用于内源性过表达lncRNA‑XIST的gRNA靶点序列及其应用的制作方法

本发明具体涉及一种用于内源性过表达lncrna-xist的grna靶点序列、crispr/dcas9慢病毒系统及其应用。
背景技术：
：胎儿生长受限(fetalgrowthrestriction,fgr)是产科的严重并发症，其发生率为5-10％，是导致围生儿死亡的主要原因之一，可导致围生儿患病率增高4-6倍。fgr不但影响胎儿的生长发育，还会导致青少年期的体格和智力发育受损，甚至可发生脑性瘫痪，成年后心血管、神经系统和代偿性疾病患病率升高。因此，需要深入研究fgr发生的分子机制，以便为胎儿生长受限早期干预和早期防治提供理论依据和潜在干预靶标。很多因素可造成胎儿生长受限，包括母体、胎儿、胎盘和环境因素，因此发病机制的研究一直是产科领域的研究热点。虽然很多研究者长期致力于fgr发病机制的研究，提出胎盘发育异常，母体感染，遗传因素等导致胎儿生长受限，但是引起fgr确切机制尚不清楚。近年来研究发现胎盘滋养细胞迁移和增殖障碍，影响胎盘的大小、形态和营养转动能力，进而影响胎儿生长的营养供应，导致胎盘物质转运能力减弱，交换表面积减少，胎儿营养供应减少，最终引起fgr的发生。目前有研究提示胎盘滋养细胞迁移和增殖障碍受到一些表观遗传调控和非编码rna(ncrna)调控因子的调控。非编码rna(ncrna)是指不编码蛋白质但在生物体生命活动中具有功能的rna分子，根据其长度分为小于200nt的短链非编码rna和大于200nt的长链非编码rna(lncrna)。短链非编码rna包括微小核糖核酸(mirna)和小干扰rna等，mirna是一类大小约18-25个核苷酸的非编码rna，通过与靶mrna3’非翻译区(utr)的碱基配对来调控基因的表达，导致靶mrna的降解或者翻译抑制影响蛋白表达，参与多种生理和病理过程。目前国内外研究表明非编码rna(ncrna)在基因调控因子介导细胞的增殖、迁移、分化、周期、凋亡等生物过程，对正常生长发育、生理功能以及多种肿瘤、先天性和神经系统等疾病的发生发展中起关键作用。近年研究表明，mirnas在胎盘的正常发育中发挥重要的调节，异常表达与胎盘疾病相关，如巨大儿、子痫前期、胎儿生长受限、早产等。本案发明人在前期研究中发现mir-424和mir141在胎儿生长受限的胎盘组织中高表达，并且其靶基因的fgfr1、mek1、plag1mrna和蛋白表达水平下降。但是否还有其它非编码基因影响胎盘发育及功能发挥，继而导致胎儿生长受限的发生仍不清楚。外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，一类是稳定表达(永久表达)。前者外源dna/rna不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天。后者外源dna整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。建立稳定细胞株，一般是根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的抗性标记基因有潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)和嘌呤霉素(puromycin)，常用hygromycinb、g418和puromycin进行选择性筛选。传统的稳定株筛选方法需要通过外源基因的瞬时转染后对靶细胞进行筛选，最终获得从单一细胞扩增起来的稳定细胞株，该方法阳性率低，周期长，工作量大。再者，xist这个lncrna基因比较大，长度为19296bp，不能用普通方式实现细胞株的稳定过表达。因此，急需一种新型的过表达lncrna-xist的grna靶点序列。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种用于内源性过表达lncrna-xist的grna靶点序列、crispr/dcas9慢病毒系统及其应用，以克服现有技术中的不足。为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：本发明实施例提供了一种用于内源性过表达lncrna-xist的grna靶点序列，其分别如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3所示。本发明实施例还提供了一种用于内源性过表达lncrna-xist的crispr/dcas9慢病毒系统，其包含前述的用于内源性过表达lncrna-xist的grna靶点序列。本发明实施例还提供了前述的用于内源性过表达lncrna-xist的crispr/dcas9慢病毒系统的构建方法包括：dcas9慢病毒表达载体在野生型cas9蛋白的基础上,d10a,h840a位点突变.带有puromycin抗性,dcas9与puromycin共用一个cmv启动子,并有p2a序列分隔；grna过表达慢病毒载体由hu6启动子启动靶向lncrna-xist启动子区的grna序列，grna序列3’端融合两个ms2序列，同时该载体由cmv启动子启动mcp-vp64融合蛋白以及blasticidin抗性，二者由ires序列分隔；mcp为能特异性结合ms2序列的rna结合蛋白，vp64为转录激活因子这两个慢病毒载体共同感染目的细胞，可以在puromycin和blasticidin药物作用下获得稳定细胞株；同时在grna和dcas9组成的复合体作用下定位到lncrna-xist启动子区，并通过grna携带的ms2序列将mcp-vp64序列募集到lncrna-xist启动子区，从而上调细胞内源的lncrna-xist的表达，实现lncrna-xist的内源过表达。前述的用于内源性过表达lncrna-xist的crispr/dcas9慢病毒系统的构建方法的原理可以参阅图11。本发明实施例还提供了前述的用于内源性过表达lncrna-xist的crispr/dcas9慢病毒系统在制备稳定内源性过表达lncrna-xist的稳定细胞株中的应用。本发明实施例还提供了一种稳定内源性过表达lncrna-xist的稳定细胞株，它是将前述的用于内源性过表达lncrna-xist的crispr/dcas9慢病毒系统转染目的细胞株得到的。在一些实施方案中，所述稳定细胞株包括人滋养细胞稳定细胞株，尤其优选为htr-8稳定细胞株。在一些实施方案中，所述稳定内源性过表达lncrna-xist的稳定细胞株的构建及筛选方法包括：将前述的用于内源性过表达lncrna-xist的crispr/dcas9慢病毒系统通过包装细胞进行包装，得到慢病毒颗粒；将慢病毒颗粒感染目的细胞株，得到稳定内源性过表达lncrna-xist的稳定细胞株。进一步的，所述构建及筛选方法还包括：将慢病毒颗粒感染目的细胞株后，再采用药物筛选的方式，得到稳定内源性过表达lncrna-xist的稳定细胞株，尤其是htr-8稳定细胞株。进一步的，所述构建及筛选方法还包括：对于筛选的过表达稳定株，抽提细胞总rna，qpcr实验检测lncrna-xist基因转录水平，从而对筛选的过表达稳定株进行验证。本发明实施例还提供了稳定内源性过表达xist的稳定细胞株的构建及筛选方法，其包括：将前述的用于内源性过表达lncrna-xist的crispr/dcas9慢病毒系统通过包装细胞进行包装，得到慢病毒颗粒；将慢病毒颗粒感染目的细胞株，得到稳定内源性过表达lncrna-xist的稳定细胞株。进一步的，所述构建及筛选方法还包括：将慢病毒颗粒感染目的细胞株后，再采用药物筛选的方式，得到稳定内源性过表达lncrna-xist的htr-8稳定细胞株。进一步的，所述构建及筛选方法还包括：对于筛选的过表达稳定株，抽提细胞总rna，qpcr实验检测lncrna-xist基因转录水平，从而对筛选的过表达稳定株进行验证。与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：本发明提供了用于内源性过表达lncrna-xist的grna靶点序列以及crispr/dcas9慢病毒系统，利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株，筛选得到的细胞或者可稳定表达目的基因，从而得到稳定沉默lncrna-xist下游特定基因的细胞株，对于lncrna-xist在滋养细胞迁移中的功能和在增殖障碍、胎儿生长受限发生中的作用的研究具有重要指导意义。附图说明图1是慢病毒感染htr-8细胞72小时后的照片。图2是慢病毒感染htr-8细胞，筛选14天后稳定株的照片。图3a-图3b分别是htr-8+h6133+y4820act、htr-8+h6133+y4820gene溶解曲线。图4a-图4b分别是htr-8+h6133+y5063act、htr-8+h6133+y5063gene溶解曲线。图5a-图5b分别是htr-8+h6133+y5064act、htr-8+h6133+y5064gene溶解曲线。图6a-图6b分别是htr-8+h6133+y5065act、htr-8+h6133+y5065gene溶解曲线。图7a、图7b分别是htr-8+h6133+y5063+y5064+y5065act、htr-8+h6133+y5063+y5064+y5065gene溶解曲线。图8a-图8b分别是htr-8act、htr-8gene溶解曲线。图9a-图9b是与对照htr-8+y4820细胞组相比，htr-8+y5063细胞组中lncrna-xist基因的表达量为1011.59％、523.63％。图10是与对照htr-8+h6133+y4820细胞组相比，htr-8+h6133+y5063、htr-8+h6133+y5064、htr-8+h6133+y5065、htr-8+h6133+y5063+y5064+y5065细胞组中lncrna-xist基因的表达量分别为498.01％、169.76％、110.51％、322.11％。图11是lncrna-xist的内源过表达的实现原理示意图。具体实施方式如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。lncrna-xist在滋养细胞迁移中的功能和在胎儿生长受限发生中的作用目前未见研究报道。本发明通过慢病毒过表达和沉默表达技术探讨其在滋养细胞迁移、增殖障碍中的作用，是本发明的鲜明特色,国内外未见报道。慢病毒是一种rna病毒，携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为dna，再整合到宿主细胞基因组以后才能表达。利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白，用于蛋白的扩增和富集；或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1lncrna-xist内源性过表达(crispra)grna载体构建及慢病毒包装1.设计靶向人lncrna-xist转录起始位点附近的grna，构建3个表达grna的慢病毒载体。目的基因：xist[human]:nr_001564[full:19296bp]grna靶点：编号grna靶点靶点序列1靶点1:a1aaccaaatcacaaagatgtccgg2靶点2:a4ggttcaaaatttacccagtaagg3靶点3:a5tggcctagaagattgaaagccgg其中，实验组载体选择y5063、y5064、y5065质粒，对照载体选择y4820质粒。关于y5063-y5065质粒的说明如下：克隆流水号：y5063、y5064、y5065基因名称：xistgenbankid：nr_001564质粒大小：8.6kb物种：human，上下游克隆酶切位点bsmbi/bsmbi载体名称：plenti-u6-grna-2x(wt+f6)ms2-cmv-mcp-vp64-ires-blasticidin原核amp抗性编码区元件xist正向测序引物hu6-f2tacgatacaaggctgttagagag反向测序引物py-seqrctattaataactaatgcatggc其中，载体的构建方法可以参照“cpisprtechnologyforgenomeactivationandrepressioninmammallancells”,coldspringharbprotoc,2016(1),jan4.利用实验组质粒和对照组质粒构建的载体分别命名为目的crispragrna质粒(如下简称目的grna质粒)和对照质粒。以y4820为例,dspcas9nc构建nc:gcactaccagagctaactcadspcas9nc-f:caccgcactaccagagctaactcadspcas9nc-r:aaactgagttagctctggtagtgchu6-f2tacgatacaaggctgttagagagef1-rcgccaccttctctaggcach7497-cjggtgttgctctcaatgatttc构建方法为：1.dspcas9nc-f和dspcas9nc-r用退火buffer溶解成20μm的浓度，于95℃水浴锅中孵育5min，再开水浴锅盖子慢慢自然冷却至室温(预计要3个小时，一般安排在晚上下班前退火，第二天做连接，转化)。2.用bsmbi酶切plenti-u6-grna-2x(wt+f6)ms2-cmv-mcp-vp64-ires-blasticidin(nebuffer3，55℃中酶切8h，为了防止水分蒸发，每过一个小时要重新离心下)，得到1885bp和13.0kb的片段，回收13.0kb的载体v。3.片段a+v连接得到目的质粒(amp抗性)。阳性鉴定用hu6-f2,h7497-cj和ef1-r进行菌落pcr，阳性转化子得到451bp的片断，对照1使用水，对照2使用h7497得到1011bp的片断。阳性测序先用hu6-f22、lncrna-xistcrispragrna及dcas9质粒抽提抽提3个目的crispragrna质粒、1个对照质粒和dcas9质粒h6133。编号质粒名称1h6133:plenti-cmv-dcas9-p2a-puro2y4820:plenti-u6-nc-2xms2-cmv-mcp-vp64-ires-blasticidin3y5063:plenti-u6-靶点1-2xms2-cmv-mcp-vp64-ires-blasticidin4y5064:plenti-u6-靶点2-2xms2-cmv-mcp-vp64-ires-blasticidin5y5065:plenti-u6-靶点3-2xms2-cmv-mcp-vp64-ires-blasticidin3、lncrna-xistcrispragrna及dcas9慢病毒包装及滴度测定将3个目的grna质粒、1个对照质粒和dcas9质粒分别包装慢病毒，并测定滴度。所获的慢病毒分别命名为目的grna病毒(简称grna1、grna2、grna3病毒)、y4820病毒(对照病毒)和h6133病毒(dcas9病毒)关于包装的过程，可以参照kutnerrh1,zhangxy,reiserj.production,concentrationandtitrationofpseudotypedhiv-1-basedlentiviralvectors.natprotoc.2009；4(4):495-505.实施例2：1、人滋养细胞(htr-8/svneo)培养人滋养细胞的培养方法可以参照grahamch，hawleyts，hawleyrg，macdougalljr，kerbelrs，khoon，lalapk.establishmentandcharacterizationoffirsttrimesterhumantrophoblastcellswithextendedlifespan.expcellres1993；206:204-211.完全培养基：dmem高糖培养基90％；胎牛血清10％。培养条件：37.0℃carbondioxide(co2),5％细胞生长：贴壁生长细胞形态：上皮样；多角形细胞传代：1:2-1:4传代；每周2-3次2、moi预实验(细胞感染预实验)慢病毒感染目的细胞：人滋养细胞(htr-8/svneo)，测定最佳感染复数(moi值)。3、lncrna-xistcrispragrna筛靶将3个目的grna病毒、1个对照病毒分别与dcas9病毒共感染htr-8/svneo细胞。实验分组：细胞感染48h后，抽提细胞总rna，qpcr实验检测lncrna-xist基因转录水平，筛选转录激活效果最好的grna(或grna组合)。实施例3：lncrna-xist内源性过表达稳定株及对照稳定株筛选将转录激活效果最好的grna病毒(或grna组合病毒)与dcas9病毒h6133共感染htr-8/svneo细胞，筛选lncrna-xist内源性过表达稳定株；将grna对照病毒与dcas9病毒h6133共感染htr-8/svneo细胞，筛选对照稳定株。需要用puro抗性筛选和sfgfp荧光流式分选。实验分组：编号稳定株1对照稳定株2lnc-xist内源性过表达稳定株具体筛选过程如下：选择使用慢病毒对照病毒和目的病毒与dcas9病毒混合感染htr-8细胞。在感染细胞72小时后(如图1所示)，通过加入并维持2ug/ml的puromycin和10ug/mlblasticidin杀死未被有效感染的细胞。从而在puromycin和blasticidin药物的维持下最终获得稳定过表达的稳定株。其中应用的细胞株和慢病毒为：目的对照病毒(y4820)；目的慢病毒(y5063)(和元构建)(y5064、y5065细胞组的构建过程可参照y5063)；dcas9病毒(h6133)(和元构建)；htr-8细胞，培养基：rpmi-1640+10％fbs+1％p/s，37℃，5％co2培养。其中应用的主要试剂耗材为：polybrene(sigma:h9268)；puromycin(sigma:p8833)；24孔板(corning:3524)；6孔板(corning:3516)；60mmdish(corning:430166)；100mmdishcorning:430167)。其中应用的主要仪器设备为：荧光显微镜(ix71，奥林帕斯)；co2培养箱(311，thermo)；生物安全柜(bsc-ⅱ-a2，上海净化)。相关的实验步骤如下：i.细胞铺板：将htr-8细胞按30％汇合度接种到6孔板1)htr-8细胞配成2.0×105cells/ml细胞悬液，待铺板。2)每孔铺2ml，即4×105cells/well，铺1个6孔板。ii.感染慢病毒：12～20小时后感染病毒加病毒计算方法：(细胞数×moi值/病毒原液滴度)×103＝病毒加药量(μl)浓度及加药量，见下表：加polybrene：每孔加10μl1mg/mlpolybrene，最终在细胞样品中polybrene终浓度为5μg/ml；感染12-20小时后换培养基：弃去培养基，每孔加入5ml新鲜的培养基。iii.稳定株筛选1)72h以后，加入终浓度2ug/mlpuromycin和终浓度10μg/mlblasticidin。每隔2-3天换一次终浓度2ug/mlpuromycin和终浓度10μg/mlblasticidin的新鲜培养基。2)药物筛选约两周后，拍荧光照片如图2所示。3)稳定细胞株冻存。由于载体没有荧光，无法从荧光图片观察结果，需进一步qpcr验证稳定株构建是否成功。实施例4：qpcr验证筛选的过表达稳定株，抽提细胞总rna，qpcr实验检测xist基因转录水平，对筛选的过表达稳定株进行验证。其中，y5063-1-hu6-f2的基因序列如下所示：nnnncnntatttgactgtaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggaaccaaatcacaaagatgtcgtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcgggagcacatgaggatcacccatgtgcgactcccacagtcactggggagtcttccctttttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctgggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgttaacggcgcgcgcacatggctcaaactttactcagnngtgctcgtggacatggtgggacagggatgtgacagtgctcnntatttcgctaatggggtgnagagtgatcagctccactcnnnanccannnacaaggtgacatgcagcgtcaggcagtctanntgnncnannnnaaagtannnnny5063-fccggaaccaaatcacaaagatgtcy5064-1-hu6-f2的基因序列如下所示：nnnngnatanttgactgtaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggttcaaaatttacccagtagtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcgggagcacatgaggatcacccatgtgcgactcccacagtcactggggagtcttccctttttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgttaacggcgcgccgccaccatggcttcaaactttactcagttcgtgctcgtggacaatggtgggacaggggatgtgacagtggctcttctaatttcgctaatggggtgnngagtgatcagctcantcacggannngnnntannnggtganatgcagcgtcaggcagtcttatgtgccnnnny5064-fccgggttcaaaatttacccagtay5065-1-hu6-f2的基因序列如下所示：nnngncatacttgactgtaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggtggcctagaagattgaaagcgtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcgggagcacatgaggatcacccatgtgcgactcccacagtcactggggagtcttccctttttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgttaacggcgcgccgccaccatggcttcaaactttactcagttcgtgctcgtggacatgnnggacaggggatgtgacagtggctccttctaatttcgctaatggggtggcagaagtggatcagcttccaactccncgggagccagggcctacaay5065-fccggtggcctagaagattgaaagc具体包括如下步骤：1.操作步骤1.1总rna抽提说明：根据invitrogen公司的trizol操作说明书进行，均为rnase-free操作。a)离心去细胞上清，每孔加入1000μltrizol，吹打，室温静置5min，后转移至另一新的1.5ml离心管中。b)每管加入200μl氯仿，用力震荡15s，室温静置15min。c)4℃，12000rpm，离心15min。d)从每管中吸取上清至另一新的1.5ml离心管。加入等体积异丙醇，混匀后4℃沉淀10min。e)4℃，12000rpm离心10min后，去上清。f)加入至少1ml4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。g)4℃，10000rpm离心5min，弃上清。h)4℃，10000rpm再次离心5min，吸去残液，室温干燥(不需完全干燥)。i)加入30～40μlrnase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提rna的浓度。1.2rna逆转录获cdnam-mlv逆转录酶和dntp购自takara公司。oligodt购自上海生工。rnase-free的物品都购自axygen。说明：根据takara公司的m-mlv操作说明书进行，均为rnase－free操作。protocol:a)将1μloligodt(100μm)和2.0μgtotalrna加入到pcr小管中，补充depc-h2o至10μl。混匀后离心，70℃水浴10min。之后立即插入到0℃冰水浴中，使oligodt和模板退火。b)按下表的比例，根据反应管数算出所需的试剂量。将m-mlv酶等在冰上混匀，得到rt反应液。c)在每个反应管中加入的10μl的rt反应液，混匀后离心。d)rt反应在42℃进行1h后完成，之后用70℃处理10min使rt酶失活。e)得到的rt反应产物——cdna，加入80μldepch2o5倍稀释，立即用于pcr或者保存在-80℃以后使用。1.3real-timepcr检测目的基因(lncrna-xist)引物序列为：hq2385-1ctaggtcaggaggttctgtcaahq2385-2tctctgcactgcttgtaggaa内参引物序列为：hmractb-fttctacaatgagctgcgtghmractb-rctcaaacatgatctgggtca)设定程序为两步法real-time定量。其中，每步的参数设置分别为：预变性95℃，30s，之后每一步变性95℃，5s，退火延伸60℃，34s，共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。b)制作熔解曲线。pcr结束后，在95℃变性1min。然后冷却至55℃保持1min，使dna双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，共进行81个循环，同时读取吸光值。请参阅图9a所示为质粒转染后检测结果，与对照htr-8+y4820细胞组相比，htr-8+y5063细胞组中lncrna-xist基因的表达量为1011.59％。请参阅图9b所示为慢病毒感染稳定株后的结果，与对照htr-8+y4820细胞组相比，htr-8+y5063细胞组中lncrna-xist基因的表达量为523.63％。实施例5qpcr筛选lncrna-xist有效激活grna筛选实验1.操作步骤1.1总rna抽提说明：根据invitrogen公司的trizol操作说明书进行，均为rnase-free操作。a)离心去细胞上清，每孔加入1000μltrizol，吹打，室温静置5min，后转移至另一新的1.5ml离心管中。b)每管加入200μl氯仿，用力震荡15s，室温静置15min。c)4℃，12000rpm，离心15min。d)从每管中吸取上清至另一新的1.5ml离心管。加入等体积异丙醇，混匀后4℃沉淀10min。e)4℃，12000rpm离心10min后，去上清。f)加入至少1ml4℃预冷的75％乙醇，洗涤沉淀及离心管壁。g)4℃，10000rpm离心5min，弃上清。h)4℃，10000rpm再次离心5min，吸去残液，室温干燥(不需完全干燥)。i)加入30～40μlrnase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提rna的浓度。1.2rna逆转录获cdnam-mlv逆转录酶和dntp购自takara公司。oligodt购自上海生工。rnase-free的物品都购自axygen。说明：根据takara公司的m-mlv操作说明书进行，均为rnase－free操作。protocol:a)将1μloligodt(100μm)和2.0μgtotalrna加入到pcr小管中，补充depc-h2o至10μl。混匀后离心，70℃水浴10min。之后立即插入到0℃冰水浴中，使oligodt和模板退火。b)按下表的比例，根据反应管数算出所需的试剂量。将m-mlv酶等在冰上混匀，得到rt反应液。c)在每个反应管中加入的10μl的rt反应液，混匀后离心。d)rt反应在42℃进行1h后完成，之后用70℃处理10min使rt酶失活。e)得到的rt反应产物——cdna，加入80μldepch2o5倍稀释，立即用于pcr或者保存在-80℃以后使用。1.3real-timepcr检测目的基因(lncrna-xist)引物序列：hq2385-1ctaggtcaggaggttctgtcaahq2385-2tctctgcactgcttgtaggaa内参引物序列：hmractb-fttctacaatgagctgcgtghmractb-rctcaaacatgatctgggtca)设定程序为两步法real-time定量。预变性95℃，30s，之后每一步变性95℃，5s，退火延伸60℃，34s，共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。b)制作熔解曲线。pcr结束后，在95℃变性1min。然后冷却至55℃保持1min，使dna双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，共进行81个循环，同时读取吸光值。其中，htr-8+h6133+y5063、htr-8+h6133+y5064、htr-8+h6133+y5065、htr-8+h6133+y5063+y5064+y506各细胞组的获取过程可参照htr-8+h6133+y4820细胞组。其中，图3a、图3b分别示出了htr-8+h6133+y4820act、htr-8+h6133+y4820gene溶解曲线，图4a、图4b分别示出了htr-8+h6133+y5063act、htr-8+h6133+y5063gene溶解曲线，图5a、图5b分别示出了htr-8+h6133+y5064act、htr-8+h6133+y5064gene溶解曲线，图6a、图6b分别示出了htr-8+h6133+y5065act、htr-8+h6133+y5065gene溶解曲线，图7a、图7b分别示出了htr-8+h6133+y5063+y5064+y5065act、htr-8+h6133+y5063+y5064+y5065gene溶解曲线，图8a、图8b分别示出了htr-8act、htr-8gene溶解曲线。再请参阅图10所示，与对照htr-8+h6133+y4820细胞组相比，htr-8+h6133+y5063、htr-8+h6133+y5064、htr-8+h6133+y5065、htr-8+h6133+y5063+y5064+y5065细胞组中lncrna-xist基因的表达量分别为498.01％、169.76％、110.51％、322.11％，具体的，各组定量数值及分析见表1。藉由上述技术方案，本发明提供了用于内源性过表达lncrna-xist的grna靶点序列以及crispr/dcas9慢病毒系统，利用慢病毒必须整合到宿主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端，可以在短时间内获得高效率的稳定细胞株，筛选得到的细胞或者可稳定表达目的基因，从而得到稳定沉默lncrna-xist下游特定基因的细胞株，对于lncrna-xist在滋养细胞迁移中的功能和在增殖障碍、胎儿生长受限发生中的作用的研究具有重要指导意义。最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。本领域技术人员应当理解，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。<110>黄璐<120>用于内源性过表达lncrna-xist的grna靶点序列及其应用<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>rna<213>人工序列<400>1aaccaaatcacaaagatgtccgg23<210>2<211>23<212>rna<213>人工序列<400>2ggttcaaaatttacccagtaagg23<210>3<211>23<212>rna<213>人工序列<400>3tggcctagaagattgaaagccgg23<210>4<211>1187<212>rna<213>人工序列<400>4nnnncnntatttgactgtaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggaaccaaatcacaaagatgtcgtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcgggagcacatgaggatcacccatgtgcgactcccacagtcactggggagtcttccctttttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctgggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgttaacggcgcgcgcacatggctcaaactttactcagnngtgctcgtggacatggtgggacagggatgtgacagtgctcnntatttcgctaatggggtgnagagtgatcagctccactcnnnanccannnacaaggtgacatgcagcgtcaggcagtctanntgnncnannnnaaagtannnnn1187<210>5<211>1183<212>rna<213>人工序列<400>5nnnngnatanttgactgtaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggttcaaaatttacccagtagtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcgggagcacatgaggatcacccatgtgcgactcccacagtcactggggagtcttccctttttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgttaacggcgcgccgccaccatggcttcaaactttactcagttcgtgctcgtggacaatggtgggacaggggatgtgacagtggctcttctaatttcgctaatggggtgnngagtgatcagctcantcacggannngnnntannnggtganatgcagcgtcaggcagtcttatgtgccnnnn1183<210>6<211>1156<212>rna<213>人工序列<400>6nnngncatacttgactgtaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggtggcctagaagattgaaagcgtttcagagctatgctggaaacagcatagcaagttgaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcgggagcacatgaggatcacccatgtgcgactcccacagtcactggggagtcttccctttttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgttaacggcgcgccgccaccatggcttcaaactttactcagttcgtgctcgtggacatgnnggacaggggatgtgacagtggctccttctaatttcgctaatggggtggcagaagtggatcagcttccaactccncgggagccagggcctacaa1156当前第1页12