本发明涉及一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的非动物源培养基及其培养方法。
背景技术：
：脑膜炎球菌性脑膜炎(meningococcalmeningitis)又称流行性脑脊髓膜炎(Neisseriameningitides，NM)，简称流脑，是由奈瑟氏脑膜炎球菌引起的一种严重危害人类健康的呼吸道传染病。易感人群主要为婴幼儿，以暴发型病死率最高，可达40％－60％。根据荚膜多糖在化学和血清学上的不同，脑膜炎球菌分为若干群，其中A、C、Y、W135群是常见的致病菌。脑膜炎球菌除了引起细菌性脑膜炎外还可引起败血症，是一类危害性极大的致病菌。脑膜炎球菌荚膜多糖是其致病的主要毒力因子，因其具有较强的抗原性，已被作为保护性抗原用于流脑疫苗的制备和生产。在当今世界儿童传染病的防治目标中，流脑的免疫预防仍然是重要课题之一。我国于1980年正式生产A群NM多糖疫苗，推广应用以来，获得满意的免疫效果。但现有的A群NM疫苗生产工艺中，采用了动物源性的发酵原料；由于动物源原材料可能带有朊病毒等致病因子的潜在风险，国际生物制品行业发展的趋势要求尽量避免使用动物源性原材料，有效降低生物制品风险。流脑A群疫苗生产厂家一般采用将A群奈瑟氏脑膜炎球菌种开启到10％羊血巧克力琼脂培养基(含羊血成分)，再传到改良半综合培养基(含牛源酸水解酪蛋白)，最后接种到改良半综合液体培养基(含牛源酸水解酪蛋白)，这些在培养基中接入的动物血液成分和动物来源的氮源成分均存在潜在的感染动物携带病毒的风险，而且成分复杂，给疫苗带来不安全的风险。据现场观察资料，疫苗接种后的全身中强反应率为3.3％；局部中强反应率约为6％。因此，需要对现有的A群奈瑟氏脑膜炎球菌的培养基进行改进，提供一种能够高效培养A群奈瑟氏脑膜炎球菌的无动物源性原料的培养基。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种无动物来源成分的A群奈瑟氏脑膜炎球菌培养基及其制备方法和应用。本发明A群奈瑟氏脑膜炎球菌的非动物源培养基，它包括液体培养基和固体培养基，其中，液体培养基为每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，其余为水；固体培养基每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，琼脂10～20g，其余为水。其中，所述非动物源有机氮源为酵母粉、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、大米蛋白胨的一种或多种的组合。优选地，所述非动物源有机氮源为酵母粉或者大豆蛋白胨。优选地，所述非动物源有机氮源为酵母粉和大豆蛋白胨的混合物，二者的重量比例为1:1；或者，所述非动物源有机氮源为酵母粉和大米蛋白胨的混合物，二者的重量比例为1:1。本发明还提供了一种制备前述培养基的制备方法，所述液体培养基按照如下步骤制备：按重量配比称取原料，混匀，即可；所述液体培养基按照如下步骤制备：按重量配比称取原料，混合，加热溶解，凝固，即可。本发明还提供了前述培养基在A群奈瑟氏脑膜炎球菌的培养中的用途。本发明还提供了一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的培养方法，它是采用前述培养基进行培养。所述培养方法的步骤如下：(1)菌种开启：启开A群奈瑟氏脑膜炎球菌工作种子批菌种，接种于固体培养基，35℃～37℃5％CO2培养18～24小时，得一代种子；(2)传二代培养：将一代种子接种于固体培养基，35℃～37℃培养18～24小时，得二代种子；(3)传三代培养：将二代种子接种于摇瓶的液体培养基中，起始OD550值为0.1～0.4，35℃～37℃培养3～8小时，得三代菌种菌液；(4)传四代培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐的液体培养基中，培养温度35℃～37℃，pH值为7.0～7.2，培养时间3～8小时，OD550值达到1.0以上时转种，得四代菌种菌液；(5)发酵罐培养：将四代菌种菌液接种于发酵罐的液体培养基中，培养温度35℃～37℃，pH值为7.0～7.2，在发酵4小时后、OD550达到2.5以上、葡萄糖浓度低于20mmol/L时开始补加20％葡萄糖溶液，并控制发酵液中葡萄糖浓度为18～30mmol/L，在补加20％葡萄糖溶液的同时补加等体积的非动物源有机氮源溶液；培养为时间6～10小时；所述非动物源有机氮源溶液每1000ml培养基含有非动物源有机氮源20g，其余为水。步骤(5)中，所述非动物源有机氮源为酵母粉、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、大米蛋白胨的一种或多种的组合。本发明将目前疫苗生产所采用的A群奈瑟氏脑膜炎球菌发酵培养基中动物源性的成分用非动物来源的成分替代并通过配方优化，获取无动物源性成分的培养基，避免了因动物源成份携带病原体给疫苗安全带来的风险，提高了疫苗的安全性，减少疫苗接种的副反应；另外，本研究根据无动物源培养基的特性，对培养工艺进行了相应改进，使培养工艺标准化，提高了批次间的稳定性。比较两种培养基发酵培养的A群奈瑟氏脑膜炎球菌生长浓度、发酵培养液中多糖含量和最终精糖收量发现，用无动物源培养基培养A群奈瑟氏脑膜炎球菌能够获得与用动物源培养基培养相同甚至更好的效果。本发明克服了现有技术的缺点，提供一种A群奈瑟氏脑膜炎球菌的无动物源培养基，该培养基为无动物源成分，完全避免了因动物携带病原体给疫苗安全带来的风险，提高了疫苗的安全性，减少疫苗接种的副反应，并且培养效果好。下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。具体实施方式实施例1本发明无动物来源成分的A群奈瑟氏脑膜炎球菌培养基的制备本发明A群奈瑟氏脑膜炎球菌无动物源培养基成分包括：氯化钾、非动物源有机氮源、味精、氯化铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、胱氨酸、硫酸镁、葡萄糖；培养方法包括：菌种开启、传二代、传三代、种子罐培养、大罐培养。液体培养基配方：每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，其余为水。取上述原料，混匀，灭菌，即可。固体培养基配方：每1000ml培养基含有如下成分：非动物源有机氮源8～30g、氯化钾0.2～0.8g、味精1～2g、氯化铵1.5～3g、磷酸氢二钠0.5～0.8g、磷酸二氢钠0.15～0.3g、胱氨酸0.01～0.03g、硫酸镁0.3～0.5g、葡萄糖6～8g，琼脂10～20g，其余为水。取上述原料，混合，加热溶解，凝固，灭菌，即可。其中，非动物源有机氮源为酵母粉、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、大米蛋白胨的一种或多种组合。实施例2本发明培养基的筛选实验1、实验方法取A群奈瑟氏脑膜炎球菌，进行摇瓶发酵试验，初始OD550值为0.1，初始pH7.2，36℃培养4h后测定OD550值与多糖产量。发酵液经离心除去菌体，上清液用注射用水多次高速离心清洗，然后加入矿化剂干烤，放至常温后加显色剂，36～37℃水浴2h，于波长285nm测定光吸收值，从标准曲线得到磷的浓度并计算出发酵液中A群流脑多糖的浓度。2、不同因素的筛选2.1非动物源有机氮源的筛选培养基中非动物源有机氮源分别为酵母、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、大米蛋白胨，对照使用50％盐酸酪素水解液，其余同实施例1。结果如下：表1.不同厂家不同型号的非动物源有机氮源对A群奈瑟氏脑膜炎球菌生长与产糖的影响实验结果说明，单独使用酵母粉和大豆蛋白胨的效果比较优良。2.2非动物源有机氮源组合的筛选培养基中非动物源有机氮源分别如下表，对照使用50％盐酸酪素水解液，其余同实施例1。表2.不同的非动物源蛋白胨(非动物源有机氮源)组合对A群奈瑟氏脑膜炎球菌生长与产糖的影响实验结果说明，采用酵母粉和大豆蛋白胨的组合，或者酵母粉与大米蛋白胨的效果比较优良。以下用实验例的方式来证明本发明的有益效果：实验例1本发明无动物源培养基与原A群奈瑟氏脑膜炎球菌培养基的比较1.实验材料试验分组：本发明培养基组：采用实施例1所示的本发明培养基，其中非动物源有机氮源为酵母粉、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、大米蛋白胨的一种或多种组合。传统培养基组：采用10％羊血巧克力琼脂培养基、改良半综合固体培养基、和改良半综合液体培养基。10％羊血巧克力琼脂培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15～20g/L，按总体积10％加入羊血改良半综合固体培养基：50％盐酸酪素水解液：TN1200mg/L，酵母浸出粉：10g/L，味精：1g/L，氯化铵：1.25g/L，磷酸二氢钠：0.2g/L，磷酸氢二钠：1g/L，甘氨酸0.1g/L，硫酸镁：0.6g/L，葡萄糖：10g/L，琼脂10～20g/L改良半综合液体培养基：50％盐酸酪素水解液：TN1200mg/L，酵母浸出粉：10g/L，味精：1g/L，氯化铵：1.25g/L，磷酸二氢钠：0.2g/L，磷酸氢二钠：1g/L，甘氨酸0.1g/L，硫酸镁：0.6g/L，葡萄糖：10g/L其中，各个阶段培养基分如下表：2.实验方法(1)菌种开启：启开A群奈瑟氏脑膜炎球菌工作种子批菌种，接种于固体培养基，35℃～37℃、5％CO2培养18～24小时；(2)传二代培养：将一代种子接种于二代固体培养基，35℃～37℃培养18～24小时；(3)传三代培养：将二代种子接种于三代摇瓶液体培养基中，起始OD550值为0.1～0.4，35℃～37℃培养3～8小时；(4)传四代培养：将三代菌种菌液接种于发酵罐液体培养基中，培养温度35℃～37℃，pH值为7.0～7.2，培养时间3～8小时，OD550值达到1.0以上时转种；(5)发酵罐培养：将四代菌种菌液接种于发酵罐液体培养基中，进行发酵罐培养，基础培养基装量40％，115℃灭菌30分钟，接种量8-10％，转速250-350rmp，培养温度35～37℃，pH值为7.0～7.2根据培养过程中溶氧变化调整通气量、罐压、转速使溶氧维持在15％以上。在发酵4小时后、OD550达到2.5以上、葡萄糖浓度低于20mmol/L时开始补加20％葡萄糖溶液，并控制发酵液中葡萄糖浓度在18～30mmol/L，同时按与20％葡萄糖溶液体积比为1:1补加20％非动物源有机氮源溶液(酵母粉、大豆蛋白胨、豌豆蛋白胨、大米蛋白胨的一种或多种组合)。当OD550达到8.0以上且不增长，pH出现上升，终止发酵。3.实验结果试验结果如下表3所示：表3本发明无动物源培养基与原A群奈瑟氏脑膜炎球菌培养基的比较与传统的含羊血等动物源性的培养基相比，本发明无动物源成分的培养基，在菌种传代时进行良好的菌种复苏和扩增培养，在发酵罐培养时的细菌浓度显著高于传统培养基，同时制备得到的多糖含量也显著高于传统培养基。实验例2采用本发明培养基培养除了无动物源A群奈瑟氏脑膜炎球菌培养基中无动物源氮源为酵母粉，其余条件同实验例1。当OD550达到8.0以上且不增长，pH出现上升，终止发酵。三批培养结果如下表：表4酵母作为无动物氮源对A群奈瑟氏脑膜炎球菌的培养结果无动物源氮源种类培养时间(h)OD550多糖产量(Ug/ml)酵母6～89～15580～630实验例2采用本发明培养基培养除了无动物源A群奈瑟氏脑膜炎球菌培养基中无动物源氮源为酵母粉和大豆蛋白胨，其余条件同实验例1。当OD550达到8.0以上且不增长，pH出现上升，终止发酵。三批培养结果如下表：表5酵母和大豆蛋白胨作为无动物氮源对A群奈瑟氏脑膜炎球菌的培养结果无动物源氮源种类培养时间(h)OD550多糖产量(Ug/ml)酵母：大豆蛋白胨(1:1)6～88～13453～587综上，本发明培养基可以高效培养A群奈瑟氏脑膜炎球菌，获得的多糖含量高，并且培养基为非动物源培养基，安全性好，应用前景优良。当前第1页1 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