本发明涉及psa3蛋白在参与psi的组装以及维持psi稳定中的应用。
背景技术：
：：在蓝细菌、藻类和植物中广泛存在两大类类囊体膜蛋白复合体，一个为光系统ⅰ复合体(psⅰ)，另一个为光系统ii复合体(psii)。psi大约有600kd，由两个小一点的亚复合体组成。psi几乎一半的亚基都是由叶绿体基因组编码的。psi的两个亚复合体分别是：①核心复合体，负责从类囊体囊腔侧的质体蓝素转移电子到基质侧的铁氧还蛋白；②lhci复合体，负责捕获光能量。核心复合体由9个膜蛋白(psaa、psab、psaf-psal)和3个外围的亚基(psac、psad和psae)组成。lhci复合体由细胞核编码的四种lhca蛋白以及部分lhcb蛋白组成，lhca蛋白位于类囊体膜内部。psaa和psab以异源二聚体的形式参与电荷分离和电子转移，核心复合体的其他亚基围绕在psaa/psab异源二聚体周围参与psi的稳定以及与lhci复合体的结合。psi大概包含两百种叶绿素、类胡萝卜素、铁硫簇和质体醌等辅基基团。现有技术中，对psi的生物发生知之甚少。有证据表明：光合真核生物中psi的组装起始于膜上psaa/psab二聚体的形成；随后psac、psad和psae组成所谓的“基质桥”添加到基质侧的psaa/psab二聚体上；在最后的步骤中，其它亚基被组装到psi中。到目前为止，已经鉴定出六个蛋白，负责psi的累积以及参与psi组装过程的不同阶段，其中包括质体编码的蛋白ycf3和ycf4，以及细胞核编码的蛋白y3ip1、pyg7/ycf37、ppd1和psa2。ycf3、ycf4和y3ip1结合在类囊体膜的基质侧，有研究表明它们参与了psi基质桥的组装过程。ppd1和psa2依附在类囊体膜的囊腔侧。pyg7是一个内膜蛋白，最近研究表明，pyg7在衣藻中的同源体负责psi的生物发生，尤其是在有氧条件下并且可以防止铁硫簇在组装过程中被氧化。技术实现要素：本发明的目的是提供psa3蛋白在参与psi的组装以及维持psi稳定中的应用。本发明首先保护钙平衡调节因子(psa3蛋白)的应用，为如下(a1)至(a6)中的至少一种：(a1)参与光系统ⅰ复合体(psⅰ)的组装；(a2)参与光系统ⅰ复合体(psⅰ)的形成；(a3)维持光系统ⅰ复合体(psⅰ)的稳定性；(a4)用于制备参与光系统ⅰ复合体(psⅰ)的组装的产品；(a5)用于制备参与光系统ⅰ复合体(psⅰ)的形成的产品；(a6)用于制备维持光系统ⅰ复合体(psⅰ)的稳定性的产品。本发明还保护钙平衡调节因子(psa3蛋白)的应用，为如下(b1)至(b10)中的至少一种：(b1)参与光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的组装；(b2)参与光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的形成；(b3)维持光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的稳定性；(b4)维持光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的水平；(b5)维持光合真核生物中psaa蛋白的水平；(b6)用于制备参与光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的组装的产品；(b7)用于制备参与光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的形成的产品；(b8)用于制备维持光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的稳定性的产品；(b9)用于制备维持光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的水平的产品；(b10)用于制备维持光合真核生物中psaa蛋白的水平的产品。本发明还保护钙平衡调节因子(psa3蛋白)的应用，为如下(c1)至(c6)中的至少一种：(c1)与pyg7蛋白结合；(c2)检测pyg7蛋白；(c3)纯化或富集pyg7蛋白；(c4)制备用于结合pyg7蛋白的产品；(c5)制备用于检测pyg7蛋白的产品；(c6)制备用于纯化或富集pyg7蛋白的产品。本发明还保护钙平衡调节因子(psa3蛋白)和pyg7蛋白的应用，为如下(d1)至(d6)中的至少一种：(d1)共同参与光系统ⅰ复合体(psⅰ)的组装；(d2)共同参与光系统ⅰ复合体(psⅰ)的形成；(d3)共同维持光系统ⅰ复合体(psⅰ)的稳定性；(d4)用于制备参与光系统ⅰ复合体(psⅰ)的组装的产品；(d5)用于制备参与光系统ⅰ复合体(psⅰ)的形成的产品；(d6)用于制备维持光系统ⅰ复合体(psⅰ)的稳定性的产品。本发明还保护钙平衡调节因子(psa3蛋白)和pyg7蛋白的应用，为如下(e1)至(e10)中的至少一种：(e1)共同参与光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的组装；(e2)共同参与光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的形成；(e3)共同维持光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的稳定性；(e4)共同维持光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的水平；(e5)共同维持光合真核生物中psaa蛋白的水平；(e6)用于制备参与光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的组装的产品；(e7)用于制备参与光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的形成的产品；(e8)用于制备维持光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的稳定性的产品；(e9)用于制备维持光合真核生物中光系统ⅰ复合体(psⅰ)的水平的产品；(e10)用于制备维持光合真核生物中psaa蛋白的水平的产品。本发明还保护一种制备光系统ⅰ复合体受损的光合真核生物的方法，包括如下步骤：敲除光合真核生物基因组中编码钙平衡调节因子(psa3蛋白)的基因，得到光系统ⅰ复合体受损的光合真核生物。本发明还保护一种制备光系统ⅰ复合体受损的光合真核生物的方法，包括如下步骤：突变光合真核生物基因组中编码钙平衡调节因子(psa3蛋白)的基因，得到光系统ⅰ复合体受损的光合真核生物。本发明还保护一种制备光系统ⅰ复合体受损的光合真核生物的方法，包括如下步骤：抑制光合真核生物中钙平衡调节因子(psa3蛋白)的活性，得到光系统ⅰ复合体受损的光合真核生物。本发明还保护一种多肽片段，由钙平衡调节因子(psa3蛋白)c末端的54个氨基酸残基组成。所述多肽片段具体可为序列表的序列3第224-277位氨基酸残基组成的多肽片段。本发明还保护所述多肽片段的应用，为如下(f1)或(f2)：(f1)参与钙平衡调节因子(psa3蛋白)和pyg7蛋白的结合；(f2)用于制备参与钙平衡调节因子(psa3蛋白)和pyg7蛋白的结合的产品。以上任一所述光合真核生物具体可为植物，例如玉米或拟南芥。所述钙平衡调节因子(psa3蛋白)具体可为如下(g1)或(g2)或(g3)或(g4)或(g5)：(g1)序列表的序列1所示的蛋白质；(g2)序列表的序列3所示的蛋白质；(g3)在(g1)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；(g4)在(g2)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；(g5)将(g1)或(g2)或(g3)或(g4)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与光系统ⅰ复合体(psⅰ)的组装相关的由其衍生的蛋白质。所述pyg7蛋白可为如下(h1)或(h2)或(h3)：(h1)序列表的序列5所示的蛋白质；(h2)在(h1)的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；(h3)将(h1)或(h2)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与(h1)具有相同功能的由其衍生的蛋白质。以上任一所述标签具体见表1。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl以上任一所述编码钙平衡调节因子(psa3蛋白)的基因可为如下(j1)或(j2)或(j3)或(j4)：(j1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；(j2)编码区如序列表中序列4所示的dna分子；(j3)在严格条件下与(j1)或(j2)限定的dna序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子；(j4)与(j1)或(j2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的dna分子。上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。psa3基因突变后导致玉米和拟南芥中psⅰ的特异缺失。核糖体模式实验和同位素脉冲标记实验分析表明叶绿体编码的psi亚基的合成速率在突变体中并未改变，这表明psa3蛋白功能包含在psi翻译后的生物发生过程。psa3蛋白定位在叶绿体类囊体膜的基质侧，其所在复合体大小比成熟psi复合体略微小一些。酵母双杂交和双分子荧光互补实验证明psa3蛋白与pyg7蛋白互作，并且psa3蛋白和pyg7蛋白分别被发现位于相似分子量大小的类囊体膜相关复合体中。综上所述，本发明的发明人发现，缺乏psa3蛋白使得光系统ⅰ复合体不能正确组装，从而psaa蛋白迅速被降解掉，进一步来说，psa3蛋白和pyg7蛋白共同在psi组装的类囊体膜基质侧辅助psi复合体的组装和稳定。本发明对于光合真核生物psⅰ的研究具有重大应用价值。附图说明图1为实施例2中三叶期的待测植株的表型。图2为实施例2中westernblot检测zm-psa3蛋白水平。图3为实施例2中westernblot检测psaa蛋白、d2蛋白、peta蛋白和atpb蛋白的水平。图4为实施例3中表型鉴定的结果。图5为实施例3中westernblot检测的结果。图6为实施例4中第一向电泳的结果。图7为实施例4中第二向电泳的结果。图8为实施例5的结果。图9为实施例6的结果。图10为实施例7的结果。图11为实施例8的结果。图12为实施例9的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。在序列表的序列1所示的zm-psa3蛋白的c末端融合his6标签，然后作为免疫原免疫兔子，得到zm-psa3蛋白的多克隆抗体，简称zm-psa3抗体。用于检测psaa蛋白的一抗：as06172，agrisera。用于检测d2蛋白的一抗：as06146pre，agrisera。用于检测peta蛋白的一抗：as06119，agrisera。用于检测atpa/atpb蛋白的一抗：as05085pre，agrisera。用于检测psad蛋白的一抗：as09461，agrisera。用于检测flag标签的一抗：as152871,agrisera。用于检测psac的一抗：as10939,agrisera。用于检测psaf的一抗：as06104,agrisera。用于检测psak的一抗：as04049,agrisera。用于检测psal的一抗：as06108,agrisera。实施例1、psa3蛋白的功能发现本发明的发明人构建了mu转座子诱导的玉米突变体库，从中筛选不能进行光合作用的突变株(具有黄化表型的植株)，采用深度测序方法鉴定mu-转座子的插入与表型共分离，鉴定到若干个插入突变。一个突变株在特定基因的起始密码子附近存在一个插入位点，将该突变株命名为突变株甲。另一个突变株在相同的特定基因的第三外显子处存在一个插入位点，将该突变株命名为突变株乙。突变株甲和突变株乙缺乏psi反应中心蛋白(psaa蛋白)，但是psii核心亚基、细胞色素b6f复合体、atp合酶和rubisco水平与野生株基本一致，植株叶片显示升高的叶绿素荧光，当种子能量耗尽后在土壤中培养三周后死亡。结果表明，所述特定基因编码参与psⅰ组装/稳定的蛋白，将该特定基因命名为zm-psa3基因(开放阅读框如序列表的序列2所示)，将该基因编码的蛋白质命名为zm-psa3蛋白(如序列表的序列1所示)。序列表的序列1所示蛋白质的原注释为钙平衡调节因子(calciumhomeostasisregulator)。zm-psa3基因为隐性基因，纯合基因型的植株发生黄化表型。zm-psa3基因主要在嫩叶组织中表达，与激活叶绿体的发育时期相吻合。在拟南芥基因组中寻找zm-psa3基因的同源基因，将其命名为at-psa3基因(at3g55250，开放阅读框如序列表的序列4所示)，将该基因编码的蛋白质命名为at-psa3蛋白(如序列表的序列3所示，第1-45位为信号肽，第46-277位为成熟蛋白)。序列表的序列3所示蛋白质的原注释为钙平衡调节因子(calciumhomeostasisregulator)。at-psa3蛋白存在于叶绿体蛋白组中。从拟南芥salk突变体库(thesalkcollection，网址为：http://signal.salk.edu)商购在at3g55250中发生t-dna插入的突变体拟南芥(编号为sail_503_b01；突变体拟南芥的背景植株为哥伦比亚生态型拟南芥，col-0)，将其命名为at-psa3突变体。经全基因组测序，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，at-psa3突变体的差异仅在于一条染色体在at-psa3基因中插入了t-dna(插入位置为“agcttcttaaag”之前,位于基因的第三个外显子处)，另一条染色体未发生任何插入。at-psa3突变体的纯合后代(即两条染色体均发生了所述t-dna插入)表现出黄化表型，移栽到土中很快死亡。at-psa3突变体的纯合后代(即两条染色体均发生了所述t-dna插入)播种在含2％蔗糖的ms培养基中，植株出现灰绿、生长缓慢的表型，叶片具有高叶绿素荧光，缺乏psi的psaa蛋白。实施例2、突变体玉米与野生型玉米的比较以玉米hiii的种子胚为受体，利用cas9技术定向敲除zm-psa3基因，得到突变体玉米，将其命名为zm-psa3突变体。经全基因组测序，与玉米hiii相比，zm-psa3突变体的差异仅在于一条染色体中的zm-psa3基因丧失了编码功能，另一条染色体的zm-psa3基因与受体相同。待测植株分别为：玉米hiii和zm-psa3突变体的纯合后代(即两条染色体中的zm-psa3基因均丧失了编码功能)。1、表型鉴定三叶期的待测植株的表型见图1。图1中，左侧植株为玉米hiii，右侧植株为zm-psa3突变体的纯合后代。与玉米hiii相比，zm-psa3突变体的纯合后代生长缓慢。采用mini-pamchlorophyllfluorometer(walz)观察三叶期待测植株的表型(参考文献：meurerj,meierhoffk,westhoffp(1996)isolationofhigh-chlorophyll-fluorescencemutantsofarabidopsisthalianaandtheircharacterisationbyspectroscopy,immunoblottingandnorthernhybridisation.planta198:385-396)。与玉米hiii相比，zm-psa3突变体的纯合后代的叶片具有高叶绿素荧光。2、zm-psa3蛋白水平的鉴定提取三叶期待测植株叶片的总蛋白，进行sds-page和westernblot，检测zm-psa3蛋白水平，结果见图2。图2中，1对应玉米hiii，2对应zm-psa3突变体的纯合后代。玉米hiii中zm-psa3蛋白对应约26kda的条带。zm-psa3突变体的纯合后代中检测不到zm-psa3蛋白。3、其他蛋白表达量检测提取三叶期待测植株叶片的总蛋白，进行sds-page和westernblot，检测psaa蛋白、d2蛋白、peta蛋白和atpb蛋白的水平。结果见图3。图3中，1对应玉米hiii，2对应zm-psa3突变体的纯合后代。与玉米hiii相比，zm-psa3突变体的纯合后代中psaa蛋白水平显著降低，d2蛋白、peta蛋白和atpb蛋白的水平均无显著差异。实施例3、野生型拟南芥、突变型拟南芥以及回补株系拟南芥的比较提及pcambia1300-flag载体的文献(在文献中的相应名称为“amodifiedpcambia1300containingeitherthemycorflagcodingsequence”)：zhaoy,xies,lix,wangc,chenz,laij,gongz.。repressorofsilencing5encodesamemberofthesmallheatshockproteinfamilyandisrequiredfordnademethylationinarabidopsis.plantcell.2014jun；26(6):2660-2675.。一、回补株系的获得1、将序列表的序列4自5’末端第1-831位核苷酸所示的双链dna分子插入pcambia1300-flag载体的xbai和sali酶切位点之间，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在pcambia1300-flag载体的xbai和sali酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第1-831位核苷酸所示的dna分子，该dna分子与载体骨架上的部分核苷酸融合，表达c末端融合三个flag标签的at-psa3蛋白(简称psa3-flag蛋白)。2、将步骤1得到的重组质粒导入农杆菌gv3101，得到重组农杆菌。3、采用蘸花法将步骤2得到的重组农杆菌对at-psa3突变体进行遗传转化，收集再生植株的种子(t0代种子)。4、t0代种子长成的植株即为t1代植株，t1代植株自交获得t1代种子，t1代种子长成的植株即为t2代植株，t2代植株自交获得t2代种子，t2代种子长成的植株即为t3代植株。对t1代植株和随机抽样的t2代植株进行pcr鉴定(提取基因组dna，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，如果得到800-900bp的扩增产物，鉴定为阳性)，如果某一t1代植株及其抽样检测的t2代植株均鉴定为阳性，该t1代植株及其自交后代为一个回补株系。f1：atatctagaatggtggttgtcactcacatc；r1：atagtcgacaagactctatgttttgttgttgaagg。二、相关鉴定待测植株分别为：at-psa3突变体的纯合后代(即两条染色体均发生了所述t-dna插入)、哥伦比亚生态型拟南芥、回补株系中背景植株为“两条染色体均发生了所述t-dna插入”的纯合突变体的t3代植株。用于鉴定背景植株为“两条染色体均发生了所述t-dna插入”的纯合突变体的方法：提取基因组dna，分别采用引物对甲(f2和r2组成)和引物对乙(f3和r2组成)进行pcr扩增，如果采用引物对甲不能实现扩增且采用引物对乙可以实现扩增，鉴定为阳性。f2：ttgaacattgatgcgccaac；r2：ccatacggcaaacaccatct；f3：tagcatctgaatttcataaccaatctcgatacac。萌发3周后的待测植株的表型见图4a。采用mini-pamchlorophyllfluorometer(walz)观察萌发3周后的待测植株的表型(参考文献：meurerj,meierhoffk,westhoffp(1996)isolationofhigh-chlorophyll-fluorescencemutantsofarabidopsisthalianaandtheircharacterisationbyspectroscopy,immunoblottingandnorthernhybridisation.planta198:385-396)。照片见图4b。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，at-psa3突变体的纯合后代生长缓慢、具有高叶绿素荧光。回补株系的t3代植株回补了at-psa3突变体的纯合后代的上述表型，与哥伦比亚生态型基本一致。提取萌发3周后的待测植株的叶片的总蛋白，进行sds-page和westernblot，检测psaa蛋白、d2蛋白、peta蛋白、atpa蛋白和psa3-flag蛋白的水平。结果见图5。图5中，1对应哥伦比亚生态型拟南芥，2对应at-psa3突变体的纯合后代，3对应回补株系的t3代植株。与哥伦比亚生态型拟南芥相比，at-psa3突变体的纯合后代中psaa蛋白水平显著降低，d2蛋白、peta蛋白和atpa蛋白的水平均无显著差异。回补株系的t3代植株中psaa蛋白、d2蛋白、peta蛋白和atpa蛋白的水平均与哥伦比亚生态型拟南芥无显著差异。实施例4、psa3蛋白负责psi的蛋白积聚和在psi组装中间体中起作用试验材料分别为：玉米hiii、实施例2得到的zm-psa3突变体的纯合后代(即两条染色体中的zm-psa3基因均丧失了编码功能)、哥伦比亚生态型拟南芥、at-psa3突变体的纯合后代(即两条染色体均发生了所述t-dna插入)。1、取处于三叶期的玉米试验材料的新鲜叶片，取萌发三周后的拟南芥试验材料的新鲜叶片，分别提取类囊体膜蛋白(参考文献：彭连伟，lpa1调控拟南芥psⅱ组装的分子机理研究，2006，兰州大学)。2、将步骤1得到的类囊体膜蛋白溶解在ddm(n-dodecyl-d-maltoside)后进行blue-nativepage(bn-page)。然后，将bn-page胶上的蛋白复合体转移到纤维素膜上，进行westernblot，采用psad蛋白的一抗检测psi(psad蛋白的存在形式为组装在psi中)。结果见图6。图6中，1对应玉米hiii，2对应zm-psa3突变体的纯合后代，3对应哥伦比亚生态型拟南芥，4对应at-psa3突变体的纯合后代。根据bn-page的结果，psi的染色条带(参考文献：pengl,fukaoy,fujiwaram,takamit,shikanait(2009)efficientoperationofnad(p)hdehydrogenaserequiressupercomplexformationwithphotosystemiviaminorlhci755inarabidopsis.plantcell21:3623-3640)在zm-psa3突变体的纯合后代以及at-psa3突变体的纯合后代中均减少：一条是相应的ndh-psi超级复合体，另一条是psi和psii的二聚物(共迁移体)。根据westernblot的结果，在玉米hiii中存在一个明显的具有psad蛋白的比较小的复合体(见图中的“*”标注)，但在zm-psa3突变体的纯合后代中缺失了，该条带应为psi组装中间体(参考文献：wittenbergg,jarvis,hojkam,tothsz,meyereh,aroem,schottlerma,bockr802(2017)identificationandcharacterizationofastableintermediateinphotosystemi803assemblyintobacco.plantj)。4、完成步骤3后，进行第二向电泳(sds-ureapage)。结果见图7。图7中，左上对应哥伦比亚生态型拟南芥，右上对应at-psa3突变体的纯合后代，左下对应玉米hiii，右下对应zm-psa3突变体的纯合后代。在zm-psa3突变体的纯合后代以及at-psa3突变体的纯合后代中psi的亚基均缺失了。实施例5、psa3蛋白不负责叶绿体编码psi亚基和组装因子的基因表达为了探索psa3如何参与psi的生物发生，分析叶绿体编码的psi亚基和psi组装因子的表达情况。试验材料分别为：玉米hiii、实施例2得到的zm-psa3突变体的纯合后代(即两条染色体中的zm-psa3基因均丧失了编码功能)、哥伦比亚生态型拟南芥、at-psa3突变体的纯合后代(即两条染色体均发生了所述t-dna插入)。取萌发10天后的拟南芥试验材料的离体叶片，进行脉冲标记实验。描述脉冲标记实验的参考文献：liuj,yangh,luq,wenx,chenf,pengl,zhangl,luc(2012)psbp-domainprotein1,anuclear-encodedthylakoidlumenalprotein,isessentialforphotosystemiassemblyinarabidopsis.plantcell24:4992-5006。结果见图8。at-psa3突变体的纯合后代中psaa蛋白和psab蛋白合成未受影响。1小时/2小时后，at-psa3突变体的纯合后代中psaa蛋白和psab蛋白的降解速度比在哥伦比亚生态型拟南芥中快。取处于三叶期的玉米试验材料，进行核糖体图谱分析(ribosomeprofiling)。描述核糖体图谱分析的参考文献：zoschker,watkinsk,barkana(2013)arapidmicroarray-basedribosomeprofiling809methodelucidateschloroplastribosomebehaviorinvivoplantcell25:2265-2275。结果见表2。玉米hiii、zm-psa3突变体的纯合后代，psaa/b，psac和ycf3的mrna均没有差异。表2玉米hiiizm-psa3突变体的纯合后代psaa2161824567psab2628527925psac2722120335psai1810816554psaj1952319541ycf351386670ycf434035624综上所述，psa3蛋白是在psi亚基蛋白的翻译后过程中起作用。实施例6、psa3蛋白结合在叶绿体类囊体膜蛋白的基质侧1、提取三叶期玉米hiii的叶片的总蛋白，分成类囊体和基质两部分(参考文献：彭连伟，lpa1调控拟南芥psⅱ组装的分子机理研究，2006，兰州大学)。分别进行sds-page和westernblot(检测psa3蛋白)。发现psa3蛋白主要富集在类囊体部分，在基质里也有少量分布。2、采用na2co3或者nabr处理完整的类囊体(如果可以将psa3蛋白洗掉，则说明psa3蛋白位于类囊体的基质侧；如果洗不掉，则位于类囊体的囊腔侧)。然后进行sds-page和westernblot(检测psa3蛋白)。结果表明，na2co3或者nabr可以将大部分psa3蛋白洗掉。psa3蛋白位于类囊体膜的囊腔侧。3、用蛋白酶k(proteinasek)或者嗜热菌蛋白酶(thermolysin)处理完整类囊体。然后进行sds-page和westernblot(检测psa3蛋白)。结果表明，psa3蛋白被降解，而类囊体囊腔侧的oe23蛋白仍旧完整。4、用tritonx-100将类囊体膜全部溶解，同时添加蛋白酶k(proteinasek)或者嗜热菌蛋白酶(thermolysin)。结果表明，psa3蛋白和oe23蛋白都会被降解。以上结果见图9(p代表沉淀，s代表上清)。以上结果都表明psa3蛋白依附于叶绿体类囊体膜的基质侧。实施例7、psa3蛋白在psi组装因子突变体中的积聚为了进一步探索psa3蛋白与其他psi生物发生相关蛋白之间的关系，比较了psa3蛋白和光合相关蛋白在其他相关玉米psi突变体中的表达情况。zm-psa2是类囊体囊腔侧组装因子，zm-pyg7是类囊体内膜上的组装因子。突变体玉米zm-psa2、突变体玉米zm-pyg7记载于如下文献：fristedtr,williams-carrierr,merchantss,barkana(2014)athylakoidmembraneproteinharboringadnaj-typezincfingerdomainisrequiredforphotosystemiaccumulationinplants.jbiolchem289:30657-30667。试验材料分别为：玉米hiii、实施例2得到的zm-psa3突变体的纯合后代(即两条染色体中的zm-psa3基因均丧失了编码功能)、突变体玉米zm-psa2的纯合后代、突变体玉米zm-pyg7的纯合后代。提取各个三叶期玉米实验材料的叶片的总蛋白，进行sds-page和westernblot。结果见图10。图10中，1对应zm-psa3突变体的纯合后代，2对应突变体玉米zm-psa2的纯合后代，3对应突变体玉米zm-pyg7的纯合后代。各个突变体的纯合后代均少了psi核心亚基的表达。突变体玉米zm-psa2的纯合后代、突变体玉米zm-pyg7的纯合后代中，psa3蛋白积聚是正常的，说明psa3蛋白的积聚不依赖psi。在突变体玉米zm-pyg7的纯合后代中，psa3蛋白水平略微下降说明pyg7蛋白和psa3蛋白有可能在功能上和生理上是互作的。实施例8、psa3蛋白存在于类囊体膜蛋白复合体，位置略低于成熟的psi复合体试验材料分别为：玉米hiii、实施例2得到的zm-psa3突变体的纯合后代(即两条染色体中的zm-psa3基因均丧失了编码功能)、突变体玉米zm-psa2的纯合后代、突变体玉米zm-pyg7的纯合后代。1、取处于三叶期的玉米试验材料的新鲜叶片，提取类囊体膜蛋白。2、将步骤1得到的类囊体膜蛋白溶解在ddm后进行blue-nativepage(bn-page)。然后，将bn-page胶上的蛋白复合体转移到纤维素膜上，进行westernblot(检测psa3蛋白和psaa蛋白)。结果见图11。图11中，1对应玉米hiii，2对应zm-psa3突变体的纯合后代，4对应突变体玉米zm-psa2的纯合后代，3对应突变体玉米zm-pyg7的纯合后代。突变体玉米zm-psa2的纯合后代、突变体玉米zm-pyg7的纯合后代中，psa3蛋白的多聚状态都有所变化。突变体玉米zm-psa2的纯合后代中，psa3蛋白积聚正常水平甚至更高，这进一步提供了psa3蛋白不存在于成熟psi的证据。突变体玉米zm-pyg7的纯合后代中，psa3蛋白复合体的丰度减少，表明pyg7蛋白对psa3蛋白结合和复合体的形成时必须的。psa3蛋白所在复合体的位置略微低于psi复合体，其迁移在psi复合体的前端。这些结果表明pyg7蛋白和psa3蛋白可能是存在于同一个大的复合体内。实施例9、psa3和pyg7在酵母和原生质体中互作at-pyg7蛋白如序列表的序列5所示。at-pyg7蛋白中，第1至59位为信号肽，第60-301为成熟蛋白。编码at-pyg7蛋白的基因命名为at-pyg7基因，开放阅读框如序列表的序列6所示。一、酵母双杂交实验pccw-suc载体为诱饵表达载体。pdsl-nx载体(又称“pdsl-nxvector”)和pdl2-xn载体(又称“pdl2-xnpreyvector”)为猎物表达载体。将编码at-pyg7成熟蛋白的dna分子(序列6第178-903位核苷酸)插入pccw-suc载体，得到表达融合蛋白atpyg7-cub(包括at-pyg7成熟蛋白和cub，cub位于c端)的重组质粒a。将编码at-psa3成熟蛋白的dna分子(序列4第136-834位核苷酸)插入pdsl-nx载体，得到表达融合蛋白nubg-atpsa3(包括nubg和at-psa3成熟蛋白，nubg位于n端)的重组质粒b。将编码at-psa3成熟蛋白的dna分子(序列4第136-831位核苷酸)插入pdl2-xn载体，得到表达融合蛋白atpsa3-nubg(包括at-psa3成熟蛋白和nubg，nubg位于c端)的重组质粒c。将编码at-psa3△c的dna分子(序列4第136-669位核苷酸+taa)插入pdsl-nx载体，得到表达融合蛋白nubg-atpsa3△c(包括nubg和atpsa3△c，nubg位于n端；at-psa3△c即at-psa3成熟蛋白的c末端缺失了54个氨基酸残基)的重组质粒d。将重组诱导载体(重组质粒a)和重组猎物载体(重组质粒b、重组质粒c或重组质粒d)共同导入nwy32酵母(dualsystemsbiotech公司)，分别在平板甲(-tlha)和平板乙(-tl)上进行培养。平板甲为缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的sd培养基琼脂平板。平板乙为缺乏亮氨酸、色氨酸的sd培养基琼脂平板。结果见图12a。atpyg7-cub和nubg-atpsa3之间可以检测到互作，但是。atpyg7-cub和atpsa3-nubg之间检测不到蛋白之间的互作，表明atpsa3蛋白的c末端对与atpyg7蛋白的互作非常重要。将atpsa3蛋白c末端54个氨基酸去掉后，则检测不到atpsa3蛋白和atpyg7蛋白之间的互作，这也同样印证了atpsa3蛋白c末端在介导atpsa3蛋白与atpyg7互作上的重要作用。二、荧光互补实验(bimolecularfluorescencecomplementationassay，bifc)puc-spyne中具有n-yfp蛋白的编码序列，puc-spyce中具有c-yfp蛋白的编码序列。n-yfp蛋白和c-yfp蛋白组成完成的yfp蛋白，产生yfp荧光。将编码at-psa3成熟蛋白的dna分子(序列4第136-831位核苷酸)插入puc-spyne，得到重组质粒e。重组质粒e表达at-psa3成熟蛋白与n-yfp蛋白的融合蛋白(n-yfp蛋白位于c端)，用psa3-yfpn表示。将编码at-psa3成熟蛋白的dna分子(序列4第136-831位核苷酸)插入puc-spyce，得到重组质粒f。重组质粒f表达at-psa3成熟蛋白与c-yfp蛋白的融合蛋白(c-yfp蛋白位于c端)，用psa3-yfpc表示。将编码at-pyg7成熟蛋白的dna分子(序列6第178-903位核苷酸)插入puc-spyne，得到重组质粒g。重组质粒g表达at-pyg7成熟蛋白与n-yfp蛋白的融合蛋白(n-yfp蛋白位于c端)，用pyg7-yfpn表示。将编码at-pyg7成熟蛋白的dna分子(序列6第178-903位核苷酸)插入puc-spyce，得到重组质粒h。重组质粒h表达at-pyg7成熟蛋白与c-yfp蛋白的融合蛋白(c-yfp蛋白位于c端)，用pyg7-yfpc表示。将重组质粒e和重组质粒h共同导入哥伦比亚生态型拟南芥原生质体，16小时后采用激光共聚焦扫描显微镜(lsm510490meta；zeiss)捕获yfp荧光。将重组质粒f和重组质粒g共同导入哥伦比亚生态型拟南芥原生质体，16小时后采用激光共聚焦扫描显微镜(lsm510490meta；zeiss)捕获yfp荧光。结果见图12b。yfp荧光在pyg7-psa3中可以观察到，说明pyg7蛋白与psa3蛋白互作。sequencelisting<110>中国科学院植物研究所<120>psa3蛋白在参与psi的组装以及维持psi稳定中的应用<130>gncyx171023<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>269<212>prt<213>玉米<400>1metglyalaleuprovalalahisserleualaleuthralaalaphe151015leuprocysargargproalaalahisglyargcysargargargarg202530tyrargalavalvalalatyrmetgluproasnproasnserproala354045alailealaglyargleuvalglyalaleuproilevalglyleuval505560alaargileleuasnaspgluglyglyvalglyglyaspileileasp65707580phealaglupheargargargvalserlyslyscysthrvalmetasp859095serlysalaphetyrasppheasnglnargargglylysproglyasp100105110prophetyrvalleuleucyscystrpleualaalaileglyalagly115120125leuleulysthrglugluileleugluglyvalalaargleuargile130135140serasnaspilegluphegluglugluthrpheileaspmetmetarg145150155160alaalalysglulysargalalysleulysalaproalaproglnile165170175prometgluthrargalaglulysalaleuglualailetyrvalcys180185190cyspheglyglnaspmetvalgluaspgluaspglulysleuleuarg195200205alaileleuasnalavalpheproservalglyargalaalavalglu210215220argmetvalalasermetalalysglnvalalaserglygluarglys225230235240argaspglyargthrvalserlysgluvalglnglnargglnleulys245250255aspleuglupheleulysglnasnlysleugluserser260265<210>2<211>810<212>dna<213>玉米<400>2atgggggcgctacccgtcgcccacagtctcgctctcaccgccgcgttcctcccgtgccgc60cgccccgcggcccacggccggtgccggcgccggcggtacagagcggtggtggcgtacatg120gagccgaaccccaactcgccggcggccatcgcggggcgcctcgtcggcgcccttcccatc180gtgggcctcgtggcgcgcatcctcaacgacgagggcggcgtcggcggcgacatcatcgac240ttcgccgagttccgccgccgcgtcagcaagaagtgcacggtcatggactccaaggccttc300tacgacttcaaccaacgacgcgggaagccaggcgatcccttctacgttctactgtgctgc360tggctggccgccatcggcgccgggctgctcaaaacggaggagatcttggaaggcgtggcg420cgcctccgcatctccaacgacatcgagttcgaggaggagacgttcatcgacatgatgagg480gcggcaaaggagaaaagggcgaagctgaaggctcctgctccgcagataccgatggagacg540cgggcggagaaggccctcgaagccatctacgtgtgctgcttcggtcaggacatggtggag600gacgaggacgagaagcttctccgggcgatactgaacgccgtgttcccctccgtcgggcgg660gccgcggtcgagaggatggtggcgtccatggccaagcaggtggcctccggcgagaggaag720cgggacgggaggaccgtgtccaaggaagtgcagcagcggcagctcaaggacctggagttt780ctgaagcagaacaagctggagtcgtcgtga810<210>3<211>277<212>prt<213>拟南芥<400>3metvalvalvalthrhisileserthrserphehisglnileserpro151015serphephehisleuargleuargasnproserthrthrserserser202530argprolysleuaspglyglyphealaleuserileargalatyrile354045glulysproasnserpheserthrphealaasnlysvalileglyser505560leuprovalileglyleuleualaargileileseraspgluglygly65707580valglyargaspleuvalaspphealagluphearglysargvalgly859095asnlyscysthrproaspaspserargalaphetyrglupheglngln100105110argargglylysalaglygluproleutyrvalleuleucyscystrp115120125valalaalavalglyalaglyleuleulysserglugluileleuglu130135140glyvalthrargvalserileserasnaspleugluphegluglugln145150155160asnpheilealaleumetthrglualaargglnargargalalysleu165170175asnileaspalaprothrileprometgluleuargvalglulysala180185190leugluglyiletyralacyscyspheargargglyleuilegluglu195200205gluaspglulysleuleulysvalmetleuilealavalpheproser210215220valglulyssergluilegluargileilelysglulysalathrarg225230235240valglugluglyglygluglugluasnvalmetalalysargleupro245250255lysglualaileglnmetglnmetlysaspleuglupheleuglngln260265270glnasnilegluser275<210>4<211>834<212>dna<213>拟南芥<400>4atggtggttgtcactcacatctccacttccttccaccaaatctctccttccttcttccat60ctccgtcttcgtaatccctccaccacttcttcgtctcgtcccaaactcgacggtggtttc120gctttgtcaattcgagcttacatagagaaaccaaactctttctccaccttcgctaacaaa180gtcatcggttctcttcccgttatcggactcctcgctcgaattatcagcgatgaaggcggc240gttggtagagatctcgtcgatttcgctgagtttaggaaacgagttgggaataaatgtact300cctgatgattctagggctttctatgagttccaacagcgacgaggcaaggcaggtgagcct360ttgtatgtgcttctgtgttgttgggttgctgcagtaggtgcaggtcttctcaaatctgaa420gagattcttgaaggtgttactagagttagcatttccaatgatctcgagtttgaagaacag480aacttcattgctttgatgactgaagctagacagagaagagcaaagttgaacattgatgcg540ccaacaataccgatggaactaagagttgaaaaggctcttgaaggtatttatgcttgttgc600tttcggagaggacttattgaagaggaggatgagaagcttcttaaagtgatgttaatagcg660gttttcccatcggttgagaagtctgagatagagagaatcatcaaagagaaggcgacaagg720gttgaggaaggaggagaggaagagaatgttatggcgaaacggttgcctaaagaagctatt780caaatgcagatgaaggatcttgaattccttcaacaacaaaacatagagtcttaa834<210>5<211>301<212>prt<213>拟南芥<400>5metphegluserasnmetvalleuglnthrleuserserserserpro151015proilehisargleutyrleuhishisserglnileleuproserser202530glyserproserlysileserleuglnilehisglyargthrleuala354045ileargserphehisasptyrvalphealagluileseralaarggly505560leuproalaleuasnlysalaserleulyslysleuproilelysgly65707580serthrpheleuleuglyglnserleuleumetvalseralahispro859095glnleualaalaalaalagluileilelysprogluproiletyrglu100105110valglygluleuphegluleuserileglnleusertyrleuleuleu115120125leuleuglyleuleuglyvalglythrphetyrvalileargglnval130135140leuvalargarggluleuaspleuseralalysgluleuglnglugln145150155160valargserglyaspalaseralathrgluleuphegluleuglyala165170175valmetleuargarglysphetyrproalaalaasnlyspheleugln180185190glnalaileglnlystrpaspglyaspaspglnaspleualaglnval195200205tyrasnalaleuglyvalsertyrvalarggluasplysleuasplys210215220glyilealaglnpheglumetalavallysleuglnproglytyrval225230235240thralatrpasnasnleuglyaspalatyrglulyslyslysgluleu245250255proleualaleuasnalapheglugluvalleuleupheaspproasn260265270asnlysvalalaargproargargaspalaleulysaspargvallys275280285leutyrlysglyvalvalalavallysserlyslysarg290295300<210>6<211>906<212>dna<213>拟南芥<400>6atgttcgaatcgaacatggttcttcaaacactatcttcttcttctcctccaattcaccgt60ctctatcttcaccattctcagattctcccttcttctgggtcacccagcaagatttctctt120cagatacatggaaggactttggccattcgatcttttcatgattatgtctttgcagaaatt180tctgctagaggtttaccggctttgaacaaagcttccttgaagaagctaccaatcaaagga240tctacctttctgctggggcagagcttgttgatggtttctgctcacccacagttggcagca300gcagcagaaatcataaagcctgaaccgatttacgaagttggagagttatttgaacttagt360attcagctttcttacttgctgttactactggggttgcttggagttggtactttctatgtg420atccgtcaagtacttgtacgcagagaactagacctctccgctaaagaattgcaggagcaa480gtaaggagcggagatgcaagtgcaacagagctctttgagcttggtgcagtgatgttgaga540aggaagttttatcctgcagccaacaagtttttgcaacaagctatccagaaatgggacggt600gatgatcaagatcttgctcaggtctataacgctcttggagtgagttatgtacgagaggat660aaacttgacaaaggaattgctcagtttgaaatggcggtgaagctgcaacccggttatgta720acagcttggaacaaccttggggatgcttatgagaagaagaaggagttgcctttggcattg780aatgcgtttgaagaagttttgttgtttgatccaaacaataaggtggctcggcctcggcga840gatgcgttgaaggatcgcgtgaagctttataaaggtgttgtggctgttaagtctaagaaa900cggtga906当前第1页12当前第1页12