本发明涉及马品种的鉴定方法，具体的，本发明涉及一种检测对侧步步态焉耆马的试剂盒的
技术领域：
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背景技术：
：焉耆马是一种古老的优良马品种，目前主要分布于新疆巴音郭楞州境内的和静县、和硕县、焉耆县、博湖县等地区；据记载，早在2000年前就存在的该品系马种，是与蒙古马杂交繁育的基础上又与东归部落带来的伏尔加河流域的高大、耐寒、善走之马种杂交，在巴音布鲁克高山草原特殊的自然条件下，由蒙古族牧民精心放牧管理和驯育而形成了这个品种；焉耆马体驱较粗重，公马平均体高142厘米、母马平均体高135厘米；焉耆马以善走著称，日行70-80公里，能日夜兼程包括爬山持续行走3-4天，具有耐力久、承重大的特征。对侧步为马术运动术语，民间俗称“走马”，马蹄落地呈两蹄声，为两节拍步法。走马又按其步伐形态分为速步和对侧步。速步亦称花步或大走，是指对角线的前后蹄同时抬起、同时前迈、同时落蹄，反侧亦然，呈x形交叉同步的步式。对侧步亦称小走，是指同侧的前后蹄同时抬起、迈进和落蹄的ii字型步伐。走马在国际上较受欢迎，因其步伐最适合轻驾马车比赛。对走马的两种步态，分别被称呼为速步和对侧步：速步为对角线的前后蹄同时抬起同时落下，对侧步为同侧的前后蹄同时抬起同时落下；一般认为，走马中的速步步态是较为常见的走马步伐，可以通过后天训练培养出来，而对侧步步态是要具备天生的能力，因此，如需选育具备对侧步步态的好马，不仅需要后天的精心训练，更需要具备先天的基因优势。焉耆马马种中先天对侧步中概率较高，在焉耆马种中选育对侧步马匹在马匹选育工作中具有重要意义。而目前的传统的目测方法检测焉耆马的对侧步步态的方法，只有马驹到了一岁以后对其进行调教训练时才能很好的对其步态进行评断，无法对刚出生的马驹进行早期的检测。最近在《nature》杂志中lisas.andersson等人发表的一项研究表明，马的dmrt3基因上的一个突变对冰岛马的步态有一定的影响。冰岛马的dmrt3基因上第902个碱基由c变为a，导致了编码氨基酸由丝氨酸变为终止密码子，影响了该蛋白质在生物过程中的作用，从而影响了冰岛马的运动方式。该研究所示的检测方法中，未公开pcr扩增的引物序列，在后续的何美升等人发表的《伊犁马dmrt3基因多态性研究》研究成果中，虽然公开了引物序列，但是该检测方法在用于检测焉耆马的dmrt3基因时，扩增的特异性与效率都较低，容易导致错误引发，且检测周期长，检测效率低，灵敏度和特异度较低，亟需开发快速准确鉴定焉耆马对侧步步态的检验试剂盒。技术实现要素：针对现有技术中，马的对侧步步态是由可以遗传的一个基因突变造成的，并且公开了马的dmrt3基因影响了马的运动方式，尽管公开了引物序列，但是该引物序列在用于检测焉耆马的dmrt3基因时，扩增的特异性与效率都较低，容易导致错误引发，且检测周期长，检测效率低，灵敏度和特异度较低，亟需要解决；本发明旨在于提供适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒及应用，操作方法简单、快捷，针对于焉耆马检测灵敏度高、特异性好，有效的解决了现有技术中扩增的特异性与效率都较低，容易导致错误引发，且检测周期长，检测效率低，灵敏度和特异度较低的问题。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：本发明提供一种适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得。(1)设计引物对：根据焉耆马dmrt3基因序列设计特异性引物。(2)pcr反应试剂：10xpcr缓冲液、taq酶、引物、2.5mmdntp、样本基因组dna和ddh2o。(3)酶切所需试剂：ddei核酸内切酶及其缓冲液。优选的，试剂盒组分为：10xpcr缓冲液2ul、2.5mmdntp2ul、10um正向引物0.5ul、10um反向引物0.5ul、taq酶0.2ul、样本基因组dna1ul、ddei内切酶1ul、酶切缓冲液2ul和ddh2o18ul。同时，本发明提供用于检测对侧步步态焉耆马的引物，根据焉耆马dmrt3基因序列设计特异性引物，引物如下所示：正向引物：5'-agcgacaaagacaccgaccag-3'；反向引物：5'-ttgccaaagtattcctcagcatca-3'。进一步，本发明提供适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒的应用，包括以下步骤：(1)提取待检测样本基因组dna；(2)利用正向引物、反向引物进行pcr扩增；扩增体系如下：10xpcr缓冲液2ul、2.5mmdntp2ul、10um正向引物0.5ul、10um反向引物0.5ul、taq酶0.2ul、样本基因组dna1ul和ddh2o13.8ul，总计20μl；扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环；最后72℃延伸10min；(3)扩增产物经酶切后电泳分析出现双条带判定为对侧步步态的马；出现单一条带或三条带判定为非对侧步步态的马。酶切体系如下：pcr反应产物10ul、ddei核酸内切酶1ul、酶切缓冲液2ul和ddh2o18ul。酶切反应程序如下：37℃水浴2h，65℃水浴30min。通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：采用本发明提供的适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒及应用，操作方法简单、快捷，针对于焉耆马检测灵敏度高、特异性好，有效的解决了现有技术中扩增的特异性与效率都较低，容易导致错误引发，且检测周期长，检测效率高，灵敏度可达90％，特异度可达100％，获得显著突出的技术效果。附图说明图1为未知基因型的焉耆马基因pcr分型的凝胶电泳图；其中，泳道1-3为对侧步步态焉耆马(突变纯合子)；泳道4-5为非对侧步步态焉耆马(包含突变的杂合子)；泳道6-8为非对侧步步态焉耆马(不含突变的纯合子)。具体实施方式本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。实施例一：适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒引物用于检测对侧步步态焉耆马的引物，根据焉耆马dmrt3基因序列设计特异性引物，引物如下所示：正向引物：5'-agcgacaaagacaccgaccag-3'；反向引物：5'-ttgccaaagtattcctcagcatca-3'。实施例二：适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒本发明提供一种适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：设计引物对：根据焉耆马dmrt3基因序列设计特异性引物；pcr反应试剂：10xpcr缓冲液、taq酶、引物、2.5mmdntp、样本基因组dna和ddh2o；酶切所需试剂：ddei核酸内切酶及其缓冲液。实施例三：适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒用于检测对侧步步态焉耆马的试剂盒，包含：10xpcr缓冲液2ul、2.5mmdntp2ul、10um正向引物0.5ul、10um反向引物0.5ul、taq酶0.2ul、样本基因组dna1ul、ddei内切酶1ul、酶切缓冲液2ul和ddh2o18ul；引物如下所示：正向引物：5'-agcgacaaagacaccgaccag-3'；反向引物：5'-ttgccaaagtattcctcagcatca-3'。实施例四：适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒应用对侧步步态焉耆马的试剂盒应用，包括以下步骤：(1)提取待检测样本基因组dna；(2)利用上游引物、下游引物进行pcr扩增；扩增体系如下：10xpcr缓冲液2ul、2.5mmdntp2ul、10um正向引物0.5ul、10um反向引物0.5ul、taq酶0.2ul、样本基因组dna1ul和ddh2o13.8ul，总计20μl；扩增程序如下：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环；最后72℃延伸10min；(3)扩增产物经酶切后电泳分析出现双条带判定为对侧步步态的马；出现单一条带或三条带判定为非对侧步步态的马。酶切的体系如下：pcr反应产物10ul、ddei核酸内切酶1ul、酶切缓冲液2ul和ddh2o18ul。酶切的反应程序如下：37℃水浴2h，65℃水浴30min。实施例五：适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒效果验证从不同的焉耆马饲养牧户中，挑选了10匹对侧步步态焉耆马和8匹非对侧步步态焉耆马，使用本发明所述的试剂盒及检测方法进行检测，并计算灵敏度及特异度。其中，计算公式：灵敏度＝真阳性数/(真阳性数+假阴性数)*100％。特异度＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数))*100％。检测结果如表1所示：表1：实际检测焉耆马步态与电泳条带匹配情况个体编号品种性别步态电泳结果yq01焉耆母对侧步双条带yq02焉耆母对侧步三条带yq03焉耆母非对侧步三条带yq06焉耆母非对侧步三条带yq07焉耆公非对侧步单条带yq08焉耆母非对侧步三条带yq09焉耆母非对侧步三条带yq10焉耆母非对侧步三条带yq11焉耆母非对侧步单条带yq12焉耆母对侧步双条带yq13焉耆公对侧步双条带yq14焉耆母非对侧步三条带yq15焉耆公对侧步双条带yq16焉耆母对侧步双条带yq17焉耆母对侧步双条带yq18焉耆母对侧步双条带yq19焉耆公对侧步双条带yq20焉耆公对侧步双条带根据表1计算，本发明提供的试剂盒及检测方法对已知步态的焉耆马进行检测，计算可得灵敏度为90％，特异度为100％。由此可知本发明在对对侧步步态焉耆马进行检测时，检出率较高，具有较高的实用价值。本发明针对现有技术中，公开的引物序列在用于检测焉耆马的dmrt3基因时，扩增的特异性与效率都较低，容易导致错误引发，且检测周期长，检测效率低，灵敏度和特异度较低，亟需要解决的问题，根据焉耆马dmrt3基因序列设计特异性引物，以样本基因组dna为模板进行pcr扩增并进行电泳分析，出现双条带判定为对侧步步态的马；出现单一条带或三条带判定为非对侧步步态的马，利用电泳条带的差异可以判别挑选对侧步步态焉耆马。本发明中对侧步步态焉耆马检测方法检测周期短，检测效率高，而且本发明的灵敏度可达90％，特异度可达100％。如上所述，即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。sequencelisting<110>新疆农业大学<120>一种适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒及应用<130>人工序列<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>人工序列<222>(1)..(21)<400>1agcgacaaagacaccgaccag21<110>新疆农业大学<120>一种适用焉耆马对侧步步态控制的检测试剂盒及应用<130>人工序列<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<220><221>人工序列<222>(1)..(24)<400>1ttgccaaagtattcctcagcatca24当前第1页12