一种用于制备可异体移植T细胞的基因编辑系统的制作方法

本发明涉及基因靶向编辑领域，尤其涉及一种利用基因编辑技术制备可异体移植t细胞技术，具体的为一种用于制备可异体移植t细胞的基因编辑系统。
背景技术：
：近年来，利用免疫疗法来治疗肿瘤，受到广泛的关注。在众多的免疫疗法中，基于嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcells，car-t)疗法，效果最为显著和成熟。目前已经有多例临床试验证明，该技术可以治愈多种肿瘤，例如b细胞肿瘤。其基本原理是利用基因工程的方法，将能识特异识别肿瘤细胞的受体基因，利用整合型病毒作为载体，将该受体基因整合到患者t细胞基因组中，从而使改造后的t细胞具有特异性识别和杀伤肿瘤细胞的目的，从而达到治疗肿瘤的效果。另一方面，该技术还存在一些急需解决的障碍，首先，该技术只能针对病人自体t细胞进行编辑，大大提高了其治疗成本及延长治疗周期(利用病人自身t细胞制备car-t细胞，一般耗时长)；第二，由于t细胞表面不仅表达car还有自身的tcr受体表达，研究发现tcr受体会影响car受体的功能，有临床研究表面，可对神经系统造成伤害，形成脑水肿。为解决以上car-t治疗技术的问题，多个研究小组利用基因编辑技术(zfn，talen)针对tcr受体敲除，取得了显著效果。有研究报道，目前利用talen技术敲除tcr受体来制备mcar-t技术(mniversaicar-t)，该技术一方面将tcr受体通过talen定点敲除，另一方面通过同源重组技术将car基因定点整合到tcr基因位点。该技术不仅有效的避免了异体移植导致的移植物抗宿主反应gvhd(ghostversμshostdisease)，使得car-t细胞的制备摆脱个性化的缺陷而进入到标准化和规模化的时代，同时还避免了tcr基因对car受体功能的干扰。此外，由于car基因定点整合到tcr位点上，避免了现行car-t制备中car基因随机整合基因组所导致的潜在癌变风险。目前该技术已经获得了fda的临床试验批文，而且利用该技术成功为两患者进行了治疗。然而由于zfn或者talen技术属于第一，二代基因编辑技术，在应用方面存在很大的局限性，例如构建流程复杂、周期长、成本高等。近几年基因编辑技术突破性的发展，利用现在的编辑手段，可以将目的基因进行精准编辑。尤其是第三代基因编辑技术crispr具有明显的优势，例如构建简单，效率高，成本低等。crispr系统均包含以下几个部分：1)pam位点，位于靶序列的下游，只有几个nt(例如，spcas9/ngg；sacas9/nngrrt)，根据此位点来选取靶序列；2)靶序列(sgrna)，识别并与切割位点结合的序列，一般在20nt左右；3)tracrna，连接于靶序列之后的一段回文rna序列；4)cas9内切酶，具有独立酶活性，cas9含有在氨基末端的rμvc和蛋白质中部的hnh2个独特的活性位点，cas9中的hnh活性位点剪切sgrna的互补dna链，rμvc活性位点剪切非互补链。其工作原理为：sgrna、tracrrna和cas9组成复合体，识别并结合于sgrna互补的序列，然后解开dna双链，形成r-loop，使sgrna与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由cas9中的hnh活性位点剪切sgrna的互补dna链，rμvc活性位点剪切非互补链，最终引入dna双链断裂(dsb)。crispr技术目前已经广泛应用于多个领域，例如动植物育种，疾病治疗，以及基础科研等领域。crispr-sacas9系统，是一种来自金黄色葡萄球菌的cas9酶。其在哺乳动物细胞中的基因编辑效率高，而且其基因比较小(3.1kb)。因此，该系统能够利用多种转染系统转染，例如电转化、腺相关病毒等。另外由于sacas9系统pam序列较长(nngrrt)，且靶点识别序列在21-23nt，导致该系统具有靶向性高、脱靶效率低等优点。鉴于现有car-t技术还有待进一步完善和优化，以及crispr/sacas9技术在基因精准编辑上等高效性和安全性，本发明将二者有机结合，用crispr/sacas9技术敲除人tcr基因，制备可异体移植的通用型t细胞，用以改善和优化car-t制备技术。crispr/cas9介导的定点同源重组必备两个条件：一是crispr/cas9，含有效切割目的基因的grna；二是同源重组供体(图1)，一般含上、下游同源臂，以及在两同源臂之间的需要定点整合的外源dna序列(该外源序列可以含启动子或不含启动子，如不含启动子，则必须插入外显子序列并保持插入后读码框正确)。当宿主的基因组dna被grna识别并引导cas9定点切割，同源重组供体存在下，宿主细胞倾向于通过同源重组的方式修复基因组dna，从而在基因组dna特定位点引入了外源dna序列(图2)。经我们研究发现，同源臂序列的长度，以及外源dna序列的长度，对重组效率都有极大影响。目前我们确定最优的同源臂长度在800bp以内(含800bp)，而外源dna序列长度以5kb以内为佳。采用crispr/cas9介导的定点同源重组技术，在敲除人tcr基因的同时，在tcr基因特定位点(cas9切割位点)，通过同源重组技术插入嵌合抗原受体(car)基因，从而达到tcr敲除和car表达的双重效果。利用该技术可以制备特异性攻击肿瘤组织的通用型t细胞，这种通用型t细胞具有以下几方面的优点：1)敲除了tcr基因，避免了异体移植导致的移植物抗宿主反应，所以利用该技术可以实现t细胞的异体移植，实现car-t的标准化和规模化生产，降低成本并缩短生产周期；2)tcr基因敲除减低tcr对细胞表面car功能的影响，降低临床安全风险；3)car定点插入tcr位点，达到tcr敲除和car表达的双重效果，避免现有技术中心car随机插入带来的癌变风险。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一种能够异体移植的通用型t细胞制备技术，该技术制备的t细胞具备以下优点：第一，能够异体移植，使用于制备car-t的t细胞成为一种储备型生物药品，便于大规模、批量化、标准化生产；第二，提高car受体的功能活性，避免了tcr受体的干扰。同时，利用crispr/cas9介导的tcr基因位点定点同源重组技术，该技术制备的t细胞具备以下优点：第一，tcr基因敲除，可以异体移植，规模化生产；第二，避免tcr受体干扰car受体的功能；第三，tcr基因位点定点插入外源基因，可实现car基因定点整合到tcr基因位点，避免异体移植导致的移植物抗宿主反应。本发明提供一种用于制备可异体移植t细胞的基因编辑系统，该系统包括在crispr/sacas9特异性敲除人tcr基因中用于特异性靶向tcr基因的sgrna，以及5′端和3′端带有tcr基因同源臂的嵌合抗原受体基因。该系统通过六型腺相关病毒(aav6)或慢病毒或杆状病毒为载体转染细胞。本发明的技术方案如下：一种用于制备可异体移植t细胞的基因编辑系统，该系统包括在crispr/cas9特异性敲除人tcr基因中用于特异性靶向tcr基因的sgrna，所述sgrna在tcr基因上的靶序列符合5′-g(21n)nngrrt-3或者5′-arrcnn(21n)c-3′的序列排列规则，所述系统还包括5′端和3′端带有tcr基因同源臂的嵌合抗原受体基因。一种用于制备可异体移植t细胞的基因编辑系统，该系统包括在crispr/cas9特异性敲除人tcr基因中用于特异性靶向tcr基因的sgrna，所述sgrna在tcr基因上的靶序列符合5′-g(21n)nngrrt-3或者5′-arrcnn(21n)c-3′的序列排列规则，所述靶向敲除tcr基因的靶序列以病毒为转染载体，所述系统还包括5′端和3′端带有tcr基因同源臂的嵌合抗原受体基因，其可以通过所述的病毒为载体，使用时与含有tcr基因的靶序列的病毒共同转染细胞。一种用于制备可异体移植t细胞的基因编辑系统，该系统包括在crispr/cas9特异性敲除人tcr基因中用于特异性靶向tcr基因的sgrna，所述sgrna在tcr基因上的靶序列符合5′-g(21n)nngrrt-3或者5′-arrcnn(21n)c-3′的序列排列规则，所述系统还包括5′端和3′端带有tcr基因同源臂的嵌合抗原受体基因，使用时把tcr基因的靶序列、cas9基因、5′端和3′端都带有tcr基因同源臂的嵌合抗原受体基因，三者一起包装到杆状病毒中，以杆状病毒为载体转染细胞。优选的，以所述人tcr基因α链和β链恒定区作为靶标，通过靶向tcr基因α链和β链的sgrna筛选，由此获得了在crispr-cas9特异性敲除人tcr基因中用于特异性靶向tcr基因的sgrna，所述人tcr基因α链和β链恒定区基因号为nc_000014.9；nc_000007.14。优选的，以所述人tcr基因α链和β链恒定区作为靶标，依据sacas9f.annranetal.2015编辑规则筛选出了多个靶序列，其中21n的靶序列如seqidno：1～seqidno：30中任意一条序列。优选的，所述sgrna在tcr基因上的靶序列符合5′-g(20n)ngg-3′或者5′-ccn(20n)c-3′的序列排列规则，并满足seqidno：37～seqidno：62中任意一条序列。优选的，所述靶向敲除tcr基因的靶序列配对组合为seqidno：3和seqidno：4，seqidno：3和seqidno：8，seqidno：4和seqidno：8，seqidno：3和seqidno：13，seqidno：3和seqidno：14，seqidno：3和seqidno：17)以及多个靶序列(≥3)组合形成的crispr/sacas9系统。优选的，所述靶向敲除tcr基因的靶序列以病毒为转染载体，所述病毒转染载体为腺相关病毒、慢病毒、腺病毒、杆状病毒、逆转录病毒中的一种，所述腺相关病毒包括各种血清型腺相关病毒以及其突变型，所述慢病毒包括整合型以及非整合型。优选的，所述靶向敲除tcr基因的靶序列为dna或相对应的rna。优选的，所述tcr基因包含α链和β链，所述基因改造具体方法为在tcr的α链和β链的一种或两种的cds序列或恒定区域的相应编码基因的外显子区，利用crispr/cas9进行定点切割，从而使tcr基因失活，达到t细胞表面无tcr受体的目的，编辑后的t细胞在有异体移植过程中避免移植物抗宿主反应。优选的，所述靶向tcr基因α链和β链的sgrna筛选包括如下步骤：步骤1)构建sgrna的寡核苷酸双链：s1：根据选择的sgrna，通过化学合成法合成寡核苷酸链，格式如下：正义链：5′-g(21n)nngrrt-3′或者5′-arrcnn(21n)c-3′，引物不合pam，反义链：与正义链互补，分别在正义链引物的5′端加上cacc，在反义链引物5′端加上aaac，以形成bbsi酶切位点的粘性末端；其中，21n代表靶序列的21个碱基序列；s2：把正义链引物和反义链引物经过退火，形成带有bbsi酶切位点的粘性末端的双链核苷酸小片段；步骤2)crispr-cas9载体构建；步骤3)细胞系转染；步骤4)突变效率检测。本发明还提供了一种应用，应用于上述所述的用于制备可异体移植t细胞的基因编辑系统，其特征在于，用外周血或脐带血来源的t细胞，通过上述用于制备可异体移植t细胞的基因编辑系统，制备成一种可异体移植的t细胞。附图说明图1a为本发明中同源重组供体(含启动子)的结构图；图1b为本发明中同源重组供体(不含启动子)的结构图；图2为本发明中基因重组示例图；图3为本发明中px601的结构图；图4为本发明中px458的结构图；图5为本发明中同源重组供体质粒pdonor-mcmv-egfp的结构图；图6a\6b\6c\6d\6e为本发明实施例中以dl2000为参照的电泳结果图；图7a\7b\7c为本发明实施例中以dl2000为参照的电泳结果图；图8a\8b为本发明实施例中以dl2000为参照的cr产物的长度的电泳结果图；图9为本发明实施例中t7e1的酶切和电泳结果图；图10为本发明实施例中pdonor-mcmv-egfp-上下游同源臂的结构图；图11为本发明实施例中seqidno：71的结构图。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例中使用到的实验材料包含：商品化的crispr-cas9载体，如px601(参照图3)，px458(参照图4)；hek293t细胞；大肠杆菌感受态细胞top10；同源重组供体质粒pdonor-mcmv-egfp(参照图5)。实施例1grna初步筛选1、针对tcra基因的grna准备(1)根据tcra基因的序列(包括包含α链和β链恒定区)设计的grna序列：crispr/spcas9系统的grna对应的靶序列如下表所示：表1针对tcra基因的crispr/spcas9系统的grna对应的靶序列。crispr/sacas9系统的grna对应的靶序列如下表所示：表2针对tcra基因的crispr/sacas9系统的grna对应的靶序列。(2)分别合成grna对应的靶序列的正义链和反义链(正义链的5′-端加cacc，若正义链5′-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤g，则在正义链的5′-端加caccg；在反义链的5′-端加aaac，若正义链5′-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤g，则在反义链的3′-端加c)；(3)将上述grna正义链和反义链溶解成100μm的母液，各取1μl加入到98μlddh2o混合稀释到1μm，90℃处理30s后，移至室温冷却完全退火。反应体系如下：2、载体准备(1)将100μl的top1o-px601和top10-px458菌液分别加入100mllb液体培养基(amp)中，恒温摇床37℃200rpm摇菌12-16h；(2)分别提取px601质粒和px458质粒，并测定质粒浓度；(3)采用bsal对px601进行酶切，采用bbsi对px458进行酶切，37℃酶切1h，反应体系如下：(4)1％琼脂糖凝胶回收经酶切的质粒px601和px458，并测定回收酶切质粒的浓度，-20℃保存备用。3、连接转化(1)将表1对应的退火后的grna与酶切纯化过的px458载体进行连接反应；将表2对应的退火后的grna与酶切纯化过的px601载体进行连接反应。25℃连接20min，反应体系如下：(2)将上述连接产物各5μl分别加入两管20μl的top10感受态细胞中，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min。42℃热击45s，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置5min。向每个离心管中加入230μl无菌的lb液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于恒温摇床37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏。(3)将复苏后的感受态细胞直接倒至lb固体平板(amp抗性)上，晃动平板使菌液涂布均匀，超净工作台吹干平板，将平板倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到500μllb液体培养基(amp)中扩大培养4h。(5)使用正向测序引物seqidno：63(5′-atttttgtgatgctcgtcag-3′)对px458的连接产物转化的菌液进行测序；使用正向测序引物seqidno：64(5′-ttccttgaccctggaaggtg-3′)对px601的连接产物转化的菌液进行测序；(6)将上述测序正确的菌种扩大培养后提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。4、细胞转染(1)hek293t细胞铺板(2)采用lipofectamine3000试剂盒将上述3(6)中提取的质粒分别转染hek293t细胞；(3)转染后的细胞培养48小时，收集细胞。5、t7e1酶切分析突变效率(1)将上述4(3)收集的细胞提取细胞基因组，并检测基因组浓度；(2)分别在grna结合位点上下游设计pcr检测引物，见表1和表2；(3)使用高保真pcr试剂盒分别扩增带有靶位点的目的片段，pcr反应条件：95℃3min→95℃15s→55℃15s→72℃30s→72℃5min，35cycles。(4)使用产物纯化试剂盒回收pcr产物，并测定产物浓度；(5)将上述纯化的pcr产物退火处理，即先加热至95℃，保温10min，然后以每30s下降2～3℃的速度降温至室温；：(6)上述每管退火产物分别加入t7核酸内切酶1(t7e1)，设置mock组(未转化的细胞)和空白对照(ck)组(不加t7e1，用ddh2o代替)，37℃酶切1h。(7)以dl2000(takara)为参照，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，电泳结果见图6和图7。图6为crispr/sacas9系统对tcra基因的grna筛选，图7为crispr/spcas9系统对tcra基因的grna筛选。(a)(b)(c)分别为以seqidno：31和seqidno：32，seqidno：33和seqidno：34，seqidno：35和seqidno：36为检测引物的grna对tcra基因的突变效率检测，泳道编号对应grna靶序列编号。根据t7e1的酶切原理，突变效率高与酶切效率成正比，图中编号带下划线的泳道酶切效率较高，即所对应的grna对tcra基因的突变效率较高。(8)在上述t7e1酶切电泳图中突变效率较高的pcr产物中，随机挑取4个，给pcr产物3′-末端加一个腺嘌呤(a)，然后用1％琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收目的片段，并测定回收产物浓度；(9)将上述4份回收产物分别与pmdtm18-t载体进行连接反应，16℃反应30min；(10)将上述4份连接产物分别按3(2)-(3)方法转化大肠杆菌感受态细胞top10，并分别涂布lb平板(amp)；(11)从上述4个平板上分别随机挑取10-50个单菌落，进行sanger测序；(12)上述测序结果统计如下表3所示。由测序结果可知：表3sanger测序比较突变效率。注：有效测序菌落总数指，随机挑取进行测序的菌落总数，减去发生载体自连的菌落数。实施例2针对tcra基因的grna组合筛选将实施例1中经过t7e1酶切和琼脂糖电泳分析，筛选出来的突变效率较高的grna，组合起来对tcra基因进行突变操作，具体步骤如下：1、grna组合如下表所示：表4针对tcra基因的crispr/sacas9系统的grna组合对应的靶序列：将实施例1中3(6)制备的质粒，按照上述组合方式，共同转染hek293t细胞，转染方式参照实施例1的4(1)～4(3)；转染后48小时，按照实施例1中5(1)～5(4)的方法扩增并纯化含有靶位点的目的片段；以dl2000(takara)为参照，用2％琼脂糖凝胶电泳检测上述pcr产物的长度。结果如图8所示(a)(b)分别为以seqidno：31和seqidno：32，seqidno：31和seqidno：34为检测引物的grna靶序列组合对tcra基因的突变效率检测，泳道编号对应grna靶序列组合的编号。如表4标识，共转的grna其靶序列之间相距一定的距离，理论上双grna共同作用会在tcra基因上形成片段缺失，通过pcr产物电泳，会形成两条大小不同的条带，图8结果与理论相符，说明本方案所选择的grna组合能有效突变tcra基因。对上述pcr产物片段大小无明显变化的grna组合，按照实施例1中5(5)～5(7)的方法进行t7e1的酶切和电泳检测。结果见图9所示：seqidno：3和seqidno：4靶序列之间相距51bp，其grna组合共同突变tcra基因后其pcr产物未形成两条独立条带，但对其通过t7e1酶切进一步验证发现具有较高的突变效率。本方案所选择的grna其靶序列之间的距离覆盖了51-2322bp，同理可证，在实施例1中筛选出来的突变效率较高的靶序列中，选取靶序列相距51-2322bp之间的两个grna组合，均能有效突变tcra基因。对上述组合中随机挑取4组grna组合，按照实施例1中5(8)～5(11)的方法进行sanger测序分析。结果如下表5所示：表5sanger测序比较grna组合突变效率实施例3crispr/cas9介导的tcra基因定点同源重组将实施例1或者实施例2中筛选出来突变效率较高的grna或者grna组合，用于crispr/cas9介导的，在tcra基因特定位点(cas9切割位点)，整合插入一段外源dna序列。以下实施例以grna靶序列seqidno：3为例，同理可证其他grna或者grna组合的实施效果。1、同源重组供体载体构建(1)以hek293t细胞基因组为模板，以seqidno：65和seqidno：66为引物扩增上游同源臂，以seqidno：67和seqidno：68为引物增下游同源臂，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的片段；表6tcra基因靶位点seqidno：3上下游同源臂扩增引物65、66、67、68引物类型引物编号引物序列上游同源臂扩增引物-fseqidno：65gttctagtggttggctacgtatgctcaaggccttatatcgag上游同源臂扩增引物-rseqidno：66gtcgacctgtgggacaagaggatcag下游同源臂扩增引物-fseqidno：67actagttctagagcggccgcctgcctattcaccgattttga下游同源臂扩增引物-rseqidno：68actgcaggctctagattcgaatgcgtgagactgacttagtg(2)提取pdonor-mcmv-egfp质粒，用snabi和sali-hf酶切pdonor-mcmv-egfp质粒，37℃酶切1h，80℃失活20min；(3)酶切后的pdonor-mcmv-egfp和上游同源臂pcr产物进行同源重组，37℃重组30min，冰浴5min；(4)5μl上述重组产物和20μltop10大肠杆菌感受态混合后冰浴30min，42℃热击60s，冰上静置5min后加入230mllb培养基(不加抗生素)，37℃摇床45min，涂板，37℃培养过夜；(5)从上述平板上分别挑取单菌落接种到500μllb液体培养基(amp)中扩大培养4h后测序；(6)扩大培养测序正确(上游同源臂重组到pdonor-mcmv-egfp载体上)的单菌落并提取质粒，用noti-hf，37℃酶切1h，然后加入bstbi，65℃酶切1h，酶切后纯化回收；(7)上述酶切产物与下游同源臂pcr产物进行同源重组，37℃重组30min，冰浴5min；(8)按本实施例4～5的方法转化top10大肠杆菌感受态、挑取单菌落，测序鉴定，序列正确的质粒即为同源重组供体载体pdonor-mcmv-egfp-上下游同源臂(图10)，对其扩大培养和保存，。2、tcra基因定点同源重组(1)将实施例1中3(6)中提取的seqidno：3对应的质粒，与上述同源重组供体质粒共同转染hek293t细胞，转染方式参照实施例1的4(1)～4(3)；(2)转化后的细胞培养48小时，收集细胞提取基因组，并测定基因组浓度；(3)以上述基因组dna为模板，在上游同源臂的5′端设计上游pcr引物(seqidno：69∶5′-ctgtggctctgcatgactcactag-3′)，在外源dna序列mcmv-egfp中间设计下游引物(seqidno：70∶5′-atcgccttcttgacgagttcttctgag-3′)，进行pcr扩增，pcr产物进行sanger测序。测序结果见seqidno：71，结果分析见图11所示：5′端126bp为tcra基因的序列，127-731bp为上游同源臂，732-1266bp为同源重组供体质粒的外源dna序列的一部分，含mcmv启动子和部分egfp基因序列。该结果说明，同源重组供体质粒的外源dna序列已成功整合到tcra基因的特定位点。按照本实施例的方法，同理可将嵌合抗原受体(car)基因定点同源重组到tcr的特定位点。seqidno：71：如下：attaaatagatgtttatatggagaagctctcatttctttctcagaagagcctggctaggaaggtggatgaggcaccatattcattttgcaggtgaaattcctgagatgtaaggagctgctgtgacttgctcaaggccttatatcgagtaaacggtagcgctggggcttagacgcaggtgttctgatttatagttcaaaacctctatcaatgagagagcaatctcctggtaatgtgatagatttcccaacttaatgccaacataccataaacctcccattctgctaatgcccagcctaagttggggagaccactccagattccaagatgtacagtttgctttgctgggcctttttcccatgcctgcctttactctgccagagttatattgctggggttttgaagaagatcctattaaataaaagaataagcagtattattaagtagccctgcatttcaggtttccttgagtggcaggccaggcctggccgtgaacgttcactgaaatcatggcctcttggccaagattgatagcttgtgcctgtccctgagtcccagtccatcacgagcagctggtttctaagatgctatttcccgtataaagcatgagaccgtgacttgccagccccacagagccccgcccttgtccatcactggcatctggactccagcctgggttggggcaaagagggaaatgagatcatgtcctaaccctgatcctcttgtcccacaggtcgacggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatcaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatsequencelisting<110>广东赤萌医疗科技有限公司<120>一种用于制备可异体移植t细胞的基因编辑系统<130>1<160>1<210>1<211>1266<212>dna<213>人工序列<400>1attaaatagatgtttatatggagaagctctcatttctttctcagaagagc50ctggctaggaaggtggatgaggcaccatattcattttgcaggtgaaattc100ctgagatgtaaggagctgctgtgacttgctcaaggccttatatcgagtaa150acggtagcgctggggcttagacgcaggtgttctgatttatagttcaaaac200ctctatcaatgagagagcaatctcctggtaatgtgatagatttcccaact250taatgccaacataccataaacctcccattctgctaatgcccagcctaagt300tggggagaccactccagattccaagatgtacagtttgctttgctgggcct350ttttcccatgcctgcctttactctgccagagttatattgctggggttttg400aagaagatcctattaaataaaagaataagcagtattattaagtagccctg450catttcaggtttccttgagtggcaggccaggcctggccgtgaacgttcac500tgaaatcatggcctcttggccaagattgatagcttgtgcctgtccctgag550tcccagtccatcacgagcagctggtttctaagatgctatttcccgtataa600agcatgagaccgtgacttgccagccccacagagccccgcccttgtccatc650actggcatctggactccagcctgggttggggcaaagagggaaatgagatc700atgtcctaaccctgatcctcttgtcccacaggtcgacggtaggcgtgtac750ggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatcacc800ggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgc850ccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtg900tccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagtt950catctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgacca1000ccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag1050cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcg1100caccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtga1150agttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgac1200ttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaa1250cagccacaacgtctat1266当前第1页12