一株产bostrycin的蕲艾内生真菌HCH285的制作方法

本发明属于药用植物和农业微生物技术领域，具体涉及从药用植物蕲艾(artemisiaargyilevl.etvan.var.argyicv.qiai)中分离一株内生真菌，该菌株为黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)，它能产生具抗癌活性的卷线孢菌素(bostrycin)，可用于规模化批量生产卷线孢菌素。

背景技术：

肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症即为恶性肿瘤的总称。目前，癌症已经成了当今社会危害人类身体健康的严重疾病，20世纪70年代初，我国癌症发病人数约为90万，死亡约70万人；2005年，癌症发病人数约180万-200万，死亡140万至150万。所有的恶性肿瘤中以肺癌的上升趋势最快，2000年至2005年，我国肺癌发病人数增加了11.6万人，死亡人数增加了10.1万人。(张晓怡.基于人群监测资料的恶性肿瘤危险因素研究[d].浙江大学,2013)。2012年新发恶性肿瘤病例约358.6万例，死亡病例218.7万例。全国恶性肿瘤发病率为264.85/10万(男性289.30/10万，女性239.15/10万)，(陈万青,等.2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[j].中国肿瘤,2016,(01):1-8)。而全球的癌症发病率也呈增长趋势，在1991年到2000年间，全球癌症发病及死亡人数均增长22％，2000年，全球新发癌症人数超过1000万。世界卫生组织预测，到2020年，每年新发癌症病人数将达到1500万，癌症已经成为新世纪人类的第一杀手，并成为全球最大的公共卫生问题，所以肿瘤防治显得愈加重要和迫切。

据文献报道，蒽醌类化合物bostrycin(卷线孢菌素)能够抑制肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞的生长(陈冬妮等,陆勇军.bostrycin通过抑制ptp1b酶活性诱导乳腺癌细胞的凋亡[a].中国化学会.第八届全国化学生物学学术会议论文摘要集[c].中国化学会:,2013:1.),因此bostrycin可作为天然的抗肿瘤潜在药物开发。

技术实现要素：

本发明在于提供从蕲艾中分离得到的一株内生真菌hch285，其代谢产物bostrycin可用于抑制肿瘤细胞，所述内生真菌为球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285，保藏编号为：cctccno：m2017061；

本发明在于通过黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285以液体发酵方法高效制备bostrycin的应用；

本发明在于提供了黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285的发酵方法，利用该方法可规模化批量生产bostrycin，采用液体发酵的bostrycin含量可达729mg/l。

为达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285的获得：申请人自菊科植物蕲艾活体植株茎段中分离得到蕲艾内生真菌hch285，经18srdna鉴定和微生物学鉴定证明该菌株属于黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)。本发明所述的黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285菌株的分离、筛选及鉴定流程见实施例1。hch285发酵液和菌丝中的代谢产物bostrycin的提取见实施例2，进行分离纯化以及经过质谱和核磁共振图谱解析，结果表明该物质为bostrycin。

菌株分类学地位的鉴定：

1.固体培养特征：

采用mya培养基(成分：麦芽浸膏20g，，酵母浸膏5g,琼脂15g，加水定容至1l，培养黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285菌株。

菌落形态：24℃培养4d，菌落直径为45mm，8d时基本长满整个培养皿，菌落为圆形，前期为白色，后变为红色；菌落绒毛状，生长稍微蓬松，菌落边缘相对整齐，菌落背面可见红色，外缘呈圆点。

菌丝形态：无色有隔菌丝。

产孢特征：，分生孢子，单个产生，球形或椭圆形，黑色、光滑、无隔、单孢。

2.its序列测定：

1)提取菌丝体总dna。

2)以its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(5’-tcctccgcttattgatagc-3’)为引物，扩增出18srdna序列，测序。

3)将测序结果递交http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast进行序列比对，根据blast结果并结合其形态学特征得出结论，证明该分离的菌株属于黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)。

所述的菌株已于2017年2月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285，保藏编号为cctccno：m2017061，地址：中国武汉武汉大学。

黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285在制备bostrycin中的应用，所述的应用包括下述步骤：

球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285按1％～3％接种量接种于发酵培养基中，发酵温度22-26℃，ph5.0-7.0，do值50％-70％，转速50-200rpm，发酵周期48-96h，放罐；

所述的发酵培养基为pdb液体培养基或psb液体培养基。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明所述对象属于微生物领域，具有生长繁殖迅速，不受季节、气候和地域限制，产量提升空间大等优点。

2.本发明提供天然的抗肿瘤潜在药物活性物质，能有效减少化学合成药物的副作用。

3.本发明首次提出了黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)可用于生产bostrycin。

4.本发明提供的黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285的bostrycin产量高，适用于bostrycin的工业化生产。摇瓶发酵中每升发酵液中bostrycin的产量为650-729mg/l，大型发酵每升发酵液中bostrycin的产量达到400-605mg/l。

附图说明

图1为黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285的itspcr产物电泳图。

图2为黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285在pda培养基上的菌落形态。

图3为黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285在显微镜下的孢子形态。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，均来源于商业渠道。

实施例1：

黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285的获得及鉴定：

1从中国湖北省蕲春县采集蕲艾(artemisiaargyilevl.etvan.var.argyicv.qiai)野生植株；

2挑选健康的植株短截茎段成10cm,流水冲洗30min，除去表面污垢；

3表面消毒，步骤如下：

1)先用70％-75％酒精浸泡2次，每次2-3min；

2)接着用0.1％hgcl2浸泡5min，轻摇3次；

3)沥干植株上的液体，再用无菌水浸洗5遍，充分洗净以避免hgcl2残留，并用最后一次浸洗液涂布于含有pda培养基(按常规方法，成分：土豆200g切小块后加少量水煮沸，葡萄糖20g，琼脂15g/l，灭菌前ph6.5；加水定容至1l，在121℃高压蒸汽下灭菌20分钟)的平皿上。以最后一次浸洗液接入平皿，200ul/皿，制备3-5个皿，作为对照组；

4)用无菌滤纸吸干茎段的残留液体，在无菌条件下将茎段剪至1cm，置于装有pda培养基的培养皿，1个茎段/皿；

5)将步骤4)的有茎段皿连同对照皿置于25℃条件下，光照(光照强度为2000lux)，培养。

4分离步骤3的茎段生长出来的菌丝体，依据常规方法(张昊，等.一种简单快速的赤霉病菌单孢分离方法——平板稀释画线分离法[j].植物保护，2008,34(6)：134-136.)对所得菌株进行分离纯化；

5对在pda培养基上能产生肉眼可见红色物质的菌株，选留纯化得hch285；

6提取hch285发酵液和菌丝中的次生代谢产物，对红色物质进行分离纯化，得单体hch285-red1，经质谱和核磁共振图谱解析，该物质为bostrycin。

7菌株hch285的总dna提取：

1)在灭菌的小型研钵中加适量hch285菌丝，加液氮进行研磨，时间不宜过长以防止dna降解。转移至2.0ml离心管中。

2)向研磨好的粘稠状菌丝中加入900μlctab提取液(65℃预热)，混合液放入65℃水浴10min。期间颠倒混匀3次。

3)加入450μltris饱和酚以及450μl氯仿/异戊醇(体积比为24:1)混合液，混匀。

4)12,000r/min，4℃离心15min，

5)取上清液800μl，放入另一个灭菌的2.0ml离心管中。加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)混合液，12,000r/min，4℃离心15min，重复2次。

6)沉淀：取上清500μl，加入50μl3mol/l醋酸钾，轻轻混匀，再加330μl预冷的异丙醇，混匀后置于-20℃10min。

7)12,000r/min，4℃离心10min，弃上清液，收集沉淀。

8)洗涤：用500μl新鲜配制的预冷70％乙醇洗涤沉淀，12,000r/min，4℃离心10min，弃上清液(防止倒流)，重复2次，收集沉淀，置37℃的恒温箱中干燥30min。

9)溶解：在干燥后的离心管中加入50μl去离子水或1×te，充分溶解后放入4℃冰箱中待电泳检测。

10)保存：将通过电泳检测的总dna放入-20℃冰箱中保存备用。

pcr扩增体系及反应条件：

pcr反应体系:5×pfubuffer5μl,dntp2μl,引物its1和its4各0.5μl,pfudna聚合酶0.2μl,dna模板1μl,ddh2o15.5μl。反应条件为94.0℃5min变性后进入循环，循环参数为：94.0℃30s，54.0℃30s，72.0℃1min，35个循环后72.0℃延伸10min。反应结束后将pcr产物用1.2％琼脂糖电泳，获得大小约为530bp的基因片段(图1)，将获得的pcr产物送去公司测序，将测序结果递交至http://blast.ncbi.nih.gov/blast.进行比对，再利用软件mega6.1和bjoedit对所克隆片段进行聚类分析(见图2)，结合菌株形态学特征(见图3)，该菌被鉴定为黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)。

该菌株已于2017年2月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285，保藏编号为cctccno：m2017061。地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

黑孢霉属球黑孢菌(nigrosporasphaerica)hch285在制备bostrycin中的应用，其应用过程包括：

1500ml锥形瓶中培养

1)将纯化后的菌株用psb液体培养基进行发酵培养。

其中：psb液体培养基的配方是：

马铃薯(切块)200g；蔗糖20g；补充蒸馏水至1000ml，ph自然。

psb液体培养基的制作方法是：将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000ml煮沸半个小时左右，用4层纱布滤去马铃薯，然后加入蔗糖20g，加水补足至1000ml，搅拌溶解后分装灭菌(在121℃高压蒸汽下灭菌20分钟)。

2)一级种子液制备：利用孔径为0.9cm的打孔器在24℃下暗培养4天的hch285的psa上打2孔菌丝，然后接种于含100ml土豆蔗糖液体培养基(psb)的250ml锥形瓶中，在24℃、150rpm暗培养2d。并且利用磁力搅拌器将菌丝打碎，使其更加均匀。

3)二级种子液制备：用移液枪吸取2m上述所得一级种子液接种于含200mlpsb培养基的500ml锥形瓶中，在24℃、200rpm培养1d，并且利用磁力搅拌器将菌丝打碎。

4)将二级种子液以1％的接种量接种于200mlpsb中，于24℃，150rpm下培养72h。

5)将发酵液及菌丝体经乙酸乙酯提取，旋转蒸发仪浓缩，干燥得粗制品。

6)将粗制品进一步分离纯化，得单体bostrycin，换算得每升发酵液bostrycin的产率为729mg/l。

2发酵罐培养：

其中：pdb液体培养基的配方是：

马铃薯(切块)200g；葡萄糖20g；补充蒸馏水至1000ml，ph自然。

1)发酵前准备

检查发酵罐(100l)供气压力、管道、阀门、电气仪表等，校正发酵罐的温度、ph电极和do电极。

2)空气管路消毒

利用高压蒸汽进行空气管路消毒，约30min；排去冷凝水后，通空气吹干空气过滤器，约20min；继续通空气，保持空气管道为正压。

3)发酵罐空消排尽

排尽夹套中的水后，通蒸汽使其缓缓进入发酵罐，对发酵罐进行空消，约30-50min。待温度下降后排尽发酵罐内的冷凝水。注意维持罐压。

4)发酵罐实消

安装前述校验的ph电极和do电极。打开发酵罐加料口，加入pdb培养基，装罐量为3/5(体积比)。开启搅拌装置低速转动。待罐内物料混合均匀后，采用加套通汽预热培养基。当培养基温度达到95-100℃时，关闭搅拌电机。待罐温约115-121℃，罐压为0.10-0.11mpa时，开始计时。30min后停止通入蒸汽，使自然冷却约10min。待罐温降至70℃以下，开启搅拌电机，缓慢旋转搅拌培养基，加速冷却。注意维持罐压。

5)接种

待培养基温度降至接种温度时即可接种。采用火焰封口接种法，用酒精棉擦洗罐顶接种口，并在四周围上酒精棉。调节进气阀以维持罐压。点燃接种口四周的酒精棉，拧下接种口螺母盖，迅速将步骤1中3)的二级种子液以接种量1％的接种量倒入罐内，再将螺母盖在火焰上灭菌后拧紧。

6)发酵培养

设定发酵参数：发酵温度24℃，ph值6.0，do值70％，转速100rpm。开启自动发酵模式，系统按照设定好的参数进行自动控制。注意观察并时时监测各发酵参数值。

7)出料

发酵72h后，利用罐压将发酵液从出料管道排出。出料完毕后应及时清洗发酵罐及管道等。

8)粗制产物提取

将发酵液中菌丝过滤，冷冻干燥，用乙酸乙酯提取、浓缩。过滤所得菌丝经破碎，用乙酸乙酯提取、浓缩干燥即得粗制产物；

9)将粗制产物分离纯化，得单体bostrycin，换算得每升发酵液bostrycin产率为605mg/l。