本发明涉及一种合成d-乳酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
乳酸是一种三碳化合物，从光学性质上，可以分为l-乳酸和d-乳酸。l-乳酸的研究较多，d-乳酸相对较少。d-乳酸是一种重要的平台化合物，被广泛应用于农药、医药、化妆品等行业。光学纯度大于95％的d-乳酸可以作为聚乳酸的优良单体。
聚乳酸是一种性质优良的可降解塑料，主要是由l-乳酸通过聚合反应获得。但是，纯粹的聚l-乳酸或聚d-乳酸，在热力学性质及机械性能等方面存在一定缺陷。将d-乳酸聚合单体以一定比例加入聚l-乳酸后可以得到立构复合物聚乳酸，立构型聚乳酸在材料性能商能够得到明显改善；例如，熔点能够提高50℃左右，而拉伸强度、杨氏模量、断裂伸长率提高到单聚物的两倍以上。全球聚乳酸市场每年约以20％～30％的速率增长，带动了高光学纯度d-乳酸需求量的增加。
d-乳酸的生物合成研究相对较少。传统的发酵菌株以乳酸菌为主，但大多数乳酸菌同时合成l-乳酸和d-乳酸，光学纯度比较差。肺炎克雷伯氏菌klebsiellapneumoniae能够利用甘油合成高光学纯度的d-乳酸，k.pneumoniae的甘油代谢途径，其主要产物是1,3-丙二醇(1,3-pdo)，即使敲除了1,3-pdo合成的关键基因，仍然会有较高水平的副产物积累，d-乳酸的合成效率降低，对后期产品分离造成了不利影响。而且，工程菌在发酵过程中，为了维持相关蛋白的作用，需要加入昂贵的抗生素，增加了生产成本。
技术实现要素：
为解决现有肺炎克雷伯氏菌的甘油代谢途径具有较高水平的副产物产物积累，降低了d-乳酸的合成效率，对后期产品分离造成了不利影响，并且发酵过程中需要加入昂贵的抗生素，生产成本高的问题，本发明提供了一种合成d-乳酸的重组菌及其构建方法与应用，本发明以klebsiellapneumoniaeatcc25955为宿主菌株，通过构建基因缺失菌株，消除了乙酸、乙醇、2,3-丁二醇等副产物的合成，实现了葡萄糖到d-乳酸的高效转化，发酵过程不需要添加抗生素，生产成本、转化效率方面都具有一定优势。
本发明的第一个目的是提供一种利用葡萄糖合成d-乳酸的重组菌，所述重组菌是以肺炎克雷伯氏菌为出发菌株，将肺炎克雷伯氏菌基因组的乙酰乳酸合成酶基因budb、乙醇脱氢酶基因adhe和乙酸激酶基因acka进行敲除得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述乙酰乳酸合成酶基因budb在ncbi的基因id为11848061，所述乙醇脱氢酶基因adhe在ncbi的基因id为11848216，所述乙酸激酶基因acka在ncbi的基因id为11848786。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是在肺炎克雷伯氏菌klebsiellapneumoniaeatcc25955的基础上构建得到的。
本发明的第二个目的是提供一种所述重组菌的构建方法，具体步骤如下：
1)以肺炎克雷伯氏菌乙酰乳酸合成酶基因budb上下游500个碱基片段为模板设计引物，pcr扩增乙酰乳酸合成酶基因budb上下游片段，再利用回收试剂盒回收目的基因片段；
2)以步骤1)回收的基因片段为模板进行搭桥pcr，再利用回收试剂盒回收目的片段δbudb；
3)对步骤2)所获得的基因片段δbudb和自杀质粒pre112进行酶切，并回收目的片段和载体；
4)将步骤3)所得的载体和目的片段按照等摩尔比混合后利用连接酶连接，并转入感受态细胞中，筛选阳性克隆；
5)将步骤4)所获得的的阳性克隆进行培养，提取质粒(即为重组载体)，并转化到e.colix7213得到大肠杆菌重组菌；
6)将步骤5)所获得的大肠杆菌重组菌与野生型肺炎克雷伯氏菌共同培养，通过重组载体与野生型肺炎克雷伯氏菌进行同源重组，获得敲除budb基因的基因缺失型菌株k.penumoniaeδbudb；
7)利用步骤1)到步骤6)的方法，在k.penumoniaeδbudb的基础上敲除adhe基因，获得budb、adhe同时缺失的菌株k.penumoniaeδbudbδadhe；
8)利用步骤1)到步骤6)的方法，在k.penumoniaeδbudbδadhe的基础上敲除acka基因，获得budb、adhe、acka同时缺失的菌株k.penumoniaeδbudbδadheδacka，获得重组菌。
在本发明的一种实施方式中，步骤4)所述连接酶为t4dna连接酶，连接时间为6h～12h。
在本发明的一种实施方式中，步骤4)所述筛选，是利用氯霉素平板过夜培养，pcr筛选。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤4)中的感受态细胞为e.colicc118感受态细胞或者e.colidh5α感受态细胞。
所述筛选，是利用氯霉素平板过夜培养，pcr筛选。
本发明的第三个目的是提供所述重组菌在生产d-乳酸中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括：活化重组菌制备种子液，然后接种至含有发酵培养基的发酵罐中，于30℃～37℃、200rpm～400rpm、通气量0.5vvm～2.5vvm条件下培养24h～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述接种是将种子液和发酵培养基按照体积比为(1-10)：(100-150)进行接种。
在本发明的一种实施方式中，所述培养的过程中通过分批补料，使葡萄糖的含量维持在1g/l～5g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述培养的过程中通过加入氨水，使培养基的ph维持在6.8～7.1。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括如下步骤：
1)活化重组菌，获得种子液；
2)将步骤1)所得的种子液，将种子液和发酵培养基按照体积比为种子液：培养基＝(1～10):(100～150)的比例接种后在30℃～37℃、200rpm～400rpm、通气量0.5vvm～2.5vvm条件下继续培养24h～48h；在培养过程中通过分批补料，使葡萄糖的含量维持在1～5g/l；通过加入氨水，使培养基的ph维持在6.8～7.1。
在本发明的一种实施方式中，发酵生产d-乳酸过程中，重组菌所用的培养基包括各种适于所选用的肺炎克雷伯氏菌生长的培养基，碳源优选葡萄糖；不使用其他碳源，其他成分为简单的无机盐成分，不做特别的限定，例如氮源可选择无机氮源(氯化铵、硫酸铵等)，优选低成本的无机氮源。
在本发明的一种实施方式中，培养基碳源为葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述培养基为m9改良培养基：0.42g/l一水合柠檬酸，1.6g/lnh4cl，1g/l酵母粉，0.2g/lmgso4·7h2o，100mmol/lph＝7.0磷酸钾缓冲液，20g/l葡萄糖。
微生物的代谢途径，很多都是已知的；但是代谢途径具有复杂性，例如，一种产物可能有多条代谢途径可以实现，这就意味着敲除某一个基因不一定实现该产物合成的减少；相同的，敲除某一个副产物合成的基因，也不一定会实现其他某一个特定产物的增加；且不同微生物之间也有差别；只有在实际实验验证后才能确认某一个操作是否会对某个产物的合成产生明显影响。本发明针对肺炎克雷伯氏菌，选择同时敲除三个副产物合成基因，实现了乳酸合成的大幅度增加，取得了意料不到的技术效果。
本发明有益效果：
本发明通过敲除乙酰乳酸合成酶基因budb、乙醇脱氢酶基因adhe和乙酸激酶基因acka，有效提高了肺炎克雷伯氏菌利用葡萄糖生产d-乳糖的产量和转化率。本发明的重组菌，具有利用葡萄糖合成d-乳酸的特点，发酵48h、在5l发酵罐水平下可以得到150.1g/l的d-乳酸，转化率为96％。
现有合成d-乳酸工程菌株具有重组表达载体，需要添加昂贵的抗生素来维持环境压力，从而保证表达载体的复制。本发明中所涉及重组菌株，是针对染色体的改造，不含重组载体，在实际发酵过程中不需要添加抗生素，从而能够有效降低生产成本、提高转化效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
所用酶试剂购自mbifermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收dna片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
m9改良培养基：0.42g/l一水合柠檬酸，1.6g/lnh4cl，1g/l酵母粉，0.2g/lmgso4·7h2o，100mmol/lph＝7.0磷酸钾缓冲液，20g/l葡萄糖。
实施例1：重组菌的构建
1、基因budb的敲除
本实施例中，以肺炎克雷伯氏菌(k.penumoniae)野生菌株的乙酰乳酸合成酶基因budb(ncbi的基因id：11848061)上下游约500个碱基片段为模板设计引物，pcr扩增乙酰乳酸合成酶基因budb上下游片段，再利用回收试剂盒回收目的基因片段。
上游片段扩增引物为5'-gctctagagtcagtcagctggaagctc-3'(seqidno.1)和5'-ataagcttcgccacctggtc-3'(seqidno.2)；下游片段扩增引物序列为：5'-gaccaggtggcgaagcttatctgcgcatcgttcgcgccat-3'(seqidno.3)和5'-cgagctcttatcgcgataatctaccg-3'(seqidno.4)。
将上述扩增片段回收后，以回收片段为模板进行搭桥pcr，再利用回收试剂盒回收目的片段δbudb。以自杀质粒pre112为媒介(roberta.edwards,lindah.keller,dieterm.schierli.improvedallelicexchangevectorsandtheirusetoanalyze987pfimbriageneexpression.gene1998；207:149-157.)与k.penumoniae野生菌株进行同源重组敲除budb基因，通过pcr验证获得已经敲除budb的k.penumoniae工程菌即k.penumoniaeδbudb。验证引物序列为5'-atggacaaacagtatccg-3'(seqidno.5)和5'-acagaatctgactcagatg-3'(seqidno.6)。
2、基因adhe的敲除
本实施例中，以肺炎克雷伯氏菌(k.penumoniae)野生菌株的乙醇脱氢酶adhe(ncbi的基因id：11848216)上下游约500个碱基片段为模板设计引物，pcr扩增乙酰乳酸合成酶基因adhe上下游片段，再利用回收试剂盒回收目的基因片段。
上游片段扩增引物为5'-gctctagaatggctgttactaatatcgc-3'(seqidno.7)和5'-cgacgccgatagcaggtttac-3'(seqidno.8)；下游片段扩增引物序列为：5'-gtaaacctgctatcggcgtcggtgcgttcggtggtctggat-3'(seqidno.9)和5'-ggggtacctcagcctttaccggagcaac-3'(seqidno.10)。
将上述扩增片段回收后，以回收片段为模板进行搭桥pcr，再利用回收试剂盒回收目的片段δadhe。以自杀质粒pre112为媒介与k.penumoniaeδbudb进行同源重组敲除budb基因，通过pcr验证获得已经敲除budb的工程菌即k.penumoniaeδbudbδadhe。验证引物序列为5'-ataatgtcgaatcgagcgac-3'(seqidno.11)和5'-gcttgtcgcgatgctatcgc-3'(seqidno.12)。
3、基因acka的敲除
本实施例中，以肺炎克雷伯氏菌(k.penumoniae)野生菌株的乙酸激酶基因acka(ncbi的基因id：11848786)上下游约500个碱基片段为模板设计引物，pcr扩增乙酰乳酸合成酶基因acka上下游片段，再利用回收试剂盒回收目的基因片段。
上游片段扩增引物为5'-gctctagaatgtcgagtaagttagtac-3'(seqidno.13)和5'-gcgtagagataggattcttc-3'(seqidno.14)；下游片段扩增引物序列为：5'-gaagaatcctatctctacgcgaaggcctggtgatgggtac-3'(seqidno.15)和5'-cgagctcttatgcggtcagacggctggc-3'(seqidno.16)。
将上述扩增片段回收后，以回收片段为模板进行搭桥pcr，再利用回收试剂盒回收目的片段δacka。以自杀质粒pre112为媒介与k.penumoniaeδbudbδadhe进行同源重组敲除acka基因，通过pcr验证获得已经敲除acka的工程菌即k.penumoniaeδbudbδadheδacka。验证引物序列为5'-atcctgcgctacgctaatgac-3'(seqidno.17)和5'-cctgcagctcgaattattgc-3'(seqidno.18)。
实施例2：重组肺炎克雷伯氏菌利用葡萄糖合成d-乳酸
本实施例中，将实施例1中获得重组肺炎克雷伯氏菌k.peneumoniaeδbudbδadheδacka在lb液体培养基中活化，活化后的菌株按1:150的比例接种到含有1.8l的m9改良液体培养基的5l发酵罐中，30℃、200rpm、0.5vvm通气条件下培养。通过补加氨水，使发酵液的ph维持在6.8左右。定时取样离心，上清液通过生物传感器检测葡萄糖含量，根据残糖浓度适量补加70％的葡萄糖溶液，使糖浓度维持在1g/l～5g/l，保证充足的碳源。培养24h终止发酵，取1ml发酵液，4℃、15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度。
经检测，d-乳酸产量为136.2g/l、葡萄糖到乳酸的转化率为88％，2,3-丁二醇、乙醇、乙酸的含量分别为0.01、3.03、7.11g/l，实现了醇类副产物合成的阻断。
实施例3：重组肺炎克雷伯氏菌利用葡萄糖合成d-乳酸
本实施例中，将实施例1中获得重组肺炎克雷伯氏菌k.peneumoniaeδbudbδadheδacka在lb液体培养基中活化，活化后的菌株按1:100的比例接种到含有1.8l的m9改良液体培养基的5l发酵罐中，37℃、300rpm、1.5vvm通气条件下培养。通过补加氨水，使发酵液的ph维持在7左右。定时取样离心，上清液通过生物传感器检测葡萄糖含量，根据残糖浓度适量补加70％的葡萄糖溶液，使糖浓度维持在1g/l～5g/l，保证充足的碳源。培养36h终止发酵，取1ml发酵液，4℃、15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度。
经检测，d-乳酸产量为140.1g/l、葡萄糖到乳酸的转化率为91％，2,3-丁二醇、乙醇、乙酸的含量分别为0.01、2.14、8.16g/l，实现了醇类副产物合成的阻断。
实施例4：重组肺炎克雷伯氏菌利用葡萄糖合成d-乳酸
本实施例中，将实施例1中获得重组肺炎克雷伯氏菌k.peneumoniaeδbudbδadheδacka在lb液体培养基中活化，活化后的菌株按10：150的比例接种到含有1.8l的m9改良液体培养基的5l发酵罐中，37℃、400rpm、2.0vvm通气条件下培养。通过补加氨水，使发酵液的ph维持在7左右。定时取样离心，上清液通过生物传感器检测葡萄糖含量，根据残糖浓度适量补加70％的葡萄糖溶液，使糖浓度维持在1g/l～5g/l，保证充足的碳源。培养48h终止发酵，取1ml发酵液，4℃、15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度。
经检测，d-乳酸产量为145.4g/l、葡萄糖到乳酸的转化率为94％，2,3-丁二醇、乙醇、乙酸的含量分别为0.01、1.6、8g/l，实现了醇类副产物合成的阻断。
实施例5：重组肺炎克雷伯氏菌利用葡萄糖合成d-乳酸
本实施例中，将实施例1中获得重组肺炎克雷伯氏菌k.peneumoniaeδbudbδadheδacka在lb液体培养基中活化，活化后的菌株按10:100的比例接种到含有1.8l的m9改良液体培养基的5l发酵罐中，37℃、400rpm、2.5vvm通气条件下培养。通过补加氨水，使发酵液的ph维持在7左右。定时取样离心，上清液通过生物传感器检测葡萄糖含量，根据残糖浓度适量补加70％的葡萄糖溶液，使糖浓度维持在1g/l～5g/l，保证充足的碳源。培养48h终止发酵，取1ml发酵液，4℃、15000rpm离心10min，取上清，用高效液相色谱检测产物浓度。
经检测，d-乳酸产量为150.1g/l、葡萄糖到乳酸的转化率为96％，2,3-丁二醇、乙醇、乙酸的含量分别为0.01、0.05、8.9g/l，实现了醇类副产物合成的阻断。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120>一种合成d-乳酸的重组菌及其构建方法与应用
<130>1
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