一种由化学转化介导的基于CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法与流程

(一)
技术领域：
本发明涉及基因敲除
技术领域：
，具体涉及由化学转化介导的基于crispr/cas9系统的特异性敲除大肠杆菌中染色体靶标基因的方法。(二)
背景技术：
：大肠杆菌(escherichiacoli)广泛应用于基因工程、遗传工程、发酵工程、代谢工程等领域，具广阔的应用前景。基因敲除涉及外源dna导入及其与染色体dna同源重组。datsenko和wanner通过导入λ-red同源重组系统大幅提高大肠杆菌的重组效率，发明了一步敲除大肠杆菌染色体基因技术(datsenko&wanner，pnas,2000,97:6640-6645)。crispr系统可导致靶标基因相应区域产生双链断裂，结合λ-red同源重组系统可进一步提高大肠杆菌基因敲除的效率(jiangetal.，natbiotechnol，2013，31:233-9；jiangetal.，applenvironmicrobiol，2015，81:2506-2514；zhaoetal.，microbcellfact，2016，15:205)。目前采用较广泛的外源dna导入细菌的方法包括电转化和化学转化。前者转化效率高，但是依赖电转化仪、电击杯等装置，因此实验成本相对较高，操作相对较繁琐；后者虽然转化效率相对较低，但是不依赖特殊装置，实验成本低，操作简便。基于λ-red同源重组系统或crispr系统的大肠杆菌基因敲除技术一般通过电转化的方法将外源dna导入细胞。目前，尚没有文献报道化学转化方法结合λ-red同源重组系统或crispr系统开展大肠杆菌基因敲除的成功案例。利用λ-red同源重组的基因敲除技术是一种常用基因打靶技术，是将一段携带与靶基因两翼同源序列的dna片段导入宿主菌细胞，利用入噬菌体red重组酶(gam、bel、exo3种蛋白)的作用，使线性dna片段与染色体的特定靶序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来。该方法所需打靶同源臂短，可以直接设计在引物上，不需要dna酶切和连接等程序，但是同源重组技术重组效率低，对突变体的筛选工作非常耗时和低效。crispr是一种源于原核生物的后天免疫系统，系统中执行dna识别和降解功能的复合物由cas蛋白和crrna组成。该系统有三种类型，其中第二类cas9系统组成简单，已经被广泛应用于基因工程领域。cas9靶向切割dna是通过两种小rna——crrna和tracrrna与靶序列互不识别来实现的。现在已经将这两种小rna融合成一条链，简称sgrna，能够识别特定的基因序列，引导cas9蛋白进行切割。现有的crispr技术敲除大肠杆菌基因的体系结合cas9蛋白和λ-red同源重组系统实现靶标基因敲除工作，操作简单、筛选效率高，能够实现精确快速的靶向切割，但是需要通过电转化的方法将外源dna导入宿主细胞，对dna片段的纯度以及感受态细胞的制备等方面要求较高。开展电转化操作需要较特殊的电转化设备(电转仪)和较昂贵的实验耗材(电击杯)，因此不适合同时开展大量单基因敲除工作。本发明采用化学转化的方法开展大肠杆菌基因敲除工作，无需电转仪和电击杯即可实现快速、高效、准确的靶标基因敲除工作，且基因敲除操作成本低廉，可同时实现大肠杆菌多个单基因敲除，适合大规模高通量基因功能筛选和鉴定工作。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种由化学转化介导的基于crispr/cas9系统的简便而快速敲除大肠杆菌染色体基因的方法，该方法扩增任一靶标基因缺失的大肠杆菌，得到携带选择性标记的同源臂dna片段；采用化学转化的方法将该dna片段和辅助质粒导入宿主细胞，可以对大肠杆菌中敲除效率相对较低的系列菌株中靶标基因快速、高效、准确敲除。此外本发明提供的技术为没有电转仪的实验室开展大肠杆菌基因敲除提供便捷的方法，为大肠杆菌的菌种研究和改良提供了有效手段并显著降低了成本。本发明采用化学转化的方法将外源dna导入宿主细胞，利用宿主细胞中事先导入的λ-red同源重组系统和crispr系统成功实现大肠杆菌基因敲除。与现有大肠杆菌基因敲除方法相比，本发明提供的方法能够在大肠杆菌中实现高效准确的目的基因敲除工作。本发明提供的细菌中基因敲除方法操作简便快捷，对实验装置无特殊要求，实验成本较低，尤其适用于高通量基因敲除工作。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种由化学转化介导的基于crispr/cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法，所述方法为：(1)将质粒pcas9转入大肠杆菌bl21，获得大肠杆菌bl21pcas9；(2)根据靶标基因设计一对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列(n20)，以ptargetf质粒为模板，pcr扩增，获得的pcr产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的ptargetf质粒，即为辅助质粒ptargetf；所述筛选是指pcr产物经纯化后回收，用dpnⅰ处理回收，导入大肠杆菌感受态细胞，挑取转化子，送去测序验证，提取含靶标基因20个核苷酸序列的ptargetf质粒；(3)以敲除靶标基因的大肠杆菌为模板，根据待敲除靶标基因位点上下游核苷酸序列设计引物，菌落pcr扩增含选择性标记基因(优选氯霉素抗性基因)和拟敲除靶标基因上下游同源dna序列的dna片段；(4)将步骤(2)获得的辅助质粒ptargetf和步骤(3)获得的dna片段通过化学转化方法转入大肠杆菌bl21pcas9感受态细胞，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。进一步，步骤(4)辅助质粒ptargetf和dna片段质量比为1:1～1:10，优选1:4。进一步，步骤(4)转入方法为：将辅助质粒ptargetf和dna片段与大肠杆菌bl21pcas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入30℃预热的lb培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分，剩余上清跟沉淀混匀，取混合液涂布于选择性的lb琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到选择性的lb琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌；所述选择性lb琼脂培养基为含终浓度25μg/ml氯霉素的lb琼脂培养基。进一步，当靶标基因为pand基因，所述方法为：(1)将质粒pcas9转入大肠杆菌bl21，获得大肠杆菌bl21pcas9；(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物ptargetf-pand1(含靶标基因20个核苷酸序列(n20)和ptargetf-pand2，以ptargetf质粒为模板，pcr扩增，获得的pcr产物转化大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的ptargetf质粒，即为辅助质粒ptargetf；ptargetf-pand1:gtcctaggtataatactagtgatatctggaatgtcaccaagttttagagctagaaatagc；ptargetf-pand2:actagtattatacctaggactgag；(3)以敲除目标基因的大肠杆菌为模板，根据待敲除基因位点上下游核苷酸序列设计引物f和r，菌落pcr扩增筛选出含选择性标记基因和拟敲除靶标基因上下游同源dna序列的dna片段；f：5’-agataaccgggattgccct-3’；r：5’-tgagccgctatgcgtatcc-3’；(4)将步骤(2)获得的辅助质粒ptargetf和步骤(3)获得的dna片段以质量比1:4与(50μl)大肠杆菌bl21pcas9感受态细胞混合，冰浴30min，然后42℃热激90s之后迅速置冰上放置1～2min，加入950μl经30℃预热的lb培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h，离心弃上清大部分(800μl)，剩余上清和沉淀混匀，取混合液涂布于含有25μg/ml氯霉素的lb琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到含25μg/ml氯霉素的lb琼脂培养基上复筛，获得敲除靶标基因的大肠杆菌。进一步，步骤(2)所述pcr扩增条件为：easytaqdna聚合酶混合液5μl、dntps4μl、1μl引物ptargetf-pand1、1μl引物ptargetf-pand2、模板1μl、easytaqdna聚合酶1μl、ddh2o补足至50μl；反应程序为：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃2.5min，30循环；72℃延伸10min；15℃保存。进一步，步骤(3)所述pcr条件为：easytaqdna聚合酶混合液5μl、dntps4μl、引物f1μl、引物r1μl、模板1μl、easytaqdna聚合酶1μl、ddh2o补足至50μl；反应程序为：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃2min10s，30循环；72℃延伸10min；15℃保存。本发明步骤(1)中将pcas质粒钙转导入大肠杆菌，包括以下步骤：(1)挑取大肠杆菌bl21单菌落接种于5mllb液体试管中，37℃，200r/min培养至od600＝0.6，低温(4℃)离心，获得的菌体分别经溶液a(购自takara感受态细胞制备试剂盒)和溶液b(购自takara感受态细胞制备试剂盒)洗涤后，重悬于溶液b，即获得大肠杆菌bl21化学转化感受态细胞；(2)转化：将5μlpcas9质粒(repa101(ts)kanpcas-cas9parab-redlaciqptrc-sgrna-pmb1)与50μl大肠杆菌bl21感受态细胞混匀，冰浴30min，将混合物42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入950μl、30℃预热的lb培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h后涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的lb固体培养基表面，30℃过夜培养12h，挑取转化子，得到含pcas9质粒的大肠杆菌bl21，记为大肠杆菌bl21-pcas9。本发明所述lb琼脂培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/l、酵母膏5g/l、nacl10g/l、琼脂粉20g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。目前主要通过电转化方法开展大肠杆菌基因敲除工作，实验依赖电转仪(单个电转仪价格1～10万元)及较昂贵的耗材电击杯(约50元/个)，因此单个基因敲除的成本在50元以上，且难以实现并行敲除多个单基因的工作。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：1.本发明利用化学转化进行基因敲除时不依赖特殊装置和昂贵的实验耗材，单个基因敲除的实验成本仅包括价格低廉的试剂和普通的耗材(总成本约0.5元)，且操作十分简便，适用于较高通量的基因敲除工作(如多基因形成的代谢调控网络研究)。此外，本发明采用化学转化敲除大肠杆菌基因的效率近100％，显著优于目前所有已知的大肠杆菌基因敲除方法。(四)附图说明图1为实施例1ptargetf-pand质粒载体图谱。图2为实施例1质粒ptargetf经pcr扩增后的凝胶电泳图，m为dl2000marker，泳道1-10代表平行的10个相同的质粒ptargetfpcr产物。图3为实施例1菌落pcr扩增携带长同源臂和氯霉素抗性基因的dna片段凝胶电泳图，m为dl2000marker，泳道1-4分别代表平行的4个相同的扩增长同源臂和氯霉素抗性基因片段的pcr产物。图4为实施例1大肠杆菌bl21△pand敲除株的菌落pcr验证凝胶电泳图，m为1kbladdermarker，泳道1-2代表2个大肠杆菌bl21野生菌平行对照，泳道3-8代表随机挑取6个转化子进行的菌落pcr验证，结果显示都为大肠杆菌bl21△pand敲除株。图5为实施例1大肠杆菌bl21野生菌和大肠杆菌bl21△pand敲除株在基本盐培养基中的生长曲线。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1大肠杆菌bl21中pand基因的敲除1、将pcas9质粒钙转导入大肠杆菌bl21，记为大肠杆菌bl21pcas9，包括以下步骤：(1)大肠杆菌bl21感受态制备：挑取大肠杆菌bl21单菌落接种于5mllb液体试管中，37℃，200r/min培养至od600＝0.6，低温(4℃)离心，获得的菌体分别经溶液a(购自takara感受态细胞制备试剂盒)和溶液b(购自takara感受态细胞制备试剂盒)洗涤后，重悬于溶液b，即获得大肠杆菌bl21化学转化感受态细胞。(2)转化：将5μlpcas9质粒与50μl大肠杆菌bl21感受态细胞混匀，冰浴30min，将混合物42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入950μl、30℃预热的lb培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h后涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的lb固体培养基表面，30℃过夜培养12h，挑取转化子，得到含pcas9质粒的大肠杆菌bl21，记为大肠杆菌bl21pcas9。2、辅助质粒ptargetf-pand的构建(1)以ptargetf质粒(源自jiangetal.，applenvironmicrobiol，2015，81:2506-2514)为模板，通过引物ptargetf-pand1(含有pand20个核苷酸，即n20)和ptargetf-pand2进行pcr，扩增得到线性化ptargetf-pandpcr产物。ptargetf-pand1:gtcctaggtataatactagtgatatctggaatgtcaccaagttttagagctagaaatagc(seqidno.1)；ptargetf-pand2:actagtattatacctaggactgag(seqidno.2)。pcr的具体条件为：easytaqdnapolymerasebuffer5μldntps4μl引物ptargetf-pand11μl引物ptargetf-pand21μl模板(质粒ptargetf)1μleasytaqdnapolymerase1μlddh2o37μltotal50μl反应程序为：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃2.5min，30循环；72℃延伸10min；15℃保存。pcr扩增后的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2所示。电泳结果在理论值大小位置出现了单一的特异性条带，用dnafragmentpurificationkit(购于takara公司)对其进行纯化回收。(2)用dpnⅰ处理纯化的pcr产物降解模板质粒，具体反应体系为：pcr产物0.5μgquickcutdpnⅰ0.5μl10×quickcutbuffer2.5μl将反应液37℃水浴15min，反应结束后，用dnafragmentpurificationkit对其进行纯化回收。(3)取两步纯化得到的pcr纯化产物(即步骤2回收的产物)转化50μl大肠杆菌dh5α感受态细胞，冰浴30min，将混合物42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入950μl、37℃预热的lb培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h后涂布于含有100μg/ml壮观霉素的lb琼脂培养基上，37℃培养12h，挑取阳性转化菌落，进行测序分析(睿迪)检测重组质粒ptargetf-pand是否含有n20部分，并附带送测引物。送测引物如下：ptf-pand:gtcttaccgggttggactcaagacg(seqidno.3)序列分析结果，得到含有正确n20部分的ptargetf-pand，质粒图谱如图1所示。测得序列如下(seqidno.4)：tcgagttcatgtgcagctccataagcaaaaggggatgataagtttatcaccaccgactatttgcaacagtgccgttgatcgtgctatgatcgactgatgtcatcagcggtggagtgcaatgtcatgagggaagcggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtcatcgagcgccatctcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggatggcggcctgaagccacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgatgaaacaacgcggcgagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccgcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaagagaacatagcgttgccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaacaggatctatttgaggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgggctggcgatgagcgaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataagatgccgctcgccagtcgattggctgagctcatgaagttcctattccgaagttccgcgaacgcgtaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatgctggatccttgacagctagctcagtcctaggtataatactagtgatatctggaatgtcaccaagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttgaattctctagagtcgacctgcagaagcttagatctattaccctgttatccctac3.通过pcr扩增获得携带拟敲除靶标基因两侧同源dna片段和氯霉素抗性基因的pcr产物(1)以大肠杆菌bw25113△pand(源自tomoyababaetal.，molecularsystemsbiology，2006，2:2006.0008)为模板，进行菌落pcr扩增出两端与pand上下游同源，中间为氯霉素抗性基因的dna片段，所采用的引物如下：f：5’-agataaccgggattgccct-3’。(seqidno.5)r：5’-tgagccgctatgcgtatcc-3’。(seqidno.6)pcr扩增获得的两端与pand上下游同源中间为氯霉素抗性基因的序列(seqidno.7)：agataaccgggattgccctgcatttgcacggaatagagcacgtccgtgctgtgtcctttcaggctctcttcaatgaaactccccgactctaaatgaagcgtgttgaggtcacaaagttcgcgtaattccactggcaaatgtatctccagaaagtcgcgagccgtctccgcatgcattaaaaattgtttaaataccgcgtcatgcggtgtggtactcggtgcatccatcttccctgtcttccgtgtggctttgcgtgaaggcagtatccagtcaaggcgcgctatcgtcagccacctctttattgtttaccgagcagcgttcagagaaatatcaattcgttacaggcgatacatggcacgcttcggcgcggtacgcaaactgctgacgcaaatgccgtcagatgagtagacactaaacaaaaatcgggcaatactgcgtgagaatttcctcaaagcaggcatcgcctgcttcgttaacgacagggtagaaaggtagaagtttgtaggctggagctgcttcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaacttcatttaaatggcgcgccttacgccccgccctgccactcatcgcagtactgttgtattcattaagcatctgccgacatggaagccatcacaaacggcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttgcccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactggtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacgtaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgacaactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtaggcgcgccgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaaggaggatattcatatttgttatccctgcggctggttactcaccagccgcgacatcgtctccagcgaatccgttcttaagatataaagtcgttttagtaacaacggattatcccccggttttactttgcctttcatggttgtcaccgccaggtgaaatccggcatcgtttgctgccttcacggcgttgtcattaaatccgccaaacggatacgaaagataccagacatgcggattaaattgcgccagagcgcggcgtgaacgtgcaaaatcaaacagaatattgtgctcactacggctcagtaatatgggtcggcgataaccatctacccgatgcaaaaaatgggtatgtgactggaaatcaaatacatcgcgaatttcgttaagctcagaaacgctcataaattgcagcgattttgggttccacttctgcgggtgacgtttgatgcgtgaggtaacaataaacgccgtcgccttcatgccatattgtttcaacacaggatacgcatagcggctcapcr扩增后的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图3所示。电泳结果在预期位置上出现了单一的特异性条带，大小为2012bp。用乙醇沉淀对其进行纯化回收备用(>1μg/μl)。pcr的具体条件为：easytaqdnapolymerasebuffer5μldntps4μl引物f1μl引物r1μl模板1μleasytaqdnapolymerase1μlddh2o37μltotal50μl反应程序为：95℃5min；95℃1min，55℃30s，72℃2min，30循环；72℃延伸10min；15℃保存。乙醇沉淀pcr产物的具体步骤：(1)按比例加入试剂：pcr产物100μl无水乙醇385μlnacl(3m)54μl(2)混匀后-20℃放置2h以上或过夜；(3)将混合物4℃8000r/min离心30min，弃上清；(4)300μl70％乙醇加入沉淀中，4℃8000r/min离心5min，弃上清；(5)沉淀于37℃或50～60℃烘箱中烘至乙醇完全挥发(≧30min)；(6)加5～10μlddh2o溶解dna，若不溶，37℃水浴加热几分钟；(7)用nd5000检测dna浓度，取0.5μl加4.5μlddh2o中稀释10倍后测浓度。4、大肠杆菌bl21pcas9感受态制备挑取步骤1制备的大肠杆菌bl21pcas单菌落接种于5mllb液体试管中，30℃，200r/min培养至od600＝0.6，低温(4℃)离心，获得的菌体分别经溶液a和溶液b(购自takara感受态细胞制备试剂盒)洗涤后，重悬于溶液b，即获得大肠杆菌bl21pcas9化学转化感受态细胞。5、转化：将1μg步骤2制备ptargetf-pand质粒(seqidno.4)和4μg步骤3制备的携带pand上下游同源序列和氯霉素抗性基因的dna片段(seqidno.7)与50μl大肠杆菌bl21pcas9感受态细胞混匀，冰浴30min，将混合物42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入950μl、30℃预热的lb培养基中，混匀后30℃，200r/min培养1h。注：ptargetf-pand质粒与携带长同源臂和抗性基因的pcr产物质量比为1:1～1:10，优选1:4。6、将步骤5菌液离心弃上清800μl后，剩余部分混匀，取50μl菌液涂布于含有25μg/ml氯霉素的lb琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子，划线到含25μg/ml氯霉素的lb琼脂培养基上复筛，获得大肠杆菌bl21△pand。7、用鉴定引物f(seqidno.5)和r(seqidno.6)进行菌落pcr验证转化子，结果如图4。鉴定引物在靶标基因外侧，鉴定引物靶定的序列在野生株中长度为1381bp(泳道1～2)，在敲除株中因氯霉素抗性基因替换原靶标基因导致其序列长度为2012bp(泳道3～8)，实验结果与预期相符，表明该方法能够成功获得大肠杆菌bl21△pand缺陷株。所有经检测的转化子(6/6)中靶标基因均被氯霉素抗性基因替换，因此采用本方法敲除大肠杆菌的阳性率可达100％。8、检测大肠杆菌bl21△pand在基本盐培养基中的生长状况，结果如图5。图中野生菌(大肠杆菌bl21)在基本盐培养基中生长正常，而大肠杆菌bl21△pand基本不长，与文献报道结果一致(源自changshuiliuetal.，metabolicengineering，2016，34:104-111)。基本盐培养基成分：三水合磷酸氢二钾14g/l、磷酸二氢钾5.2g/l、氯化铵1g/l、硫酸镁0.5g/l、酵母膏0.2g/l、葡萄糖20g/l、氯化钠1g/l、溶剂为去离子水，ph值自然。培养条件：挑大肠杆菌bl21△pand单菌落到5mllb液体培养基，37℃培养过夜后离心，沉淀用基本盐培养基洗三次，弃上清，加入500μl的基本盐培养基混匀后加入到50ml基本盐摇瓶培养并监测菌株的生长曲线。同样条件下以大肠杆菌bl21为对照测试生长曲线。以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>浙江工业大学<120>一种由化学转化介导的基于crispr/cas9系统敲除大肠杆菌基因的方法<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>60<212>dna<213>未知(unknown)<400>1gtcctaggtataatactagtgatatctggaatgtcaccaagttttagagctagaaatagc60<210>2<211>24<212>dna<213>未知(unknown)<400>2actagtattatacctaggactgag24<210>3<211>25<212>dna<213>未知(unknown)<400>3gtcttaccgggttggactcaagacg25<210>4<211>2118<212>dna<213>未知(unknown)<400>4tcgagttcatgtgcagctccataagcaaaaggggatgataagtttatcaccaccgactat60ttgcaacagtgccgttgatcgtgctatgatcgactgatgtcatcagcggtggagtgcaat120gtcatgagggaagcggtgatcgccgaagtatcgactcaactatcagaggtagttggcgtc180atcgagcgccatctcgaaccgacgttgctggccgtacatttgtacggctccgcagtggat240ggcggcctgaagccacacagtgatattgatttgctggttacggtgaccgtaaggcttgat300gaaacaacgcggcgagctttgatcaacgaccttttggaaacttcggcttcccctggagag360agcgagattctccgcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtgg420cgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgca480ggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatcttgctgacaaaagcaaga540gaacatagcgttgccttggtaggtccagcggcggaggaactctttgatccggttcctgaa600caggatctatttgaggcgctaaatgaaaccttaacgctatggaactcgccgcccgactgg660gctggcgatgagcgaaatgtagtgcttacgttgtcccgcatttggtacagcgcagtaacc720ggcaaaatcgcgccgaaggatgtcgctgccgactgggcaatggagcgcctgccggcccag780tatcagcccgtcatacttgaagctagacaggcttatcttggacaagaagaagatcgcttg840gcctcgcgcgcagatcagttggaagaatttgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaag900gtagtcggcaaataagatgccgctcgccagtcgattggctgagctcatgaagttcctatt960ccgaagttccgcgaacgcgtaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgac1020caaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaa1080aggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaacc1140accgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggt1200aactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttagg1260ccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttacc1320agtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagtt1380accggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttgga1440gcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgct1500tcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcg1560cacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgcca1620cctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaa1680cgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgtt1740ctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctga1800taccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga1860gcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatgctg1920gatccttgacagctagctcagtcctaggtataatactagtgatatctggaatgtcaccaa1980gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagt2040ggcaccgagtcggtgctttttttgaattctctagagtcgacctgcagaagcttagatcta2100ttaccctgttatccctac2118<210>5<211>19<212>dna<213>未知(unknown)<400>5agataaccgggattgccct19<210>6<211>19<212>dna<213>未知(unknown)<400>6tgagccgctatgcgtatcc19<210>7<211>2012<212>dna<213>未知(unknown)<400>7agataaccgggattgccctgcatttgcacggaatagagcacgtccgtgctgtgtcctttc60aggctctcttcaatgaaactccccgactctaaatgaagcgtgttgaggtcacaaagttcg120cgtaattccactggcaaatgtatctccagaaagtcgcgagccgtctccgcatgcattaaa180aattgtttaaataccgcgtcatgcggtgtggtactcggtgcatccatcttccctgtcttc240cgtgtggctttgcgtgaaggcagtatccagtcaaggcgcgctatcgtcagccacctcttt300attgtttaccgagcagcgttcagagaaatatcaattcgttacaggcgatacatggcacgc360ttcggcgcggtacgcaaactgctgacgcaaatgccgtcagatgagtagacactaaacaaa420aatcgggcaatactgcgtgagaatttcctcaaagcaggcatcgcctgcttcgttaacgac480agggtagaaaggtagaagtttgtaggctggagctgcttcgaagttcctatactttctaga540gaataggaacttcggaataggaacttcatttaaatggcgcgccttacgccccgccctgcc600actcatcgcagtactgttgtattcattaagcatctgccgacatggaagccatcacaaacg660gcatgatgaacctgaatcgccagcggcatcagcaccttgtcgccttgcgtataatatttg720cccatggtgaaaacgggggcgaagaagttgtccatattggccacgtttaaatcaaaactg780gtgaaactcacccagggattggctgagacgaaaaacatattctcaataaaccctttaggg840aaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgc900cggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaa960acggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccata1020cgtaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaac1080ttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctgg1140ttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgg1200gatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcct1260gaaaatctcgacaactcaaaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaag1320ttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttc1380ccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggt1440aggcgcgccgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaataggaactaagga1500ggatattcatatttgttatccctgcggctggttactcaccagccgcgacatcgtctccag1560cgaatccgttcttaagatataaagtcgttttagtaacaacggattatcccccggttttac1620tttgcctttcatggttgtcaccgccaggtgaaatccggcatcgtttgctgccttcacggc1680gttgtcattaaatccgccaaacggatacgaaagataccagacatgcggattaaattgcgc1740cagagcgcggcgtgaacgtgcaaaatcaaacagaatattgtgctcactacggctcagtaa1800tatgggtcggcgataaccatctacccgatgcaaaaaatgggtatgtgactggaaatcaaa1860tacatcgcgaatttcgttaagctcagaaacgctcataaattgcagcgattttgggttcca1920cttctgcgggtgacgtttgatgcgtgaggtaacaataaacgccgtcgccttcatgccata1980ttgtttcaacacaggatacgcatagcggctca2012当前第1页12