苗期水培接种快速鉴定番茄颈腐根腐病抗性植株的方法与流程

本发明涉及蔬菜抗病育种技术领域，特别涉及一种苗期水培接种快速鉴定番茄颈腐根腐病抗性植株的方法。

背景技术：

番茄(Solanum esculentum L.)是我国重要的蔬菜作物之一，营养丰富，可以周年种植，并且产量越来越高，品种花色越来越多，用途广泛，深受种植者和消费者喜爱。据2014年联合国粮食及农业组织(FAO)统计，我国番茄种植面积和产量均居世界首位，种植面积约1500多万亩，产量约5260万吨。但是在番茄长期、大面积的生产过程中，其病害也随之发展，危害加重，尤其是近年来番茄颈腐根腐病(Fusarium crown and root rot,FCRR)的大面积暴发，并有进一步发展的趋势。番茄颈腐根腐病是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici，FORL)引起的最具破坏性的番茄土传病害之一(Jarvis and Shoemaker,1978；Roberts et al.,2000)。该病害在世界各地普遍发生，首先于1974年在日本发现(Sato and Arak,1974)，之后在美国、加拿大、墨西哥、以色列、韩国、中国等许多国家陆续被发现(Scott and Jones,2000；Scott,2005)，该病对多数国家的番茄生产造成极大威胁。近些年，番茄颈腐根腐病在我国山东、东北、河北、北京、江苏、浙江等番茄主产区大范围发生，误诊或防治不及时，番茄发病率达80％以上，致死率达30％以上，造成严重减产，给种植户造成严重的经济损失(程琳等，2016)。由于近年来此病害危害在我国有逐年扩大的趋势，对于番茄颈腐根腐病的防治，目前较好的办法是选育抗病品种。

在番茄抗病育种过程中，需要鉴定后代品系的抗性。当前所应用的抗病鉴定方法是田间自然鉴定和温室人工接种鉴定。田间自然鉴定是将试验设立在田间发病区，并在利于病害流行的自然条件下进行，然而，田间影响番茄颈腐根腐病发生的因素有很多，如气候条件、土壤环境及微生物数量等，该方法鉴定时间较长、结果的稳定性不高、重复性较差，不同年分鉴定结果可能存在差异；温室人工浸根接种鉴定，条件可控，此方法能克服田间自然抗性鉴定结果重复性差的缺点，但是鉴定时间较长，要求12天以上。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种苗期水培接种快速鉴定番茄颈腐根腐病抗性植株的方法，能提高番茄抗颈腐根腐病品种筛选的育种效率，同时为研究番茄抗病种质资源筛选、抗病分子机理等提供简易快速的检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种苗期水培接种快速鉴定番茄颈腐根腐病抗性植株的方法，包括如下步骤：

(1)准备待鉴定番茄幼苗；以不同番茄品系为材料，各品系选取健康饱满的番茄种子20-30粒，放入培养皿中，加水没过番茄种子，将培养皿放入25℃培养箱中催芽4d，选取萌发正常的种子播种于灭菌后的育苗培养基质中，进行培养，幼苗长到2-4片真叶，挑选健康、均匀一致的幼苗作为待鉴定番茄幼苗，备用；

(2)制备番茄颈腐根腐病原菌孢子液：将番茄颈腐根腐病原菌接种于PDA培养基中，置于22℃下培养15天，将菌丝刮入到无菌水中，再配制成孢子浓度为1-3×10⁶个孢子/ml的悬液得番茄颈腐根腐病原菌孢子液；

(3)病原菌侵染处理：将步骤(1)的待鉴定番茄幼苗从育苗培养基质中取出，清洗后得自然伤根幼苗，然后将自然伤根幼苗插入以步骤(2)的番茄颈腐根腐病原菌孢子液为培养液的水培装置中，保证仅自然伤根幼苗的根部浸入培养液中；

(4)抗病性检测：分别于侵染处理后的3天、4天、5天、6天，调查侵染苗的发病状况，根据番茄颈腐根腐病病情分级标准确定0、1、2、3共4个发病等级，再根据该发病等级计算病情指数，最后根据发病率和病情指数鉴定植株抗病能力。

发病率和病情指数按0～4级进行鉴定(参考文献：Manzo D.,Ferriello F.,Puopolo G.,Zoina A.,D’Esposito D.,Tardella L.,Ercolano M.R.Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici induces distinct transcriptome reprogramming in resistant and susceptible isogenic tomato lines.BMC plant biology,2016,16(1):53.)。

0级：无症状；1级：主根和侧根中度变褐，但是没有出现腐烂状况；2级：主根开始腐烂，但是可以发现新生的侧根，地上部无明显症状；3级：主根和植物冠严重腐烂，植株几乎死亡。

本方法采用室内水培接种鉴定，在有限的空间和较短的时间内，苗期即可鉴定出番茄材料的颈腐根腐病抗性，同时可避免受到环境和其他土壤微生物等条件的影响，该方法简便、重复性高、鉴定结果稳定性好，可为番茄颈腐根腐病抗病育种及品种的田间应用提供理论依据。

作为优选，每个番茄品系选取6-8株幼苗进行病原菌侵染处理。

作为优选，步骤(3)病原菌侵染处理过程中，环境温度控制在22-25℃。

作为优选，步骤(3)中，水培装置选用10mL的离心管，或者高10cm、容积250mL的塑料瓶，或者高10cm、容积250mL的玻璃瓶。

作为优选，步骤(2)中，所述番茄颈腐根腐病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型。

作为优选，步骤(1)中，育苗培养基质采用草炭∶蛭石＝2∶1的体积比混合而成。

作为优选，根据病情指数检测植株抗番茄颈腐根腐病的抗性等级，具体分级如下：

病情指数(DI)的计算按如下公式计算：

病情指数＝Σ(级数×发病株数)/(最高病情级数×总株数)×100，式中Σ为和；

按病情指数(DI)分别划分为：高抗(HR)：0＜DI≤10；抗(R)：10＜DI≤20；中等(M)：20＜DI≤40；感(S)：40＜DI≤60；高感(HS)：DI＞60。

本发明的有益效果是：本发明的实施在室内环境即可进行，常年均可进行；检测结果不会受到气候环境及土壤环境的影响，检测结果较稳定、可靠、费用低、步骤简单；检测的时间较短，一般7天即可检测出抗病结果。

附图说明

图1为不同的容器接种；其中a为选用高约10cm，容积约250mL的玻璃瓶接种；b为选用10mL的离心管接种。

图2为浙砧1号和T15-196的抗病性表现；其中1为对照，2、3、4为接种处理。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

以不同番茄品系为材料(浙江省农科院蔬菜所提供)，进行接种试验。具体如下：

(1)准备待鉴定番茄幼苗；以不同番茄品系为材料，各品系选取健康饱满的番茄种子20-30粒，放入培养皿中，加水没过番茄种子，将培养皿放入25℃培养箱中催芽4d，选取萌发正常的种子播种于灭菌后的育苗培养基质(采用草炭∶蛭石＝2∶1的体积比混合而成)中，水浇透，25℃环境温度下进行培养，幼苗长到2-4片真叶，挑选健康、均匀一致的幼苗作为待鉴定番茄幼苗，备用。

(2)制备番茄颈腐根腐病原菌孢子液：将番茄颈腐根腐病原菌(尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，由浙江省农科院植微所提供)接种于PDA培养基中，置于22℃下培养15天，将菌丝刮入到无菌水中，再配制成孢子浓度为1-3×10⁶个孢子/ml的悬液得番茄颈腐根腐病原菌孢子液。

PDA培养基制备：新鲜马铃薯200g，加蒸馏水煮沸，继续加热30分钟后，4层纱布过滤，滤液加葡萄糖18g，琼脂20g，溶解后加蒸馏水定容至1000ml，然后进行高温高压(121℃，15分钟)灭菌，自然pH。

(3)病原菌侵染处理：每个番茄品系选取6株幼苗进行病原菌侵染处理，将步骤(1)的待鉴定番茄幼苗从育苗培养基质中取出(在提苗过程使之自然摩擦伤根，不需人工剪根来伤根)，轻轻提苗并抖动进行清洗，清洗后得自然伤根幼苗，然后将自然伤根幼苗插入以步骤(2)的番茄颈腐根腐病原菌孢子液为培养液的水培装置中，保证仅自然伤根幼苗的根部浸入培养液中，环境温度控制在22-25℃，以无菌水为对照；番茄幼苗水培装置：选用10mL的离心管，或者高约10cm，容积约250mL的玻璃瓶(图1)。

(4)抗病性检测：分别于侵染处理后的3天、4天、5天、6天，调查侵染苗的发病状况，根据番茄颈腐根腐病病情分级标准确定0、1、2、3共4个发病等级，再根据该发病等级计算病情指数，最后根据发病率和病情指数鉴定植株抗病能力。

侵染处理后3天后，进行病情调查，根据发病率和病情指数判断植株抗病能力，图2为浙砧1号和T15-196的抗病性表现。发病率和病情指数按0～4级进行鉴定(参考文献：Manzo D.,Ferriello F.,Puopolo G.,Zoina A.,D’Esposito D.,Tardella L.,Ercolano M.R.Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici induces distinct transcriptome reprogramming in resistant and susceptible isogenic tomato lines.BMC plant biology,2016,16(1):53.)。

0级：无症状；

1级：主根和侧根中度变褐，但是没有出现腐烂状况；

2级：主根开始腐烂，但是可以发现新生的侧根，地上部无明显症状；

3级：主根和植物冠严重腐烂，植株几乎死亡。

(5)抗性分级。根据病情指数检测番茄颈腐根腐病抗性，具体分级如下：

病情指数(DI)的计算按如下公式计算：

病情指数＝Σ(级数×发病株数)/(最高病情级数×总株数)×100，式中Σ为和。

按病情指数(DI)分别划分为，高抗(HR)：0＜DI≤10；抗(R)：10＜DI≤20；中等(M)：20＜DI≤40；感(S)：40＜DI≤60；高感(HS)：DI＞60。

采用本发明苗期水培接种鉴定番茄颈腐根腐病抗性材料的方法，通过对7个番茄品系(均由浙江省农科院蔬菜所提供)的番茄颈腐根腐病抗性检测，其中高抗品系1个，抗病品系1个，感病品系2个，高感品系3个(表1)，与田间鉴定进行比校，结果一致。

T15-196：从西安引进的T0P1374(F₁)的高度分离后代经连续7代选择而成。T01-254：从广东农科院引进的抗青枯病的番茄品种“粤星”经连续7代选择而成。Sn-01-5：以先正达引进的齐达力为母本和粉红果材料T10-60杂交，从其高度分离后代经连续9代选择而成。T11-023A：从杭州市农科院引进的番茄品种“航杂3号”经连续9代选择而成。KP-13：从亚洲蔬菜研究中心(AVRDC)引进的番茄材料L1466A与大红株系材料T05-069杂交经连续9代选择而成。

表1 7个番茄品系的病情统计

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。