骨保护素的S77突变体蛋白及其相关产品与应用的制作方法

文档序号：16816001发布日期：2019-02-10 14:32阅读：363来源：国知局

本发明涉及生物技术领域中骨保护素的突变体蛋白及其相关产品与应用。

背景技术：

以骨质疏松症、关节炎为代表的骨吸收相关疾病是世界常见的多发病，已严重影响了人类健康。骨吸收相关疾病的病理特征为骨吸收―形成失平衡，而调节骨吸收和形成平衡的最重要的信号传导通路被证明是opg/rankl/rank系统。在该系统中，骨保护素(osteoprotegerin，opg)作为中心环节，发挥着至关重要的作用。

1997年，美国和日本两个研究组同期发现了opg蛋白。它属于tnf受体超家族成员，为可溶性、分泌性糖蛋白，由401个氨基酸组成，表达于成骨细胞/骨间质细胞中，是目前发现的唯一的破骨细胞负向调节因子。因考虑到opg对破骨细胞的重要调节作用，上述两个研究组立即开始查找与opg密切相关的蛋白，发现了其配体—核因子-кb受体活化因子配体(receptoractivatorofnf-κbligand，rankl)和破骨细胞表面膜受体rank(thereceptoractivatorofnf-κb)。短短2年，opg/rankl/rank系统为人们所认识，回答了成骨细胞调控破骨细胞的准确机制：opg相当于整个opg/rankl/rank系统的制动器。它作为rankl的假受体，竞争性抑制rankl与rank结合，从而抑制破骨细胞活性和分化,对抗骨质疏松，因此rankl/opg比例成为骨质疏松致病机制中的关键因素。许多激素和细胞因子(例如tgf-β、pth、1，25-vd3、糖皮质激素和雌激素)都通过opg通路起作用。骨质疏松小鼠注射opg后，骨密度明显上升，而opg基因敲除小鼠表现为严重骨质疏松。

opg防治骨质疏松的重要作用被揭示后，成为竞相追捧的“明星蛋白”。世界最大的生物公司-amgen尝试开发的opg-fc曾进入到临床ⅱ期研究，初步实验表明opg能够抑制人体骨吸收，对抗骨质疏松。amgen公司甚至和美国航空航天局(nasa)合作开展了opg预防废用性骨质疏松症的太空实验。正当opg作为抗骨质疏松药物的研发蓬勃开展的时候，amgen公司却在2005年停止了对该蛋白的研发投入，放弃了关于opg的进一步研究。其它实验室对opg的研究也近于停滞。其原因之一是发现opg存在着缺陷，影响了其临床应用：rankl的结构与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosis-inducingligand，trail)相似，opg与rankl结合的同时也能与trail结合，抑制了trail的抗癌作用，加大肿瘤发生的风险。trail是一种人体自分泌的蛋白，其能特异性杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显细胞毒作用。

2006年澳大利亚evogenix公司申请了一种opg突变体衍生物的专利(us2006/0189528a1)，其所涉及的基因突变位点主要为i115，r122和f128。通过这些位点氨基酸的替换，降低opg突变体与trail的结合能力，从而减少其促进肿瘤发生的危险。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何在保留野生型骨保护素的抑制rankl介导的破骨细胞活化的能力的情况下，降低野生型骨保护素对trail的抗癌作用的抑制。

为了解决以上技术问题，本发明提供了野生型骨保护素的突变体蛋白，所述突变体蛋白是由野生型骨保护素进行1个氨基酸残基的替代构成的突变体蛋白，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在所述野生型骨保护素的全长序列的第77位氨基酸残基发生替代；所述突变体蛋白具有对核因子-кb受体活化因子配体(rankl)的亲和活性但是所述突变体蛋白对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(trail)的亲和活性低于所述野生型骨保护素对trail的亲和活性。

上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素包括野生型骨保护素的全长片段，也包括野生型骨保护素的活性片段。

上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素可来源于任何物种，如来源于哺乳动物的骨保护素，如人。

上述突变体蛋白中，人野生型骨保护素的全长氨基酸序列是seqidno.10，如genbankaccessionnumbernp_002537.3(26-jun-2017)所示。

上述突变体蛋白中，所述野生型骨保护素可为人野生型骨保护素的活性片段。所述人野生型骨保护素的活性片段的氨基酸序列可为全长序列的第22-201位氨基酸残基。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白包括任何在所述野生型骨保护素的全长序列的第77位氨基酸残基发生替代的变异蛋白，无论是截短的还是全长的，无论是单体形式还是二聚体形式。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白和所述野生型骨保护素对rankl的亲和活性和对trail的亲和活性之间的比较是基于大小相似的蛋白质进行的。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白具有对rankl的亲和活性可为所述突变体蛋白对rankl的亲和活性是所述野生型骨保护素对rankl的亲和活性的70％以上。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白对trail的亲和活性低于所述野生型骨保护素对trail的亲和活性为所述突变体蛋白对trail的亲和活性是所述野生型骨保护素对trail的亲和活性的25％以下。

上述突变体蛋白中，所述70％以上可为a1)-a10)中的任一种：

a1)大于等于76％至等于100％；

a2)大于等于80％至等于100％；

a3)大于等于81％至等于100％；

a4)大于等于82％至等于100％；

a5)大于等于83％至等于100％；

a6)大于等于84％至等于100％；

a7)大于等于85％至等于100％；

a8)大于等于90％至等于100％；

a9)大于等于95％至等于100％；

a10)77％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、90％、95％或100％。

上述突变体蛋白中，所述25％以下可为b1)-b9)中的任一种：

b1)、小于等于20％至等于0或小于等于20％至小于等于16％；

b2)、小于等于16％至等于0或小于等于16％至小于等于13％；

b3)、小于等于13％至等于0或小于等于13％至小于等于11％；

b4)、小于等于11％至等于0或小于等于11％至小于等于10％；

b5)、小于等于10％至等于0或小于等于20％至小于等于5％；

b6)、小于等于5％至等于0或小于等于5％至小于等于3％；

b7)、小于等于3％至等于0或小于等于3％至小于等于1％；

b8)、小于等于1％至等于0；

b9)、11％、8％、7％、6％或5％。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白可为将所述野生型骨保护素的第77位的丝氨酸氨基酸残基替代为其它氨基酸残基得到的蛋白质。

所述其它氨基酸残基本领域技术人员可根据所述突变体蛋白对rankl的亲和活性和对trail的亲和活性确定，只要能使所述突变体蛋白对rankl的亲和活性满足上述a1)-a10)中任一种，对trail的亲和活性满足上述b1)-b9)中的任一种要求的其它氨基酸残基均可选用。

所述其它氨基酸可从r1)至r4)中选择：

r1)下述19种氨基酸中的任一种：丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、脯氨酸(pro)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、蛋氨酸(met)、甘氨酸(gly)、苏氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、酪氨酸(tyr)、天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)、天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)；所述氨基酸的构象为l型；

r2)下述19种氨基酸中的任一种：丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、脯氨酸(pro)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、蛋氨酸(met)、甘氨酸(gly)、苏氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、酪氨酸(tyr)、天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)、天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)；所述氨基酸的构象为d型；d型氨基酸是指与组成蛋白质的l型氨基酸相对应的氨基酸；

r3)对所述r1)或r2)进行化学修饰得到的人工修饰的氨基酸；

r4)自然界存在的稀有氨基酸。

所述r3)中的化学修饰可为甲基化或磷酸化等修饰。

所述自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、γ氨基丁酸或高丝氨酸等。

上述突变体蛋白中，所述其它氨基酸可为c1或c2：

c1、非极性氨基酸或极性氨基酸；

c2、所述其它氨基酸为缬氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在序列上只是所述野生型骨保护素的全长序列的第77位氨基酸残基发生替代，其它氨基酸残基没有发生替代。具体地，上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白与所述野生型骨保护素相比，在序列上只有所述野生型骨保护素的全长序列的第77位氨基酸残基不同，其它氨基酸残基均相同。

上述突变体蛋白中，所述突变体蛋白具体可为d1至d5中的任一种：

d1、氨基酸序列是seqidno.6的蛋白质(名称为opgs77f)，或氨基酸序列是seqidno.6的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；

d2、氨基酸序列是seqidno.4的蛋白质(名称为opgs77d)，或氨基酸序列是seqidno.4的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；

d3、氨基酸序列是seqidno.3的蛋白质(名称为opgs77g)，或氨基酸序列是seqidno.3的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；

d4、氨基酸序列是seqidno.7的蛋白质(名称为opgs77e)，或氨基酸序列是seqidno.7的第5-184位氨基酸残基的蛋白质；

d5、氨基酸序列是seqidno.5的蛋白质(名称为opgs77v)，或氨基酸序列是seqidno.5的第5-184位氨基酸残基的蛋白质。

下述e1至e3的所述突变体蛋白的相关产品，也属于本发明的保护范围：

e1、所述突变体蛋白的相关生物材料，所述相关生物材料可为下述b1)至b16)中的任一种：

b1)编码所述突变体蛋白的核酸分子；

b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；

b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；

b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；

b9)含有b1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

b10)含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

b11)含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

b12)含有b4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

b13)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

b14)含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

b15)含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

b16)含有b4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

e2、所述突变体蛋白的衍生物，为下述a11或a12：

a11、在所述突变体蛋白的氨基端或/和羧基端融合标签蛋白得到的融合蛋白或将具有靶向性功能的蛋白与所述突变体蛋白连接得到的融合蛋白；

a12、对所述突变体蛋白进行下述a21至a28中至少一种修饰得到的修饰物：

a21、添加亮氨酸拉链；

a22、添加异亮氨酸拉链；

a23、加入锌原子和双硫基；

a24、被装载到人血清白蛋白纳米颗粒中；

a25、与hsa配体结合；

a26、与peg结合；

a27、用聚乳酸-乙醇酸共聚物微球缓释系统装载；

a28、与抗体的fc段(可结晶片段)结合；

e3、所述突变体蛋白的单聚体或多聚体。

上述相关产品中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

上述相关产品中，所述重组微生物可为将所述突变体蛋白的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物可为f11至f14中的任一种:

f11、原核微生物；

f12、革兰氏阴性细菌；

f13、埃希氏菌属细菌；

f14、大肠杆菌bl21(de3)。

上述生物材料中，b9)至b16)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。

上述相关产品中，所述具有靶向性功能的蛋白可为抗体或转铁蛋白。所述抗体可为单链抗体或完整抗体。所述标签蛋白(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签蛋白可为flag标签蛋白、his6标签蛋白、mbp标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、gst标签蛋白或sumo标签蛋白等。

本发明还提供了抑制rankl介导的破骨细胞活化的药物。

本发明所提供的抑制rankl介导的破骨细胞活化的药物，含有所述突变体蛋白或/和所述相关产品。

所述抑制rankl介导的破骨细胞活化的药物具体可为预防和/或治疗骨吸收相关疾病的药物，如预防和/或治疗骨质疏松症的药物、预防和/或治疗关节炎的药物等。上述物中，所述药物的活性成分可为所述突变体蛋白或/和所述相关产品，所述药物的活性成分还可含有其它成分，所述药物的其它活性成分本领域技术人员可根据其抑制rankl介导的破骨细胞活化效果确定。

上述药物中，所述药物还可含有载体或赋形剂。所述载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲基纤维素等)。

实验证明，将人野生型骨保护素全长序列的第77位的丝氨酸残基(s77)分别替代为甘氨酸残基、天冬氨酸残基、缬氨酸残基、苯丙氨酸残基和谷氨酸残基得到的突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f和opgs77e与相应的野生opg(opgwt)相比，与rankl的亲和力分别是野生型的0.82倍、0.86倍、0.77倍、0.90倍和0.85倍，与trail亲和力分别是野生型的0.07倍、0.08倍、0.06倍、0.05倍和0.11倍。突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f和opgs77e与相应的野生opg(opgwt)相比，抑制rankl诱导破骨细胞分化能力无显著差别。说明s77位点的突变没有降低opg对rankl的抑制作用。突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f和opgs77e对trail的抑制作用远低于野生opg(opgwt)，这些opg突变体蛋白可以克服野生型抑制trail抗肿瘤作用的缺陷，更高效、安全地发挥防治骨吸收相关疾病的作用。

附图说明

图1为经分子筛纯化后获得的opgs77g和opgk108a的鉴定结果。

a为sds-page电泳鉴定。1-2道分别为opgs77g和opgk108a，箭头所示为各道的纯化蛋白。

b为opgs77g复性后分子筛纯化图像。箭头所示为opgs77g的洗脱峰。

图2为opg抑制rankl刺激raw264.7细胞分化成熟为破骨细胞的实验(上图)和opg抑制trail导致的colo205细胞凋亡实验(下图)。图中，wopg为野生型人骨保护素opgwt，m1为opgs77g，m101为opgs77d，m102为opgs77v，m103为opgs77f，m104为opgs77e，m2为opgk108a，m3为阳性对照opgr122g。上图中，negative孔中rankl的浓度是0ng/ml，opg的浓度是0ng/ml；rankl的孔中rankl的浓度为50ng/ml，opg的浓度是0ng/ml；rankl：opg1:1的孔中rankl的浓度为50ng/ml，opg的浓度是50ng/ml，rankl：opg1:2的孔中rankl的浓度为50ng/ml，opg的浓度是100ng/ml，rankl：opg1:4的孔中rankl的浓度为50ng/ml，opg的浓度是200ng/ml，rankl：opg1:8的孔中rankl的浓度为50ng/ml，opg的浓度是400ng/ml。

下图中，negative孔中trail的浓度是0ng/ml，opg的浓度是0ng/ml；trail的孔中trail的浓度是100ng/ml；trail：opg1:1的孔中trail的浓度是100ng/ml，opg的浓度是100ng/ml，trail：opg1:5的孔中trail的浓度是100ng/ml，opg的浓度是500ng/ml，trail：opg1:25的孔中trail的浓度是100ng/ml，opg的浓度是2500ng/ml，trail：opg1:125的孔中trail的浓度是100ng/ml，opg的浓度是12500ng/ml。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的trail来源于人，其氨基酸序列如ncbireferencesequence:np_003801.1(updatedate：06-may-2017)，由281个氨基酸残基组成，为peprotech公司产品。

下述实施例中的rankl来源于人，其氨基酸序列如ncbireferencesequence:np_003692.1(updatedate：02-jul-2017)由317个氨基酸残基组成，为abcam公司产品。

本申请研究了野生型人骨保护素上两个可能满足具有对核因子-кb受体活化因子配体的亲和活性但是对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的亲和活性低于野生型人骨保护素这两个条件的关键位点,分别为s77和k108，设计了野生型人骨保护素的突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、opgs77e和opgk108a。具体见如下实施例。

实施例1、制备野生型人骨保护素opgwt及野生型人骨保护素的突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、opgs77e、opgk108a和opgr122g

1、制备野生型人骨保护素opgwt

野生型人骨保护素opgwt的氨基酸序列是seqidno.2的第154至345位氨基酸残基。野生型人骨保护素opgwt含有人全长骨保护素(氨基酸序列是genbankaccessionnumbernp_002537.3(updatedate：26-jun-2017)或seqidno.10))的第22-201位氨基酸残基。

参照如下文献的方法制备野生型人骨保护素opgwt：mengmengjin,etal.sortasea-aidedescherichiacoliexpressionsystemforfunctionalosteoprotegerincysteine-richdomain.applmicrobiolbiotechnol(2017)101:4923–4933.doi10.1007/s00253-017-8188-6。具体方法如下：

1.1制备dna分子

制备seqidno.1所示的dna。seqidno.1所示的dna为融合有分选酶a(sortasea,srta)和lpxtg基序的融合蛋白srta-lpetg-opgwt基因。srta-lpetg-opgwt基因表达seqidno.2所示的融合蛋白srta-lpetg-opgwt。seqidno.2的n末端为分选酶sortasea，分选酶sortasea会在lpxtg的thr和gly之间进行切割，释放出目的蛋白opgwt。opgwt的氨基酸序列为seqidno.2的第154至345位氨基酸残基。seqidno.2的第158至337位氨基酸残基对应于人全长骨保护素(氨基酸序列是genbankaccessionnumbernp_002537.3(26-jun-2017))的第22-201位氨基酸残基。将氨基酸序列是seqidno.10的第22-201位氨基酸残基的片段作为野生型。seqidno.2的第150-至154位氨基酸残基为lpxtg基序，第3至149位氨基酸残基为分选酶a的氨基酸序列。

1.2制备表达载体

用核苷酸序列是seqidno.1的第1-1019位核苷酸的dna替换pet28a(+)(novagen)的ncoi和xhoi识别位点间的片段(包括ncoi识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet28a(+)的其它序列不变，得到srta-lpetg-opgwt基因重组表达载体，命名为pet28a-srta-lpetg-opgwt。pet28a-srta-lpetg-opgwt含有srta-lpetg-opgwt基因，pet28a-srta-lpetg-opgwt导入e.colibl21(de3)可获得氨基酸序列是seqidno.2的第154至345位氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质含有人全长骨保护素的第22-201位氨基酸残基，将该蛋白质命名为opgwt。seqidno.2的第158至337位氨基酸残基与人全长骨保护素的第22-201位氨基酸残基相同。

1.3获得野生型人骨保护素opgwt

将pet28a-srta-lpetg-opgwt转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，将其均匀涂布于含卡那霉素的lb平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有pet28a-srta-lpetg-opgwt的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgwt。

将bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgwt接种入含100ug/ml卡那霉素的lb培养基中扩增(37℃，200rpm)，od600达到0.6时加入iptg诱导表达(iptg终浓度1mm)，37℃诱导5h后超速离心收菌。菌体重悬于100ml清洗缓冲液(50mmtris，150mmnacl，5mmedta，1％v/vtritonx-100，ph8.0)，超声破碎后再次以清洗缓冲液清洗并离心保留沉淀，此过程多次重复进行，获得包涵体，分装冻存。包涵体室温下溶于溶解缓冲液中(6m盐酸胍,50mmtrisph8.5,1mmedta,150mmnacl，10mmdtt)蛋白浓度为30mg/ml,再以复性缓冲液(20mmna2hpo4，1ml-精氨酸，20％甘油，10mm还原型谷胱甘肽和1mm氧化型谷胱甘肽，ph7.3)稀释至蛋白浓度10mg/ml，溶液装入透析袋中置于透析液(20mmna2hpo4ph7.3,0.5ml-精氨酸和10％甘油)中4℃条件下透析12h，更换透析液(20mmna2hpo4ph7.3,0.2ml-精氨酸,5％甘油)，再次置于4℃条件下12h，再次更换透析液(20mmna2hpo4ph7.3)置于4℃条件下12h。所获蛋白超速离心(20,000g10min)后进行分子筛层析纯化(superdex200,gehealthcare)得到野生型人骨保护素opgwt，分装后-80℃冻存。分子筛层析纯化所用缓冲液为tris缓冲液(0.1mtris,50mmnaclph7.0)。

2、制备人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基突变为甘氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgs77g

人骨保护素的突变体蛋白opgs77g的氨基酸序列为seqidno.3，是将人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基(对应于seqidno.2的第213位氨基酸残基)突变为甘氨酸残基(对应于seqidno.3的第60位氨基酸残基)的突变体。人骨保护素的突变体蛋白opgs77g在氨基酸序列上，与野生型人骨保护素opgwt的区别仅在于seqidno.2的第213位氨基酸残基(对应于seqidno.3的第60位氨基酸残基)。

2.1制备dna分子

将seqidno.1的第639-641位的agt(丝氨酸的密码子)替换为ggt(甘氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶a和lpxtg基序的融合蛋白srta-lpetg-opgs77g基因。srta-lpetg-opgs77g基因表达融合蛋白srta-lpetg-opgs77g。srta-lpetg-opgs77g的氨基酸序列是将seqidno.2的第213位的丝氨酸残基突变为甘氨酸残基，保持seqidno.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

2.2制备表达载体

用融合蛋白srta-lpetg-opgs77g基因替换pet28a(+)的ncoi和xhoi识别位点间的片段(包括ncoi识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet28a(+)的其它序列不变，得到srta-lpetg-opgs77g基因重组表达载体，命名为pet28a-srta-lpetg-opgs77g。pet28a-srta-lpetg-opgs77g含有srta-lpetg-opgs77g基因，pet28a-srta-lpetg-opgs77g导入e.colibl21(de3)可获得氨基酸序列是seqidno.3的人骨保护素的突变体蛋白opgs77g。

2.3获得人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基突变为甘氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgs77g

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为pet28a-srta-lpetg-opgs77g得到含有pet28a-srta-lpetg-opgs77g的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77g；将1.3的bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77g，得到人骨保护素的突变体蛋白opgs77g。

3、制备人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基突变为天冬氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgs77d

人骨保护素的突变体蛋白opgs77d的氨基酸序列为seqidno.4，是将人全长骨保护素的第77位丝氨酸残基(对应于seqidno.2的第213位氨基酸残基)突变为天冬氨酸残基(seqidno.4的第60位氨基酸残基)的突变体。人骨保护素的突变体蛋白opgs77d在氨基酸序列上，与野生型人骨保护素opgwt的区别仅在于seqidno.2的第213位氨基酸残基(对应于seqidno.4的第60位氨基酸残基)。

3.1制备dna分子

将seqidno.1的第639-641位的agt(丝氨酸的密码子)替换为gac(天冬氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶a和lpxtg基序的融合蛋白srta-lpetg-opgs77d基因。srta-lpetg-opgs77d基因表达融合蛋白srta-lpetg-opgs77d。srta-lpetg-opgs77d的氨基酸序列是将seqidno.2的第213位的丝氨酸残基突变为天冬氨酸残基，保持seqidno.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

3.2制备表达载体

用融合蛋白srta-lpetg-opgs77d基因替换pet28a(+)的ncoi和xhoi识别位点间的片段(包括ncoi识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet28a(+)的其它序列不变，得到srta-lpetg-opgs77d基因重组表达载体，命名为pet28a-srta-lpetg-opgs77d。pet28a-srta-lpetg-opgs77d含有srta-lpetg-opgs77d基因，pet28a-srta-lpetg-opgs77d导入e.colibl21(de3)可获得氨基酸序列是seqidno.4的人骨保护素的突变体蛋白opgs77d。

3.3获得人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基突变为天冬氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgs77d

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为pet28a-srta-lpetg-opgs77d得到含有pet28a-srta-lpetg-opgs77d的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77d；将1.3的bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77d，得到人骨保护素的突变体蛋白opgs77d。

4、制备人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基突变为缬氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgs77v

人骨保护素的突变体蛋白opgs77v的氨基酸序列为seqidno.5，是将人全长骨保护素的第77位丝氨酸残基(对应于seqidno.2的第213位氨基酸残基)突变为缬氨酸残基(seqidno.5的第60位氨基酸残基)的突变体。人骨保护素的突变体蛋白opgs77v在氨基酸序列上，与野生型人骨保护素opgwt的区别仅在于seqidno.2的第213位氨基酸残基(对应于seqidno.5的第60位氨基酸残基)。

4.1制备dna分子

将seqidno.1的第639-641位的agt(丝氨酸的密码子)替换为gtt(缬氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶a和lpxtg基序的融合蛋白srta-lpetg-opgs77v基因。srta-lpetg-opgs77v基因表达融合蛋白srta-lpetg-opgs77v。srta-lpetg-opgs77v的氨基酸序列是将seqidno.2的第213位的丝氨酸残基突变为缬氨酸残基，保持seqidno.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

4.2制备表达载体

用融合蛋白srta-lpetg-opgs77v基因替换pet28a(+)的ncoi和xhoi识别位点间的片段(包括ncoi识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet28a(+)的其它序列不变，得到srta-lpetg-opgs77v基因重组表达载体，命名为pet28a-srta-lpetg-opgs77v。pet28a-srta-lpetg-opgs77v含有srta-lpetg-opgs77v基因，pet28a-srta-lpetg-opgs77v导入e.colibl21(de3)可获得氨基酸序列是seqidno.5的人骨保护素的突变体蛋白opgs77v。

4.3获得人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基突变为缬氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgs77v

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为pet28a-srta-lpetg-opgs77v得到含有pet28a-srta-lpetg-opgs77v的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77v；将1.3的bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77v，得到人骨保护素的突变体蛋白opgs77v。

5、制备人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基突变为苯丙氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgs77f

人骨保护素的突变体蛋白opgs77f的氨基酸序列为seqidno.6，是将人全长骨保护素的第77位丝氨酸残基(对应于seqidno.2的第213位氨基酸残基)突变为苯丙氨酸残基(seqidno.6的第60位氨基酸残基)的突变体。人骨保护素的突变体蛋白opgs77f在氨基酸序列上，与野生型人骨保护素opgwt的区别仅在于seqidno.2的第213位氨基酸残基(对应于seqidno.6的第60位氨基酸残基)。

5.1制备dna分子

将seqidno.1的第639-641位的agt(丝氨酸的密码子)替换为ttc(苯丙氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶a和lpxtg基序的融合蛋白srta-lpetg-opgs77f基因。srta-lpetg-opgs77f基因表达融合蛋白srta-lpetg-opgs77f。srta-lpetg-opgs77f的氨基酸序列是将seqidno.2的第213位的丝氨酸残基突变为苯丙氨酸残基，保持seqidno.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

5.2制备表达载体

用融合蛋白srta-lpetg-opgs77f基因替换pet28a(+)的ncoi和xhoi识别位点间的片段(包括ncoi识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet28a(+)的其它序列不变，得到srta-lpetg-opgs77f基因重组表达载体，命名为pet28a-srta-lpetg-opgs77f。pet28a-srta-lpetg-opgs77f含有srta-lpetg-opgs77f基因，pet28a-srta-lpetg-opgs77f导入e.colibl21(de3)可获得氨基酸序列是seqidno.6的人骨保护素的突变体蛋白opgs77f。

5.3获得人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基突变为苯丙氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgs77f

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为pet28a-srta-lpetg-opgs77f得到含有pet28a-srta-lpetg-opgs77f的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77f；将1.3的bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77f，得到人骨保护素的突变体蛋白opgs77f。

6、制备人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基突变为谷氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgs77e

人骨保护素的突变体蛋白opgs77e的氨基酸序列为seqidno.7，是将人全长骨保护素的第77位丝氨酸残基(对应于seqidno.2的第213位氨基酸残基)突变为谷氨酸残基(seqidno.7的第60位氨基酸残基)的突变体。人骨保护素的突变体蛋白opgs77e在氨基酸序列上，与野生型人骨保护素opgwt的区别仅在于seqidno.2的第213位氨基酸残基(对应于seqidno.6的第60位氨基酸残基)。

6.1制备dna分子

将seqidno.1的第639-641位的agt(丝氨酸的密码子)替换为gaa(谷氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶a和lpxtg基序的融合蛋白srta-lpetg-opgs77e基因。srta-lpetg-opgs77e基因表达融合蛋白srta-lpetg-opgs77e。srta-lpetg-opgs77e的氨基酸序列是将seqidno.2的第213位的丝氨酸残基突变为谷氨酸残基，保持seqidno.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

6.2制备表达载体

用融合蛋白srta-lpetg-opgs77e基因替换pet28a(+)的ncoi和xhoi识别位点间的片段(包括ncoi识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet28a(+)的其它序列不变，得到srta-lpetg-opgs77e基因重组表达载体，命名为pet28a-srta-lpetg-opgs77e。pet28a-srta-lpetg-opgs77e含有srta-lpetg-opgs77e基因，pet28a-srta-lpetg-opgs77e导入e.colibl21(de3)可获得氨基酸序列是seqidno.7的人骨保护素的突变体蛋白opgs77e。

6.3获得人全长骨保护素的第77位的丝氨酸残基突变为谷氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgs77e

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为pet28a-srta-lpetg-opgs77e得到含有pet28a-srta-lpetg-opgs77e的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77e；将1.3的bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77e，得到人骨保护素的突变体蛋白opgs77e。

7、制备人全长骨保护素的第108位的赖氨基酸残基突变为丙氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgk108a

人骨保护素的突变体蛋白opgk108a是将seqidno.3的第60位的甘氨酸残基(对应于人全长骨保护素的第77位)突变为丝氨酸残基、并将第seqidno.3的第91位的赖氨酸残基(对应于人全长骨保护素的第108位)突变为丙氨酸残基，保持seqidno.3的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。在本申请中作为对照。

7.1制备dna分子

将seqidno.1的第732-734位的aag(赖氨酸的密码子)替换为gca(丙氨酸的密码子)，其它核苷酸不变，得到融合有分选酶a和lpxtg基序的融合蛋白srta-lpetg-opgk108a基因。srta-lpetg-opgk108a基因表达融合蛋白srta-lpetg-opgk108a。srta-lpetg-opgk108a的氨基酸序列是将seqidno.2的第244位的赖氨基酸残基突变为丙氨酸残基，保持seqidno.2的其它氨基酸残基均不变得到的序列。

7.2制备表达载体

用融合蛋白srta-lpetg-opgk108a基因替换pet28a(+)的ncoi和xhoi识别位点间的片段(包括ncoi识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet28a(+)的其它序列不变，得到srta-lpetg-opgk108a基因重组表达载体，命名为pet28a-srta-lpetg-opgk108a。pet28a-srta-lpetg-opgk108a含有srta-lpetg-opgk108a基因，pet28a-srta-lpetg-opgk108a导入e.colibl21(de3)可获得人骨保护素的突变体蛋白opgk108a。

7.3获得人全长骨保护素的第108位的赖氨基酸残基突变为丙氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgk108a

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为pet28a-srta-lpetg-opgk108a得到含有pet28a-srta-lpetg-opgk108a的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgk108a；将1.3的bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgk108a，得到人骨保护素的突变体蛋白opgk108a。

8、制备人全长骨保护素的第122位的精氨酸残基突变为甘氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgr122g

us2006/0189528a1披露了人骨保护素的突变体蛋白r122g。本申请中制备r122g作为阳性对照。

人骨保护素的突变体蛋白r122g(在本申请中称为opgr122g)的氨基酸序列为seqidno.9，含有人全长骨保护素的第22-194位氨基酸残基但将人全长骨保护素的第122位的精氨酸残基突变为甘氨酸残基(对应于seqidno.9的第258位氨基酸残基)的突变体。

8.1制备dna分子

制备seqidno.8的dna分子。seqidno.8所示的dna为融合有分选酶a(sortasea,srta)和lpxtg基序的融合蛋白srta-lpetg-opgr122g基因。srta-lpetg-opgr122g基因表达融合蛋白srta-lpetg-opgr122g。

8.2制备表达载体

用融合蛋白srta-lpetg-opgr122g基因替换pet28a(+)的ncoi和xhoi识别位点间的片段(包括ncoi识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet28a(+)的其它序列不变，得到srta-lpetg-opgr122g基因重组表达载体，命名为pet28a-srta-lpetg-opgr122g。pet28a-srta-lpetg-opgr122g含有srta-lpetg-opgr122g基因，pet28a-srta-lpetg-opgr122g导入e.colibl21(de3)可获得氨基酸序列是seqidno.9的人骨保护素的突变体蛋白opgr122g。

8.3人全长骨保护素的第122位的精氨酸残基突变为甘氨酸残基的人骨保护素的突变体蛋白opgr122g

参照步骤1.3，与步骤1.3的区别仅在于以下两点：将1.3的pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为pet28a-srta-lpetg-opgr122g得到含有pet28a-srta-lpetg-opgr122g的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgr122g；将1.3的bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgwt替换为bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgr122g，得到人骨保护素的突变体蛋白opgr122g。

9、实验结果

结果表明bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgwt、bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77g、bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77d、bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77v、bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77f、bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgs77e、bl21(de3)/pet28a-srta-lpetg-opgk108a和pet28a-srta-lpetg-opgr122g经iptg诱导后发现以表达蛋白以包涵体形式存在。本实施例通过制备包涵体、蛋白变性、复性，并经分子筛(aktaavant，gehealthcare)纯化获得相应的可溶性的野生型人骨保护素opgwt，人骨保护素的突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、opgs77e、opgk108a和opgr122g(图1)。

实施例2、野生型人骨保护素opgwt及人骨保护素的突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、opgs77e、opgk108a和opgr122g的与rankl和trail的亲和力测定

采用表面等离子共振(surfaceplasmonresonance,spr)技术进行，使用仪器设备为biacore3000(gehealthcare)，以rankl或trail为固定相固定于cm5芯片表面某一通道(稀释配给入10mm醋酸钠ph5.5)，响应值上升约2000ru为佳；以tnfrsf9固定于另一通道作为内参；实施例1制备的opgwt及人骨保护素的突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、opgs77e、opgk108a和opgr122g为流动相，以biacore缓冲液(10mmhepes,150mmnacl,0.005％tween20,ph7.4)分别将opgwt及人骨保护素的突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、opgs77e、opgk108a和opgr122g配制为不同浓度(0,3.125,6.25,12.5,25,50,100nm)，依次流过通道，结果以传感图的形式记录，并使用biaevaluationsoftware4.1(biacore,gehealthcare)按照1:1的结合模型进行拟合，计算平衡-解离常数(kd)。

表1、野生型人骨保护素opgwt及人骨保护素的突变体蛋白与rankl及trail的亲和力。

注：wild为野生型人骨保护素opgwt，m1为opgs77g，m101为opgs77d，m102为opgs77v，m103为opgs77f，m104为opgs77e，m2为opgk108a，m3为阳性对照opgr122g。结果如表1所示，表明：

opgs77g与rankl的亲和力(kd＝6.34×10^-9)同野生型opgwt与rankl亲和力(kd＝5.22×10^-9)接近，是野生型的0.82倍；但其与trail亲和力较野生型相比显著下降(8.75×10^-7及6.55×10^-8)，是野生型的0.07倍。

opgs77d与rankl的亲和力(kd＝6.09×10^-9)同野生型opgwt与rankl亲和力(kd＝5.22×10^-9)接近，是野生型的0.86倍；但其与trail亲和力较野生型相比显著下降(8.33×10^-7及6.55×10^-8)，是野生型的0.08倍。

opgs77v与rankl的亲和力(kd＝6.78×10^-9)同野生型opgwt与rankl亲和力(kd＝5.22×10^-9)接近，是野生型的0.77倍；但其与trail亲和力较野生型相比显著下降(1.09×10^-6及6.55×10^-8)，是野生型的0.06倍。

opgs77f与rankl的亲和力(kd＝5.82×10^-9)同野生型opgwt与rankl亲和力(kd＝5.22×10^-9)接近，是野生型的0.90倍；但其与trail亲和力较野生型相比显著下降(1.22×10^-6及6.55×10^-8)，是野生型的0.05倍。

opgs77e与rankl的亲和力(kd＝6.16×10^-9)同野生型opgwt与rankl亲和力(kd＝5.22×10^-9)接近，是野生型的0.85倍；但其与trail亲和力较野生型相比显著下降(6.01×10^-7及6.55×10^-8)，是野生型的0.11倍。

opgk108a与rankl的亲和力(kd＝6.41×10^-9)同野生型opgwt与rankl亲和力(kd＝5.22×10^-9)接近，是野生型的0.81倍，但其与trail亲和力较野生型相比也接近(9.47×10^-8及6.55×10^-8)，是野生型的0.69倍。

阳性对照opgr122g与rankl的亲和力(kd＝6.96×10^-9)同野生型opgwt与rankl亲和力(kd＝5.22×10^-9)接近，是野生型的0.75倍，但其与trail亲和力较野生型相比显著下降(2.62×10^-7及6.55×10^-8)，是野生型的0.25倍。

以上结果说明，本申请的人骨保护素的突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、和opgs77e对rankl的亲和力高于阳性对照opgr122g，对trail的亲和力均显著低于阳性对照opgr122g。虽然opgk108a对rankl的亲和力高于阳性对照opgr122g，但是对trail的亲和力也显著高于阳性对照opgr122g。

实施例3、野生型人骨保护素opgwt及人骨保护素的突变体蛋白opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、opgs77e、opgk108a和opgr122g的生物学活性

1、抑制rankl介导的破骨细胞活化实验

rankl诱导的破骨细胞的分化和成熟以多核细胞的形成和多核细胞表达抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)为标志。

利用raw264.7细胞分化实验来检测野生型人骨保护素opgwt及人骨保护素的突变体蛋白抑制rankl介导的破骨细胞活化的能力。小鼠单核巨噬细胞白血病细胞raw264.7在rankl刺激下分化为破骨细胞。具体试验方法如下：小鼠巨噬细胞来源细胞系raw264.7传代至24孔板(1×10⁴细胞/孔)，使用含10％fbs的α-mem培养基培养。各孔加入rankl至其终浓度50ng/ml，诱导raw264.7细胞分化成破骨细胞，并加入不同浓度的opg(实施例1制备的opgwt、opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、opgs77e、opgk108a和opgr122g)抑制rankl的促分化作用，细胞在恒温培养箱(37℃，含5％co2)培养4天，使用抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)试剂盒进行染色，按文献报道方式(poleketal.2003)显微镜下对多核(细胞核数量>3个)trap染色阳性的细胞进行计数。同时设不加rankl和opg的阴性对照组。实验重复4次并进行统计分析。

raw264.7细胞分化后trap染色定量分析结果如图2所示，相对于阴性对照组(negative),rankl组(rankl)的trap阳性多核细胞有显著增加，说明rankl成功地刺激了raw264.7细胞的分化为成熟的破骨细胞。随着opg浓度的增加，各组trap阳性多核细胞比例不断下降，说明opg起到了抑制rankl活性的作用。与野生opg(opgwt)相比，突变体opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、opgs77e、opgk108a和opgr122g抑制rankl诱导破骨细胞分化能力无显著差别。说明s77位点的突变没有降低opg对rankl的抑制作用。该结果与实施例2的亲和力测定结果相吻合。

2、抑制trail导致的肿瘤细胞凋亡实验

trail诱导的细胞凋亡实验采用sub-g1dna含量分析的方法(allenetal.2012)。即在人结肠癌细胞colo205细胞培养基中加入trail至其浓度100ng/ml及不同浓度的opg(实施例1制备的opgwt、opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f、opgs77e、opgk108a和opgr122g)，细胞在恒温培养箱(37℃，含5％co2)培养3h。离心收集细胞，清洗后重悬于含80％乙醇的pbs(ph7.4)中，离心弃上清后再次以含0.2％tritonx-100和0.5mg/mlrna酶的pbs重悬，后以25ug/ml碘化丙啶染色后facsort流式细胞仪(bdbiosciences,mountainview,ca)行流式细胞检测。同时设不加trail和opg的阴性对照组(negative)。

实验结果如图2所示，trail成功地促使了50.25％±5.74％的colo205细胞的凋亡。随着opg浓度的增加，野生opg组细胞凋亡比例不断下降，说明trail诱导细胞凋亡作用受到抑制；与之相比，突变体opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f和opgs77e各组随着opg浓度增加细胞凋亡比例下降较少，特别是opgs77f最高浓度组(opgs77f浓度为12.5μg/ml，trail:opg＝1:125)细胞凋亡比例为33.75％±4.42％，接近仅加入trail诱导表达的对照组(50.25％±5.74％)，远高于野生opg(opgwt)最高浓度组(5.25％±4.86％)。另一突变体opgk108a的细胞凋亡比例下降则很多(最高浓度时为12.53％±2.56％)。此外，作为阳性对照的opgr122g在其最高浓度时细胞凋亡比例为21.62％±6.53％。该实验结果表明，突变体opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f和opgs77e对trail的抑制作用远低于野生opg(opgwt)，甚至低于阳性对照的opgr122g，其降低程度甚至优于阳性对照opgr122g位点的突变。该结果与实施例2的亲和力测定结果相吻合。

综合以上结果说明，本申请成功找到了新的符合研究设想——rankl亲和力不变但trail亲和力显著下降的opg上的s77突变位点，并且通过多种氨基酸替代，获得了较理想的opgs77g、opgs77d、opgs77v、opgs77f和opgs77e这些opg突变体蛋白。这些opg突变体蛋白可以克服野生型抑制trail抗肿瘤作用的缺陷，更高效、安全地发挥防治骨吸收相关疾病的作用。

<110>北京济全生物科技有限公司

<120>骨保护素的s77突变体蛋白及其相关产品与应用

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