本发明涉及口腔护理技术，尤其涉及口臭、口气的研究，具体涉及一种口腔中硫化氢产生菌的定量检测方法和应用。
背景技术：
口气，又名口臭，是人群中常见的一种疾病，发病原因有全身的和局部的，据报道发病原因属于口腔内因素的患者占80％，其中牙周炎和龈炎患者各占50％。口腔中的细菌与唾液、菌斑中的蛋白质作用形成硫化氢等挥发性硫化物是引起口臭的主要原因。口臭气味的主要成份是挥发性硫化物，其中90％为硫化氢(H2S)和甲硫醇。口腔中的细菌主要有：葡萄球菌、链球菌、涎链球菌、放线菌、棒状杆菌、范永球菌、乳酸杆菌、梭形杆菌、螺旋菌、奈瑟菌和伴放线杆菌等，其中数量最多、最主要的是链球菌、葡萄球菌和乳酸杆菌。
产生硫化氢的细菌主要包括牙龈卟啉单胞菌、齿垢螺旋体和中间普雷沃菌。舌苔上产硫化氢的细菌主要为韦荣球菌属、放线菌属和普雷沃菌属，口臭患者口腔中这些细菌的数量明显高于健康人群。在半胱氨酸中产生硫化氢的细菌主要有厌氧消化链球菌、微小普雷沃菌、黏液真杆菌、牙周蜈蚣菌、蛛形新月形单胞菌以及拟杆菌属，在血清中产生硫化氢的细菌有中间普雷沃菌、洛氏普雷沃菌、牙龈卟啉单胞菌和齿垢密螺旋体。
口臭会给生活带来诸多困扰，目前评价口臭的方法主要有三种:(1)人的感官评价，主要是通过闻的方式根据被测试者口气的严重程度给出评分，但该方法需要有经验的人才能给出较准确的评分，且人的感官因人而异，带有很大的主观性，数据准确性低；(2)细菌分析法，取舌苔或舌背样品，用特异性培养基培养，鉴定某些特异菌种并菌落计数，但该方法要对不同选择培养基上的菌落进行菌种鉴定，步骤繁琐，实验周期长；(3)硫化物测定法，主要是使用便携式硫化物测定仪Halimeter或者气相色谱法测定硫化物的含量，但仪器设备资金投入较大，而且对操作人员要求高。
有关于简易口臭实验模型的研究报道提到了醋酸铅试纸法，并验证了醋酸铅法与Halimeter法的相关性，实验证明醋酸铅试纸变色程度与Halimeter测得的硫化物含量有较好的正相关性，说明醋酸铅法在原理上说是一种比较可靠的方法，但是该报道仅仅是通过人的视觉感官对醋酸铅试纸变色程度进行评价来对口臭进行简单地判断，无法实现细菌的量化统计和分析，从而无法对口臭进行有效地治疗。
技术实现要素：
本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简单、数据可靠、成本低廉的，能够对口腔中产生硫化氢的细菌进行定量检测的方法。
本发明的另一个目的是提供上述定量检测方法的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
一种口腔中硫化氢产生菌的定量检测方法，该检测方法包括如下步骤：
步骤1
将胰蛋白胨大豆琼脂培养基或脑心浸液琼脂培养基于115℃,高温蒸汽灭菌20分钟后，备用；
配制醋酸铅水溶液、五水合硫代硫酸钠水溶液和还原型谷胱甘肽水溶液；
步骤2
将步骤1配制的醋酸铅水溶液、五水合硫代硫酸钠水溶液和还原型谷胱甘肽水溶液分别经过滤除菌处理后加入到步骤1灭菌处理后的培养基中，混合均匀后倒平板；
步骤3
将待测样品涂布步骤2制备的平板，37℃恒温培养36～48h后，进行菌落计数。
上述步骤1中，所述胰蛋白胨大豆琼脂培养基采用市售的胰蛋白胨大豆琼脂培养基即可实现本发明，也可以按照胰蛋白胨大豆琼脂培养基的传统配方配制：每升胰蛋白胨大豆琼脂培养基含有胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、氯化钠5g和琼脂15g，pH7.3±0.2，25℃。
上述步骤1中，所述脑心浸液琼脂培养基采用市售的脑心浸液琼脂培养基即可实现本发明，也可以按照脑心浸液琼脂培养基的传统配方配制：每升脑心浸液琼脂培养基含有牛脑浸粉4g、牛心浸粉4g、蛋白胨5g、酪蛋白胨16g、氯化钠5g、葡萄糖2g、硫酸氢二钠2.5g和琼脂13.5g，pH值7.4±0.2，25℃。
上述步骤1中，醋酸铅、五水合硫代硫酸钠和还原性谷胱甘肽均为市售产品。
上述步骤1中，醋酸铅水溶液为醋酸铅质量百分比浓度为10％的醋酸铅水溶液，五水合硫代硫酸钠水溶液为五水合硫代硫酸钠质量百分比浓度为10％的五水合硫代硫酸钠水溶液，还原型谷胱甘肽水溶液为还原型谷胱甘肽质量百分比浓度为25％的还原型谷胱甘肽水溶液；上述步骤2中，将醋酸铅水溶液、五水合硫代硫酸钠水溶液和还原型谷胱甘肽水溶液分别经过滤除菌处理后加入到步骤1灭菌处理后的培养基中，所述醋酸铅水溶液和培养基的体积比为1:50，所述五水合硫代硫酸钠水溶液和培养基的体积比为1:100，所述还原型谷胱甘肽水溶液和培养基的体积比为1:100。
上述步骤2中，所述过滤除菌是采用0.22μm的滤膜进行过滤除菌。
上述步骤3中，待测样品为患者口腔唾液或者舌苔样品。
上述步骤3中，待测样品在涂布平板前需先稀释10～100倍后吸取100μL再涂布平板，具体操作时的稀释比例是根据唾液或舌苔样品含有的微生物数量级确定的，控制最终平板微生物菌落在30～300之间即可。所述待测样品稀释是采用0.85％生理盐水对待测样品进行稀释。
本发明人研究发现，将待测样品涂布至步骤2制备的平板，37℃恒温培养36～48h后，会有很多菌落生长，但是只有产硫化氢的细菌菌落为黑色，因为硫化氢与醋酸铅反应生成硫化铅黑色沉淀，而其余非产硫化氢的细菌菌落为白色或淡黄色，颜色区别非常明显，因此，只需对黑色菌落进行计数，即可实现对产硫化氢的细菌菌落的精确计数。
本发明的定量检测方法可用于不同配方或者不同品牌口腔护理产品对口臭问题的治理效果检测，如发明人研究发现，一般口臭患者的唾液中产硫化氢细菌数量平均在2300cfu/mL左右,用了去口气的牙膏两周以后，唾液中产硫化氢细菌数量多数降到50cfu/mL以下，因此，将不同配方或者不同品牌的口腔护理产品进行试用，若试用两周后，患者唾液中产硫化氢细菌数量可降到50cfu/mL以下，则说明该配方或者该品牌具有一定的治疗口臭的效果。
本发明的定量检测方法还可以用来指导口腔护理产品的研发，如通过对不同配方口腔护理产品试用后的定量检测，来精确判断哪个配方可以有效治疗口臭。
本发明的定量检测方法还可以用来实现口臭患者的精确治疗，如市面上去除口臭的口腔护理产品很多，但是对于患者个人来说，并不是每个产品都能有效的，所以通过对不同品牌进行试用后，采用本发明的定量检测方法，可以精确判断哪个品牌的产品能够有效减少患者口腔中产硫化氢细菌的数量，从而针对患者量身选择合适的去除口臭的口腔护理产品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明通过对培养基的选择、醋酸铅、五水合硫代硫酸钠和还原性谷胱甘肽的选择和用量，以及培养条件的选择，保证了产硫化氢的细菌能形成黑色菌落，而非产硫化氢的细菌不会产生黑色菌落，从而能清晰准确地将产硫化氢的细菌和其它细菌区别开来，保证了本发明对产硫化氢细菌定量检测的准确性。
2、本发明的基础培养基中还选择添加五水合硫代硫酸钠和还原性谷胱甘肽，从而可有效保护醋酸铅不被氧化，实现醋酸铅作用的稳定发挥，保障了定量检测的准确性。
3.本发明通过菌落培养和菌落计数，实现了口腔中产硫化氢细菌的量化统计和分析，从而实现了对口臭进行有效地治疗。
4.本发明所用检测设备简单、成本低廉，对操作人员要求不高，且数据可靠，有利于大规模推广。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1
实验对象：口臭患者6人。
本实施例对6位口臭患者分别取样，每位患者都要取四个待测样品，具体如下所示：
样品1：在该患者使用去口气牙膏前先对患者的唾液取样，该唾液样品为该患者的样品1；
样品2：在该患者使用去口气牙膏前先对患者的舌苔取样，该舌苔样品为该患者的样品2；
样品3：让该患者使用一款去口气的牙膏两周后，对该患者的唾液取样，该唾液样品为该患者的样品3；
样品4：让该患者使用一款去口气的牙膏两周后，对该患者的舌苔取样，该舌苔样品为该患者的样品4。
6位患者都是使用同一款去口气牙膏，且牙膏的使用方法都是每天早中晚各刷牙一次，为期两周。
然后将所有待测样品均按照本发明的方法进行定量检测，具体步骤为：
步骤1
将脑心浸液琼脂培养基于115℃,高温蒸汽灭菌20分钟后，备用；
配制醋酸铅质量百分比浓度为10％的醋酸铅水溶液；
配制五水合硫代硫酸钠质量百分比浓度为10％的五水合硫代硫酸钠水溶液；
配制还原型谷胱甘肽质量百分比浓度为25％的还原型谷胱甘肽水溶液；
步骤2
将步骤1配制的醋酸铅水溶液采用0.22μm的滤膜进行过滤除菌后按照1:50的体积比加入到步骤1灭菌处理后的培养基中，将步骤1配制的五水合硫代硫酸钠水溶液采用0.22μm的滤膜进行过滤除菌后按照1:100的体积比加入到步骤1灭菌处理后的培养基中，将将步骤1配制的还原型谷胱甘肽水溶液采用0.22μm的滤膜进行过滤除菌后按照1:100的体积比加入到步骤1灭菌处理后的培养基中，然后将培养基混合均匀后倒平板；
步骤3
将待测样品稀释10倍后吸取100μL涂布步骤2制备的平板后，37℃恒温培养48h后，进行黑色菌落的计数。
上述步骤1中，脑心浸液琼脂培养基、醋酸铅、五水合硫代硫酸钠和还原性谷胱甘肽均为市售产品。
结果如表1所示。
表1 产H2S细菌计数
从表1的结果可以看出，该款去口气牙膏对4号和6号患者的去除口臭效果最好，而对于3号患者来说，该款去口气牙膏显然治疗效果不是很理想，所以3号患者需考虑更换别的品牌的去口气牙膏。
从表1的结果也能清晰地看出每个患者主要口臭的产生部位，如1号患者，主要是唾液中含产硫化氢细菌较多，因此，对于1号患者来说，就可以针对这个部位进行相应地治疗。
综上所述，采用本发明的方法确实能够做到对产硫化氢细菌的量化统计，而且这种量化统计确实对口臭治疗起到很积极的作用。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。