一步法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测人基质金属蛋白酶11的试剂盒的制作方法

本发明属生物
技术领域：
，为一种通过以mrna为模板，使反转录和实时荧光定量pcr在同一反应体系中进行的检测技术，可以精确定量检测标本中人基质金属蛋白酶11(mmp11)的mrna表达量的试剂盒
背景技术：
：上世纪中期，随着人们生存居住环境、饮食习惯以及生活水平的不断改变、不断提高，与此同时各类肿瘤的发病率/死亡率也呈逐年上升趋势。结直肠癌的发病率和死亡率仅次于肺癌和乳腺癌，已成为第三恶性肿瘤。结直肠癌具有高度恶性与侵袭性的生物学特性，常发生浸润、转移，此生物学特性是导致患者预后较差及死亡率较高的一个重要因素。结直肠癌的发生、发展是与多基因相关、多因素相互影响、多步骤、错综复杂循序渐进的过程；然而其诊治关键要点与大多数肿瘤一样，在于早期发现、早期诊断、早期治疗。临床研究表明，早期结直肠癌的手术治愈率可以达到80%-90%，然而结直肠癌患者常常因早期缺乏特异性的临床症状与体征，不易引起患者足够的重视，难以在患病早期及时的发现并行手术治疗。多数结直肠癌患者在发现时已是中期，甚至是晚期，即使行手术治疗，也难以达到患者理想的效果，术后复发转移率较高，生存期也较短，预后不佳。近几年，以消化道内镜结合病理学检查为主的诊断方法在临床上广泛应用，但是针对我国目前医疗现状来说，暂不适合大规模消化内窥镜筛查，进而导致早期行手术治疗率较低。临床发现中晚期结直肠癌患者即使进行手术治疗，也有30%-40%的患者术后出现复发或转移播散，复发和转移目前导致结直肠癌患者死亡最主要原因之一。近年来，结直肠癌治疗及手术方案有了明显的改善与进步，同时各种后期治疗手段如：放、化疗在不断更新与完善，生物治疗、基因治疗等新方法不断涌现。血循环中存活的肿瘤细胞是远处转移和复发的基础，尽管各种结直肠癌的各种检测方法不断的增多，然而这一类细胞数量极微，不易被临床常规手段检测出来。近年来，通过逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)技术检测外周血中微量循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell，ctc)已成为可能并被尝试。基质金属蛋白酶是一种细胞外基质肽链内切酶,所有基质金属蛋白酶含有共同的一个保守序列,这也是与金属离子结合的部位,其催化活性依赖于酶活性中心与金属锌离子的结合。基质金属蛋白酶最初都是细胞分泌的以无活性的酶的前体形式存在,只有通过被激活才能发挥作用。mmp11是基质金属蛋白家族中的一种,根据其编码基因序列,发现其属于基质金属蛋白家族,由于其和先前发现的基质分解素有着相似的结构,被命名mmp11。研究表明mmp11与肿瘤的增值、转移有重要的关系,mmp11在癌细胞株及胃癌细胞中高表达,通过重组质粒抑制mmp11的表达发现体外胃癌细胞株的生长被抑制,这证明mmp11在肿瘤细胞的增值生长中发挥着重要的作用,也有研究表明,mmp11表达高的病人,其预后较差,对于预测患者的预后具有一定的参考意义。一步法荧光定量pcr技术使反转录和pcr扩增在同一反应体系中进行，反应过程中无需打开管盖，避免交叉污染，节省实验时间。具有方便、便捷、重复性好等特点。技术实现要素：本发明试剂盒包含：逆转录聚合酶链反应液(rt-pcr反应液)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mulv)逆转录酶、rna酶抑制剂(rnasin)、耐热性dna聚合酶(taqdna聚合酶)、标准品、阴阳性对照品。其中逆转录聚合酶链反应液含有焦炭酸二乙酯处理的水、逆转录聚合酶链缓冲液、寡聚(dt)15-18(oligo(dt)15-18)、dntps、mgcl2、检测用上下游引物、荧光探针。检测用引物分检测用上游引物和检测用下游引物：上游引物序列为：5’—ggaactggagtgtccttgctgta—3’，下游引物序列为：5’—ggtatgttgcagcctccagg—3’，荧光探针序列为：5’—fam—ccacttcctgaggtcag—tamra—3’标准品序列为：ggaactggagtgtccttgctgtatccctgttgtgaggttccttccaggggctggcactgaagcaagggtgctggggccccatggccttcagccctggctgagcaactgggctgtagggcagggccacttcctgaggtcaggtcttggtaggtgcctgcatctgtctgccttctggctgacaatcctggaaatctgttctccagaatccaggccaaaaagttcacagtcaaatggggaggggtattcttcatgcaggagaccccaggccctggaggctgcaacatacc。阴阳性对照品中，阴性对照品为无mmp11mrna的rna样品，阳性对照品为有人基质金属蛋白酶11(mmp11)mrna的rna样品。本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。本发明建立了一步法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术检测mmp11表达的方法，反应过程中无需打开管盖，避免交叉污染，节省实验时间。在本检测项目中，我们采用了特异性荧光探针杂交定量pcr检测技术，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰，使被检测基因的特异性大大提高。并经检测患者标本，表明该方法切实可行。本方法所设计的引物、探针以及检测结果，可以为荧光定量pcr检测试剂盒的开发提供可靠的依据。本发明试剂盒使用方法：每次检测均应设立阳性对照品和阴性对照品。标准品用1×tebuffer稀释为1×102-1×107拷贝/ml。逆转录聚合酶链扩增检测：在荧光定量pcr仪上进行，总体积50μl，其中逆转录聚合酶链反应液46.5μl，检测样品(mrna、标准品、阳性或阴性对照)2μl，莫洛尼氏鼠白血病病毒(m-mulv)逆转录酶0.5μl，rna酶抑制剂(rnasin)0.5μl，耐热性dna聚合酶(taqdna聚合酶)0.5μl。反应条件：45℃逆转录30分钟，95℃预变性5分钟，95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒共40个循环，72℃延伸10分钟。根据所获得的标准曲线，计算得到各待测标本中mmp11的量(拷贝数/ml)。附图说明图1为实时荧光定量rt-pcr标准品检测。图2为实时荧光定量rt-pcr标准曲线。具体实施方式本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。实施例1一步法荧光定量rt-pcr法检测mmp11的表达。一、材料：trizol试剂及限制性内切酶均购自美国invitrogen公司，pgem-t-easy克隆载体、m-mlv逆转录酶、taqdna聚合酶、oligo(dt)15-18购自美国promega公司，abi7500型定量pcr仪为美国abi公司产品。二、引物及探针设计与合成：以mmp11全长cdna序列(genbank登录号nm_005940.4)为模板，使用primerexpresstm(v3.0，美国abi公司)软件分析taqman引物和探针位点，并根据同时考虑mmp11基因组dna序列情况，从中选择最佳组合。本发明标准品的引物和检查用引物为相同引物。上游引物序列为5’—ggaactggagtgtccttgctgta—3’，下游引物序列为5’—ggtatgttgcagcctccagg—3’，荧光探针序列为5’—fam—ccacttcctgaggtcag—tamra—3’，均由大连宝生物技术公司合成。三、标准品制备患者的新鲜手术标本立即液氮冻存，并于液氮存在下于研钵中磨碎后用trizol试剂提取总rna，取2.5μlrna，在50μl逆转录聚合酶链反应体积内，用上下游引物在abi7500型pcr仪上进行pcr扩增，条件为45℃逆转录30分钟，95℃预变性5分钟，95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒共30个循环，72℃延伸10分钟后置4℃。pcr产物经电泳检测后即用克隆系统插入pgem-t-easy克隆载体，并将阳性克隆送上海生工公司进行测序验证。测序成功之后提取克隆载体质粒，即为标准品。测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。实施例2荧光定量rt-pcr法检测mmp11的应用。一、标本检测8例经病理确诊的恶性结直肠癌肿瘤患者手术切除标本，分离手术切除标本，经pbs洗涤后离心收集，用trizol试剂提取总rna，取2.5μlrna，在50μl逆转录聚合酶链反应体积内，用上下游引物在abi7500型pcr仪上进行pcr扩增，条件为45℃逆转录30分钟，95℃预变性5分钟，95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒共40个循环，72℃延伸10分钟后置4℃。同时加标准品检测作标准曲线。测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测标本的mmp11表达量。二、样品检测结果标准品检测结果参见图1.标准曲线参见图2。8例患者手术切除标本检测结果如下表患者编号性别年龄标本mmp11值(拷贝数/ml)1男52手术切除标本3.1×1042女48手术切除标本5.9×1023女60手术切除标本2.7×1024男66手术切除标本1.0×1025男83手术切除标本4.7×106女54手术切除标本3.2×1047女68手术切除标本5.3×1028男71手术切除标本1.3×10本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上诉内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。ggaactggagtgtccttgctgtatccctgttgtgaggttccttccaggggctggcactgaagcaagggtgctggggccccatggccttcagccctggctgagcaactgggctgtagggcagggccacttcctgaggtcaggtcttggtaggtgcctgcatctgtctgccttctggctgacaatcctggaaatctgttctccagaatccaggccaaaaagttcacagtcaaatggggaggggtattcttcatgcaggagaccccaggccctggaggctgcaacatacc当前第1页12