本发明涉及一种预测中国人个体运动性能的方法，适用于中国人人群预测，属生物检测技术领域。
背景技术：
人体运动能力的能量供应、神经肌肉控制能力及体形特征等存在着明显的种族和个体差异，上述因素均受到基因的影响。突出的运动能力很大程度上取决于运动基因遗传优势。随着分子遗传学的进展及其在运动医学领域的应用，科学家发现一些重要的身体运动素质如力量、速度和耐力及其发展潜力具有相当高的遗传度，运动员对训练的敏感度也受到遗传因素很大的影响。遗传因素作为内因，影响发展的空间及极限，决定人的运动天赋和发展潜力。对大量优秀运动员的研究表明,先天遗传因素优势占2/3，后天训练作用占1/3。因此，发现与了解个人的运动遗传优势成为人们有目的的规划成长道路的重要参考依据。
优秀运动员之所以能更容易取得辉煌的运动成就，目前认为，主要与以下因素有关：
1、人种的差异
国际人类基因组的正版图谱(2001年)研究表明：人与人之间的基因密码的相似程度高达99.99％，仅0.01％的差异。但正是这0.01％的差异，使得个体在生理和体能上有了不同的表达，使得遗传存在个体、种族间、运动能力差异。运动医学长期研究的结果表明，黑人的心血管直径较其他人种粗，耐高温，脚部和小腿之间的(专业语言，脚部与小腿哪块肌肉)有一个出色的力矩，臀大肌发达等体能特点。另外，心肺功能、肌肉类型、力量、速度和耐力及其发展潜力具有相当高的遗传度，运动员对训练的敏感度也在很大程度上受遗传因素的影响。
2、运动相关基因与运动关键基因
目前与运动相关的基因有206个，起关键性作用的运动基因18个，但具体哪些运动基因与中国人的体能指标密切相关还有待进一步研究。
欧美国家机构开展了运动基因检测服务并已应用于运动员选材过程，同时在健康基因也开始向商业化发展，但由于人种不同，目前还没有针对中国人群开发的检测试剂盒。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，制备得到一种针对中国人(特别是汉族群体)的运动优势相关基因的检测方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明提供一种预测中国人个体运动性能的方法，包括：
选择以下a或b中的一种或两种，
a.筛选所述个体在ace基因第16内含子是否存在与运动性能有关的遗传学变异；
根据存在的一种或多种遗传学变异预测运动性能，其中：i)所述个体的ace基因分型为ii基因型与耐力性能正相关；ii)所述个体的ace基因分型为ii基因型与耐力性能负相关；
b.筛选actn3基因编码577位氨基酸的密码子中是否存在与运动性能有关的遗传学变异；
根据存在的一种或多种遗传学变异预测运动性能，其中：i)所述个体的基因分型为577xx基因型与耐力性能正相关；ii)所述个体的基因分型为577rr基因型与耐力性能负相关。
优选的，所述个体为女性。
进一步，所述筛选采用pcr方法，pcr筛选ace基因中采用的引物为：
正向：5’-ctggagaccactcccatcctttct-3’
反向：5’-gatgtggccatcacattcgtcagat-3’。
进一步，所述筛选采用pcr方法，pcr筛选actn3基因中采用的引物为：
正向：5’-ctgttgcctgtggtaagtggg-3’
反向：5’-tggtcacagtatgcaggaggg-3’。
本发明还提供一种中国人个体运动优势相关基因的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取待测对象的外周静脉血基因组dna；
(2)采用pcr扩增ace基因第16内含子片段；
(3)步骤(2)pcr产物分析待测对象的基因型，ii型仅有490bp扩增片段，为插入纯合型；dd型仅有190bp，为缺失纯合型；id型既有190bp片段，又有490bp片段，为杂合型；
(4)采用pcr扩增actn3基因的片段；
(5)步骤(4)pcr产物分析：采用内切酶ddei酶切pcr扩增产物，琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物得到待测对象的基因型，rr型有205bp和86bp两条带；xx型有108bp、97bp和86bp三条带，为纯合子突变；rx型既有205bp，又有108bp、97bp和86bp条带，为杂合子突变。
进一步，本发明提供一种为中国人个体选择运动或运动项目的方法，选择以下a或b中的一种或两种，
a.筛选所述个体在ace基因第16内含子是否存在与运动性能有关的遗传学变异；
根据存在的一种或多种遗传学变异选择短距离赛跑/力量运动或耐力运动，
其中：
i)所述个体的ace基因分型为ii基因型与耐力性能正相关；ii)所述个体的ace基因分型为ii基因型与耐力性能负相关；
b.筛选actn3基因编码577位氨基酸的密码子中是否存在与运动性能有关的遗传学变异；
根据存在的一种或多种遗传学变异选择短距离赛跑/力量运动或耐力运动，其中：
i)所述个体的基因分型为577xx基因型与耐力性能正相关；ii)所述个体的基因分型为577rr基因型与耐力性能负相关。
与现有技术相比，本发明具有以下的显著技术效果：
该检测法检测到的中国人(中国人)的运动优势基因，可用于为个体选择或匹配一种运动或运动项目(例如短距离赛跑/力量运动或耐力运动)以及用于评价和预测运动性能、优化设计训练计划的新方法，其包括评价多个基因或基因型，所描述的方法可用于通过遗传学评估、生理测试、体能测定和/或心理学评估发展出更适合于运动员的训练计划，本发明的试剂盒还可以用于检测幼儿、儿童和青少年的12个与运动优势和潜能相关的基因，预测其运动天赋，为其未来从事的体育运动项目提供合理化建议。
具体实施方式
在下面的部分中,例如描述了发明的一些实施方案以举例说明本发明的不同的实施方案、对本领域人员显而易见的是实践不同的实施方案并不需要采用在此所概述的所有的或甚至一些具体细节。在一些情况中,那些熟知的方法或成分并没有被写入本说明书中。
本发明公开了筛选个体的运动员潜能的方法。若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
核酸
本发明不同的实施方案包括分离并分析核酸分子,例如dna、mrna或cdna。相关核酸可以编码靶蛋白的一部分或全部(例如,actn3、ace等)。“核酸”在此包括单链和双链分子,以及dna、rna、化学修饰的核酸以及核酸类似物。预计在本发明范围内的核酸可以是长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约275、约300、约325、约3-50、约375、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约600、约625、约650、约675、约700、约725、约750、约775、约800、约825、约850、约875、约900、约925、约950、约975、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1750、约2000、约2250、约2500个或更长核苷酸残基的核酸,以及最长到包括全长的染色体dna。
从复杂的混合物中部分或完全纯化dna和/或rna的方法在本领域是熟知的,例如细胞匀浆或提取。(见例如guidetomolecularcloningtechniques,eds.bergerandkimmel,academicpress,newyork,ny,1987；molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,eds.sambrook,fritschandmaniatis,coldspringharborpress,coldspringharbor,ny,1989)。一般地,首先将细胞、组织或其他来源的材料匀浆化,例如通过在液氮中冷冻,随后用研钵和研棒碾磨。用韦林搅切器、virtis匀浆器、dounce匀浆器或其他匀浆器都可以将特定的组织匀浆化。用去污剂例如十二烷基硫酸钠(sds)、tritonx-100、chaps(3-(3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸盐(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate))、辛基葡糖苷或其他本领域已知的去污剂提取粗匀浆液。熟知的是,可以加入例如核糖核酸酶或脱氧核糖核酸酶抑制剂的核酶抑制剂预防靶核酸的降解。
用例如异硫氰酸胍的离液剂(chaotrophic)或例如苯酚的有机溶剂也可以进行提取。在一些实施方案中,例如用蛋白酶k的蛋白酶处理可以被用于降解细胞蛋白。离心或超速离心可以去除颗粒污染。可用低离子强度的水缓冲液的透析去除盐或其他的可溶性污染物。通过在-20℃加入乙醇或加入乙酸钠(ph6.5,约0.3m)以及0.8体积的2-丙醇可以沉淀核酸。离心收集所沉淀的核酸,或对染色体dna,可用玻璃吸液管或其他探针卷出所沉淀的dna。训练有素的本领域人员将认识到上面所列举的方法仅仅是举例说明的,并且根据所分析的特殊类型的核酸,可以进行多种变更。
在特定的实施方案中,所分析的核酸可以是天然存在的dna或rna分子。事实上,所阐述的方法可以分析任何天然存在的核酸,包括不限定于染色体、线粒体或叶绿体dna或核糖体rna、转运rna、核不均一rna或信使rna。用本领域已知的标准方法可以从原核或真核细胞中获得核酸。同样的,例如用pcrtm或其他已知的扩增方法或通过制备含有相关核酸的文库例如bac、yac、粘粒、质粒或噬菌体文库可以人工制备相关核酸。(见例如bergerandkimmel,1987；sambrooketal.,1989.)。对于分析而言,核酸的来源并不重要的,预计在本发明的范围内,事实上可以分析任何来源的核酸。
核酸扩增
在特殊的实施方案中,可以首先扩增被分析的用于筛选的核酸-增加信号强度。根据标准的方法学,可以从生物学标本所含的细胞内分离到用作为扩增模板的核酸序列(例如骨骼肌的dna或mrna)。核酸可以是基因组dna或被分段的或完整的细胞rna。如果所用的是rna,需要将rna转化为互补的cdna。在一个实施方案中,rna是完整的细胞rna并被直接用作为扩增的模板。在一个实例中,通过扩增(例如通过pcr)actn3的多核苷酸序列或更优选的它的包括1747c>tsnp的片段(例如外显子16),并测序扩增产物或测定在扩增产物中是否存在1747c>tsnp。在另一个实例中,已知577x等位基因含有ddei限制性位点,通过ddei消化扩增产物以及对消化产物的大小分级(例如通过凝胶电泳)可容易测定到该基因。产物的大小可用于基因分型个体的actn3位点。各种形式的扩增在本领域是熟知的,并且可以使用任何一种已知的方法。一般地,扩增包括使用一种或多种与所扩增的靶核酸序列选择性或特异性杂交的引物。
引物
在此所定义的术语引物意思是包括任何一种在模板依赖过程中能引导新核酸合成的核酸。引物通常是长度从10到20个碱基对的寡核苷酸,但是可以采用更长的序列。引物可以是双链或单链形式,尽管单链形式是优选的。引物设计的方法在本领域是熟知的,依据从标准的沃森-克里克碱基配对中所得到的互补序列进行设计(即腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶结合,以及鸟嘌呤与胞嘧啶结合)。从本领域人员熟知的商业和/或公共渠道可得到选择和设计扩增引物的计算机程序。在下面的实施例中提供了用于测定运动性能的遗传学变异的预测物例如actn的1747c>tsnp的特殊引物序列。本领域人员将认识到所提供的特殊序列只是举例说明的以及在实践权利要求的方法中可以使用其他的引物和/或探针序列。
扩增方法
有多种模板依赖性方法可以扩增在给定的标本中所存在的标记序列。其中一个最熟知的扩增方法是聚合酶链反应(称为pcr),美国专利nos.4,683,195、4,683,202和4,800,159对此有详细描述。
本发明的一个实施方案可以包括从一个个体中得到适合的标本并测定特异的信使rna,例如actn3mrna。本发明所用的示例性标本是肌肉组织标本(例如,肌肉组织活检,例如打孔活检)。一旦得到组织标本,可以制备标本用于用标准技术(例如单细胞分离、外膜消化、mrna的寡dt分离等)分离核酸。也可以用本领域已知的试剂盒进行mrna的分离(pierce,apbiotech等)。为了定量所扩增的mrna的量,可以进行逆转录酶pcr扩增方法。将rna逆转录为cdna的方法是熟知的并被描述于sambrooketal.,1989。其他的用于逆转录的方法利用了热稳定的dna聚合酶。在1990年12月21日提交的wo90/07641中描述了这些方法。
用于扩增核酸的另一个方法是连接酶链反应(“lcr”),欧洲申请no.320308公开了该方法。在lcr中,制备两个互补的探针对,当存在靶序列时,每对都将与靶序列的反向互补链结合,使得它们被连接。当存在连接酶时,两个探针对会连接形成单一单元。和pcr一样,通过温度循环,从靶序列中脱离出结合连接的单元,然后作用为连接过多探针对的“靶序列”。美国专利4,883,750描述了一种与lcr相似的将探针对与靶序列结合的方法。
在pct申请no.pct/us87/00880中所描述的qbeta复制酶也可被用作为本发明的另一种扩增方法。在该方法中,当存在rna聚合酶时,将具有靶序列的互补区域的rna的可复制序列加入到标本中。聚合酶将复制可被测定的可复制序列。
等温扩增方法也可用于扩增本发明的核酸,其中用限制性内切酶和连接酶实现在限制性位点的一条链上含有5′-[α-硫]-三磷酸核苷的靶分子的扩增。(walkeretal.,proc.natlacad.sci.usa89:392-396,1992)。
链置换扩增(sda)是另一种进行核酸等温扩增的方法,它包括多轮的链取代和合成,即缺口转译。一种与之相似的方法是修复链反应(rcr),包括将在整个靶向扩增的区域内的一些探针退火,紧接着是修复反应,其中只存在四种碱基中的两种碱基,所添加的其他的两种碱基可以是容易检测到的生物素化的衍生物。在sda中使用了相似的方法。也可用循环探针反应(cpr)检测靶向特异序列。在cpr中,具有非特异dna的3’和5’序列以及特异rna的中间序列的探针与标本中所具有的dna杂交。杂交后,紧接着rna酶h处理反应物,所鉴定的探针产物是消化后所释放出的特征性产物。原始模板退火为另一个循环探针并重复反应。
在本发明中可用在gb申请no.2202328和pct申请no.pct/us89/01025中所描述的其他扩增方法。在前一个申请中,“修饰的”引物被用于pcr样、模板和酶依赖性合成。可以用捕获基团(例如生物素)和/或检测基团(例如酶)标记修饰引物。在后一个申请中,将过量的标记探针加入到标本中。当存在靶序列时,探针结合靶序列并被催化降解。在降解后,靶序列被完整地释放并被过量探针结合。标记探针的降解表示着靶序列的存在。其他核酸扩增方法包括基于转录的扩增体系(tas),包括核酸序列依赖的扩增(nasba)和3sr。kwohetal.,proc.nat7acad.sci.usa86:1173(1989)；gingerasetal.,pct申请wo88/10315。在nasba中,用标准的苯酚/氯仿提取、临床标本的热变性、裂解缓冲液的处理以及用于分离dna和rna的minispin柱或rna的盐酸胍提取可以制备核酸。这些扩增技术包括退火具有靶向特异序列的引物。聚合后,用rna酶h消化dna/rna杂合体,同时将双链dna分子再次热变性。在每种情况中,通过加入第二种靶向特异引物将单链dna完全双链化,随后聚合。然后用例如t7或sp6的聚合酶多次转录双链dna分子。在等温循环反应中,rna被逆转录为双链dna,用例如t7或sp6的聚合酶再次转录。所形成的无论是被截断或完整的产物都提示靶向特异序列。
davey等欧洲申请no.329822公开了一种核酸扩增方法包括循环合成单链rna(“ssrna”)、ssdna和双链dna(dsdna),本发明可使用此方法。ssrna是第一个引物寡核苷酸的第一个模板,用逆转录酶(rna依赖性dna聚合酶)将其延伸。然后,通过核糖核酸酶h(rna酶h,一种特异于dna或rna双链体中的rna的rna酶)的活性从所得到的dna:rna双链体中去除rna。所形成的ssdna是第二个引物的第二个模板,引物也包括rna聚合酶启动子的序列(例如是t7rna聚合酶)以及5’端与模板同源。用dna聚合酶(例如是大肠杆菌dna聚合酶1的大“klenow”片段)延伸引物,生成具有与引物之间的原始rna序列相同的序列以及在另一末端具有附加的启动子序列的双链dna(“dsdna”)分子。该启动子序列可被合适的rna聚合酶用于生产dna的多个rna拷贝。然后这些拷贝重新进入引起极快速扩增的循环。在正确选择酶后,可以等温地进行该扩增而在每个循环中都不需添加酶。因为该方法的循环性能,所选的起始序列可以是dna或rna形式。
miller等pct申请wo89/06700公开了一种核酸序列扩增方案,它根据启动子/引物序列与靶向单链dna(“ssdna”)的杂交,紧接着是序列的多个rna拷贝的转录。这个方案不是循环的,即所形成的rna转录物不能生成新的模板。其他扩增方法包括“竞争”和“单侧pcr”frohman,m.a.,in:pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,academicpress,n.y.(1990)和oharaetal.,proc.natzacad.sciusa,86:5673-5677(1989)。
在本发明的扩增步骤中也可以使用方法,方法根据存在具有所形成的“双寡核苷酸”序列的核酸时的两个(或多个)寡核苷酸的连接,并籍此扩增双寡核苷酸。(例如wuetal.,genomics4:5601989)。
分离方法
在扩增之后,为了确定是否发生了特异性扩增的目的,可能需要将扩增产物从模板和过量引物中分离出来。在一个实施方案中,利用标准方法通过琼糖脂、琼糖脂-丙稀酰胺、或聚丙稀酰胺凝胶电泳分离扩增产物。(例如sambrooketal.,1989)。另外,可以采用色谱技术实现分离。本发明可以使用多种类型的色谱(freifelder,1982))。
鉴定方法
各种检测核酸序列变异体的方法在本领域是已知的,并且可以使用任何一种已知的方法。在一个实施方案中,检测可以是通过southern印迹和标记探针的杂交。在southern印迹中所涉及的技术对于本领域人员是熟知的(例如,sambrooketal.,1989)。简言之,用凝胶电泳分离扩增产物。然后将凝胶与膜接触,例如硝酸纤维素膜,使得核酸转移并非共价结合到膜上。随后,将膜与能与靶向扩增产物杂交的结合有发光团的探针孵育。通过将膜暴露于x射线平片或离子发射检测装置完成检测。在美国专利no.5,279,721中描述了上述的一个实例,它显示了一种用于自动化电泳和核酸转移的设备和方法。设备可以在不外处理凝胶下进行电泳和印迹,并适合于进行本发明的方法。
从不同的渠道例如thirdwave、pyrosequencing、appliedbiosystems、affymetrix、sequenom、nanogen等可以商业化获得检测核酸序列的方法和设备，任何一种商业体系都可以被用于检测actn3或其他性能相关的基因中的序列变异。
下面结合具体实例对本发明详细描述。
实施例1：筛选出运动员组ace基因型分布特征
材料和方法
通过在triton-x100的细胞裂解和蛋白酶k的消化之后的苯酚:氯仿的提取从总共218名运动员[}浙江省田径队、游泳队和皮划艇队，其中田径运动员69名(包括2名国家级健将和2名国际级健将)，游泳运动员34名，皮划艇运动员115名(包括8名国家级健将和5名国际级健将)]试验组，288名健康献血者对照组(男性149人，女性139人)dna，进行pcr扩增。根据研究需要我们将试验组分成了耐力运动员组和速度/爆发型运动员组，耐力运动员组总共129人包括8名田径运动员(≥800m)、6名游泳运动员(≥400m)和115名皮划艇运动员，速度/爆发型运动员组总共89人包括61名田径运动员(≤400m、铅球、标枪、铁饼、跳高、跳远)和28名游泳运动员(<400m)，其中耐力运动员组男性75人，女性54人；速度/爆发型运动员组男性43人，女性46人。
pcr扩增ace基因第16内含子片段，pcr引物序列如下:
正向：5’-ctggagaccactcccatcctttct-3’(seqno:1)
反向：5’-gatgtggccatcacattcgtcagat-3’(seqno:2)
pcr循环条件：反应混合物经94℃预变性5分钟后，以94℃变性60秒，58℃退火120秒，72℃延伸90秒，共35个循环后，最后72℃延伸5分钟终止扩增，pcr扩增采用朗基mg96g型pcr仪。
结果与分析
序列比较分析以genebank[www.nibc.nlm.nih.gov]中人actn3基因(基因登录号nm_001104)序列为正常标准，所得序列用dnatool(ver.5.1)或pcgene(ver3.0)软件进行序列对比，确定突变的位置和性质。采用spss13.0统计软件，等位基因和基因型频率分布经基因平衡定律。具体结果如表1和表2所示。
表1耐力运动员组与爆发型运动员组ace基因型男女分组比较
表2爆发型运动员组actn3基因型分布
如表1位于ace基因第16号内含子的插入或缺失(i/d)多态性经pcr方法检测可以扩增出两种dna片段，一种是490bp长的dna片段，称之为插入型(i型)，另一种是190bp长的dna片段，称之为缺失型(d型)，因此在群体中可有ii、id及dd3种基因型，ii型仅有490bp片段，为插入型纯合子；dd型仅有190bp片段，为缺失型纯合子；id型则既有490bp片段，又有190bp片段，为杂合型。如表2，女性耐力运动员ii基因型频率较对照高，dd基因型频率较对照低，即中国女性耐力运动员ace基因多态频率分布特征。另外，对照人群ace基因i/d多态频率分布与欧美人群有非常显著差异，即在中国普通人群高比例的i等位基因和ii基因型频率的基础上，欧美研究结论中得出的杰出耐力运动员的独特特征或许不可能出现在中国群体中，或许是另外的表现形式。
实施例2：筛选出不同类型运动员组actn3基因型分布特征
材料和方法
通过在triton-x100的细胞裂解和蛋白酶k的消化之后的苯酚:氯仿的提取从对131例对照人群中和89名爆发性运动组dna进行pcr扩增。
pcr扩增actn3基因的片段，pcr引物序列如下：
正向：5’-ctgttgcctgtggtaagtggg-3’(seqno:3)
反向：5’-tggtcacagtatgcaggaggg-3’(seqno:4)
pcr循环条件：反应混合物经94℃预变性5分钟后，以94℃变性30秒，58.2℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环后，最后72℃延伸5分钟终止扩增，pcr扩增采用朗基mg96g型pcr仪。
结果与分析
pcr扩增出长290bp的dna片段，如表2，由于人类actn3基因r577x多态性，从测序结果可以判断actn3基因第16号外显子的1747核苷酸是否有一c到t位点突变，如果无突变发生，则为rr纯合野生型，若该位点变为t，则为xx突变纯合型，若既有c又有t则为rx杂合型。如果为rr型，扩增出来的片段只有一个ddei酶切位点，若带有1747c到t突变，则会产生一个新的ddei酶切位点，3种actn3基因型pcr扩增片段经ddei限制性内切酶消化后可见，纯合子突变xx型经酶切后能产生3种长度片段，分别为86bp、97bp和108bp，rr型只有86bp和205bp两种片段，rx型既有86bp和205bp片段，又有97bp和108bp片段，为杂合型。具体结果如表3所示。
表3爆发型运动员组actn3基因型男女分组比较
如表3，女性耐力运动员xx基因型所占比例和x等位基因频率均显著高于对照组，由此可见，actn3基因的x等位基因对女性耐力运动员的耐力表现有促进作用。131例对照人群中actn3基因型分布为rr型36.6％(48/131)，rx型为48.9％(64/131)，xx型为14.5％(19/131)；等位基因频率r型为61.1％，x型为38.9％。89名爆发型运动员actn3基因型分布为rr型34.8％(31/89)，rx型为49.4％(44/89)，xx型为15.8％(14/89)；等位基因频率r型为59.6％，x型为40.4％。
以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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<110>杭州势必健生物科技有限公司
<120>预测中国人个体运动性能和选择运动项目的方法
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