雌性fvb小鼠进行免疫。在初次免疫以后，每周进行一次加强免疫，共进行四次免疫。4.2细胞融合在最后一针加强免疫后，取小鼠大腿根处淋巴结，在生理盐水中碾磨后取富含淋巴细胞的悬浮液，按常规电转方法将其与sp2/0细胞融合。将融合细胞在含有hat的rpmi-1640完全培养基中置于5％co2，37℃条件下培养。实施例5.杂交瘤细胞的筛选实验在12000株不同单克隆杂交瘤细胞中，通过酶标反应，筛选出950株分泌的抗体可结合人pd-l1蛋白的杂交瘤细胞；在这950株细胞中，有139株可以结合293f细胞上表达的pd-l1；在这139株细胞中，有23株具备抑制生物素标记的人pd-l1与293上pd-1的结合的能力。我们集中在这23株细胞进行后续实验。将上述23株杂交瘤细胞的上清与生物素标记的人pd-l1(10ug/ml)混合，室温孵育30分钟。然后将混合物与293fpd-1稳转细胞株在37摄氏度孵育30分钟，以facsbuffer洗涤细胞3次后，加入5μg/ml的sa-apc并孵育30分钟。facsbuffer洗涤细胞3次后，通过流式细胞仪检测以验证杂交瘤细胞分泌的抗体是否可以抑制人pd-l1与293f细胞表面的pd-1的结合。如图4，结果显示4，6，16，17，18，21对pd-l1与293f细胞上pd-1的结合有较好的抑制效果。实施例6.候选抗体的jurkat荧光素分析将表达pd-l1的cho细胞铺到96孔板，每孔细胞量为5×104，37℃，7％co2培养过夜，去除细胞上清，每孔中加入40ul抗体稀释液(起始浓度为60ug/ml，3倍浓度梯度稀释)，加入40ul可以持续表达pd-1和nfat-荧光素酶报告基因的jurkat报告细胞，总细胞数为1×105细胞，37℃，7％co2培养6小时，加入荧光素酶试剂，酶标仪检测发光值。如图5，荧光素检测结果显示4，6，16，17,18，21等对pd-l1抑制jurkat细胞中荧光素酶表达的现象有明显的回复作用。实施例7.候选抗体与人pd-l1重组蛋白的结合常数测定如表1所示，通过fortebio仪器测定不同的鼠源抗体与人pd–l1之间的结合常数。说明制备的鼠源抗体都能够特异性结合人pd-l1。表1样品4616171821kd(nm)1.70.10.51.62.30.9实施例8.候选抗体可变区序列的获得考虑杂交瘤细胞表达抗体的表达量、活性、类型等，选择6，16，18，21继续向下进行。培养候选杂交瘤细胞，1000rpm离心收集细胞，并以trizol提取总rna。以此为模板，合成第一链cdna后，以第一链cdna为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的可变区dna序列12。在50μl反应体系中,分别加入cdna1μl,10×pcr缓冲液5μl,上游及下游引物各1μl(25pmol),dntp1μl,25mmolplmgcl21μl,h2o39μl,95℃预变性10min,加taq酶1μl,进入温度循环,进行pcr扩增。反应条件为94℃变性1min,58℃退火1min,72℃延伸15s,共32个循环,然后72℃保温10min。将扩增产物测序后，得到候选杂交瘤重链和轻链可变区序列为：6lcseqidno:31seqidno:1lcdr1：seqidno:2lcdr2：seqidno:3lcdr3：6lcaltseqidno:32seqidno:4lcdr1：seqidno:5lcdr2：seqidno:6lcdr3：6hcseqidno:33seqidno:7hcdr1：seqidno:8hcdr2：seqidno:9hcdr3：16lcseqidno:34seqidno:10lcdr1：seqidno:11lcdr2：seqidno:12lcdr3：16hcseqidno:35seqidno:13hcdr1：seqidno:14hcdr2：seqidno:15hcdr3：18lcseqidno:36seqidno:16lcdr1：seqidno:17lcdr2：seqidno:18lcdr3：18hcseqidno:37seqidno:19hcdr1：seqidno:20hcdr2：seqidno:21hcdr3：18hcaltseqidno:38seqidno:22hcdr1：seqidno:23hcdr2：seqidno:24hcdr3：21lcseqidno:39seqidno:25lcdr1：seqidno:26lcdr2：seqidno:27lcdr3：21hcseqidno:40seqidno:28hcdr1：seqidno:29hcdr2：seqidno:30hcdr3：实施例9.构建嵌合抗体表达载体从人血细胞(北京血液研究所)中克隆重链恒定区fc片段和轻链k恒定区，联入pcdna3.1质粒以加以改造。上述重链和轻链可变区序列片段由genscript公司合成，重链经bspqi酶切，轻链经bspqi酶切后，联入相对应改造的pcdna3.1质粒中，并经测序确定正确克隆。后续的实验材料均由此系列质粒转染细胞后，提取获得。实施例10.elisa检测嵌合抗体与pd-l1的结合96孔酶标板，0.5μg/ml的pd-l1包被，37摄氏度恒温孵育60分钟。然后弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，加入含有2％bsa的pbs溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后加入梯度稀释的抗体，37摄氏度孵育60分钟后用洗涤缓冲液冲洗3次，然后加入1：10000倍稀释的biotin-antiigg4，37摄氏度孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗三次后，加入用洗涤缓冲液以1：10000倍稀释的hpr-strep，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入100μltmb底物溶液显色，室温反应30分钟后，以100μl2m的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。如图6所示，嵌合抗体组合24，25可以与pd-l1特异性结合。其ec50分别为7.782ng/ml和9.233ng/ml。实施例11.嵌合抗体与293f细胞上pd-l1的结合将表达pd-l1的cho细胞消化后离心重悬到facsbuffer中，按细胞量为～2.5×104，体积为50ul加入到1.5mlep管中，加入50ul不同浓度的抗体稀释液混匀，室温孵育30min；用facsbuffer洗涤细胞两次后加入100ulgoatanti-humanigg-pe抗体，避光孵育30min；用facsbuffer洗涤两次后进行facs检测。如图7所示，嵌合抗体组合24，25可以与293f细胞上的pd-l1特异性结合。其ec50分别为7.782ng/ml和9.233ng/ml。实施例12.嵌合抗体抑制人pd-l1与293f细胞上pd-1的结合取重组表达的嵌合抗体(10ug/ml)与生物素标记的人pd-l1(1ug/ml)混合，室温孵育30分钟。然后将混合物与293fpd-1稳转细胞株(1.5×105细胞)在37摄氏度孵育15分钟，以pbs洗脱3次后，加入5μg/ml的sa-apc并室温孵育30分钟。以pbs洗脱3次后，通过流式细胞仪检测以验证嵌合抗体是否可以抑制人pd-l1与293f细胞表面的pd-1结合。如图8所示，嵌合抗体能特异性抑制人pd-l1与293f细胞表面的pd-1结合。实施例13.嵌合抗体的jurkat荧光素分析将表达pd-l1的cho细胞铺到96孔板，每孔细胞量为5×104，37℃，7％co2培养过夜，去除细胞上清，每孔中加入40ul抗体稀释液(起始浓度为60ug/ml，3倍浓度梯度稀释)，加入40ul可以持续表达pd-1和nfat-荧光素酶报告基因的jurkat报告细胞，总细胞数为1×105细胞，37℃，7％co2培养6小时，加入荧光素酶试剂，酶标仪检测发光值。如图9所示，嵌合抗体能特异性抑制人pd-l1与pd-1结合,促进报告基因的表达。实施例14抗体的人源化改造根据上述获得的杂交瘤细胞分泌的抗体的可变区序列，进行人源化改造。简言之，人源化改造过程涉及以下步骤：a、把各杂交瘤细胞分泌的抗体的基因序列与人胚胎系抗体基因序列进行比对，找出同源性高的序列；b、分析考察hla-dr亲和性，选出亲和力低的人胚胎系框架序列；c、利用计算机模拟技术，应用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式。通过计算静电力，范德华力，亲疏水性和熵值，分析各杂交瘤细胞分泌的抗体基因序列中可与pd-1作用以及维护空间构架的关键氨基酸个体，将其嫁接回已经选择的人胚胎系基因框架，并在此基础上标配出必须保留的框架区氨基酸位点，合成人源化抗体(pini,a.等,etal.(1998).designanduseofaphagedisplaylibrary:humanantibodieswith10subnanomolaraffinityagainstamarkerofangiogenesiselutedfromatwo-dimensionalgel.,journalofbiologicalchemistry,273(34):21769-21776)。在此基础上我们得到了以下多个人源化抗体。其中包括以下克隆，30和38。30-lc(seqidno:42,轻链氨基酸序列)(seqidno:43,轻链核苷酸序列)30-hc(seqidno:44,重链氨基酸序列)(seqidno:45,重链核苷酸序列)38-lc(seqidno:46,轻链氨基酸序列)(seqidno:47,轻链核苷酸序列)38-hc(seqidno:48,重链氨基酸序列)(seqidno:49,重链核苷酸序列)实施例15elisa检测人源化抗体与人pd-l1的结合96孔酶标板上铺板，pd-l1包被，37摄氏度恒温孵育60分钟。然后弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，加入含有2％bsa的pbs溶液封闭60分钟。用洗涤缓冲液洗3次后100μl每孔加入生物素标记的igg4抗体，37摄氏度孵育30分钟后用洗涤缓冲液冲洗3次，然后加入不同稀释倍数的人源化抗体，37摄氏度孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗三次后，用洗涤缓冲液以1：10000倍稀释hpr标记的mouseanti-humanigg(h+l)，室温孵育1小时，经洗涤缓冲液冲洗3次后，加入100μltmb底物溶液显色，室温反应30分钟后，以100μl2m的盐酸溶液终止反应并在450nm处读出吸光度。如图10所示，人源化抗体结合pd-l1的ec50值分别为558pg/ml和837pg/ml。实施例16.人源化抗体与293f细胞上pd-l1的结合将表达pd-l1的cho细胞消化后离心重悬到facsbuffer中，按细胞量为～2.5×104，体积为50ul加入到1.5mlep管中，加入50ul不同浓度的抗体稀释液混匀，室温孵育30min；用facsbuffer洗涤细胞两次后加入100ulgoatanti-humanigg-pe抗体，避光孵育30min；用facsbuffer洗涤两次后进行facs检测。如图11所示，人源化抗体30，38可以与293f细胞上的pd-l1特异性结合。实施例17.人源化抗体抑制人pd-l1与293f细胞上pd-1的结合取重组表达的嵌合抗体(10ug/ml)与生物素标记的人pd-l1(1ug/ml)混合，室温孵育30分钟。然后将混合物与293fpd-1稳转细胞株(1.5×105细胞)在37摄氏度孵育15分钟，以pbs洗脱3次后，加入5μg/ml的sa-apc并在4摄氏度孵育15分钟。以pbs洗脱3次后，通过流式细胞仪检测以验证嵌合抗体是否可以抑制人pd-l1与293f细胞表面的pd-1结合。如图12所示，人源化抗体能特异性抑制人pd-l1与293f细胞表面的pd-1结合。实施例18.人源化抗体的jurkat荧光素分析将表达pd-l1的cho细胞铺到96孔板，每孔细胞量为5×104，37℃，7％co2培养过夜，去除细胞上清，每孔中加入40ul抗体稀释液(起始浓度为60ug/ml，3倍浓度梯度稀释)，加入40ul可以持续表达pd-1和nfat-荧光素酶报告基因的jurkat报告细胞，总细胞数为1×105细胞，37℃，7％co2培养6小时，加入荧光素酶试剂，酶标仪检测发光值。如图13所示，人源化抗体能特异性抑制人pd-l1与pd-1结合,促进报告基因的表达。实施例19.人源化抗体对小鼠肿瘤生长的抑制作用取36只6-8周龄雌性c57bl/6j小鼠，右侧腋下注射1×106(50μl)mc38-b7h1结肠癌细胞，第5-7天可触摸到肿瘤形成后，测量小鼠肿瘤的体积。分成3组,每组5只。组1每只腹腔注射100μlklh；组2腹腔注射150μg/100μljs3-30；组3腹腔注射150μg/100μljs3-38。每周注射2次，连续注射3周；每周测量3次。按照长×宽2/2计算肿瘤体积。如图14所示，人缘化抗体可以明显抑制mc38-b7h1诱导的肿瘤的生长。序列表<110>上海君实生物医药科技股份有限公司<120>抗pd-l1抗体及其应用<160>49<210>1<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>1lysserileserlystyr15<210>2<211>3<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>2serglyser1<210>3<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>3glnglnhistyrglugluprotrpthr15<210>4<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>4glnaspvalserhisgly15<210>5<211>3<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>5trpalaser1<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>6glnglnhistyrserthrproprothr15<210>7<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>7glyaspserphethrserglytyr15<210>8<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>8ilesertyrthrglysertyr15<210>9<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>9alaargglyleuasntrpaspglulysphealatyr1510<210>10<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>10gluservalgluphetyrglythrserleu1510<210>11<211>3<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>11alaalaser1<210>12<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>12glnglnglyarghisvalprotyrthr15<210>13<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>13glytyrthrphethrasntyrval15<210>14<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>14ileasnproasnileaspglygly15<210>15<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>15alalysproargglyser15<210>16<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>16serleuleutyrserasntyrglnlyshisser1510<210>17<211>3<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>17trpalaser1<210>18<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>18glnglntyrtyrsertyrprophethr15<210>19<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>19glyaspserphethrserglytyr15<210>20<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>20ilesertyrserglyserthr15<210>21<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>21alaargcysglyglytrpleuleuprophethrtyr1510<210>22<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>22glyaspserilethrserglytyr15<210>23<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>23sertyrthrglyserthr15<210>24<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>24alaargglnalaglytrpleuileserpheaspphe1510<210>25<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>25glnasnvalaspthrser15<210>26<211>3<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>26seralaser1<210>27<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>27glnglntyrtyrglytyrprophethr15<210>28<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>28glyaspserilethrargglytyr15<210>29<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>29ilesertyrthrglyserthr15<210>30<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>30alathrserthrglytrpleuaspprovalasptyr1510<210>31<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>31aspvalglnilethrglnserprophetyrleualaalaserprogly151015gluthrilethrileasncysargalaserlysserileserlystyr202530leualatrptyrglnglulysargglylysasnasnlysvalleuile354045tyrserglyserthrleuglnserglyileproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro65707580gluaspphealamettyrtyrcysglnglnhistyrglugluprotrp859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>32<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>32aspilevalmetthrglnserhislysphevalserthrservalgly151015aspargvalserilethrcyslysalaserglnaspvalserhisgly202530valalatrptyrglnglnlysproglyglnserprolysvalleuile354045tyrtrpalaserthrarghisthrglyvalproaspargphethrgly505560serglyserglythrasptyrthrleuthrileserservalglnala65707580gluaspleualaleutyrtyrcysglnglnhistyrserthrpropro859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>33<211>108<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>33gluvalglnleuglngluserglyproserleuvallysprosergln151015thrleuserleuthrcysservalthrglyaspserphethrsergly202530tyrtrpasntrpilearglyspheproglyasnlyspheglutyrmet354045glytyrilesertyrthrglysertyrtyrpheasnproserleulys505560serargileserilethrargaspthrserlysasnglnphetyrleu65707580glnleuasnservalthrthrgluaspthralathrtyrtyrcysala859095argglyleuasntrpaspglulysphealatyrtrpglyglnglythr100105110leuvalthrvalserala105<210>34<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>34aspilevalleuthrglnserproalaserleualavalserleugly151015glnargalathrilesercysargalasergluservalgluphetyr202530glythrserleumetglntrptyrglnglnlysproglyglnpropro354045lysleuleuiletyralaalaserasnvalaspserglyvalproala505560argpheserglyserglyserglythrasppheserleuasnilehis65707580provalglugluaspaspilealamettyrphecysglnglnglyarg859095hisvalprotyrthrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105110<210>35<211>113<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>35gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala151015servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530valilehistrpvallysglnthrproglyglnglyleuglutrpile354045glytyrileasnproasnileaspglyglysertyrasnglulysphe505560asnglylysalalysmetthrserasplysserserserthrvalhis65707580metgluleuargserleuthrtyrgluaspphealavaltyrtyrcys859095alalysproargglysertrpglyglnglythrleuvalthrvalser100105110ala<210>36<211>113<212>prt<213>人工序列<220><223>抗体序列<400>36aspilevalmetserglnserproserserleualavalservalgly151015glulysvalalametilecyslysserserglnserleuleutyrser202530asntyrglnlyshisserleualatrptyrglnglnlysproglygln354045serprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarggluserglyval505560proaspargphethrglyserglyserglythraspphethrle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