本发明属于检测技术领域，具体涉及一种快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒及方法。
背景技术：
目前实现个体谱系识别对y染色体和线粒体snp检测的方法有一下几种：
1．测序法（一代测序）：对目标位点区段进行pcr扩增，之后利用纯化试剂盒对pcr产物进行纯化去除反应体系中的各种组分，再基于pcr产物为模板利用测序引物和测序试剂盒进行测序反应，测序反应产物经纯化试剂盒纯化之后再经与去离子甲酰胺混合变性之后上测序仪测序。该技术涉及步骤较多，很难实现大规模的高通量快速检测，同时成本也很高。
2.测序法（二代测序）：二代测序可以实现大样本的高通量检测，但是该技术需要非常复杂的建库和测序过程，最终产生大量的数据，数据分析必须要专业人士才能完成。该技术目前成本很高，很难大规模推广使用。
3.snp芯片检测法：芯片技术是将需要检测位点信息设计成为探针，并在一个芯片上集中多个位点信息，实现大规模的快速检测，但是芯片杂交和数据读取以及数据解读都需要非常专业的技术人员独立分工完成。目前该方法成本也相对较高，很少用于个体谱系识别对y染色体snp检测。
4.pcr产物限制性酶切法：该技术利用突变位点序列特征设计限制性内切酶酶切位点，通过pcr扩增实现酶切位点的引入，对pcr产物进行酶切之后电泳分型，根据酶切结果判断突变类型。该技术有很多缺陷，有些突变位点很难引入酶切位点，限制性内切酶活性也影响了酶切效果而产生假阴性结果，往往需要测序结果来检验数据质量。该技术应用上涉及很多步骤及电泳图像读取不能实现自动化，不可能实现大样本的高通量检测。
5.基于多重pcr扩增的snapshot检测法：该方法是目前法医学上个体谱系识别对y染色体snp检测的主要方法，该方法可以实现多个位点的快速检测。snapshot技术需要pcr制备snapshot反应模板，经酶法纯化备用。利用各个突变位点信息设计snapshot反应引物，为区分不同位点将snapshot反应引物设计为有长度差异，以便区分不同位点信息。利用snapshot模板、引物和试剂盒完成单个碱基扩增反应，之后再经一轮酶纯化，与去离子甲酰胺和liz内标混合变性，用一代测序仪分离片段大小以及读取单碱基扩增时引入的荧光信号，以区分不同位点的snp变异信息。该技术实验步骤繁琐，多重扩增经常出现有些位点信息缺失，需要补数据。还有多重扩增需要花大量时间去优化反应体系，以实现各个位点荧光信号的均一性。该技术产生的数据读取存在一定误差，需要实验人员手动检查原始数据，由于信号强度差异，会出现假阴性。所以需要对数据抽样测序确认。
目前决定个体y染色体谱系识别的snp单倍型分析的常用技术是snapshot技术，该技术是最近几年才逐渐成熟应用于法医检查，也已经有多项相关专利。该技术根据引物长度分辨不同snp信息，以带荧光末端双脱氧核苷酸信号判定每个snp的单倍型信息，可以实现多重扩增。该技术也是一项理想的y-snp分型手段，但是snapshot技术存在一些自身的不足。首先，snapshot技术需要进行两步pcr扩增（一步检测产物扩增和一步延伸反应扩增），同时需要进行两步酶法纯化（一步检测扩增产物纯化和一步延伸产物纯化）；其次，多重扩增的体系需要根据情况来调整引物和模版的配比，才能使最终检测信号强度保持一致；第三，snapshot检测结果，需要人工检查原始数据的可靠性，才能对数据质量有一个保障；第四，多重扩增过程中，经常出现部分位点信息缺失，需要耗时费力地重复实验补充大量的缺失位点信息。因此，开发一种能解决上述技术问题的产品是非常必要的。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒；第二目的在于提供所述的快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒的使用方法。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒包括用于扩增检测y染色体snp特征位点所对应的引物和代表snp位点两种突变类型序列特征的探针。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
1）将pcr反应体系混合好之后，样品加入96或384孔板放在pcr仪进行扩增反应；
2）完成扩增之后，将板子放入带sds扫描功能的定量pcr仪中读取荧光信号；
3）仪器据荧光信号自动分析样本的y-snp单倍型，以电子表格形式输出结果。
本发明所述的快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒，即taqman探针法快速检测决定个体谱系识别的y染色体snp特征位点的法医学试剂盒，是一步法扩增就能完成检测，不需要纯化和模版制备，简化了y-snp的检测流程；其次，taqman探针法只检测荧光信号的有和无，不存在调整实验体系配比来优化信号强度；第三，不需要人工核对原始数据；第四，偶尔有个别样本信号缺失，补充起来也很方便快捷。taqman探针法简化了实验流程，排除了干扰数据准确性的实验因数和步骤，缩短了检测时间，节省了工作量和实验成本。
本发明所述的快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒检测法（taqman探针快速检测法）与现有对y染色体snp检测方法的差别为：
1.taqman探针快速检测法利用医学检验上成熟的taqman探针技术，结合累计荧光读取，实现了实验步骤的简便化，单次扩增，不用对产物进行任何纯化和处理，直接对产物扫描读取荧光信号，信号收集可以自动化完成，10秒左右就能完成一个96孔或384孔板扫描，数据自动产生一个excel表格，实现了实验步骤的快捷简便操作，同时具备高通量检测特性。
2.因为反应体系较小，实现了微量样本的检测，同时也降低了检测成本。
3.由于mgb探针特性，pcr产物实现100bp以下扩增，实现了对降解和陈旧性dna模板的检出。
4.该方法实现了节约试剂耗材，节约了检测时间和工作量，并对法医上很难用常规方法检测的微量或陈旧性dna实现检测。
5.taqman技术利用序列特异匹配才能出现荧光信号的特征，数据准确可靠。
6.该技术只需要普通pcr仪和带sds功能的定量pcr仪，设备要求低，技术简单，易于操作，可以大规模推广使用。
本发明所述的快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒，即taqman探针法快速检测决定个体谱系识别的y染色体snp特征位点的法医学试剂盒，跳出了传统检测技术的思路，采用一个简便快捷的方式实现了高通量的检测目标，降低了检测成本和劳动力。同时对设备要求不高，实验简单易于操作，有利于广泛应用。同时，这个技术基于成熟的taqman探针检测平台，数据准确可靠，可实现自动化收集数据。有广泛的市场需求和应用前景。taqman探针法快速检测决定个体谱系识别的y染色体snp特征位点的法医学试剂盒，简化了法医学利用谱系筛查锁定嫌疑人的遗传检测步骤，实现了低成本的高通量检测，实验简单易于操作，将对现有利用多个str进行个体身份确认的体系具有高度的互补性，同时，也方便法医对犯罪重点检测对象的数据库建设。taqman探针法快速检测决定个体谱系识别的y染色体snp特征位点的法医学试剂盒，跳出了传统检测技术的思路。实验技术简单易于操作，简单培训就可以操作，同时，对设备要求低。检测过程简单快捷，可以在低成本下实现高通量检测。数据准确可靠，可实现自动化收集数据。有广泛的市场需求和应用前景。
附图说明
图1为实施例1测试结果示意图；
图2为实施例1测试结果示意图；
图3为实施例1测试结果示意图；
图4为实施例1测试结果示意图；
图5为实施例1测试结果示意图；
图6为实施例1测试结果示意图；
图7为实施例1测试结果示意图；
图8为实施例1测试结果示意图；
图9为实施例1测试结果示意图；
图10为实施例1测试结果示意图；
图11为实施例1测试结果示意图；
其中，▼代表绿色荧光，▲代表蓝色荧光。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒包括扩增检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点所对应的引物和代表snp位点两种突变类型序列特征的探针。
所述的扩增检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点所对应的引物以2个为一组进行复合扩增。
所述的用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点都对应一对上、下游引物和两条突变类型序列特征的探针。
所述的用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点对应的上、下游引物以及探针的序列如下：rs2267802，上下游引物seqid：no.1~2，探针seqid：no.3~4；rs3212291，上下游引物seqid：no.5~6，探针seqid：no.7~8；rs9306841，上下游引物seqid：no.9~10，探针seqid：no.11~12；rs35284970，上下游引物seqid：no.13~14，探针seqid：no.15~16；rs2032597，上下游引物seqid：no.17~18，探针seqid：no.19~20；rs9341278，上下游引物seqid：no.,21~22，探针seqid：no.23~24；rs16981290，上下游引物seqid：no.,25~26，探针seqid：no.27~28；rs72613040，上下游引物seqid：no.29~30，探针seqid：no.31~32；rs13447443，上下游引物seqid：no.33~34，探针seqid：no.35~36；rs78149062，上下游引物seqid：no.37~38，探针seqid：no.39~40；rs3898，上下游引物seqid：no.41~42，探针seqid：no.43~44。
所述的快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒包括用于扩增检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点所对应的引物的浓度为10µm。
本发明所述的快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1）将pcr反应体系混合好之后，样品加入96或384孔板放在pcr仪进行扩增反应；
2）完成扩增之后，将板子放入带sds扫描功能的定量pcr仪中读取荧光信号；
3）仪器据荧光信号自动分析样本的y-snp单倍型，以电子表格形式输出结果。
所述的pcr反应体系由如下组成：pcr上下游引物（0.125µl+0.125µl）+代表两种单倍型的探针（0.1µl+0.1µl）+2xtaqmanfastqpcrmastermix（2.5µl）+dna模版1-20ng（1µl）+去离子水（2.05µl）=6µl。
扩增反应的条件为：扩增预变性：95℃、4min；扩增循环：95℃、7s，60℃、40s，72℃、1s循环40次。
本发明所述的快速检测用于鉴定y染色体单倍型谱系的snp特征位点的试剂盒组成具体为：
1）每个检测位点的pcr上下游引物（浓度为10µm）；
2）代表snp位点两种突变类型序列特征的探针，两条探针分别标记（5`6-fam，3`bhq-x；5`hex，3`bhq-x）（浓度为10µm）；
3）2xtaqmanfastqpcrmastermix(b639274_b639275_b639276bbi)；
4）测试样本（c／d/n/o四种单倍型阳性样本）。
反应体系各种试剂配比：pcr上下游引物（0.125µl+0.125µl）+代表两种单倍型的探针（0.1µl+0.1µl）+2xtaqmanfastqpcrmastermix（2.5µl）+dna模版1-20ng（1µl）+去离子水（2.05µl）=6µl
东亚人群谱系核心支y-snp位点：
c-m130(rs35284970).
d-jst021355(rs2267802).
e-m96(rs9306841).
f-m89(rs2032652).
g-m201(rs2032636).
hijklt-m578(rs73614810).
ij-m429(rs17306671).
klt-m9(rs3900).
n-231(rs9341278).
o-p186(rs16981290).
qr-m45(rs2032631).
东亚人群谱系主要分支y-snp位点：
c2-m217(rs2032668).
d1-n1(rs3212291)；d3-p99.
n-m46(rs34442126).
o1-m119(rs72613040).
o2-m268(rs13447443);o2-m176(rs11575897).
o3-m122(rs78149062);o3-kl1(rs17276338);o3-p201(rs2267801);
o3-m7(rs3898);o3-m134(rs200634940);o3-page23(rs34893929)
i-m170(rs2032597).
方法和步骤：
1.pcr反应体系混合好之后，样品加入96或384孔板放在pcr仪进行扩增反应。
2.扩增反应条件：
扩增预变性：95℃、4min；
扩增循环：95℃、7s，60℃、40s，72℃、1s循环40次。
3.完成扩增之后，将板子放入带sds扫描功能的定量pcr仪中读取荧光信号。
4.仪器据荧光信号自动分析样本的y-snp单倍型，以电子表格形式输出结果。
本发明的技术路线如下：
1.利用taqman探针快速检测平台，设计新型mgb探针，用于检测决定y染色体单倍型的snp，对被检个体的父系特征进行谱系识别。
2.利用taqman探针的特性，mgb探针带有荧光报告基团和荧光淬灭基团，两个基团共同存在时不会发荧光，只有在探针严格与模板匹配条件下才能将荧光报告基团切下来而发荧光，利用带sds扫描功能的定量pcr进行累积荧光扫描，实现快捷简便地对检测样本进行个体谱系识别。
3.2-6微升的pcr反应扩增体系，实现法医检验上常见的微量dna检测。
4.由于是进行累计荧光扫描，可以在普通pcr仪上完成扩增反应，然后利用带sds扫描功能的定量pcr在10秒左右完成累计荧光检测。
5.基于taqman探针技术优化实验体系，利用pcr板实现单次扩增完成96或384个样本，实现高通量的检测。
6.采用新型mgb探针，可以合成长度20nt左右的探针，将pcr扩增长度限制在100bp以下，实现对法医应用中常见的降解或陈旧性dna模板的有效检测。
7.该技术实现了单次pcr扩增就能得到结果，大量节约了检测费用和时间，也节约了劳动力。对设备要求低，技术简便，易于操作，可实现大规模样本的高通量快速检测。
下面以随机样本进行测试对本发明做进一步说明：
实施例1
d-jst021355(rs2267802)
rs2267802-f：5'-cccagcccattttatctatct-3'
rs2267802-r：5'-tcagggtagaaattaaaagagga-3'
探针为正向：
rs2267802-p-aagaaacctctaaaccta5`6-fam，3`bhq-x
rs2267802-p-gagaaacctctgaacct5`hex，3`bhq-x
a型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型
g型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型
实施例2
d1-n1(rs3212291)
rs3212291-f：5'-atctgctagcaaagttggctt-3'
rs3212291-r：5'-ctattcaagctactaccttaaagca-3'
探针为反向：
rs3212291-p-cccaggagaaaatc5`6-fam，3`bhq-x
rs3212291-p-gccaggacaaaatc5`hex，3`bhq-x
c型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型
g型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型
实施例3
e-m96(rs9306841)
rs9306841-f：5'-ccatatattttgccataggtttt-3'
rs9306841-r：5'-ctgtgatgtgtaacttggaaaac-3'
探针为反向：
rs9306841-p-cctcataataggataaaac5`6-fam，3`bhq-x
rs9306841-p-gctcataatacgataaaac5`hex，3`bhq-x
c型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型
g型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型
实施例4
c-m130(rs35284970)
rs35284970-f：5'-tatctcctcttctattgcaggg-3'
rs35284970-r：5'-ttcagcaacagtaagtcgaatg-3'
探针为正向：
rs35284970-p-cttggatttccctgccca5`6-fam，3`bhq-x
rs35284970-p-tcttggatttctctgccca5`hex，3`bhq-x
c型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型
t型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型
实施例5
i-m170(rs2032597)
rs2032597-f：5'-gcattatacaaattactattttatt-3'
rs2032597-r：5'-cctcattttacagtgagacacaac-3'
探针为反向：
rs2032597-p-actgaaaaaaatgaacaat5`6-fam，3`bhq-x
rs2032597-p-cctgaaaaaaaggaacaat5`hex，3`bhq-x
a型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型
c型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型
实施例6
n-231(rs9341278)
rs9341278-f：5'-tcattcaattaatacctaaaaaaca-3'
rs9341278-r：5'-caggtatgaattctttgacgat-3'
探针为正向：
rs9341278-p-atactgctttcaaattg5`6-fam，3`bhq-x
rs9341278-p-gtactgctttcgaattg5`hex，3`bhq-x
a型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型
g型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型
实施例7
o-p186(rs16981290)
rs16981290-f：5'-agttggaccagggacagg-3'
rs16981290-r：5'-tcaaattgaaatgtggaaataat-3'
探针为反向：
rs16981290-p-acctgatttttgttcc5`6-fam，3`bhq-x
rs16981290-p-ccctgattttggttcc5`hex，3`bhq-x
a型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型
c型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型
实施例8
o1-m119(rs72613040)
rs72613040-f：5'-agaaaaatgttatgggttattcc-3'
rs72613040-r：5'-gggagacagataattctgctct-3'
探针为反向：
rs72613040-p-gttgctattttcgcctg5`6-fam，3`bhq-x
rs72613040-p-tttgctattttagcctgt5`hex，3`bhq-x
g型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型、
t型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型
实施例9
o2-m268(rs13447443)
rs13447443-f：5'-tttgtatgatcatgcctagcct-3'
rs13447443-r：5'-ccccttctattgtgataccatgt-3'
探针为正向：
rs13447443-p-acctctaaaatataattt5`6-fam，3`bhq-x
rs13447443-p-gcctctaaaatgtaattt5`hex，3`bhq-x
a型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型
g型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型
实施例10
o3-m122(rs78149062)
rs78149062-f：5'-gtgttagaaaagatagctttattca-3'
rs78149062-r：5'-gaataaatcaaggtagaaaagca-3'
探针为反向：
rs78149062-p-aatactaattcatgctctc5`6-fam，3`bhq-x
rs78149062-p-gtactaattcacgctctc5`hex，3`bhq-x
a型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型
g型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型
实施例11
o3-m7(rs3898)
rs3898-f：5'-gcatgtaatcattcctctctgtat-3'
rs3898-r：5'-ccattgtgtttaaattttgtagttg-3'
探针为反向：
rs3898-p-cctgttcttcttgttgtt5`6-fam，3`bhq-x
rs3898-p-gctgttcttcttcttgtt5`hex，3`bhq-x
c型即mp型探针,为fam标记；蓝色荧光，表现为x型
g型即hp型探针，为hex标记；绿色荧光，表现为y型。
sequencelisting
<110>杨亚军
<120>一种快速检测y染色体snp特征位点的试剂盒及方法
<130>2017
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