本发明涉及生物医药技术领域，涉及镇痛活性肽dkk突变体及其衍生物的制备与应用，具体地说，本发明涉及镇痛活性肽dkk十个突变体及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备方法，以及作为镇痛药物在医药领域中的应用。
背景技术：
疼痛是人类共有而又有较大个体差异性的一种不愉快的主观感觉，它在躯体受到威胁时提供警报信号，是生命不可缺少的一种保护机制。人们通过大量的研究获得了蝎镇痛活性肽，但是获得的镇痛活性肽各有差异，其效果也不完全一致。因此，获得活性更好的蝎镇痛活性肽也是本领域技术人员研究的重点和方向。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题是提供一系列镇痛活性肽dkk突变体。
本发明还提供了所述镇痛活性肽突变体的衍生物、类似物或活性片段。
本发明还提供了所述的镇痛活性肽dkk突变体、其衍生物、类似物或活性片段的获得方法。
本发明进一步提供了所述的镇痛活性肽dkk突变体、其衍生物、类似物或活性片段的镇痛活性。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明利用生物技术，在镇痛活性肽dkk的基础上筛选获得镇痛活性肽dkk突变体及其衍生物、类似物或活性片段；镇痛活性肽dkk突变体的镇痛生物活性较镇痛活性肽dkk具有显著提高。
本发明所述的镇痛活性肽dkk突变体是在dkk(seqidno.1)的基础上经过dkk的第6、7、8、13、15、23、24、36、37、38、63、64位中的一个或多个位点突变获得。
进一步地，所述的突变体是将镇痛活性肽dkk的第15、23、24、36、37、38位中的一个或多个位点突变为ala或第13位突变为arg或第6-8位突变为arg-arg-arg或第63、64位的lys缺失突变。
具体地，本发明所述的突变体是在dkk(seqidno.1)的基础上经过dkk的s13r，kk6364⊿，gsn678rrd，gsn678rrd和kk6364⊿，w36a，t37a，w38a，l15a，k23a，e24a位氨基酸残基分别进行突变获得。其序列分别为seqidno.2-11所示。
本发明还包括镇痛活性肽dkk突变体的衍生物、类似物或活性片段。
本发明提供多种镇痛活性肽dkk突变体及其衍生物、类似物或活性片段的制备方法，它包括：利用基因工程技术进行表达或通过化学合成获得。
所述的基因工程技术方法包括：
⑴将镇痛活性肽dkk突变体及其衍生物、类似物或活性片段的编码dna重组至表达载体；
⑵用步骤⑴的重组表达载体转化适当的宿主细胞(原核或真核细胞)；
⑶在适合的诱导表达条件下，培养步骤⑵的被转化的宿主细胞；
⑷收获并纯化所得到的表达产物。
在本发明中，宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
本发明进一步提供上述镇痛活性肽dkk突变体及其部分片段或衍生物或类似物的表达产物分离纯化方法。可使用盐析沉淀、超滤、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤等方法，从细胞的溶胞产物及培养液中分离并纯化所需的表达产物。在表达产物的分离和纯化过程中，可使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sds-page)、酶联免疫吸附法(elisa)或蛋白免疫印迹法(western)检测表达产物的存在及生物质谱检测分子大小。
本发明进一步提供了上述镇痛活性肽dkk突变体及其部分片段或衍生物或类似物的体内镇痛生物学活性实验。
本发明还提供了上述镇痛活性肽dkk突变体及其部分片段或衍生物或类似物在生物制药领域的应用，具体地说是镇痛生物活性。
本发明还提供了含有如上镇痛活性肽dkk突变体及其部分片段或衍生物或类似物及其包含该氨基酸序列的蛋白质及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。
本发明进一步提供如上镇痛活性肽dkk突变体及其部分片段或衍生物或类似物及其包含该氨基酸序列的蛋白质在生产镇痛药物中的应用。可使用本发明的蛋白或含有该蛋白质的药物组合物作为治疗剂，用于治疗特定类型人体的各种疼痛相关疾病。本发明的药物组合物的治疗有效剂量一般应根据疾病的性质、严重程度及对药物的敏感适应性，以及给药途径等诸多因素由临床医生按照个体化原则来确定。
表一镇痛活性肽dkk突变体氨基酸序列
dgyirgsngckisclwgnegcnkeckgfgayygycwtwglacwceglpddktwksesntcggkk；(seqidno.1：dkk)
dgyirgsngckirclwgnegcnkeckgfgayygycwtwglacwceglpddktwksesntcggkk；(seqidno.2：突变点s13r)
dgyirgsngckisclwgnegcnkeckgfgayygycwtwglacwceglpddktwksesntcgg；(seqidno.3突变点kk6364⊿)
gyirdkkdckisclwgnegcnkeckgfgayygycwtwglacwceglpddktwksesntcggkk；(seqidno.4突变点gsn678rrd)
dgyirdkkdckisclwgnegcnkeckgfgayygycwtwglacwceglpddktwksesntcgg；(seqidno.5突变点gsn678rrd和kk6364⊿)
dgyirgsngckisclwgnegcnkeckgfgayygycatwglacwceglpddktwksesntcggkk；(seqidno.6突变点w36a)
dgyirgsngckisclwgnegcnkeckgfgayygycwawglacwceglpddktwksesntcggkk；(seqidno.7突变点t37a)
dgyirgsngckisclwgnegcnkeckgfgayygycwtaglacwceglpddktwksesntcggkk；(seqidno.8突变点w38a)
dgyirgsngckiscawgnegcnkeckgfgayygycwtwglacwceglpddktwksesntcggkk；(seqidno.9突变点l15a)
dgyirgsngckisclwgnegcnaeckgfgayygycwtwglacwceglpddktwksesntcggkk；(seqidno.10突变点k23a)
dgyirgsngckisclwgnegcnkackgfgayygycwtwglacwceglpddktwksesntcggkk；(seqidno.11突变点e24a)
本发明的镇痛活性肽dkk突变体及其衍生物、类似物、活性片段可与任何载体混合制备医学上可接受的剂型。
针对镇痛活性肽dkk的镇痛活性，利用基因工程技术获得一系列镇痛活性肽dkk突变体及其部分片段或衍生物或类似物，通过获得表达产物的实验动物体内镇痛活性，以获得可以进一步开发镇痛类药物的镇痛活性肽dkk突变体及其部分片段或衍生物或类似物。本发明所述的获得方法常规、简单、产量高，不仅具有重要的指导意义和实用价值，也为工业化生产奠定了基础。
具体实施方式
实施例1：
本实施例描述用于表达获得本发明镇痛活性肽dkk突变体基因的构建策略和基本方法:根据镇痛活性肽dkk的氨基酸序列及其基因序列，利用常规基因工程技术，以镇痛活性肽dkk基因为出发基因，将其转换为对应突变位点的目的氨基酸的编码序列，从而分别获得镇痛活性肽dkk突变体基因，该基因编码的镇痛活性肽dkk突变体结构如表一。采用重叠延伸产生特异位点诱变的方法，具体过程为：依据dkk的氨基酸序列，设计相应产生突变位点的寡核苷酸引物。以已经构建的pnju-dkk为模板，如果突变位点在n末端(如gsn678rrd)或c末端(如kk6364⊿)，可利用上游(突变)和下游(突变)引物，经过一步pcr的方法获得突变体。如果突变位点是非末端(如l15a,w38a等)，可通过重叠延伸pcr方法获得。首先利用dkk-f和dkk-r与中间突变点的下和上游引物进行pcr，产生两种具有一定长度相同序列的中间产物，再以经过核酸回收试剂盒回收的pcr中间产物为模板，以dkk-f和dkk-r为引物，进行第三轮重叠延伸pcr方法扩增，获得相应的突变体。
实施例2：
镇痛活性肽dkk突变体及其衍生物、类似物、活性片段的获得：
1.镇痛活性肽dkk突变体及其衍生物、类似物、活性片段基因的构建：
根据镇痛活性肽dkk突变体设计相应寡核苷酸引物，同时在上述两个寡核苷酸引物的5′端，分别加上各自的限制性核酸内切酶水解位点序列，以便基因重组的实施；以实施例1获得的镇痛活性肽dkk突变体基因为模板进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳检测产物并进行核酸片段的凝胶回收；经过上述提及的限制性核酸内切酶双酶切后与同样进行双酶切的质粒在t4dnaligase的作用下进行重组连接，热转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，经过菌落pcr和限制性核酸内切酶酶切验证筛选获得阳性转化子后提交生物技术服务公司进行dna序列测定。结果表明，通过上述基因工程的方法成功构建镇痛活性肽dkk突变体表达重组载体。
2.镇痛活性肽dkk突变体及其衍生物、类似物、活性片段的获得：将阳性重组质粒热转化大肠杆菌bl21(λde3)，然后从该lb固体平板(含相应筛选抗生素)上挑取单菌落后接种至3mllb(含相应抗生素)，于37℃，200r/min振荡过夜培养。按照1％接种量将过夜培养物接种至400ml含相应抗生素的新鲜lb培养基的三角瓶中，于37℃，200r/min振荡培养至od600为0.6-0.8，加入终浓度为0.166mmol/l的诱导物异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，培养4h。结束发酵，3000g、4℃离心20min，收集菌体。用40ml裂解缓冲液(0.1mpbs,0.15mnacl,50mm咪唑)重悬菌体，进行超声破碎，超声结束后于12,000g、4℃离心20min，得上清液，所得沉淀按照上述步骤重复破碎一次，合并两次上清液，直接上样于0.1mpbs(ph8.0)预先平衡好的金属离子螯合层析柱，经过两个不同阶段的ph缓冲液分别充分洗涤5个柱床体积后，使用0.5m咪唑(ph9.0)进行洗脱并收获该洗脱液。所得产物经过15％sds-page验证其纯度。由柱层析色谱图和sds-page图谱说明，重组蛋白质获得高效表达，达到电泳纯度。上述获得的表达产物，利用载体中的自我切割蛋白，获得不含任何标签的镇痛活性肽dkk十个突变体。该重组表达质粒编码表达产物的结构特征为表一中的各个突变体。
3.镇痛活性肽dkk突变体在酵母中的表达及其纯化：将编码镇痛活性肽dkk突变体1基因用寡核苷酸引物进行扩增，获得插入片断。pcr反应所使用的5′寡核苷酸引物序列含有ecorⅴ限制性内切酶的酶切位点和镇痛活性肽dkk突变体的n末端区域氨基酸序列的编码序列，3′端引物序列含有ecorⅰ限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止密码子和镇痛活性肽dkk突变体1的c末端区域氨基酸序列的编码序列，引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于酵母表达载体ppic9k上的限制性内切酶酶切位点(其中ecorⅴ和snabⅰ的内切酶切口为平末端)，该质粒载体编码抗生素抗性(ampr和kanr)，一个来自2μ质粒的复制子，一个aox1启动子，在毕赤酵母中可由甲醇诱导高效表达，一个α-因子的信号肽序列，一个转录终止信号，一个his4选择性标记以及整合序列。用snabⅰ和ecorⅰ消化ppic9k载体，用ecorⅴ和ecorⅰ消化插入片段，随后将插入片段连入ppic9k载体，连接产物热转化e.colidh5α菌株，在含有amp的lb培养皿上筛选转化子，在含有amp(100μg/ml)的lb液体培养基中过夜培养含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证插入片段正确插入。取质粒线性化后，电转化入酵母细胞，线性化的重组载体通过与宿主基因组的同源序列发生同源重组产生稳定的酵母转化体。利用g418筛选出高拷贝的整合转化子。将筛选得到的菌株接种于装有25mlmgy、bmg或bmgy培养基的250ml摇瓶中，于28～30℃/250～300转/分培养至od600＝2～6(16～18h)；室温下3000转/分离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的mm、bmm或bmmy重悬菌体(约10～20ml)；将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28～30℃/250～300转/分的摇床上继续生长；每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0％；分离样品的上清液,用截留分子量为3000da的超滤膜超滤除去色素，用sds-page、western-blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
实施例4：
本实施例通过小鼠体内镇痛模型醋酸扭体法确定镇痛活性肽dkk突变体的体内生物活性-镇痛活性。此外也旨在验证镇痛活性肽dkk突变体衍生物、类似物、活性片段的镇痛活性。
小鼠醋酸扭体法镇痛模型：将冰醋酸作为化学刺激物注入昆明种小鼠腹腔内，继而引起深部的、大面积而较持久的疼痛刺激，致使小鼠产生“扭体”反应(腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部高起)。
18-22g昆明种小鼠，雌雄各半，随机分组，每组10只，样品实验组分别腹腔注射系列镇痛活性肽dkk及其类似物样品1.23mg/kg体重，20min后按0.2ml/20g腹腔注射0.6％(v/v)醋酸引起内脏痛，5min后记录小鼠10min内的扭体次数。以吗啡为阳性对照，生理盐水为空白对照，按照下述公式计算各个给药组的扭体反应抑制率。
镇痛生物活性实验结果表明：
生理盐水空白组实验动物扭体次数(mean±sem)为45.80±2.99；
阳性对照组(吗啡，1.00mg/kg体重)实验动物扭体次数(mean±sem)为28.95±1.85，扭体抑制率为36.79％；
镇痛生物活性实验结果表明：
1.生理盐水空白组实验动物扭体次数(mean±sem)在45.6±2.9。
2.镇痛活性肽dkk(剂量，1.23mg/kg体重)组的实验动物扭体反应抑制率为42.9％。
3.镇痛活性肽dkk突变体s13r(剂量，1.23mg/kg体重)的实验动物扭体反应抑制率为76.2％，相对镇痛活性肽dkk的镇痛生物活性增加具有显著意义。
4.镇痛活性肽dkk突变体kk6364⊿(剂量，1.23mg/kg体重)的实验动物扭体反应抑制率为72.5％，相对镇痛活性肽dkk的镇痛生物活性增加具有显著意义。
5.镇痛活性肽dkk突变体gsn678rrd(剂量，1.23mg/kg体重)的实验动物扭体反应抑制率为81.1％，相对镇痛活性肽dkk的镇痛生物活性增加具有显著意义。
6.镇痛活性肽dkk突变体gsn678rrd和kk6364⊿(剂量，1.23mg/kg体重)的实验动物扭体反应抑制率为76.8％，相对镇痛活性肽dkk的镇痛生物活性增加具有显著意义。
7.镇痛活性肽dkk突变体w36a(剂量，1.23mg/kg体重)的实验动物扭体反应抑制率为70.2％，相对镇痛活性肽dkk的镇痛生物活性增加具有显著意义。
8.镇痛活性肽dkk突变体t37a(剂量，1.23mg/kg体重)的实验动物扭体反应抑制率为63.8％，相对镇痛活性肽dkk的镇痛生物活性增加具有显著意义。
9.镇痛活性肽dkk突变体w38a(剂量，1.23mg/kg体重)的实验动物扭体反应抑制率为68.4％，相对镇痛活性肽dkk的镇痛生物活性增加具有显著意义。
10.镇痛活性肽dkk突变体l15a(剂量，1.23mg/kg体重)的实验动物扭体反应抑制率为65.7％，相对镇痛活性肽dkk的镇痛生物活性增加具有显著意义。
11.镇痛活性肽dkk突变体k23a(剂量，1.23mg/kg体重)的实验动物扭体反应抑制率为66.9％，相对镇痛活性肽dkk的镇痛生物活性增加具有显著意义。
12.镇痛活性肽dkk突变体e24a(剂量，1.23mg/kg体重)的实验动物扭体反应抑制率为70.9％，相对镇痛活性肽dkk的镇痛生物活性增加具有显著意义。
序列表
<110>沈阳药科大学
<120>镇痛活性肽dkk十个突变体及其制备与应用
<130>镇痛活性肽dkk十个突变体及其制备与应用
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