一种草莓开花基因FvbHLH78及其应用的制作方法

技术领域：
：本发明属于分子生物学、基因工程
技术领域：
，具体涉及一种草莓开花相关基因fvbhlh78及其应用。
背景技术：
：：草莓属蔷薇科多年生草本植物，其果实柔软多汁，营养丰富，素来有“水果皇后”之誉。草莓在世界上栽培面积较广，占小浆果栽培面积的首位，熟期长达6～7个月，可以补充水果淡季市场。近年来草莓的栽培发展很快，栽培品种也越来越多，已经受到了广大消费者的喜爱。bhlh(basichelix-loop-helixprotein)是真核生物中存在最广泛的一大类转录因子，bhlh转录因子在真核生物的生长发育和调控中起到重要作用。bhlh(basichelix-loop-helix，碱性螺旋–环–螺旋)转录因子家族普遍存在于真核生物中，因其含有螺旋–环–螺旋(helix-loop-helix，hlh)结构而被命名。bhlh保守结构域约含有60个氨基酸，其n端为富含碱性氨基酸的dna结合区，c端为α螺旋1–环–α螺旋(maetal，1994)。bhlh转录因子家族基因成员在拟南芥(baileyetal.，2003)、水稻(lietal.，2006)、烟草(rushtonetal.，2008)、葡萄(尹欢等，2013)和番茄(sunetal，2015)等作物中相继被发现并报道。bhlh转录因子可参与植物多个生长发育过程(nesietal，2000；ramsayetal，2003；groszmannetal.，2008；kondouetal.，2008；fujisawaetal.，2013)，而且在植物响应干旱(seoetal.，2011)、高盐(zhouetal.，2009；陈李淼等，2013)、脱落酸(abeetal.，2003)、低温(chinnusamyetal.，2003；wangetal.，2012)、缺铁(zhangetal.，2015)和低磷(yietal.，2005)等非生物胁迫过程中也发挥重要作用。其通过特定的氨基酸残基与靶基因相互作用，进而调节相关基因的表达。然而，由于植物bhlh家族成员众多、参与的生物过程复杂，对于其了解还不是十分清楚。植物中bhlh家族成员的数量众多，仅次于myb类转录因子，例如拟南芥中就有超过140个的bhlh转录因子，水稻中bhlh转录因子则超过160个。这一庞大的转录因子家族导致不可避免的功能冗余，因此研究单个bhlh转录因子的功能就变得相对困难。植物bhlh转录因子既可以作为转录激活子又能作为转录抑制子发挥生物学作用，其作用方式多种多样。在单子叶和双子叶植物的气孔发生、形态等方面，玉米和水稻中均存在ice1的同源基因(liu，2009)，揭示了bhlh转录因子在调控气孔发育过程普遍存在。植物中大多数的bhlh转录因子具有组织与时空特异性，表明bhlh转录因子主要在特定的发育阶段起作用。然而目前，关于bhlh转录因子参与植物开花调控的研究鲜有报道。技术实现要素：：(1)本发明提供了一种调控植物开花的草莓bhlh转录因子基因fvbhlh78，所述基因编码核苷酸序列如seqidno.1所示。所述的调控植物早花的草莓fvbhlh78基因编码的蛋白质，具有序列表中seqidno.2所述的氨基酸序列。(2)本发明提供了含有上述草莓bhlh转录因子fvbhlh78的植物表达载体pri101-gfp。将fvbhlh78基因克隆到pri101-gfp，获得pri101-gfp-camv35s-fvbhlh78。(3)本发明所述基因fvbhlh78在培育早花植物中的应用。具体是将fvbhlh78基因通过表达载体转入目的植物内。所述植物优选是模式植物拟南芥。(4)本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，利用克隆及rt-pcr技术，分离与鉴定草莓开花相关基因序列信息，并通过农杆菌浸花法将基因转入拟南芥，鉴定证明转基因植株开花时间明显早于野生型(图4)，说明fvbhlh78基因对植物提早开花有一定的影响。附图说明：图1fvbhlh78基因编码区序列的扩增结果。图2荧光定量pcr分析不同组织器官中fvbhlh78基因的表达情况。图3重组载体pri101-gfp-camv35s-fvbhlh78的构建。(a)大肠杆菌bhlh78-pmd18-tpcr检测电泳结果。(b)大肠杆菌pri101-gfp-camv35s-fvbhlh78pcr检测电泳结果。图4转基因拟南芥及野生型对照开花时期对照，转基因植株比野生型提早开花。具体实施方式：实施例1草莓bhlh78基因的克隆(1)以二倍体森林草莓‘ruegen’为试材，材料在温室大棚中生长。(2)rna提取：用ctab法进行试验材料的总rna提取，整个操作过程按照ctab法rna提取流程，然后再以该总rna为模板反转录得到cdna第一链。(3)基因的克隆：以反转录的果实cdna第一链为模板，利用引物bhlh78-f和bhlh78-r进行pcr扩增，回收pcr产物，获得1653bp的目的片段。bhlh78-f：gcagtcgacatggaaaaggacaacagttcaggbhlh78-r：gcaggatccatgctcaactttcatctgagc注：bhlh78-f和bhlh78-r引物序列中前九个碱基，即gcagtcgac和gcaggatcc，为构建载体需要，人为加入的不属于fvbhlh78基因序列的酶切位点与保护碱基。bhlh78-r引物由于构建gfp融合表达载体需要，去掉了终止密码子。实施例2植物表达载体的构建(1)胶回收目的片段之后，将其连接到pmd18-t载体(购自takara公司)，后转化大肠杆菌感受态细胞trans5α(购自北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性单菌落，提取质粒，测序。(2)选用salⅰ和bamhⅰ分别对测序正确的bhlh78-pmd18-t重组质粒和pri101-gfp质粒双酶切，回收载体大片段和目的基因小片段，用t4连接酶连接后转化大肠杆菌trans5α感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)，鉴定重组质粒后，得到带有目的基因的植物过表达载体。实施例3转化拟南芥及转基因功能验证(1)浸花法侵染拟南芥。挑取一个含有目的基因bhlh78的农杆菌gv3101阳性克隆，接种于加入kan(卡那霉素)50mg/l+rif(利福平)25mg/l的液体yep培养基中，28℃200rpm振荡培养24h，取1ml培养好的菌液，加入50ml液体yep培养基活化，使od600＝0.8左右。将菌液转入无菌的50ml离心管中，5000rpm，10min离心收集菌体，再用同等体积的重悬液(1/2ms+0.5g/lmes+5％sucrose)重悬农杆菌，并加入表面活性剂silwet，使其终浓度达到300μl/l。将刚开花的拟南芥植株花序在此溶液中浸泡20s。将浸染菌液的拟南芥花序盖膜保湿，黑暗培养24小时左右，置于光照下正常管理成熟收获种子。(2)转基因植株的抗性鉴定收集当代转基因植株种子(t0代)，播种于含有kana(卡那霉素)(30mg/l)的1/2ms固体培养基上筛选。将生长2周左右的绿色抗性植株转栽到营养钵里，基质为草炭、蛭石和珍珠岩比为3：3：1(体积比)。收集t1代种子。将该种子种植于含有kana(卡那霉素)(30mg/l)的1/2ms培养基上，统计分离比，选取符合3存活：1死亡分离比的转基因株系植株移栽至钵里进行栽培，收集t2代种子，将该种子种植于含有kana(卡那霉素)(30mg/l)的1/2ms培养基上，种子在培养基上全部为绿苗，t2代为纯合系。(3)转基因植株进行表型鉴定。将转基因拟南芥t2代植株(转入pri101-gfp-camv35s-fvbhlh78表达载体的转基因拟南芥)和野生型拟南芥在同等短日照(8h光照/16h黑暗)条件下进行培养，测试结果如表1所示。表1表型开花时间莲座叶野生型拟南芥3313.5±0.8转基因株系1226.9±0.6转基因株系2226.8±0.5与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥(转入pri101-gfp-camv35s-fvbhlh78表达载体的转基因拟南芥)开花时莲座叶仅有7片叶，转基因植株都比野生型拟南芥提前开花，同等短日照培养条件下，野生型拟南芥需要33天开花，而转入fvbhlh78基因的转基因拟南芥仅需要22天开花。根据结果表明，fvbhlh78基因超表达促进拟南芥提前开花。试验结果表明，草莓fvbhlh78基因为有功能的基因，具有促进生殖生长，缩短开花时间的作用。序列表seqidno:1atggaaaaggacaacagttcaggcacgcccagctggaacccttcaagcttaatgcactccaatgagctcaattgtgctccacaccaacttcccaattcttacttcaatgccaattgggacaatccaatggatcagagcgatccctttgagtctgctttgagttccatggtgtcctcaccggcggcttccaacgccgtcgctgccaccgccttccccggagaaggcggaggagacatgacaagagaactgattggaagactaggaagcatttgcaactcaggagacatatcttcattgtcttacaataacagtactaacaattcatgctatagtaccccactaaactcttcaccgccaaataagttcaacttgtcaatggttgatccacatatgagaggcaattttccaatcccagcaccctcatcacacccaagtttggctccattttcagctgaccctggttttgtagagagggctgcaaggttttccagctttggaaatcatggtggtctgaatggtcagttcaatttgaatgaagctgaattggcatatagatcaatgctgaagcttgattcacccaagctttccagagcttctagcaatcaatcactgagatctcaaatgggtgctgttcaagaaagcatcaaaagctcttcaccccaagatgagaattcatttcctgataagaaggtcagcaggttctcaaggtccaccaccccagataatggtgaattgggtgattccagagaagggtcatcagtttctgagcagatcccaactggggatttgagtgtgaaagcagagaatgtttccaactcaaggaagaggaaggctgttccaaaaggaaaagccaaagaaacctcttcatctccatctgttaaaaatggcaaggctgtgactgaagagcaaccaaattccaagagaagcaaaactgatgaagcttctgggaatgaaaaggaaactcaaaagtcaaacaaagaatcaaatggaggtggcaaaactaccaaggataaaccaggggttgttgagcctccaaaggactatatacatgtcagagccagaaggggtcaagctactgatagccatagtctggcagaaagagttcgaagagagaaaattagtgaaaggatgaagttccttcaagatcttgttcctggttgcaacaaggtaactgggaaagctgtgatgctagatgagatcataaactatgttcaatcattgcagcgccaagtcgagtttctttcgatgaaattggcgactgtgaatcctagaatggatttgaacatggaagatcttctgtcaaaggaaattcttcaatctcaaggagctttacagaatgccctctaccaattagattccgcagtcccagcatcatttccttttgggtatcaaccccagcaacttccacctttacatagcaacagcatctctaatgaggcagacacacattttccagtaaatttaaatgctgcgctgactcaaaattcaaccatgcaatcgccagcttttgatagatttggtggagcaaatcctcag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