用于治疗变态反应的核酸的制作方法

文档序号：14246083阅读：611来源：国知局

本申请为国际申请日2012年6月15日、国际申请号pct/us2012/042552于2015年2月6日进入中国国家阶段、申请号201280075163.5、发明名称“用于治疗变态反应的核酸”的分案申请。相关专利申请的交叉引用

本专利申请依赖于2011年6月14提交的美国临时专利申请no.61/496,866的公开内容并且要求该临时专利申请的权益，特此将该临时专利申请的整个公开内容以引用的方式并入本文。

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地讲，本发明涉及用作dna疫苗的核酸以及将其用于治疗遭受变态反应或易受变态反应影响的受试者的方法。

背景技术：

变态反应是表征为产生对抗变应原(或引起变态反应的分子)的ige抗体的超敏反应性疾病。变态反应影响超过25％的人口。变态反应可通过许多途径(包括呼吸道、皮肤接触、摄食、昆虫叮咬或药物注入)进入人体。

变态反应疾病管理包括诊断和治疗。变态反应学家使用多种技术，如皮肤点刺测试、基于放射变应原吸附的技术、elisa或激发测试来证明变应原特异性ige以及来鉴定变应原来源而诊断变态反应。变态反应的治疗最通常分为两类：回避和施与抗组胺剂。第三种替代方法即变态反应免疫疗法，其要求患者每周接受由小量攻击性变应原组成的注射剂以帮助免疫系统重新训练(reeducate)其对变应原的应答。

变应原融合蛋白的使用和产生是本领域所熟知的。例如，美国专利no.7,566,456教导了具有ige和igg结合域以及编码变应原的融合蛋白。另外，wo97/07218教导了供在变态反应免疫疗法中使用的变应原-抗cd32融合蛋白。然而，这两篇文献均没有教导它们各自的融合蛋白如何通过抗原递呈而与t细胞相互作用来诱导或改变th1应答。此外，在引导含抗cd32的疫苗至树突细胞到实现th1细胞的正诱导之间没有理论联系。这两篇文献均教导了一种组合物，该组合物在治疗上引入一种变应原，使得该变应原可作为变应原融合蛋白存在于血清中。

已经由toda等人(2002)确定，可将变应原的t细胞表位(在本例中是位于氨基酸247-258处的cryj2表位)附接至融合蛋白并且可用于进行变态反应特异性免疫疗法。toda等人(2002)描述的特异性组合物是dna疫苗的使用，该dna疫苗编码与ii类相关恒定链肽(clip)附接的cryj2的主要cd4t细胞表位(位于氨基酸247-258)。clip含有溶酶体/内体运输序列并且含有结合至mhcii的肽结合槽的域。toda等人(2002)显示，用cryj2肽/clipdna疫苗免疫导致使小鼠启动主要的th1应答，该应答表征为较高的ifn-γ和igg2a产生。然而，toda等人没有教导可用于进行变态反应特异性免疫疗法的变应原的整个蛋白质编码序列的细胞内靶向。

美国专利no.6,982,326和美国专利no.6,090,386描述了编码日本柳杉(cryptomeriajaponica)主要花粉变应原cryj1、cryj2、junsi和junvi的核酸序列以及其片段或肽。该发明还提供了在用编码cryj1、cryj2、junsi和junvi或其至少一种片段、以及cryj1、cryj2、junsi或junvi的片段或者其至少一种片段的核酸序列转化的宿主细胞中产生的纯化的cryj1、cryj2、junsi和junvi以及其至少一种片段，以及合成制备的cryj1、cryj2、junsi或junvi的片段。cryj1、cryj2、junsi和junvi以及其片段被公开可用于诊断、治疗和预防日本柳杉花粉症。该发明还提供cryj1和cryj2的分离的肽。在该发明范围内的肽包含cryj1或cryj2的至少一个t细胞表位，或者优选至少两个t细胞表位。该发明还涉及经修饰的肽，该肽具有与对应的天然存在的变应原或其部分相似的或增强的治疗特性但具有减少的副作用。还提供了治疗或诊断个体中对日本柳杉花粉敏感的方法以及包含一种或多种该发明的肽的治疗组合物和多重肽制剂(multipeptideformulation)。该发明没有教导如何将表位或变应原合并进具有免疫刺激特性的dna疫苗中。

美国专利no.7,547,440和美国专利no.7,112,329通过用涵盖日本扁柏(hinoki)花粉变应原一级结构的重叠肽对建立自遭受日本扁柏花粉变态反应的患者的t细胞系进行刺激，鉴定了日本扁柏花粉变应原分子上的t细胞表位位点。该肽可用于针对患有春天树木花粉症的患者(包括与日本扁柏花粉有交叉反应性的日本扁柏花粉症患者)的基于肽的免疫疗法。该肽还可用于诊断春天树木花粉症。该发明局限于诊断学和表位的多肽递送。

dna疫苗已发展为传统的全细胞或全病毒疫苗的替代形式。一般而言，dna疫苗是经工程改造的核酸，其包含编码一种或多种表位的序列。将该核酸递送至细胞，通常是抗原递呈细胞(apc)，使该核酸表达，所表达的蛋白质上存在的表位在内体/溶酶体区室中加工，并最终递呈在细胞的表面上。授予august等人的美国专利no.5,633,234公开并表征了溶酶体相关膜蛋白(lamp)的内体/溶酶体靶向序列。该专利鉴定了该蛋白质c端区域中的关键残基，该关键残基对该蛋白质靶向至内体/溶酶体区室是必要的。该专利公开了，抗原肽与c端lamp靶向序列融合可为免疫应答的产生提供增强的表位加工和递呈。

此外，授予harris等人的美国专利申请公开no.2004/0157307公开了lamp腔内域(lumenaldomain)作为“运输域”来引导由dna疫苗表达的嵌合蛋白穿过一个或多个细胞区室/细胞器如穿过溶酶体囊泡途径的用途。该嵌合蛋白包括lamp多肽的腔内域、包含此前从抗原蛋白质鉴定和选择的肽表位序列的抗原域、跨膜域和内体/溶酶体靶向序列。

已提出将dna疫苗作为变应性疾病的治疗方法(raz等人，1996；hartl等人，2004；hsu等人，1996；crameri2007；weiss等人，2006)。基本原理是，由dna疫苗编码的变应原蛋白质将优先激活变应原特异性th1细胞应答，伴随着由apc、自然杀伤细胞(nk)和t细胞产生干扰素，而不是激活特征性的th2型应答，如il-4、il-5和il-13的分泌，以及由b淋巴细胞形成ige和在晚期反应中嗜酸性粒细胞的成熟和募集。然而，th1和th2t细胞表型的差异性诱导的根本机制看起来涉及大量的因素，例如疫苗制剂的细菌dna的独特性质(如未甲基化的和cpgdna残基)、由先天免疫引起的细胞因子环境和变应原的细胞运输特性(chen等人，2001；kaech等人，2002)。尚没有发明或方法成功地解决通过递送编码变应原的核酸所进行的变态反应治疗的不确定性。因而，至今尚未实现这样一种变态反应治疗方法。此外，施用dna疫苗用于治疗变应性疾病已导致变应原肽分泌进细胞外环境，从而有可能导致通过激活ige而意外地诱导变应性应答。

技术实现要素：

本发明提供编码变应原性蛋白质、变应原性多肽和变应原性肽的核酸(本文也称为“构建体”)。该核酸设计用于递送至免疫细胞以及在那些细胞中产生变应原性蛋白质、多肽和肽。所编码的蛋白质、多肽和肽具有靶向序列，用于将该蛋白质靶向至mhc-ii区室供一种或多种表位的加工和展示，从而导致对所述表位的免疫应答。一般而言，该核酸包含以下域，所述域与所编码的蛋白质的各个域相关：信号序列域；细胞器内稳定化域；变应原域；跨膜域；和胞质溶酶体/内体靶向域。

在编码的蛋白质的语境中，提供信号序列来将所编码的蛋白质引导至内质网或溶酶体。细胞器内稳定化域是设计为耐受蛋白水解的并且设计用于保护蛋白质的其余部分(尤其是变应原域)免于在加工供细胞进行表位递呈之前被降解的序列。在示例性的实施例中，细胞器内稳定化域是lamp-1的腔内域。变应原域包含一种或多种变应原性表位的序列，所述变应原性表位可用来在所述表位在其中递呈的动物中引起免疫应答。通常，变应原域包含一种或多种变应原蛋白质，但在一些实施例中，可使用变应原性蛋白质的免疫原性多肽或肽片段。在下文论述的示例性实施例中，表位是植物变应原的表位。在本发明的编码的蛋白质中，变应原域不包括信号肽，例如作为变应原蛋白质的一部分天然存在的信号肽。变应原域可包含单种变应原性蛋白质、多肽或肽，或者可包含两种或更多种变应原性蛋白质、多肽或肽。若存在两种或更多种变应原，则每种变应原可来自相同的物种/来源或者一种或多种可来自一种或多种不同的来源。若存在两种或更多种变应原，则它们可协同表达以在所表达的蛋白质中提供相等拷贝数的每种编码区。跨膜域可以是适于引导蛋白质插入膜和穿过膜运输的任何序列。许多这类序列是本领域已知的或者可容易地设计。溶酶体/内体靶向域可以是能够将肽引导至溶酶体或内体的任何序列。这类序列是本领域已知的并且在本文中通过lamp-1的胞质尾部序列示例。

如上文所提及的，在优选的实施例中，该核酸包含变应原域，该变应原域包括变应原性蛋白质的整个变应原性编码序列，但缺少变应原的信号序列的编码序列。在一些实施例中，本发明的核酸不包含整个变应原性编码序列，而是仅包含足够量的该编码序列而使得所编码的多肽在表达时能够折叠而实现该多肽上存在的至少一个表位的天然三维结构。如在包含整个变应原编码序列的构建体中，若存在短于整个编码序列，则该核酸构建体还缺少变应原性多肽或肽的天然存在的信号肽的编码序列。

在优选的实施例中，核酸构建体在变应原域中包含多个变应原性蛋白质、多肽和/或肽的编码序列。存在的每个变应原可来自相同来源，每者来自不同来源，或它们的任何组合。

本发明的核酸，以及因而所编码的蛋白质、多肽和肽可用于治疗遭受变态反应或潜在发展变态反应的受试者，尤其是动物受试者的方法中。一般而言，根据本发明的治疗方法包括将本发明的核酸以足以将所述核酸递送至免疫系统的一种或多种免疫细胞，并且优选递送至一种或多种抗原递呈细胞(apc)的量施用给受试者。一旦递送，所述核酸就表达，所编码的蛋白质在细胞内进行加工，并且表位展示在细胞的表面上。该治疗方法可认为是使用核酸和蛋白质来提供治疗性或预防性免疫应答的方法。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施例的核酸的示意图，其中在变应原域中提供包含单个表位的单个抗原。

图2示出了根据本发明的核酸的载体图谱，其中变应原域包含在人lampn-端序列(ss和isod)和人lampc-端序列(tm和tg)之间插入的cryj2变应原(来自日本柳杉的变应原)，但没有信号序列。

图3为根据本发明的一个替代实施例的核酸的示意图，其中在变应原域中提供单一变应原的多个表位序列。

图4为根据本发明的一个替代实施例的核酸的示意图，其中在变应原域中提供多个不同的变应原序列。

图5示出了根据本发明的核酸的载体图谱，其中变应原域包含变应原cryj1(来自日本柳杉的变应原)和变应原cryj2(来自日本柳杉的变应原)的变应原序列(无信号肽)。

图6a示出了在变应原域中包括三个花生变应原(arah1、arah2和arah3，都缺少信号序列)的核酸的载体图谱。

图6b示出了由图6a的核酸编码的蛋白质的示意图。

图7示出了根据本发明的核酸的载体图谱，绘出了缺少cryj1变应原序列的天然存在的信号序列。该特定构建体用于下文详细描述的实验中以显示移除变应原序列的天然信号序列的重要性。

图8示出了不被本发明涵盖的核酸构建体的载体图谱，其中cryj2变应原在质粒骨架上编码，但是缺少ss、ios、tm和tg域。该构建体在下文详细描述的实验中用作比较对照。

图9示出了蛋白质印迹，其绘出了根据本发明的构建体在293细胞中的表达。分图a示出了当用抗cryj2抗体测定时，根据本发明的构建体中的cryj1-cryj2组合变应原(见图5)和单独的cryj2变应原(见图2)的表达。分图b示出了当用抗cryj1抗体测定时，cryj1-cryj2组合变应原和cryj1变应原(缺少其天然的信号序列；见图7)的表达。分图b还显示，在其中未移除cryj1变应原的天然信号序列的构建体(载体图谱未示出)中cryj1变应原的表达是不可检测的。

图10示出了线图，该图绘出了根据本发明的核酸构建体与包含变应原序列的其他构建体相比的效力。分图a(图10a)显示，与包含与cryj2编码序列融合的质粒骨架的构建体(见图8)相比，由于施用本发明的cryj2-lamp构建体(见图2)而见到igg1产量和检测值的显著增加。分图b(图10b)显示，与包含与cryj2编码序列融合的质粒骨架的构建体(根据图10a)相比，由于施用本发明的cryj2-lamp构建体(根据图10a)而见到igg2a产量和检测值的显著增加。

图11绘出了条形图，该图示出了cryj2-lamp构建体在小鼠中的剂量效应。分图a(图11a)绘出了与单独注射载体dna相比，在以10μg至100μg范围的多种量注射dna疫苗后21天和28天时的igg2a检测值。分图b(图11b)绘出了与单独注射载体dna相比，在以10μg至100μg范围的多种量注射dna疫苗后21天和28天时的igg1检测值。

图12绘出了条形图，该图示出了与单独的载体相比，用本发明的cryj2-lamp构建体处理的小鼠脾脏培养物中il-4和ifn-γ的诱导效果。分图a(图12a)示出了il-4的效果。分图b(图12b)示出了ifn-γ的效果。

图13绘出了线图，该图显示了用cryj2-lampdna疫苗免疫先前致敏的小鼠的效力。分图a(图13a)示出了随时间推移的igg1滴度。分图b(图13b)示出了随时间推移的igg2a滴度。

图14绘出了条形图，该图示出了小鼠脾细胞培养物中ifn-g(分图a(图14a))和il-4(分图b(图14b))的诱导。

图15绘出了条形图，该图示出了免疫的小鼠中循环cryj2蛋白的定量。

图16绘出了豚鼠数据的条形图，该图示出了用cryj2-lamp构建体免疫且用重组cryj2攻击的豚鼠的igg1检测值(分图a(图16a))和igg2检测值(分图b(图16b))。

图17绘出了条形图，该图示出了在85天毒理学glp安全性研究期间用cryj2-lampdna疫苗免疫的新西兰白兔中的抗cryj2应答。

图18绘出了蛋白质印迹，其示出了来自根据本发明的构建体的花生变应原h1、h2和h3的共表达。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的各个示例性实施例。应当理解，下面对示例性实施例的论述无意于限制本发明，而是在本文中广义地公开。相反，提供下面的论述以使读者对本发明的某些方面和特征有更详细地理解。除非另外指明，否则本发明的实践采用本领域技术人员技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组dna技术。这类技术充分解释于这些领域中的普通技术人员已知的文献中，因而不需要在本文中详细描述。同样，关于医学治疗的本发明实践遵循本领域已知的标准方案，并且那些方案不需要在本文中详细描述。

在详细描述本发明的实施例之前，应当理解本文所用的术语仅是为了描述特定实施例的目的，而无意于限制。另外，若提供了值的范围，则应该理解，除非上下文另有明确规定，否则也具体公开了该范围上限和下限之间的每个居间的值，至下限的十分之一个单位。任何声明的值之间的每个较小的范围或声明的范围中的每个居间的值以及该声明的范围中的任何其他声明的或居间的值涵盖于本发明内。这些较小的范围的上限和下限可独立地包括或排除在该范围内，并且其中限值中的一者、二者包括在该较小范围中或者限值中的二者均不包括在该较小范围中的每个范围也涵盖于本发明内，所声明范围中的任何具体排除的限值除外。若所声明的范围包括限值中的一者或二者，则排除了那些包括的限值中的一者或二者的范围也包括在本发明中。因而应当理解，若给出了值的范围，则该范围内的每个值，以及落入该范围内的每个范围也被固有地叙述，并且不对每个值以及每个可能的值的范围进行具体叙述不是忽略那些值和范围，而是方便读者以及为了本公开简洁起见。

除非另外限定，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与所述术语所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的材料和方法类似或等同的任何方法和材料均可用于实践或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物以引用的方式并入本文以结合所述出版物引用的方法和/或材料公开和描述方法和/或材料。当本公开与任何并入的出版物冲突时以本公开为准。

如本文和权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物，除非上下文另有明确规定。因而，例如，提及“变应原”包括多个这种变应原，并且提及“该样品”包括提及一个或多个样品以及其本领域技术人员已知的等同物，等等。此外，使用可用等同术语描述的术语包括使用那些等同术语。因而，例如，使用术语“受试者”应该理解为包括术语“动物”、“人”和本领域用于指经受医学治疗者的其他术语。

如本文所用，术语“包含”旨在意指构建体、组合物和方法包括所述的元素和/或步骤，但不排除其他元素和/或步骤。“基本上由…组成”在用于限定构建体、组合物和方法时，意指排除任何对所述构建体、组合物和方法具有重要意义的其他元素和步骤。因而，基本上由本文所限定的元素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等等。“由…组成”意指排除衡量元素之外的其他成分以及施用本发明组合物的基本方法步骤。由这些过渡术语每一者限定的实施例在本发明的范围内。

“嵌合dna”是较大dna分子中可鉴定的dna区段，该dna区段在天然条件下不与该较大分子相关联存在。因而，当嵌合dna编码蛋白质区段时，该区段编码序列的旁侧将为在任何天然存在的基因组中不处于该编码序列旁侧的dna。在旁侧dna编码多肽序列的情形中，所编码的蛋白质称为“嵌合蛋白”(即具有非天然存在的融合在一起的氨基酸序列的蛋白质)。等位变异或天然存在的突变事件不会产生本文所定义的嵌合dna或嵌合蛋白。

如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”可互换使用来指任何长度的核苷酸聚合形式。多核苷酸可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知的或未知的功能。术语“多核苷酸”包括例如单链、双链和三螺旋分子、基因或基因片段、外显子、内含子、mrna、trna、rrna、核糖酶、反义分子、cdna、重组多核苷酸、支链多核苷酸、适体、质粒、载体、分离的任何序列的dna、分离的任何序列的rna、核酸探针和引物。核酸分子还可包含经修饰的核酸分子(如包含经修饰的碱基、糖和/或核苷酸间连接)。

如本文所用，术语“肽”是指两个或更多个亚单元氨基酸、氨基酸类似物或模拟肽的化合物。亚单元可通过肽键或通过其他键(如，作为酯、醚等)连接。术语“肽”在本文中一般用来指肽(即2至约20个残基的多聚氨基酸)、多肽(即约20个残基至约100个残基的肽)和蛋白质(即具有约100个或更多个残基的肽)。

如本文所用，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及d或l光学异构体二者，以及氨基酸类似物和模拟肽。如果肽链短的话，三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。虽然术语“蛋白质”涵盖术语“多肽”，但“多肽”可以为短于全长的蛋白质。

术语“变应原”是指任何天然存在的蛋白质或蛋白质的混合物，所述蛋白质或蛋白质的混合物已据报道在它们重复暴露于个体时诱导变应性反应，即ige介导的反应。变应原是能够引起变应性反应的任何化合物、物质或材料。变应原通常理解为一亚类抗原，该亚类抗原为能够引起免疫应答的化合物、物质或材料。为了实施本发明，变应原可尤其选自天然的或原本的变应原、经修饰的天然变应原、合成的变应原、重组变应原、类变应原以及它们的混合物或组合。特别要关注的是能够引起ige介导的速发型超敏反应的变应原。

天然存在的变应原的例子包括花粉变应原(如树、杂草、药草和青草花粉变应原)、螨虫变应原(来自例如屋尘螨类和仓储螨类)、昆虫变应原(如吸入物、唾液和毒液起源的变应原)、来自例如动物(如狗、猫、马、大鼠、小鼠等)的唾液、毛发和皮屑的动物变应原、真菌变应原和食物变应原。变应原可以是以下形式：变应原提取物、纯化的变应原、经修饰的变应原或重组变应原或重组突变体变应原、超过30个氨基酸的变应原片段或它们的任何组合。

就它们的化学或生物化学性质而言，变应原可代表天然的或重组的蛋白质或肽、天然的或重组的蛋白质或肽的片段或截短形式、融合蛋白、合成的化合物(化学变应原)、模拟变应原的合成化合物、或通过化学或物理方法变更的变应原如通过热变性修饰的变应原。

可通过若干测试将变应原归类为主要变应原。如果至少25％的患者显示出强的ige结合(3分)并且至少50％的患者显示出中等结合(2分)，则变应原通常归类为主要变应原，其中所述结合通过crie(交叉放射免疫电泳(crossedradioimmuneelectrophoresis))测定(crie强结合，即一天后x射线胶片上可见的ige结合；crie中等结合，即3天后出现的结合；crie弱结合，即10天后出现的结合)。至少10％的患者为强ige结合将变应原归类为中等变应原，不到10％的患者为明显地特异性结合将变应原归类为次要变应原。其他方法也可用于测定ige结合，例如ige印迹法。

“表位”是一结构，通常由短的肽序列或寡糖构成，其被免疫系统的组分特异性识别或特异性结合。t细胞表位已总体显示为线性寡肽。如果两个表位可被相同抗体特异性结合，则它们彼此对应。如果两个表位二者均能够结合相同的b细胞受体或结合相同的t细胞受体，并且一种抗体与其表位的结合基本上防止另一表位的结合(如少于约30％、优选少于约20％并且更优选少于约10％、5％、1％或约0.1％的其他表位结合)，则两个表位彼此对应。

如本文所用，如果两条核酸编码序列或它们的互补序列编码相同的氨基酸序列，则这两条核酸编码序列彼此“对应”。

如本文所用，与另一序列具有某一百分比(至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸区域(或者多肽或多肽区域)意指，当手动或使用本领域常规的软件程序进行最佳比对时，在比较的两条序列中该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。

当在所限定长度的dna序列上至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、并且优选至少约80％、并且最优选至少约90或95％的核苷酸匹配时，两条核苷酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。类似地，当在所限定长度的多肽序列上多肽的至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约66％、至少约70％、至少约75％、并且优选至少约80％、并且最优选至少约90或95％或98％的氨基酸残基匹配时，两条多肽序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。基本上同源的序列可使用序列数据库(sequencedatabank)中可用的标准软件通过比较序列来鉴定。基本上同源的核酸序列也可在dna杂交实验中在例如严格条件下鉴定，所述严格条件是针对特定系统定义的。定义适当的杂交条件在本领域技术内。例如，严格条件可以是：以5xssc和50％甲酰胺下于42℃下杂交，并以0.1xssc和0.1％十二烷基硫酸钠于60℃下洗涤。

还可提供结构域序列的“经保守修饰的变体”。关于特定的核酸序列，术语“经保守修饰的变体”是指编码相同的或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者若核酸不编码氨基酸序列，则是指基本上相同的序列。具体地讲，简并密码子置换可通过生成其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(batzer等人，1991,nucleicacidres.(《核酸研究》)19:5081；ohtsuka等人，1985,j.biol.chem.(《生物化学杂志》)260:2605-2608；rossolini等人，1994,mol.cell.probes(《分子和细胞探针》)8:91-98)。

术语野生型蛋白质的“生物活性片段”、“生物活性形式”、“生物活性等同物”和“功能衍生物”意指使用适于检测活性的测定法测量时所具有的生物活性与野生型蛋白质的生物活性至少基本上相同(如不显著不同)的物质。例如，包含运输域的生物活性片段是可共定位至与包含该运输域的全长多肽相同的区室的片段。

当已将外源或异源核酸引入细胞内时该细胞已被该核酸“转化”、“转导”或“转染”。转化dna可以或不可以与构成细胞基因组的染色体dna整合(共价连接)。在例如原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化dna可维持在附加型元件如质粒上。在真核细胞中，稳定转化的细胞是其中转化dna已整合进染色体中使得其被子代细胞通过染色体复制而遗传的细胞。该稳定性通过真核细胞建立由一群含有该转化dna的子代细胞组成的细胞系或克隆的能力来证明。“克隆”是通过有丝分裂衍生自单个细胞或共同祖先的一群细胞。“细胞系”是能够体外稳定生长许多代(如至少约10代)的原代细胞的克隆。

“复制子”是充当体内dna复制的自主单位的任何遗传元件(如质粒、染色体、病毒)。

如本文所用，“病毒载体”是指包含待体内、离体或体外递送进宿主细胞中的多核苷酸的病毒或病毒颗粒。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。在基因转移由腺病毒载体介导的方面，载体构建体是指包含腺病毒基因组或其部分和选定的与腺病毒衣壳蛋白相关联的非腺病毒基因的多核苷酸。

如本文所用，“核酸递送载体”是可将所关注的多核苷酸运送进细胞中的核酸分子。优选地，这种载体包含与表达控制序列有效连接的编码序列。然而，所关注的多核苷酸序列不一定包含编码序列。例如，在一个方面，所关注的多核苷酸序列是结合靶分子的适体。在另一方面，所关注的序列是调控序列的互补序列，其结合调控序列以抑制该调控序列的调控。在又一个方面，所关注的序列本身是调控序列(例如，用于滴定出细胞中的调控因子)。

如本文所用，“核酸递送媒介物”定义为可将插入的多核苷酸携带进宿主细胞并且与如上所述核酸递送载体相伴出现的任何分子或分子群组或大分子(例如基因或基因片段、反义分子、核糖酶、适体等)。

如本文所用，“核酸递送”或“核酸转移”是指将外源多核苷酸(例如转基因)引入进宿主细胞中，而无论用于该引入的方法如何。所引入的多核苷酸可稳定地或暂时地维持在宿主细胞中。稳定的维持通常要求所引入的多核苷酸或者含有与宿主细胞相容的复制起点或者整合进宿主细胞的复制子如染色体外复制子(如质粒)或核或线粒体染色体中。

如本文所用，“表达”是指多核苷酸转录成mrna和/或翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组dna，则表达可包括转录自基因组dna的mrna的剪接。

如本文所用，“在转录控制下”或“有效连接”是指多核苷酸序列的表达(如转录或翻译)，该表达由表达控制元件和编码序列的适当毗邻控制。在一个方面，当表达控制序列控制和调节dna序列的转录时，则该dna序列“有效连接”至该表达控制序列。

如本文所用，“编码序列”是当置于适当表达控制序列的控制下时转录并翻译成多肽的序列。编码序列的边界由5'(氨基)端处的起始密码子和3'(羧基)端处的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于原核序列、来自真核mrna的cdna、来自真核(如哺乳动物)dna的基因组dna序列以及甚至合成的dna序列。多聚腺苷酸化信号和转录终止序列将通常位于编码序列的3'。

如本文所用，“遗传修饰”是指对细胞的正常核苷酸序列的任何添加或缺失或中断。可实现apc的遗传修饰的任何方法均处于本发明的精神和范围内。本领域认识到的方法包括病毒介导的基因转移、脂质体介导的转移、转化、转染和转导，例如病毒介导的基因转移如基于dna病毒(如腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒)的载体以及基于逆转录病毒的载体的使用。

如本文所用，“溶酶体/内体区室”是指含有膜中的lamp分子、在抗原加工中起作用的水解酶和用于抗原识别和递呈的mhcii类分子的膜结合酸性囊泡。

该区室充当通过包括内吞作用、吞噬作用和胞饮作用在内的多种机制中的任一种从细胞表面内化的外来物质以及通过专门的自溶现象递送至该区室的细胞内物质的降解位点(参见例如deduve,eur.j.biochem.(《欧洲生物化学杂志》)137:391,1983)。本文所用的术语“内体”涵盖溶酶体。

如本文所用，“溶酶体相关的细胞器”是指包含溶菌酶的任何细胞器并且包括但不限于miic、cuv、黑素体、分泌粒、裂解性颗粒、血小板致密颗粒、嗜碱颗粒、伯贝克颗粒、吞噬溶酶体、分泌溶酶体等。优选地，这样一种细胞器缺少甘露糖6-磷酸受体并且包含lamp，但是可能会或可能不会包含mhcii类分子。关于综述，参见例如blott和griffiths,naturereviews,molecularcellbiology(《自然综述，分子细胞生物学》),2002；dell'angelica等人，thefasebjournal(《faseb杂志》)14:1265-1278,2000。

如本文所用，“lamp多肽”是指lamp-1、lamp-2、cd63/lamp-3、dc-lamp或任何溶酶体相关膜蛋白或同源物、直系同源物、变体(如等位变体)和经修饰的形式(如包含一个或多个天然存在的或工程改造的突变)。在一个方面，lamp多肽是哺乳动物溶酶体相关膜蛋白，例如人或小鼠溶酶体相关膜蛋白。更一般地说，“溶酶体膜蛋白”是指包含存在于内体/溶酶体区室或溶酶体相关细胞器的膜中的域并且还包含腔内域的任何蛋白质。

如本文所用，“靶向”表示将本发明的嵌合蛋白引导至优选的位点，如发生抗原加工和与mhcii结合的细胞器或区室的多肽序列。照此，“靶向域”是指递送至细胞区室/细胞器所需的一系列氨基酸。优选地，靶向域是结合至接头蛋白或ap蛋白(例如ap1、ap2或ap3蛋白)的序列。示例性的靶向域序列在例如dell’angelica,2000中描述。

如本文所用，体内核酸递送、核酸转移、核酸疗法等是指将包含外源多核苷酸的载体直接引入进生物体(如人或非人哺乳动物)的体内，由此将该外源多核苷酸体内引入进这种生物体的细胞中。

如本文所用，术语原位是指一种类型的体内核酸递送，其中使该核酸与靶细胞邻近(例如，不系统性地施用该核酸)。例如，原位递送方法包括但不限于在位点处直接注入核酸(例如，注入进组织，如肿瘤或心脏肌肉中)、通过开放的术野使核酸与细胞或组织接触、或者使用医学进入装置如导管将核酸递送至位点。

如本文所用，术语“分离的”和“纯化的”有时互换使用来指与各成分(细胞及其他成分)分离，其中在自然界中多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常与所述成分相关。例如，对于多核苷酸，分离的多核苷酸是与5'和3'序列分离的多核苷酸，在染色体中该多核苷酸通常与该5'和3'序列相关联。如对本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来使其与其天然存在的对应物相区分。此外，术语“分离的”和“纯化的”不意味着完全分离和完全纯化。这些术语用于表示从一些或所有天然与多核苷酸等相关存在的其他物质部分纯化和完全纯化。因而，这些术语可意指从一种天然相关的物质分离或纯化(例如，dna从rna分离或纯化)、从同一大类分子的其他物质分离或纯化(例如，与样品中的所有蛋白质相比，特定蛋白质显示出20％的纯度)或任何组合。分离和纯化可意指约1％至约100％(包括100％)的任何水平。照此，“分离的”或“纯化的”细胞群体基本上不含自然界中与之相关联的细胞和材料。所谓基本上不含杂质的或基本上纯化的apc意指细胞群体的至少50％是apc，优选至少70％、更优选至少80％、并且甚至更优选至少90％不含自然界中与之相关联的非apc细胞。当然，本领域的技术人员将认识到，所有具体的值，包括值的分数，均涵盖在这些范围内而无需在本文中列出每个特定的值。为了简洁起见未具体公开各值；然而，读者应该理解，每个具体的值固有地被本发明公开和涵盖。

如本文所用，“靶细胞”或“受体细胞”是指单独的细胞或期望为或已经成为外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白质的接受者的细胞。该术语还旨在包括单个细胞的子代，并且由于天然的、偶然的或有意的突变，该子代可不一定与初始的亲本细胞完全相同(在形态上或在基因组或总dna互补上)。靶细胞可与其他细胞接触(例如，如在组织中)或者可在生物体的体内循环。

本文所用的术语“抗原递呈细胞”或“apc”意指在其表面上递呈与主要组织相容性复合体分子或其部分、或者，一种或多种非典型的mhc分子或其部分相关联的抗原的任何细胞。合适的apc的例子在下文中详细地进行了论述并且包括但不限于全细胞如巨噬细胞、树突细胞、b细胞、杂交apc和foster抗原递呈细胞。

如本文所用，“经工程改造的抗原递呈细胞”是指在其表面上具有非天然的分子部分的抗原递呈细胞。例如，这样一种细胞在其表面上可能天然不具有共刺激分子或者在其表面上可能除了天然的共刺激分子外还具有额外的人工共刺激分子，或者可在其表面上表达非天然的ii类分子。

如本文所用，术语“免疫效应细胞”是指能够结合抗原并且介导免疫应答的细胞。这些细胞包括但不限于t细胞、b细胞、单核细胞、巨噬细胞、nk细胞和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，例如ctl系、ctl克隆，以及来自肿瘤、炎症或其他浸润物的ctl。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用来指本发明所针对的动物。术语动物应该理解为包括人和非人动物；若两者之间的区别是所需的，则使用术语人和/或非人动物。在实施例中，受试者或患者是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人、农场动物(如牛、绵羊、猪)、运动动物(如马)和宠物(如犬和猫)。

临床变态反应症状对本领域技术人员是已知的，并且不需要在本文中给出详尽的清单。非限制性的例子包括鼻炎、结膜炎、哮喘、荨麻疹、湿疹，其包括皮肤、眼、鼻、上呼吸道和下呼吸道中的反应，其中共同症状是例如眼和鼻发红和瘙痒、瘙痒和流鼻涕、咳嗽、气喘、呼吸短促、瘙痒和组织肿胀。

“免疫性体内测试”的例子是皮肤点刺测试(spt)、结膜激发测试(cpt)、用变应原进行支气管攻击(bca)和其中对一种或多种变态反应症状进行监测的各种临床测试。参见例如haugaard等人，jallergyclinimmunol(《变态反应临床免疫学杂志》)，第91卷，第3期，第709-722页，1993年3月。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”涵盖任何本领域已知的标准药用载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳液，例如油/水或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂。该组合物还可包括稳定剂和防腐剂。关于载体、稳定剂和佐剂的例子，参见martinremington'spharm.sei.(《雷明顿氏药物科学》)，第15版(伊斯顿市的马克出版公司(mackpublco.,easton)(1975))。

如本文所用，“治疗有效量”在本文中用于意指足以预防、校正异常的生理反应和/或使之正常化的量。在一个方面，“治疗有效量”是足以使临床重要的病理学特征(例如肿瘤体的尺寸、抗体产量、细胞因子产量、发烧或白细胞计数或组胺水平)减少至少约30％、更优选减少至少50％、最优选减少至少90％的量。

“抗体”是结合特异性表位的任何免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语涵盖多克隆抗体、单克隆抗体和嵌合抗体(如双特异性抗体)。“抗体结合位点”是抗体分子的由重链和轻链可变区和高变区构成的结构部分，该部分特异性结合抗原。示例性的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子，以及免疫球蛋白分子含有互补位的那些部分，包括fab部分、fab’部分、f(ab’)2部分和f(v)部分，这些部分优选用于本文所述的治疗方法。

术语“口腔粘膜施用”是指一种施用途径，其中将剂型置于舌下或口腔别的地方以让活性成分与患者的口腔或咽的粘膜形成接触以便获得该活性成分的局部或系统效果。口腔粘膜施用途径的例子是舌下施用。术语“舌下施用”是指其中将剂型置于舌底部以便获得活性成分的局部或系统效果的施用途径。如本文所用，术语“真皮内递送”意指将疫苗递送至皮肤中的真皮。然而，疫苗将不必仅位于真皮中。真皮是人皮肤中位置在距表面约1.0与约2.0mm之间的皮肤中的层，但个体之间以及身体的不同部分中存在一定量的变化。通常，通过深入皮肤表面下1.5mm可预计到达真皮。真皮的位置在表面的角质层和表皮与下面的皮下层之间。取决于递送模式，疫苗可最终仅仅或主要位于真皮层内，或者其可最终分布在表皮或真皮内。

如本文所用，变态反应免疫疗法、变态反应治疗的语境中的术语“预防”或者描述针对变态反应患者所设计的干预的其他术语意指在所有患者的至少20％中防止ige应答。术语“预防”不意味着在所有患者中完全防止发展ige介导的疾病，并且这样一个定义不在本发明通过减少变态反应症状的机制来治疗变态反应的范围内，并且与该术语在本领域中的使用不一致。变态反应免疫疗法领域的技术人员众所周知的是，变态反应治疗不会在100％患者中100％有效，并因而“预防”的绝对定义在本发明上下文中不适用。本发明设想了本领域认可的预防的概念。

本发明提供多聚核酸、多聚氨基酸以及治疗需要所述多聚核酸和多聚氨基酸的受试者的方法。从广义上讲，该多聚核酸可以认为是用于细胞内产生变应原性序列(多聚氨基酸)的核酸(如dna、rna)疫苗，该变应原性序列在施用该多聚核酸的受试者的体内引发保护性免疫应答。该多聚核酸在施用时，优先经由mhc-ii途径引起细胞介导的免疫应答以及通过激活变应原特异性的1型辅助性t细胞(th1)细胞应答(伴随由apc、nk细胞和t细胞产生干扰素)而不是th2型应答引起igg抗体的产生，th2型应答涉及ige抗体、粒细胞(如嗜酸性粒细胞)和其他物质的产生。在一定程度上，mhc-ii和mhc-i应答二者均可产生。然而，本发明提供了一种应答，其主要或者基本上是mhc-ii应答。优选地，该核酸不编码抗生素抗性基因。

本发明至少部分地基于这样的认识：某些结构(并因而功能)元件的组合可为核酸疫苗和所编码的变应原提供有利的特性，从而使得变态反应治疗方法满足本领域尚未得到满足的需求。在本发明的多个实施例(旨在将这些实施例理解为作为独立的实施例单独存在以及理解为组合了独立实施例的两种或更多种特征的实施例)中，该组合包括使用溶酶体运输域来将变应原氨基酸序列引导至具有mhcii蛋白的溶酶体。这样做使得对变应原序列主要发生igg应答而不是ige应答。另外，独立的实施例或者实施例的组合提供构建体，该构建体含有一定长度的核酸序列，该长度足以编码可提供表位的天然存在的三维结构的氨基酸序列。在优选的实施例中，核酸序列提供/编码全长变应原编码序列，但是其缺少与该变应原序列相关联的任何天然存在的信号肽序列。在其它实施例中，该核酸序列编码变应原的至少一个变应原性区域，而不是全长变应原蛋白质(并且还缺少信号序列，如果该信号序列天然存在的话)。尽管本领域认识到可产生对抗表位的一级序列的免疫应答，但是本发明认识到，用于产生针对所编码的表位的mhc-ii免疫应答的核酸疫苗优选使用这样的核酸构建体：其编码足够的序列数据以至少在将变应原性序列递送至溶酶体进行加工时，在包含变应原性表位的区域中产生正确的三维肽结构。虽然不限于任何特定的分子理论，据信将进行正确的三维折叠的蛋白质、多肽或肽递送至内体可改善变应原性表位的加工和递呈以供免疫应答。

作为可单独地或作为实施例的组合的一部分实施的实施例的另一个例子，提供了从单个构建体表达多种变应原。至今，尚未表明可有效地制备和使用防范变应原的核酸疫苗。本发明不仅提供对抗变应原的有效核酸疫苗，而且还提供同时对抗多种变应原的有效核酸疫苗。变应原可以是来自相同来源(如单种植物)的变应原，或者可以是来自两种或更多种来源(如树、花、食物等)的变应原。如上所述，可以使用全长变应原序列(缺少变应原的任何天然相关的信号序列)，或者可以使用变应原性部分。在包含多种变应原序列的构建体中，可以使用全长或截短的变应原序列的任何混合物。另外，就其他实施例而言，优选的是移除每条变应原序列的天然存在的信号序列(即每条变应原序列的天然存在的信号序列不存在于构建体中)。

尽管已发现将信号序列用于变应原域内的独立变应原性序列对核酸构建体的功能是有害的，但已经发现，在该核酸疫苗构建体内使用信号序列区或域是一重要的特征。照此，在实施例中，核酸疫苗在信号序列域内包括至少一条信号序列以将所编码的肽引导至膜并穿过膜。尽管信号序列的氨基酸序列在构建体与构建体之间可有所不同，并且可以选择任何已知的信号序列，但已经发现在优选的实施例中，信号序列是存在的并且与变应原序列的编码序列在框内提供。单条信号序列的使用足以将整个编码的嵌合蛋白引导至膜并穿过膜。照此，信号序列用于每条变应原序列是不必要的，并且事实上，已发现对变应原表位在免疫细胞表面的正确定位、加工和表达是有害的。

此外，在具体的实施例中以及在实施例的组合中，已经发现，在多肽从胞质向内体转移的过程中，包括在内体中在多肽切割成用于在细胞表面递呈的单元之前的时候，变应原序列的螯合或物理保护在提供有用的根据本发明的核酸疫苗方面可能是重要的因素。照此，一般而言，本发明包括包含细胞器内稳定化域(iosd)以保护变应原序列的构建体。

本发明的核酸包含至少以下域：信号序列域；细胞器内稳定化域；变应原域(其可包含单种变应原或两种或更多种变应原，各包含一个或多个变应原性表位)；跨膜域；和胞质溶酶体/内体靶向域。各个域存在于单个嵌合的或经工程改造的核酸上。各个域可用本领域已知且广泛实践的技术以任何线性顺序组合。在优选的实施例中，对各域进行组合和布置使得它们构成编码嵌合蛋白的单个开放阅读框，该开放阅读框与足以表达该嵌合蛋白的转录元件有效连接。该核酸因而可以是表达载体，例如质粒、噬菌粒、病毒载体等。优选地，该核酸包含适于在哺乳动物细胞如人细胞中表达的转录元件。这种表达载体元件和表达载体是本领域已知并广泛使用的，如美国专利申请公开no.2004/0157307所示例的，将该专利申请公开以引用的方式并入本文。用于产生根据本发明的核酸构建体的质粒骨架的非限制性例子在本文有时候称为“piti”质粒，其序列以seqidno:1提供。

本发明的核酸的三种示例性构型分别在图1、3和4中以示意图绘出。图1示出了域的顺序布置方式，其中在所编码的嵌合蛋白中包括包含单个表位的单种变应原。图3示出了域的顺序布置方式，其中单种变应原的多个不同表位包括在所编码的嵌合蛋白的变应原域内。这两个表位被布置成使得它们处于同一阅读框中并因而二者均作为嵌合蛋白的一部分产生。本领域的技术人员将立刻认识到，可使用标准的分子生物学技术在同一阅读框中在表位域内提供三个或更多个表位。图4示出了域的顺序布置方式，其中两种不同的变应原存在于变应原域中。当然，技术人员将认识到各变应原序列可含有一个或多个变应原性表位。根据本发明核酸的实施例的这三个示意图，读者将立刻认识到，来自任何数目的来源并且含有任何数目的表位的任何数目的变应原可包括在变应原域内，并且使用标准的分子生物学技术连接在框内。

图2绘出了根据本发明的一个实施例的核酸的载体图谱(“piti-cryj2-lamp”；在本文中有时候也称为“cryj2-lamp”)，其与图1中以示意图绘出的本发明实施例大致相关。该载体或递送媒介物包括具有puc复制起点和用于所编码的蛋白质产生的各种转录和表达元件的质粒骨架。更具体地讲，其包括piti骨架的序列(seqidno:1)。应该注意，根据本发明的优选实施例，该核酸构建体不包括抗生素抗性基因。该核酸还包含所编码的蛋白质的序列，该序列包含人lamp蛋白的n端区，该n端区包括信号序列和细胞器内稳定化域。该核酸还提供所编码的蛋白质的序列，该序列包含与lamp蛋白的n端区框内融合的cryj2变应原序列(缺少其信号序列)。该核酸还包括编码人lamp蛋白的c端区的一部分的序列，该部分包括跨膜区和靶向区。cryj2-lamp嵌合蛋白序列的编码区作为seqidno:2提供。cryj2-lamp嵌合蛋白的氨基酸序列作为seqidno:3提供。

在示例性的实施例中，本发明还涉及用于日本柳杉的其他变应原(包括cryj1变应原)的递送和表达的核酸构建体。使用相同的质粒骨架，已经产生了piti-cryj1-lamp构建体。该嵌合蛋白可引发mhcii型免疫应答。piti-cryj1-lamp构建体的编码区作为seqidno:4给出。cryj1-lamp嵌合蛋白的氨基酸序列作为seqidno:5提供。

如图3和4中所示，变应原域可包括具有多个变应原性表位的变应原，或者可包括多种变应原(各具有一个或多个变应原性表位)。图5绘出了核酸构建体的一个特定示例性实施例的载体图谱，其中变应原域包括两条变应原性序列。在该示例性实施例中，变应原域含有日本柳杉的cryj1和cryj2变应原(各缺少其天然的信号序列)，该变应原与lamp信号序列域和细胞器内稳定化域框内融合并且在n末端融合。cryj1-cryj2序列还在c末端与lamp跨膜域和靶向域融合。该嵌合蛋白的编码区的全部核苷酸序列以seqidno:6给出。所编码的嵌合蛋白的全部氨基酸序列以seqidno:7给出，其中：残基1-27代表该嵌合蛋白的信号序列；残基28-380代表细胞器内稳定化域(取自人lamp的序列)；残基381和382代表连接物；残基383-735代表cryj1的编码区(无其信号序列)；残基736-741代表连接区；残基742-1232代表cryj2变应原的编码区；残基1233-1234代表连接区；残基1235-1258代表跨膜和靶向域；并且残基1259-1270代表额外的c端残基。

本发明的核酸构建体在可协同产生的变应原数目方面基本上是无限的。照此，两种、三种、四种、五种、六种、十种、二十种或更多种不同的变应原(来自相同来源或不同来源的混合物)可包括在本发明的核酸构建体中。图6a给出了根据本发明实施例的另一示例性核酸的载体图谱。该载体或递送媒介物包括具有puc复制起点和用于所编码的蛋白质产生的各种转录和表达元件的质粒骨架。骨架可以是但不一定是seqidno:1的piti骨架。该核酸还包含所编码的蛋白质的序列，该序列包含人lamp蛋白的n端区，该n端区包括信号序列域和细胞器内稳定化域。该核酸还提供所编码的嵌合蛋白的序列，该序列包含花生变应原多聚蛋白arah1/arah2/arah3。该核酸还包括编码人lamp蛋白的c端区的一部分的序列，该部分包括跨膜区和靶向区。该嵌合蛋白的编码区的核苷酸序列以seqidno:8提供。由图6a的载体编码的嵌合蛋白在图6b中以示意图给出(并且以seqidno:9给出)。

存在于本发明的核酸中的域在下文中就所编码的嵌合蛋白提供的功能进行了更详细的描述。应当理解，本发明的实践不依赖于或受限于任何特定的核酸或蛋白质序列，而是，其为给构建体提供优点和特性的各元件和各域的组合。还应当理解，当在所编码的蛋白质的物理和功能特性的语境下论述时，描述是关于核酸构建体的各域，并且反之亦然。其足以告知本领域技术人员所述核酸或蛋白质的物理和功能特性。利用计算机和遗传密码的简并性来获得编码已知蛋白质序列的所有可能的核酸分子以及来获得由核酸编码的蛋白质是简单的事情。因而，提及特定蛋白质序列的物理或功能特性就立刻给技术人员公开了与该物理或功能特性相关的所有可能的核酸序列，反之亦然。

对两种或更多种核酸分子或序列进行设计和组合以获得编码根据本发明的嵌合蛋白的序列也完全处于本领域技术人员的技术范围内。同样，选择和组合转录和翻译控制元件来根据需要体内或体外表达编码序列和嵌合蛋白也完全在技术人员的能力范围内。因此，这些通常使用的技术不需要在本文中详细论述来使得能实践本发明。

本发明的核酸包含信号序列域。信号序列域含有信号序列，该信号序列用于编码的嵌合蛋白插入进限定外部环境与内部环境之间的边界的生物膜中。信号序列还引导蛋白质从外部环境向内部环境的转移。信号序列的一般结构是本领域所熟知的，因为有特定信号序列的许多例子。实践者可根据针对落入本发明范围内的每个实施例的各种选择参数随意选择任何适当的信号序列。在示例性的实施例中，信号序列是将嵌合蛋白引导至内质网的信号序列。此刻值得注意的是，信号序列域仅仅是嵌合蛋白含有信号序列的部分。照此，在将变应原序列包括在构建体中之前，存在于变应原域中的变应原的天然存在的信号序列已被移除。已经发现的是，移除这些单独的信号序列可改善构建体在体内的总体性能。

本发明的核酸包含细胞器内稳定化域(iosd)。该iosd包含编码氨基酸序列的序列，该氨基酸序列经由化学键与变应原域中的一条或多条序列结合并且在嵌合蛋白到达内体/溶酶体区室中之前保护那些序列免于降解(如蛋白水解)。本质上，可将iosd设想为变应原域序列的保护帽，防护那些序列，尤其是变应原性表位序列，以免受蛋白水解酶、低ph和其他蛋白质去稳定化物质和条件的影响。iosd可以是许多已知的或经工程改造的序列的任一者，包括但不限于lamp多肽腔内域和巨涎蛋白/cd68蛋白，巨涎蛋白(macrosialin)/cd68蛋白为在巨噬细胞和巨噬细胞样细胞中作为晚内体蛋白表达的高度糖基化的跨膜蛋白。iosd的关键特征是iosd与变应原域结合并保护其免于蛋白水解直至mhcii类分子从不变肽释放的能力。以该方式，变应原性表位的三维结构得以保持直至活性的mhcii类分子可供相互作用。在优选的实施例中，iosd包含溶酶体蛋白的全部或部分序列。在一些实施例中，iosd是除了lamp多肽腔内域之外的蛋白质或多肽，例如但不限于巨涎蛋白/cd68。

本发明的核酸构建体包含变应原域。变应原域包含编码包含一个或多个变应原性表位的变应原蛋白、多肽或肽的一条或多条序列。变应原域不包括来自存在的变应原的信号序列。许多蛋白质性变应原是本领域已知的，并且变应原和/或变应原性表位中的任一者或组合可根据本发明使用。若使用短于全长的变应原性序列，则优选地，将全长变应原蛋白的一个或多个表位于它们在该变应原性蛋白内的天然位置背景中提供。更具体地讲，本发明提供改良的核酸疫苗，其中该疫苗编码嵌合蛋白，该嵌合蛋白保留或基本保留它们的三维结构直至mhcii类分子能够结合该嵌合蛋白上的表位。以该方式，与将短肽递送至mhcii类分子相比，可引发改善的免疫应答，所述短肽通常将缺少适当的三维结构。因此，优选的是变应原域编码包括一个或更多个表位(如果最初存在于变应原蛋白质上的话)的相对较长的氨基酸序列。

变应原域可包括两种或更多种变应原，各含有一个或更多个变应原性表位。众所周知的是某些变应原性蛋白质含有两个或更多个表位。因为本发明的优选实施例使用变应原性蛋白质的整个变应原性编码区(即缺少信号序列的编码区)或其实质部分，所以某些变应原域将包括处于其天然存在的关系的两个或更多个表位。或者，两个或更多个已知的表位可融合进一个编码区。再一次，在示例性的实施例中，两种或更多种变应原性蛋白质或其变应原性区域存在于变应原域中。若对两个或更多个表位进行工程改造而存在于单个表位域中，则所述表位可来自同一抗原蛋白。或者，它们可来自同一物种的两种不同蛋白质。再一次，它们可来自两种不同物种的同一蛋白质。此外，它们可来自两种或更多种不同物种的两种或更多种不同蛋白质。本质上，本发明设想了来自相同或不同物种的相同或不同蛋白质的表位的任何组合。同样，各变应原和表位的顺序可以可想象的任何方式变动。来自多个物种的变应原性蛋白质和/或变应原性肽的混合使得能产生稳健的核酸疫苗，该疫苗基于多种变应原可为针对单种来源的生物体(如，特定物种的树)的变态反应提供治疗，以及基于多种变应原可为针对多种来源的生物体(如，在一年的同一季节期间释放孢子的多种植物)的变态反应提供治疗。由单种核酸疫苗对抗多种变应原的能力迄今尚未证明。

本发明的核酸构建体还包含跨膜域。跨膜域是蛋白质的众所周知的且得到充分表征的物理和功能元件，其部分存在于生物膜的两侧上。本质上，跨膜域是性质通常是疏水性或亲脂性并且用于将蛋白质锚定在生物膜处的氨基酸的线性序列。一般来讲，这类序列长度为20-25个残基。本领域的技术人员非常清楚这类序列并且可容易获得或工程改造合适的跨膜序列以用于本发明。

除了上面论述的元件，本发明的核酸还包含靶向域。靶向域是编码氨基酸序列的序列，该氨基酸序列用于将所编码的嵌合蛋白靶向至内体/溶酶体区室。虽然不如此受限于其身份，但在优选的实施例中，靶向域包含lamp多肽的c端胞质靶向序列、dc-lamp、lamp2、lamp-3、limpii、endolyn或巨涎蛋白/cd68。

在实施例中，本发明的核酸在变应原域中包含seqidno:2(即缺少其信号序列的cryj2核苷酸序列)的序列或编码seqidno:3(即缺少其信号序列的cryj2蛋白质序列)的另一序列作为变应原域的一部分。seqidno:2由编码cryj2的整个蛋白质编码序列的核苷酸组成，其信号序列除外(即seqidno:2)，cryj2为存在于日本柳杉花粉中的一种果胶酸裂解酶蛋白。本领域众所周知cryj2与存在雪松花粉的区域中的季节性和持续性变态反应相关。cryj2特异性的ige通常存在于接近雪松林的区域中的变态反应患者中。应该注意，在作为本发明公开内容的一部分提供的序列表中，对每种变应原的信号序列(如果存在的话)进行了注解。应当理解，在本发明构建体的背景下，这些信号序列不存在。

在其它实施例中，核酸包含seqidno:4(即cryj1核苷酸序列，缺少其信号序列)的序列或编码seqidno:5(即cryj2蛋白质序列，缺少其信号序列)的另一序列。在其他实施例中，核酸包含seqidno:2和seqidno:4二者的序列或分别编码seqidno:3和seqidno:5的其他序列。在实施例中，核酸包含一种或多种本文所公开的其他序列，例如编码任何以下变应原的那些：cryj3(cryj3.8；日本柳杉；seqidno:10；信号序列为残基1-26)、cjp-4(日本柳杉；seqidno:11)、cjp-6(日本柳杉；seqidno:12)、cjp-8(日本柳杉；seqidno:13；信号序列为残基1-35)、cpa63(日本柳杉；seqidno:14；信号序列为残基1-20)、cjp38(日本柳杉；seqidno:15；信号序列为残基1-28)、chao1(日本扁柏(c.obtuse)；seqidno:16；信号序列为残基1-21)、juna1(阿斯赫刺柏(j.ashei)；seqidno:17；信号序列为残基1-21)、junv1(北美圆柏(j.virginiana)：seqidno:18；信号序列为残基1-21)、cupa1(亚利桑那赫克萨拉(h.arizonica)；seqidno:19；信号序列为残基1-21)、juno1(酸刺柏(j.oxycedrus)；seqidno:20；信号序列为残基1-21)、cups1(地中海柏木(c.sempervirens)；seqidno:21；信号序列为残基1-21)、chao2(日本扁柏；seqidno:22；信号序列为残基1-22)、juna2(阿斯赫刺柏；seqidno:23；信号序列为残基1-22)、cupa2(亚利桑那赫克萨拉；seqidno:24)、juna3(阿斯赫刺柏；seqidno:25；信号序列为残基1-16)、junr3(杜松(j.rigida)；seqidno:26；信号序列为残基1-26)、cups3(地中海柏木；seqidno:27；信号序列为残基1-26)、cupa3(亚利桑那赫克萨拉；seqidno:28)、ch4a(加州山松(p.monticola)；seqidno:29；信号序列为残基1-25)、ch4-1(花旗松(p.menziesii)；seqidno:30；信号序列为残基1-26)、pt-1(火炬松(p.taeda)；seqidno:31)和ltp(欧洲云杉(p.abies)；seqidno:32；信号序列为残基1-25)。未参考seqidno列出的核酸和氨基酸序列也可公开获得。根据核酸序列，仅通过计算机程序实施就能获得根据本发明的蛋白质序列。当然，这些蛋白质序列的在生物化学上同源的序列也为这些实施例所涵盖。例如，与所公开的序列显示出30％或更高的同一性，例如40％或更高、50％或更高、75％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高或者99％或更高的同一性的序列为这些实施例所涵盖。应当理解，该概念不仅适用于本文所公开的变应原的特定序列，而且还适用于本文提供的所有蛋白质和核酸序列。另外，如上所述，所公开的范围内的每个值应该理解为被本公开具体地涵盖。

在本发明的特定例子中，提供了在变应原域中包含seqidno:2或编码seqidno:3的另一序列的dna疫苗。当将这样一种疫苗施用给存在相当的日本柳杉变态反应迹象的患者时，该疫苗导致从头合成包含变应原cryj2(在seqidno:3中给出)的融合或嵌合(这两个术语在本文中可互换使用)蛋白。由于该嵌合蛋白上存在的域的组合，该蛋白质被从内质网引导进内吞溶酶体途径中，从而导致在mhc囊泡中将该融合蛋白加工成表位，一些表位与mhcii类分子结合，从而导致增强的体液免疫应答。

在本发明的另一个例子中，提供了在变应原域内包含seqidno:4的序列或编码seqidno:5的另一序列的dna疫苗。当将这样一种疫苗施用给存在相当的日本柳杉变态反应迹象的患者时，该疫苗导致从头合成包含变应原cryj1(在seqidno:4的序列中给出)的融合或嵌合(这两个术语在本文中可互换使用)蛋白。由于该嵌合蛋白上存在的域的组合，该蛋白质被从内质网引导进内吞溶酶体途径中，从而导致在mhc囊泡中将该融合蛋白加工成表位，一些表位与mhcii类分子结合，从而导致增强的体液免疫应答。

在本发明的另一个例子中，提供了在变应原域中包含seqidno:6的dna疫苗。当将这样一种疫苗施用给存在相当的日本柳杉变态反应迹象的患者时，该疫苗导致从头合成包含变应原cryj1和cryj2(seqidno:7)的融合或嵌合(这两个术语在本文中可互换使用)蛋白。由于该嵌合蛋白上存在的域的组合，该蛋白质被从内质网引导进内吞溶酶体途径中，从而导致在mhc囊泡中将该融合蛋白加工成表位，一些表位与mhcii类分子结合，从而导致增强的体液免疫应答。

在本发明的另一个例子中，在变应原域中提供了编码juna1的整个蛋白质编码序列的核酸，juna1为属于阿斯赫刺柏属的果胶酸裂解酶。juna1展示出与cryj1具有高度序列同一性并且保留与cryj1相似的酶活性且在已知的表位中具有高度相似性。

众所周知其他多肽与cryj1具有交叉反应性并且该交叉反应性是由于共享与果胶酸裂解酶家族多肽的酶活性相关的表位。该家族包括日本扁柏的主要变应原(日本扁柏(cho1))，并且包括来自以下的变应原：阿斯赫刺柏(juna1)、北美圆柏(junv1)、亚利桑那柏木(cuppressusarizonica)(cupa1)、酸刺柏(juno1)和地中海柏木(cups1)。在文献中已经观察到，变态反应患者中存在对来自雪松科(柏木属(cupressus))的花粉的强交叉反应性。下面的表i描绘了示出相关蛋白质之间的交叉反应性水平的表。虽然就cryj1和cryj2详细地描述了本发明，但应当理解除了cryj1和cryj2序列或者作为cryj1和cryj2序列的替代形式，还可使用本文中并且尤其是表i中公开的一种或多种变应原。

表i：日本柳杉与其他变应原的交叉反应性

本领域众所周知的是，用于将编码区的核苷酸序列插入进不同编码区的核苷酸序列中的某些位点(即融合位点)比其他位点更有利。在例如图1-5中教导的变应原序列的位置被教导为对使用本发明中教导的组合物是有利的位置。将变应原序列的位置移至其他位置，例如lamp多肽的腔内域或其他细胞器内稳定化域中是在本发明的范围内。然而，优选的是变应原不设置在跨膜域或胞质域的编码区内。在本发明的优选例子中，将变应原序列插入进lamp多肽的腔内域中，在距离与跨膜域的接合点5个氨基酸和lamp多肽腔内域的5'n端侧上最多20个氨基酸之内。

本发明的核酸可作为纯化的或分离的分子提供。该核酸还可作为组合物的一部分提供。该组合物可基本上由核酸组成，意指该核酸是适于编码序列表达的组合物中的唯一核酸。或者，该组合物可包含本发明的核酸。在示例性的实施例中，该组合物是包含本发明的核酸以及一种或多种药学上可接受的物质或载体的药物组合物。在一些实施例中，该组合物包含促进细胞摄入核酸的物质。在一些实施例中，该组合物包含有助于将核酸递送至特定细胞类型如免疫细胞(例如apc)的靶向分子。在实施例中，所述核酸是用于递送所述核酸至细胞或组织的递送媒介物或递送载体的一部分。

在本发明的特定例子中，该组合物包含两种dna疫苗的混合物，其中一种疫苗包含一种变应原的序列并且其中另一种疫苗包含另一种变应原的序列。可以1:1、1:2、1:3、1:4，依序最高至1:10的比例将这两种疫苗构建体混合在一起。优选的比例是1:1。

在本发明的特定例子中，cryj1、cryj2和/或juna2的核酸存在于核酸递送载体中。在本发明的优选实施例中，该核酸递送载体不含抗生素抗性基因，如美国专利申请公开no.2008/006554所教导的核酸递送载体或美国专利申请公开no.2006/003148中所公开的载体或由该专利申请公开得到的载体。在本发明的特定例子中，该核酸是病毒载体，例如腺病毒载体。

该核酸和组合物是新颖的并且可用作减少患者中的变态反应的药剂。例如，该核酸和组合物可用于减轻具有经证实的与日本柳杉花粉相关或由同源的花粉或变应原引起的变态反应的患者中的花粉症。作为另一非限制性例子，该核酸可用于减轻食物变态反应，例如针对花生或其他坚果的变态反应。递送核酸和组合物来治疗由日本柳杉花粉引起的花粉症，使得该核酸和组合物转染抗原递呈细胞，导致对cryj1和/或cryj2内所含的表位具有特异性的免疫球蛋白g(igg)的血清水平增加。该应答可用于减轻变态反应症状。递送其他变态反应的变应原(包括豚草、其他树的花粉和食物)也导致igg的血清水平增加。

本发明还提供治疗有需要的受试者的方法。该方法是预防性治疗或治疗性治疗遭受针对一种或多种变应原的变态反应或有发展该变态反应的风险的受试者的方法。该方法包括给受试者以足以引起apc摄入和表达根据本发明的dna疫苗的量施用根据该dna疫苗。该dna疫苗的表达导致所编码的变应原性表位递呈在apc上，并发展igg免疫应答。

在本发明的特定例子中，将seqidno:2、seqidno:4和/或另一变应原编码序列施用给细胞。在优选的实施例中，该细胞是抗原递呈细胞，如树突细胞。优选地，树突细胞是人树突细胞。本发明可通过本领域已知为核酸疫苗的有效递送方法的方法施用，包括肌内注射、皮下注射、电穿孔、基因枪免疫接种或脂质体介导的转移。

本发明提供可用于治疗与日本柳杉相关的花粉症的制剂。此前已经确定，将编码变应原的蛋白质编码序列的dna质粒递送给动物可增加ifn-γ产量和降低il-4产量，其可用于治疗对特异性变应原会出现变态反应的动物。本发明提供用于治疗具有与日本柳杉花粉相关的变态反应的患者的改良的dna疫苗组合物。本发明的融合蛋白具有与mhcii类囊泡相交的特异性细胞内运输模式，并导致变应原表位向免疫系统的增强递呈，从而尤其是导致增强的抗体应答。本发明所提供的核酸和组合物可用于进行变态反应免疫疗法。

本发明提供一种制剂，其在施用给细胞时导致增加的特异性抗体应答。增加的对变应原的抗体应答可用于治疗ige介导的变应性疾病。ige具有与其细胞限制以及在结合同源变应原时所导致的细胞内信号传导相关的某些特性。当b细胞接受th2细胞分泌的il-4时产生对抗变应原的ige。这有助于指导b细胞产生ige类抗体。由b细胞分泌时，ige结合至fc-eri(由肥大细胞和嗜酸性粒细胞表达的其高亲和力受体)，从而导致这些细胞和该动物变得对后来的变应原暴露敏感。因此，在摄取、吸入或粘膜接触变应原时，可引发变态反应的症状。由于抗体的结合特性，已经提出，减轻变态反应症状的一种方式是通过用其他抗体类型进行竞争来螯合可供ige结合的游离变应原。具体地讲，增加igg的变态反应制剂已被提出为减轻变应性疾病的途径。本文描述的发明诱导增强的igg产生，从而以临床上显著的方式引起ige与igg比例的降低。已进行的研究的结果表明，在第98天，由cryj2-lamp构建体诱导的igg水平大于通过递送编码未经修饰的cryj2的核苷酸所诱导的igg水平。

在本发明的另一个例子中，教导了一种方法，该方法用于选择雪松树花粉中存在的果胶酸裂解酶多肽来确定与cryj1(一种果胶酸裂解酶)的氨基酸或核酸序列的序列同源性程度，从而可产生与cryj1相似的物质的新组合物，并且从而施用该物质的同源组合物给患者将产生可用于治疗与雪松花粉相关的变态反应的治疗结果。

实例

现在将参照本发明的示例性实施例描述本发明。以下实例旨在使读者能更好理解本发明构建体的构造和活性，而不应该理解为限制本发明的范围。

实例1：通用的材料和方法

免疫和血清收集

从马里兰州弗雷德里克市的哈伦实验室(harlanlaboratories,frederick,maryland)购买六到八周龄的雌性balb/c小鼠并在我们在马里兰州罗克维尔市(rockville,maryland)的动物设施中供养。用100μl体积无菌pbs中的50μg质粒dna以肌内或真皮内的方式进行dna免疫。通过眼眶采血获得血清并在-20℃下保存供后面的分析。为了致敏，给小鼠注射5μg/ml重组cryj2(rcryj2)或重组cryj1(rcyrj1)以及100μl明矾(2mg/ml)，总体积为200μl。每周一次对小鼠进行采血并通过elisa针对cryj特异性抗体分析血清。

豚鼠

在马里兰州林冠线的春之谷实验室(springvalleylaboratories(woodline,md))购买雌性豚鼠并圈养。用200μl体积无菌盐水中的100μg质粒dna以肌内的方式进行dna免疫接种。通过心脏采血获得血清并在20℃下保存供后面的分析。

cyrj2特异性免疫球蛋白应答的检测

在4℃下用pbs中的rcryj2以5μg/ml的浓度包被nuncmaxisorp免疫测定板。在用pbs中的1％bsa封闭后，将血清稀释在含有0.05％吐温20的pbs(pbs-t)中，加入该血清并温育1小时。使用过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠igg、igg1或igg2a抗体(杰克逊实验室(jacksonlaboratories))检测与固定在孔上的cryj2结合的igg、igg1或igg2a。添加tmb底物(kpl)并用tmb终止溶液终止酶活性。在450nm下读板。在某些情况下，使用sure终止溶液(surestopsolution)(kpl)并在650nm下读板。

供细胞因子测量的脾细胞的制备

无菌移出脾脏并挑取而制备单细胞悬浮物。为了研究初级应答，将脾细胞在24孔板(4×10⁵个细胞/孔)中在存在或不存在10μg/ml、5μg/ml或2.5μg/mlrcryj2的情况下培养72小时。

细胞因子测定法

通过elisa针对ifn-γ和il-4的存在对上清液进行测定。将匹配的抗体对用于ifn-γ和il-4并根据制造商的说明书来进行。用小鼠重组ifn-γ和il-4生成标准曲线。所有抗体和细胞因子均购自加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司(invitrogen,carlsbad,ca)。ifn-γ和il-4测定法的检测极限分别为20和10pg/ml。

实例2：从构建体表达变应原

为了显示本发明的核酸构建体可用于在转化的细胞中表达一种或多种变应原，用cryj2-lamp质粒、cryj1+j2-lamp质粒(图4)、cryj1-lamp质粒、cryj1质粒(缺少cryj1信号序列；图7)和单独的基础质粒载体(阴性对照；seqidno:1)转染人293细胞。实验的结果在图9中示出。

图9a示出了转染反应的结果，用抗cryj2抗体进行检测。简而言之，将三十微克的细胞裂解物进行电泳，然后转移至膜进行免疫印迹分析。通过用cryj2单克隆抗体产生免疫印迹，然后进行化学发光来检测蛋白质。从图中可以看到，检测到包含单独的cryj2变应原以及cryj1+cryj2变应原的构建体(泳道2和3)，而未检测到其他变应原。在该实验中，在实验之前移除了cryj1和cryj2变应原的天然存在的信号序列，泳道5中的构建体除外。这些结果显示，不仅本发明的构建体适于表达变应原，而且多种变应原可共同表达。

图9b示出了转染反应的结果，用抗cryj1抗体进行检测。简而言之，将三十微克的细胞裂解物进行电泳，然后转移至膜进行免疫印迹分析。通过用cryj1单克隆抗体产生免疫印迹，然后进行化学发光来检测蛋白质。从图中可以看到，检测到包含cryj1+cryj2变应原(缺少天然的信号序列)的构建体(泳道3)，包含已移除天然存在的信号序列的cryj1变应原的构建体(泳道5)也是如此。然而，其中cryl变应原包括其天然的信号序列的构建体未检测到。这些结果显示，本发明的构建体适于表达和检测多种变应原，并且移除天然存在的信号序列在表达和检测产物方面是重要的。

实例3：支持构建体的mhcii加工途径的数据

为了测定由本发明构建体产生的嵌合蛋白是否通过mhcii途径加工，进行了一组实验来比较当作为质粒上的编码区或作为根据本发明的构建体上的变应原域施用时针对cryj2蛋白的免疫应答。结果在图10的分图a和b中给出。

更具体地讲，该图显示了四次dna免疫接种和花粉粗提物致敏后的cryj2特异性应答。在第0、7、14和21天用cryj2-lamp质粒dna或cryj2质粒(参见图8)dna皮下免疫小鼠组(n＝5)。最后的dna免疫接种后六周(第77天)，将小鼠用明矾中的花粉粗提物致敏并三周(第91天)后给予加强剂量。数据显示了从每个时间点汇集的血清产生的值。接受cryj2-lampdna的小鼠中的igg1(分图a)和igg2a(分图b)应答在整个112天保持升高并且远高于接受不包括lamp的cryj2质粒dna的那些小鼠。经由根据本发明的构建体递送变应原因而提供了比递送没有本发明构建体背景的变应原更优的mhcii应答。

实例4：剂量的理论基础-针对不同剂量的构建体以及针对单独的载体的免疫应答的比较

图11示出了以不同剂量水平进行四次dna免疫接种后对于igg2a产量和igg1产量而言的cryj2特异性应答。在第0、7、14和21天给小鼠组(n＝5)肌内给予10μg、50μg或100μg的cryj2-lamp质粒dna或载体dna。最后一次dna免疫接种后三周，处死小鼠并移出脾脏供细胞因子诱导测定。

数据显示了对于每个疫苗剂量从汇集的血清产生的值。cryj2-lamp质粒dna的全部三种浓度均引起igg1和igg2a应答，其中50μg剂量显示已引起最高的抗体应答。任何浓度的单独载体没有诱导任何抗体应答。这些数据显示，对于引发免疫应答而言存在剂量依赖的应答，并且该免疫应答至少部分是mhcii型应答。

实例5：说明经由mhcii途径的免疫应答的另外的数据

在该组实验中，将il-4和ifn-γ用作标记物测定了经刺激的脾细胞的上清液中的细胞因子分泌。具体而言，在第42天采集小鼠(n＝3)的脾细胞并在存在10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml或无rcryj2的情况下培养。将来自未经处理过的小鼠(mice)的脾细胞用作阴性对照。通过elisa测量经rcryj2刺激的脾细胞的il-4和ifn-γ水平，单位为pg/ml。

数据在图12的分图a和b中给出。数据显示接受50μgcryj2-lamp质粒dna的小鼠比接受较低剂量的质粒dna的那些小鼠具有显著更高的ifn-γ(mhcii免疫应答途径激活的确定生物标记物)表达。在所述组任一者中见到极小的il-4水平应答，il-4是mhci途径的确定生物标记物。对于il-5，也存在极小的应答(如果有的话)(数据未显示)。这些结果表明，cryj2-lampdna免疫接种诱导了th1记忆细胞而不是th2细胞的募集，如通过在用重组cryj2蛋白刺激后产生ifn-γ而不是il-4表明的。

实例6：在先前用cryj2致敏的小鼠中用cryj2-lampdna疫苗免疫的治疗效果研究

为了研究dna-lamp-cryj2疫苗的治疗效果，将小鼠组(n＝5)用三次5μgrcryj2重组蛋白注射剂致敏并在四周后，用四次cryj2-lamp质粒dna注射剂处理，其以每周一次(7天)的间隔给予。该dna免疫诱导了igg2a的促升效果和igg1抗体的暂时增加，从而指示该dna疫苗的th1介导的调节效果。在第167天和174天的两次额外的dna免疫接种促升了cryj2特异性的igg2a应答并且igg1应答几乎没有改变。对小鼠的视觉检查没有显示身体不适或皮肤反应。胃口也没有改变，它们看起来也不嗜睡。对igg1和igg2a滴度的影响分别在图13的分图a和b中示出。

实例7：小鼠脾细胞培养物中ifn-γ和il-4的诱导

还就细胞因子诱导对cryj2-lampdna疫苗的治疗效果进行了研究。在第183天收获小鼠(n＝3)的脾细胞并用不同浓度的rcryj2进行刺激。将来自未经处理过的小鼠的脾细胞用作阴性对照。通过elisa测量经rcryj2刺激的脾细胞的il-4和ifn-γ水平，单位为pg/ml。与载体组中的ifn-γ表达相比，在cryj2-lamp免疫接种的组中检测到显著升高的ifn-γ表达。然而，il-4表达没有显示出与载体组的不同。cry12-lampdna免疫接种引起的ifn-γ增加据推测涉及抗原特异性th1细胞的募集和th1细胞因子环境的产生。从该实验获得的数据在图14的分图a和b中给出。

实例8：血清中的循环cryj2蛋白的检测

用cryj2蛋白、pdna-cryj2(无lamp)和cry12-lamp-vax免疫小鼠。在第0、1、2、3、4和7天获取血清样品并在灵敏的夹心免疫测定法中评价游离cryj2蛋白的存在。在所述蛋白质和非lamp免疫接种中检测到游离的cryj2。然而，在用cryj2-lamp-vax免疫的小鼠进行的任何实验中在任何时间点未检测到游离的变应原(最低可检测水平为2ng/ml)。支持该论断的数据在图12中给出。

根据本发明的lamp疫苗将是可治疗变态反应而不将游离变应原系统性地引入患者中的唯一制剂。这不像传统的免疫疗法，传统的免疫疗法有时候由于系统性引入变应原而可导致过敏反应。该实验显示接受cryj2-lampdna质粒的小鼠不具有游离的cryj2蛋白并因而不释放进体循环中，而对于仅给予蛋白质或无lamp的cryj2dna的小鼠则可见该释放。

实例9：dna疫苗在豚鼠中的效力

为了扩大对本核酸构建体在其他动物中的功能的科学认识，在用cryj2-lampdna疫苗免疫、然后用重组cryj2蛋白攻击的雌性豚鼠中进行了研究。研究的结果在图16的分图a和b中示出。

具体地讲，在第0、7和14天让雌性豚鼠接受100μg的cryj2-lampdna疫苗或单独的载体的肌内注射。在第14天的最后一次dna疫苗免疫接种后四周，在第42天和49天让豚鼠接受10μg/ml的rcryj2蛋白/明矾的皮下注射。在第0、21、35、63和77天从豚鼠获得血清样品。数据显示，对于igg2，接受cryj2-lampdna的豚鼠的平均吸光度值一直增加到第35天，igg1应答极小或没有。igg2a的增加与th1偏向性应答中通常所见的相符。

实例10：在其他哺乳动物中的另外的调查研究-说明安全性的毒理学数据

让新西兰白兔接受4.128mg的cryj2-lampdna的肌内注射。年龄和性别匹配的对照兔子接受单独的盐水。在第1、14、28、42和56天免疫兔子。在第1、14、28、42、56、58和85天从兔子获得血清样品。在多次肌内注射cryj2-lamp质粒或盐水后1:100的兔血清的平均吸光度值在图17中示出。从图中可以看到，数据显示接受盐水的兔子的平均吸光度值小于0.100。用cryj2-lampdna处理的组中的兔子的吸光度值通常一直增加到第42天，并且在某些情况下一直增加到第85天。

实例11：对食品变应原的适用性

在过去的25年中，根据花生变态反应患者中的致敏，已经鉴定了8种重要的花生变应原。三种主要的花生变应原最常被花生变态反应个体的ige识别：65-100％识别arah1，其为63.5kda种子储藏豌豆球蛋白(vicilin)家族蛋白质；71-100％识别arah2，其为17kda种子储藏羽扇豆球蛋白(conglutin)家族蛋白质；以及45-95％识别arah3，其为14kda种子储藏大豆球蛋白(glycinin)家族蛋白质。除了为引发花生依赖的变态反应和过敏反应的共同致病因素之外，这三种蛋白质也看起来促进较强的变态反应。靶向这些变应原来作为花生变态反应免疫疗法的基础有潜力在花生变态反应的各色人群中提供针对强的变态反应的最广泛保护。目前正进行i期临床试验，该临床试验使用三种主要变应原的低变应原性形式和热灭活细菌佐剂作为变态反应免疫疗法。该试验正在进行，但由于高度复杂的制造工艺，这种疗法的最终商业化将会是一个挑战。

为了解决上升的食品变态反应(尤其是花生变态反应)发生率，产生了根据本发明的核酸构建体。该构建体在图6a中绘出，并且所编码的嵌合蛋白的示意图在图6b中绘出，如上面所论述的。该构建体可用于在施用该构建体的受试者中产生主要的mhcii应答。三种最常见的花生变应原在单个嵌合蛋白中的存在提供了广泛的免疫作用，该免疫作用将可治疗群体中的绝大多数花生变态反应。

使该构建体表达，结果在图18中示出。图18显示，所有三种变应原均可表达并在蛋白质印迹上检测为单个多聚蛋白。

对本领域技术人员将显而易见的是，可在本发明的实践以及在核酸构建体的构造中进行各种修改和变动而不脱离本发明的范围或精神。鉴于本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对本领域技术人员将是显而易见的。意图是，所述说明和实例应视为仅仅是示例性的，其中本发明的真正范围和精神由权利要求书表明。

序列表的另外的序列

除了作为本申请的一部分提供的正式序列表中提供的序列之外，下面的序列构成本公开的一部分：

1.cryl-cry2-lamp嵌合构建体的编码区的核苷酸序列如下：

seqidno:6-cryj1+j2-lamp

2.arah1/h2/h3多聚蛋白的编码区的核酸序列：

seqidno:8

2.arah1/h2/h3多聚蛋白嵌合构建体的编码区的氨基酸序列如下：

seqidno:9-arah-lamp

序列表

<110>免疫治疗有限公司（immunomictherapeutics,inc.）

<120>用于治疗变态反应的核酸（nucleicacidsfortreatmentofallergies）

<130>spi175586-11

<150>pct/us2012/042552

<151>2012-06-15

<150>61/496,866

<151>2011-06-14

<160>32

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2898

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>descriptionofartificialsequence:synthetic

pitiplasmidpolylnucleotide

<400>1

ccgcctaatgagcgggcttttttttcttaggccttcttccgcttcctcgctcactgactc60

gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacg120

gttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaa180

ggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctga240

cgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaag300

ataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgct360

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