聚赖氨酸甘油酯及其制备方法、用途以及制备聚赖氨酸的方法与流程

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及聚赖氨酸甘油酯及其之制备方法、用途以及制备聚赖氨酸的方法。

背景技术：

1977年日本学者s.shima和h.sakai在从微生物中筛选dragendo～positive(简写为dp)物质的过程中，发现了一种含有25—30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，称为ε-多聚赖氨酸(ε-pl)。

然而，目前ε-多聚赖氨酸的衍生物仍有待研究。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

发明人在对以甘油作为唯一碳源的聚赖氨酸发酵液进行分析时发现，发酵液中除了聚赖氨酸还存在一种可能的聚赖氨酸衍生物，而以葡萄糖为唯一碳源进行聚赖氨酸发酵时，则未发现聚赖氨酸的衍生物。该衍生物经过鉴定为聚赖氨酸甘油酯，该聚赖氨酸甘油酯的结构不同于现有的聚赖氨酸甘油酯，且具有较好的防腐效果。但是，发明人在研究过程中发现，该聚赖氨酸甘油酯在分离提取中受ph影响较大。进而，发明人经过大量实验得到较优的分离提取条件，在此条件下聚赖氨酸甘油酯的得率较高。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备聚赖氨酸甘油酯的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用甘油作为底物进行发酵处理，得到发酵产物；以及对所述发酵产物进行提取处理，以便获得聚赖氨酸甘油酯。由此，根据本发明实施例的制备方法能够获得大量聚赖氨酸甘油酯，且操作简便。

根据本发明的实施例，上述制备聚赖氨酸甘油酯的方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述提取处理是在酸性条件下进行的。由此，以便进一步获得大量且纯度较高的聚赖氨酸甘油酯。

根据本发明的实施例，所述提取处理包括：将所述发酵产物进行固液分离，收集第一上清液；调节所述第一上清液的ph值至碱性，离心，调节收集的上清液的ph值至酸性，得到第二上清液；将所述第二上清液进行过滤，收集滤液；将所述滤液进行浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液进行乙醇沉淀，离心，收集沉淀；将所述沉淀进行重溶，离心，收集第三上清液；调节所述第三上清液的ph值至酸性，得到第四上清液；以及将所述第四上清液进行乙醇沉淀，离心，收集沉淀，以便获得所述聚赖氨酸甘油酯。由此，以便进一步获得大量且纯度较高的聚赖氨酸甘油酯。

根据本发明的实施例，所述提取处理包括：将所述发酵产物于5000rpm的转速下离心20min，收集第一上清液；用5mnaoh溶液调节所述第一发酵液的ph值至8.5，于5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，并调节收集的上清液的ph值至3.2，得到第二上清液；将所述第二上清液经10kd的超滤膜过滤，3000rpm的转速和4℃的温度下离心，收集滤液；用旋转蒸发仪，于60℃条件下将所述滤液浓缩5倍，得到浓缩液；向所述浓缩液中加入4倍体积预冷的无水乙醇，搅拌，5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，收集沉淀；将所述沉淀用ph7.0磷酸缓冲液重溶，5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，收集第三上清液；将所述第三上清液的ph值调节至3.2，再加入4倍体积预冷的无水乙醇，5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，收集沉淀，以便得到所述聚赖氨酸甘油酯。由此，以便进一步获得大量且纯度较高的聚赖氨酸甘油酯。

根据本发明的实施例，所述发酵处理的培养基包括：60g/l的甘油、10g/l的(nh4)2so4、0.8g/l的kh2po4·3h2o、0.5g/l的mgso4·7h2o、1.36g/l的kh2po4、0.04g/l的znso4·7h2o、0.03g/l的feso4·7h2o以及5g/l的酵母提取物，所述培养基的ph值为6.8。由此，以便进一步获得大量且纯度较高的聚赖氨酸甘油酯。

根据本发明的实施例，所述发酵处理条件如下：发酵温度为30℃，转速为200rpm，时间为72小时，发酵菌种为streptomycesalbulus。由此，以便进一步获得大量且纯度较高的聚赖氨酸甘油酯。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种聚赖氨酸甘油酯。根据本发明的实施例，所述聚赖氨酸甘油酯具有下式所示的结构，其中，n为21～34，所述聚赖氨酸甘油酯是通过前面所述制备聚赖氨酸甘油酯的方法获得的。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述聚赖氨酸甘油酯在制备防腐剂中的用途。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备聚赖氨酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用甘油作为底物进行发酵处理，得到聚赖氨酸甘油酯；以及对所述聚赖氨酸甘油酯进行水解处理，以便得到聚赖氨酸。由于生产菌株更耐受聚赖氨酸甘油酯，因此采用先获得大量聚赖氨酸甘油酯，再对其进行水解得到聚赖氨酸的方法，利用该种方式能够获得更高产量的聚赖氨酸。

根据本发明的实施例，所述水解处理是在微生物体内进行的。由此，能够进一步获得高产量聚赖氨酸。

根据本发明的实施例，所述水解处理是在微生物体外进行的，所述水解处理包括：将所述聚赖氨酸甘油酯溶解于ph值为3.2的柠檬酸缓冲液中，并调节混合液的ph值至7.0，以便得到聚赖氨酸。由此，能够进一步获得高产量聚赖氨酸。

根据本发明的实施例，所述发酵处理的培养基和发酵处理条件是如前面所述制备聚赖氨酸甘油酯的方法中所限定的。由此，能够进一步获得高产量聚赖氨酸。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的制备聚赖氨酸甘油酯方法的流程示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的发酵液组成的色谱图；

图3显示了根据本发明一个实施例的聚赖氨酸甘油酯的nmr色谱图；

图4显示了根据本发明一个实施例的对照组发酵液组成的色谱图，其中★表示聚赖氨酸；

图5显示了根据本发明一个实施例的实验组发酵液组成的色谱图，其中★表示聚赖氨酸，☆是聚赖氨酸甘油酯；

图6显示了根据本发明一个实施例的不同碳源对聚赖氨酸甘油酯影响的分析示意图；

图7显示了根据本发明一个实施例的不同温度对聚赖氨酸甘油酯稳定性的影响的分析示意图；

图8显示了根据本发明一个实施例的不同反应时间对聚赖氨酸甘油酯稳定性的影响的分析示意图；以及

图9显示了根据本发明一个实施例的不同ph值对聚赖氨酸甘油酯稳定性的影响的分析示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

本发明提出了一种制备聚赖氨酸甘油酯的方法、聚赖氨酸甘油酯及其用途以及制备聚赖氨酸的方法，下面将分别对其进行详细描述。

制备聚赖氨酸甘油酯的方法

在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面描述的聚赖氨酸甘油酯的方法。根据本发明的实施例，参见图1，该方法包括：s100发酵处理以及s200提取处理。由此，根据本发明实施例的制备方法能够获得大量聚赖氨酸甘油酯，且操作简便。下面将详细描述该制备方法。

根据本发明的实施例，参见图1，该方法包括：

s100发酵处理

在该步骤中，采用甘油作为底物进行发酵处理，得到发酵产物。目前，以生物发酵方法获得聚赖氨酸甘油酯时，通常采用甘油、葡萄糖等作为碳源。发明人发现，以甘油作为唯一碳源时，发酵产物中不仅存在聚赖氨酸，还存在本发明的聚赖氨酸甘油酯。然而，以葡萄糖作为碳源时，未发现生成聚赖氨酸甘油酯。进而，发明人采用以甘油作为唯一碳源的培养基进行发酵处理，并从所得到的发酵产物中分离提取出聚赖氨酸甘油酯。

根据本发明的实施例，发酵处理的培养基包括：60g/l的甘油、10g/l的(nh4)2so4、0.8g/l的kh2po4·3h2o、0.5g/l的mgso4·7h2o、1.36g/l的kh2po4、0.04g/l的znso4·7h2o、0.03g/l的feso4·7h2o以及5g/l的酵母提取物，培养基的ph值为6.8。发明人发现，培养基组成会影响聚赖氨酸甘油酯的得率，进而经过大量实验得到上述较佳的培养基组成，在此条件下能够进一步提高聚赖氨酸甘油酯的得率。

根据本发明的实施例，发酵处理条件如下：发酵温度为30℃，转速为200rpm，时间为72小时，发酵菌种为streptomycesalbulus。发明人发现，发酵处理条件和发酵菌种会影响聚赖氨酸甘油酯的得率，进而经过大量实验得到上述较佳的发酵处理条件和发酵菌种，在此条件下能够进一步提高聚赖氨酸甘油酯的得率。

根据本发明的实施例，提取处理是在酸性条件下进行的。发明人发现，将发酵产物的ph值维持在7.0的条件下，12小时后，聚赖氨酸甘油酯将完全水解成聚赖氨酸。进而，发明人发现，保证提取处理是在酸性条件下进行，能够尽可能地减少聚赖氨酸甘油酯水解，从而获得大量聚赖氨酸甘油酯。

需要说明的是，本发明所使用的术语“酸性”是指ph值小于7.0。根据本发明的优选实施例，保证提取处理是在ph值为3.2的条件下进行，能够最大程度地减少聚赖氨酸甘油酯水解，从而获得大量聚赖氨酸甘油酯。

根据本发明的实施例，提取处理包括：将发酵产物进行固液分离，收集第一上清液；调节第一上清液的ph值至碱性，离心，调节收集的上清液的ph值至酸性，得到第二上清液；将第二上清液进行过滤，收集滤液；将滤液进行浓缩，得到浓缩液；将浓缩液进行乙醇沉淀，离心，收集沉淀；将沉淀进行重溶，离心，收集第三上清液；调节第三上清液的ph值至酸性，得到第四上清液；以及将第四上清液进行乙醇沉淀，离心，收集沉淀，以便获得聚赖氨酸甘油酯。发明人经过大量实验得到上述较佳的提取处理条件，在此条件下能够获得大量聚赖氨酸甘油酯，且纯度较高。

根据本发明的具体实施例，提取处理包括：

1)将发酵产物于5000rpm的转速下离心20min，收集第一上清液。

2)用5mnaoh调至第一发酵液的ph值至8.5，于5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，并调节收集的上清液的ph值至3.2，得到第二上清液。由此，以便除去发酵液中难溶的杂质，这步尽量在15min内完成，从而避免产物降解。

3)将第二上清液经10kd的超滤膜过滤，3000rpm的转速和4℃的温度下离心，收集滤液。

4)用旋转蒸发仪，于60℃条件下将滤液浓缩5倍，得到浓缩液。

5)向浓缩液中加入4倍体积预冷的无水乙醇，搅拌，5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，收集沉淀。由此，以便使得聚赖氨酸甘油酯沉淀。

6)将沉淀用ph7.0磷酸缓冲液重溶，5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，收集第三上清液。这步尽量在15min内完成，从而避免产物降解。

7)将第三上清液的ph值调节至3.2，再加入4倍体积预冷的无水乙醇，5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，收集沉淀，以便得到聚赖氨酸甘油酯。通过将体系的ph值调节至3.2，以避免聚赖氨酸甘油酯降解。进一步地，采用无水乙醇以沉淀聚赖氨酸甘油酯，从而获得大量纯度较高的聚赖氨酸甘油酯。

发明人经过大量实验，结合聚赖氨酸甘油酯的特性而得到上述较佳的提取处理条件，以便尽可能较少聚赖氨酸甘油酯降解，获得大量且纯度较高的聚赖氨酸甘油酯。

需要说明的是，虽然步骤2)中，将体系的ph值调节至8.5(碱性)，但是离心以及收集上清所用时间较短，后续立即将上清的ph值调节至3.2(酸性)，整体上保证了提取处理在酸性条件下进行，从而保证了聚赖氨酸甘油酯的得率。同理地，步骤6)中，短时间内采用中性缓冲盐重溶沉淀、离心和收集上清，整体上保证了提取处理在酸性条件下进行，同样保证了聚赖氨酸甘油酯的得率。

聚赖氨酸甘油酯

在本发明的一个方面，本发明提出了一种聚赖氨酸甘油酯。根据本发明的实施例，该聚赖氨酸甘油酯具有下式所示的结构，其中，n为21～34，聚赖氨酸甘油酯是通过前面所描述制备聚赖氨酸甘油酯的方法获得的。现有的聚赖氨酸甘油酯结构中，聚赖氨酸的羧基端与甘油的1,3位羟基发生了酯化反应。然而本发明的聚赖氨酸甘油酯中，聚赖氨酸的羧基端与甘油的2位羟基发生了酯化反应，两者结构并不相同。另外，发明人意外地发现，本发明的聚赖氨酸甘油酯具有较好的防腐效果。

用途

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所描述的聚赖氨酸甘油酯在制备防腐剂中的用途。发明人意外地发现，本发明的聚赖氨酸甘油酯具有较好的防腐效果，可用于制备防腐剂。

制备聚赖氨酸的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备聚赖氨酸的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：采用甘油作为底物进行发酵处理，得到聚赖氨酸甘油酯；以及对聚赖氨酸甘油酯进行水解处理，以便得到聚赖氨酸。发明人发现，由于生产菌株更耐受聚赖氨酸甘油酯，因此采用先获得大量聚赖氨酸甘油酯再对其进行水解得到聚赖氨酸的方法，利用该种方式能够获得更高产量的聚赖氨酸。

需要说明的是，对于水解处理条件不作严格限定，既可以在微生物体内进行，也可以在微生物体外进行。根据本发明的具体实施例，水解处理是在微生物体外进行的，水解处理包括：将聚赖氨酸甘油酯溶解于ph值为3.2的柠檬酸缓冲液中，并调节混合液的ph值至7.0，以便得到聚赖氨酸。发明人发现，聚赖氨酸甘油酯在ph值7.0的条件下能够降解为聚赖氨酸，且聚赖氨酸的得率较高。由此，以便获得高产量聚赖氨酸。

根据本发明的实施例，发酵处理的培养基和发酵处理条件是如前面所描述的制备聚赖氨酸甘油酯的方法中所限定的。由于生产菌株更耐受聚赖氨酸甘油酯，因此采用先获得大量聚赖氨酸甘油酯再对其进行水解得到聚赖氨酸的方法，利用该种方式发酵能够获得更高产量的聚赖氨酸。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在该实施例中，按照下列方法获得聚赖氨酸甘油酯：

1、发酵处理

将streptomycesalbulusnbrc14147接种于发酵培养基中进行摇瓶发酵，30℃，200rpm培养72小时，得到发酵液。

其中，发酵培养基如下：

甘油60g/l；(nh4)2so410g/l；kh2po4·3h2o0.8g/l；mgso4·7h2o0.5g/l；kh2po41.36；znso4·7h2o0.04g/l；feso4·7h2o0.03g/l；酵母提取物5g/l，ph6.8。

2、提取处理

方案如下：发酵液固液分离-----调ph至碱性-----调ph至酸性-----进行超滤去除大分子杂蛋白-----乙醇沉淀-----中性条件下重溶除去难溶蛋白----调ph至酸性----乙醇再次沉淀得到产品。

具体步骤：

1)发酵液于5000rpm，20min进行固液分离；

2)用5mnaoh调至ph值为8.5；5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，除去沉淀，收集上清，并调节上清ph值至3.2；

3)将上清经10kd的超滤膜过滤，3000rpm，4℃，截留大分子杂蛋白，收集滤液；

4)用旋转蒸发仪，于60℃条件下将滤液浓缩5倍，得到浓缩液；

5)向浓缩液中加入4倍体积预冷的无水乙醇，搅拌，5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，收集沉淀；

6)将沉淀用ph7.0磷酸缓冲液重溶，5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，除去难溶的杂蛋白；

7)将上清液快速调至ph3.2，再加4倍体积预冷的无水乙醇，5000rpm的转速及4℃的温度下离心10min，离心收集沉淀；

8)冻干，得到淡黄色粉末。

整个提取处理过程基本是在酸性条件下完成的。

将提取的产物进行lc-ms分析，结果(图2)表明，提取的产物和发酵液中的产物几乎一样，并未发生降解，产物单一，属于甘油酯。

实施例2聚赖氨酸甘油酯结构鉴定

取适量甘油酯溶于重水(d2o)中，进行13c-nuclearmagneticresonance(nmr)鉴定。结果如图3所示，经过图谱解析，确定甘油酯的结构为聚赖氨酸的羧基端与甘油的2位羟基发生了酯化反应，得到最终产物，2-ε-poly(l-lysyl)-glycerol。

实施例3聚赖氨酸甘油酯的活性检测

将大肠杆菌8099(3.7×10⁹cfu/ml)、大肠杆菌o157:h7(1.05×10⁹cfu/ml)和atcc6538(1.9×10⁸cfu/ml)三株菌按10倍梯度稀释原菌悬液，共稀释100倍制成菌悬液，然后各吸取4.5ml1g/l聚赖氨酸甘油酯加入0.5ml稀释好的菌悬液，混合均匀(体积9:1)。吸1ml上述混合溶液置于平板中，用凉至45℃的lb培养基作倾注，转动平板，使其充分均匀。凝固后倒置培养48h后计数。计算抑菌率及杀菌率：x＝(a-b)/a×100％(式中：x—抑菌率，％；a—对照样品平均菌落数；b—被试样品平均菌落数)

结果如下表所示，可以看出聚赖氨酸甘油酯具有明显的抑菌活性。

实施例4

在该实施例中，研究不同碳源对聚赖氨酸甘油酯的影响。

实验组：按照实施例1的发酵处理进行；

对照组：按照实施例1的发酵处理进行，区别在于，发酵培养基如下：葡萄糖50g/l；(nh4)2so410g/l；k2hpo4·3h2o0.8g/l；mgso4·7h2o0.5g/l；kh2po41.36g/l；znso4·7h2o0.04g/l；feso4·7h2o0.03g/l；酵母提取物5g/l。

结果如图4～6所示。经发酵后，用质谱检测在对照组中产生的产物为聚合度n＝25-31的聚赖氨酸(图4)，而在实验组中的产物是聚合度为n＝25-30的聚赖氨酸甘油酯和n＝25-31的聚赖氨酸(图5)。另外，实验组中聚赖氨酸的产量比对照组中产量高(图6)。由此，采用甘油作为唯一碳源进行发酵处理，获得聚赖氨酸的同时也可以获得聚赖氨酸甘油酯。

实施例5

1、研究不同温度对聚赖氨酸甘油酯稳定性的影响

在ph7.0条件下，各取1ml实施例1的步骤1所得到的发酵液，分别在25、30、35、40、45和50℃条件下放置12h，lc-ms结果(图7)表明当温度高于40℃时，聚赖氨酸甘油酯较完全地水解为聚赖氨酸，从而无法获得聚赖氨酸甘油酯。

2、研究不同反应时间对聚赖氨酸甘油酯稳定性的影响

在ph7.0，40℃条件下，各取1ml实施例1的步骤1所得到的发酵液，分别反应1、5、7和12h，比较水解度随水解时间的变化情况。lc-ms结果(图8)表明反应时间达到5h时，聚赖氨酸甘油酯较完全地水解为聚赖氨酸，从而无法获得聚赖氨酸甘油酯。

3、研究不同ph值对聚赖氨酸甘油酯稳定性的影响

实施例1的步骤1所得到的发酵液的ph值稳定在为3.2左右，故初步选择ph3.2和ph7.0做比较，40℃条件下反应12h，比较不同ph对聚赖氨酸甘油酯水解的影响。lc-ms结果(图9)表明在ph3.2条件下，水解12h后，聚赖氨酸甘油酯没有被水解，ph7.0的条件下，聚赖氨酸甘油酯较完全地水解为聚赖氨酸，从而无法获得聚赖氨酸甘油酯。

由此，只要保证提取过程中体系的ph值维持在酸性条件下(优选3.2)，则可获得大量聚赖氨酸甘油酯。并且，在保证酸性提取条件下，提取温度和时间对于聚赖氨酸甘油酯的得率影响不显著。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。