本发明涉及涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种烟草nttctp蛋白及其编码基因在植物耐旱、耐盐基因工程中的应用。
背景技术：
：环境中物理化学因素的变化,例如干旱、盐碱、冷害、冻害、水涝等胁迫因素以及生物因素例如病虫害对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。提高作物的耐逆性，除了利用传统的育种方法，目前，分子遗传育种已经成为科技工作者所关注的领域之一。在非生物和生物逆境的胁迫下，高等植物细胞有多种途径感受和应答外界环境中物化参数的变化，将胞外的信号变为胞内信号，经过一系列磷酸化级联反应将信号传递到细胞核，经转录因子调控相关的功能基因，启动逆境应答基因的表达，提高植物的耐逆性。技术实现要素：本发明的目的是提供一种烟草nttctp蛋白及其编码基因在植物耐旱、耐盐基因工程中的应用。本发明提供的蛋白质，获自烟草，命名为nttctp蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。所述耐逆性具体可为耐盐性和/或耐旱性。为了使(a1)中的nttctp蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述(a2)中的nttctp蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的nttctp蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码所述nttctp蛋白的基因(nttctp基因)也属于本发明的保护范围。所述nttctp基因为如下(b1)-(b3)中任一所述的dna分子：(b1)编码区如序列表中序列2所示的dna分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna序列杂交且编码与植物耐逆性相关蛋白的dna分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有90％以上同源性且编码与植物耐逆性相关蛋白的dna分子。所述耐逆性具体可为耐盐性和/或耐旱性。上述严格条件可为用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。含有所述nttctp基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有nttctp基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。使用nttctp基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用nttctp基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，也可不加入任何筛选基因，直接通过逆境胁迫进行筛选。本发明还保护nttctp蛋白或nttctp基因在调控植物耐逆性中的应用。所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。本发明还保护nttctp蛋白或nttctp基因在植物育种中的应用。所述植物育种是为了选育耐逆性高的植物。所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中nttctp基因的表达，得到耐逆性提高的转基因植物。所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。所述方法中，所述“抑制目的植物中nttctp基因的表达”是通过干扰载体实现的。所述干扰载体可通过ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到目的植物中。所述干扰载体具体可为含有干扰片段的重组表达载体。所述干扰片段包括区段甲和区段乙。所述区段甲和所述区段乙为反向互补序列。所述区段甲的序列如序列表的序列3所示。所述干扰载体具体可为将载体pzh01的saci和kpni酶切位点之间的小片段取代为了序列表中序列3所示的dna分子，并且将载体pzh01的xbai和sali酶切位点之间的小片段取代为了序列表中序列4所示的dna分子得到的重组表达载体。本发明还保护一种提高植物耐逆性的方法，包括如下步骤：降低目的植物中nttctp蛋白的活性和/或表达量，得到耐逆性提高的转基因植物。所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。以上任一所述目的植物具体可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为茄目植物。所述茄目植物可为茄科植物。所述茄科植物可为夜香树族植物。所述夜香树族植物可为烟草属植物。所述烟草属植物所述植物具体可为烟草，例如烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)。本发明还保护以上任一所述方法在植物育种中的应用。所述植物育种是为了选育耐逆性高的植物。所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。本发明还保护一种降低植物耐逆性的方法，包括如下步骤：将所述nttctp基因导入目的植物中，或，提高目的植物中nttctp蛋白的活性和/或表达量，得到耐逆性降低的植物。所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。所述方法中，所述nttctp基因可以通过含有nttctp基因的重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体可通过ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。所述重组表达载体具体可为将载体prokⅱ的多克隆位点间插入序列表的序列2的自5′端第1-504位核苷酸所示的dna分子得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将载体prokⅱ的bamhⅰ和kpnⅰ酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列2的自5′端第1-504位核苷酸所示的dna分子得到的重组质粒。本发明还保护一种特异dna分子，包括区段甲和区段乙。所述区段甲和所述区段乙为反向互补序列。所述区段甲的序列如序列表的序列3所示。本发明还保护一种干扰载体，是将所述特异dna分子导入表达载体得到的。所述干扰载体具体可为将载体pzh01的saci和kpni酶切位点之间的小片段取代为了序列表中序列3所示的dna分子，并且将载体pzh01的xbai和sali酶切位点之间的小片段取代为了序列表中序列4所示的dna分子得到的重组表达载体。本发明还保护所述特异dna分子或所述干扰载体在植物育种中的应用。所述植物育种是为了选育耐逆性高的植物。所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。以上任一所述植物具体可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为茄目植物。所述茄目植物可为茄科植物。所述茄科植物可为夜香树族植物。所述夜香树族植物可为烟草属植物。所述烟草属植物所述植物具体可为烟草，例如烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)。本发明发现了一种蛋白，来源于烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)，名称为nttctp，将其编码基因沉默后，可得到耐旱和/或耐盐性增加的转基因植物，在培育作物稳产中有重要意义。附图说明图1为nttctp过量表达载体(a)和rnai载体(b)的示意图。图2为nttctp过表达和rnai植株的分子鉴定。图3为nttctp转基因植株和对照高盐或干旱胁迫下的表型分析。图4为nttctp过表达、rnai植株和对照在高盐或干旱胁迫处理恢复40天存活率统计。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。载体pzh01记载在hanxiao,etal.functionalanalysisofthericeap3homologueosmads16byrnainterference,plantmolecularbiology,2003,52,957-966，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)记载在hongsh,kimki,chunghy,kimyj,sunterg,bisarodm,chungis,expressionofrecombinantendostatedleafdisksofnicotianatabacumvar.xanthi,biotechnologyletters,2004,26(18),1433-1439，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。载体prokii(双元表达载体)记载在d.c.baulcombe,g.r.saunders,m.w.bevan,m.a.mayoandb.d.harrison,expressionofbiologicallyactiveviralsatelliternafromthenucleargenomeoftransformedplants.nature321(1986),pp.446–449中，公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。实施例1、nttctp蛋白及其编码基因的获得对各品种烟草基因组进行序列分析、区段截取和功能验证，从烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)中发现一种蛋白质，将其命名为nttctp蛋白，如序列表的序列1所示。将编码nttctp蛋白的基因命名nttctp基因，如序列表的序列2所示。实施例2、nttctp蛋白及其编码基因的功能一、重组过表达载体prokⅱ-nttctp的构建1、提取烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)叶片rna，反转录得到cdna。2、以步骤1得到的cdna为模板，采用nttctp-f1和nttctp-r1作为引物进行pcr扩增，得到的pcr产物。nttctp-f1：caggatccatgttggtttatcaggatcttctc；nttctp-r1：acgggtaccacacttgacctccttgagtcc。nttctp-f1和nttctp-r1中，下划线分别标注bamhⅰ和kpnⅰ酶切位点。3、用限制性内切酶bamhⅰ和kpnⅰ双酶切步骤2的pcr扩增产物，回收酶切产物。4、用限制性内切酶bamhⅰ和kpnⅰ双酶切载体prokⅱ，回收约12900bp的载体骨架。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组过表达载体prokⅱ-nttctp。根据测序结果，对重组过表达载体prokⅱ-nttctp进行结构描述如下：将载体prokⅱ的bamhⅰ和kpnⅰ酶切位点之间的小片段取代为了序列表中序列2自5’末端第1-504位核苷酸所示的dna分子。重组过表达载体prokⅱ-nttctp部分原件示意图如图1a所示。二、重组rnai干涉载体pzh01-nttctp-rnai的获得1、提取烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)叶片rna，反转录得到cdna。2、以步骤1得到的cdna为模板，采用nttctp-rf和nttctp-rr组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物。nttctp-rf：tgctctagagagctccggattcatttccctacactg；nttctp-rr：acgcgtcgacggtaccacacttgacctccttgagtcc。nttctp-rf和nttctp-rr中，下划线分别标注xbaⅰsacⅰ和salⅰkpnⅰ酶切位点。3、用限制性内切酶saci和kpni双酶切步骤1的pcr扩增产物，回收酶切产物。4、用限制性内切酶saci和kpni双酶切载体pzh01，回收约11900bp的载体骨架。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组载体pzh01-rnai-1。根据测序结果，对重组载体pzh01-rnai-1进行结构描述如下：将载体pzh01的saci和kpni酶切位点之间的小片段取代为了序列表中序列3所示的dna分子。6、用限制性内切酶xbai和sali双酶切步骤1的pcr扩增产物，回收酶切产物。7、用限制性内切酶xbai和sali双酶切步骤5得到的重组载体pzh01-rnai-1，回收约12400bp的载体骨架。8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组rnai干涉载体pzh01-nttctp-rnai。根据测序结果，对重组rnai干涉载体pzh01-nttctp-rnai进行结构描述如下：将载体重组载体pzh01-rnai-1的xbai和sali酶切位点之间的小片段取代为了序列表中序列4所示的dna分子。重组rnai干涉载体pzh01-nttctp-rnai部分原件示意图如图1b所示。三、过表达转nttctp烟草和rna干扰转nttctp烟草的获得及鉴定1、将步骤一得到的重组过表达载体prokⅱ-nttctp经叶圆盘法转入烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)中，获得22株t0代过表达转nttctp烟草。2、取步骤1的t0代过表达转nttctp烟草的叶片，提取总rna并反转录为cdna，以cdna为模板，采用qrt-pcr的方法检测nttctp基因的表达情况(以tubllin基因为内参基因)，采用引物qrt-nttctpf1和引物qrt-nttctpr1组成的引物对检测nttctp基因的表达，采用引物qrt-nttuba1f1和引物qrt-nttuba1r1组成的引物对检测tubllin基因的表达。设置以烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)cdna作为模板的对照。qrt-nttctpf1:5’-cagggagctgttgatgtgaacat-3’；qrt-nttctpr1:5’-tgctcctgaagcctgaaagtgt-3’；qrt-nttuba1f1:5’-acgtgctttcgtgcactggtat-3’；qrt-nttuba1r1:5’-gcaccaacttcctcgtaatcct-3’。3、将步骤二得到的重组rnai干涉载体pzh01-nttctp-rnai经叶圆盘法转入烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)中，获得25株t0代rna干扰转nttctp烟草。4、取步骤3的t0代rna干扰转nttctp烟草的叶片，提取总rna并反转录为cdna，以cdna为模板，采用qrt-pcr的方法检测nttctp基因的表达情况(以tubllin基因为内参基因)，采用引物qrt-nttctpf1和引物qrt-nttctpr1组成的引物对检测nttctp基因的表达，采用引物qrt-nttuba1f1和引物qrt-nttuba1r1组成的引物对检测tubllin基因的表达。设置以烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)cdna作为模板的对照。qrt-nttctpf1:5’-cagggagctgttgatgtgaacat-3’；qrt-nttctpr1:5’-tgctcctgaagcctgaaagtgt-3’；qrt-nttuba1f1:5’-acgtgctttcgtgcactggtat-3’；qrt-nttuba1r1:5’-gcaccaacttcctcgtaatcct-3’。部分结果如图2所示。经检测22株t0代过表达转nttctp烟草中有19个株系中nttctp表达量显著高于对照，而25株t0代rna干扰株系中有18个株系nttctp表达量显著低于对照。选取nttctp过表达株系oe-02和oe-07及rna干扰株系中几乎未能检测出nttctp表达的ri-16和ri-20做进一步功能鉴定。将t0代烟草自交，经过4代获得上述株系的纯系。四、转空载体烟草的获得1、采用载体prokⅱ经叶圆盘法转入烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)中，获得转空载体烟草(过表达对照)。2、采用载体pzh01经叶圆盘法转入烟草(nicotianatabacumvar.xanthi)中，获得转空载体烟草(rna干扰对照)。五、表型分析待测植株：烟草(nicotianatabacumvar.xanthi，对照)、t4代过表达转nttctp烟草(oe-02和oe-07)、t4代rna干扰转nttctp烟草(ri-16和ri-20)、转空载体烟草(过表达对照)和转空载体烟草(rna干扰对照)。1、将待测植株种子接种于ms固体培养基中，22℃培养(16h光照/8h黑暗)，约8天后，长出子叶。2、将步骤1得到的子叶转移至含250mmnacl或600mm甘露醇(man)的ms固体培养基中，此时植株生长非常缓慢，所有植株均有生长点变白，30天后将所有植株移至蛭石中，浇水，使其恢复生长，观察表型并统计存活率。各组植株在恢复生长23天或40天的表型观察结果如图3所示。结果表明，无论250mmnacl胁迫，还是600mm甘露醇胁迫，在胁迫处理后恢复23天或40天，与对照相比，过表达植株均明显敏感，而rnai植株的耐性均有所提高。各组植株在恢复生长40天的存活率统计结果见图4。结果表明，经250mmnacl处理后恢复的对照、oe-02、oe-07、ri-16和ri-20的存活率分别为48±7、30±12、32±10、57±8和65±10％，两个nttctp过表达株系在高盐胁迫后的存活率显著低于对照，而nttctprna干涉(rnai)株系在高盐胁迫后的存活率显著高于对照。经600mm甘露醇处理后恢复的对照、oe-02、oe-07、ri-16和ri-20的存活率分别为57±7、38±9、35±10、83±11和87±9％，两个nttctp过表达株系在甘露醇模拟的干旱胁迫后的存活率极显著低于对照，而nttctprna干涉(rnai)株系在甘露醇胁迫后的存活率极显著高于对照。转空载体烟草(过表达对照)和转空载体烟草(rna干扰对照)的统计结果与对照无显著性差异。上述实验表明，nttctp在植株中的含量降低，也即nttctp的编码基因nttctp的沉默提高了转基因植株的耐旱/耐盐性。此结果对于提高植物，特别是茄科植物的耐旱/耐盐性有较大价值。<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所<120>烟草nttctp蛋白及其编码基因在植物耐旱、耐盐基因工程中的应用<160>4<210>1<211>168<212>prt<213>烟草（nicotianatabacumvar.xanthi）<400>1metleuvaltyrglnaspleuleuserglyaspgluleuleuserasp151015serpheprotyrthrgluleugluasnglyvalleutrpgluvalgln202530glylystrpvalvalglnglyalavalaspvalasnileglyalaasn354045proseralagluglyalaaspgluaspgluglyvalaspaspglnala505560ilelysvalvalaspilevalaspthrpheargleuglngluglnpro65707580serpheasplyslysglnphevalalatyrmetlyslystyrilelys859095serleuthrprolysleuglyalagluglnglugluvalphelysasn100105110asnileglnglyalathrlystyrleuleuserlysleuseraspleu115120125glnphephevalglyglusermetalaaspaspthrglymetvalphe130135140alatyrtyrlysaspglyalathraspprothrpheleutyrleuala145150155160hisglyleulysgluvallyscys165<210>2<211>507<212>dna<213>烟草（nicotianatabacumvar.xanthi）<400>2atgttggtttatcaggatcttctctccggggatgagctcctttcggattcatttccctac60actgaacttgagaatggagtgctttgggaagtacaagggaagtgggttgttcagggagct120gttgatgtgaacatcggggcgaatccatctgctgaaggtgcagatgaagacgaaggtgtt180gatgatcaagccatcaaggttgttgatattgttgacactttcaggcttcaggagcagcct240tcttttgacaagaagcagtttgttgcctacatgaagaaatatatcaagagccttacaccc300aagttaggcgcagagcaggaagaagtttttaagaacaacattcaaggagcaaccaagtac360cttttgtcaaagctcagtgaccttcaattctttgttggtgagagcatggctgatgatact420ggaatggtgtttgcctactacaaggatggcgccactgatccgacctttttgtaccttgca480catggactcaaggaggtcaagtgttaa507<210>3<211>461<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3cggattcatttccctacactgaacttgagaatggagtgctttgggaagtacaagggaagt60gggttgttcagggagctgttgatgtgaacatcggggcgaatccatctgctgaaggtgcag120atgaagacgaaggtgttgatgatcaagccatcaaggttgttgatattgttgacactttca180ggcttcaggagcagccttcttttgacaagaagcagtttgttgcctacatgaagaaatata240tcaagagccttacacccaagttaggcgcagagcaggaagaagtttttaagaacaacattc300aaggagcaaccaagtaccttttgtcaaagctcagtgaccttcaattctttgttggtgaga360gcatggctgatgatactggaatggtgtttgcctactacaaggatggcgccactgatccga420cctttttgtaccttgcacatggactcaaggaggtcaagtgt461<210>4<211>461<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4acacttgacctccttgagtccatgtgcaaggtacaaaaaggtcggatcagtggcgccatc60cttgtagtaggcaaacaccattccagtatcatcagccatgctctcaccaacaaagaattg120aaggtcactgagctttgacaaaaggtacttggttgctccttgaatgttgttcttaaaaac180ttcttcctgctctgcgcctaacttgggtgtaaggctcttgatatatttcttcatgtaggc240aacaaactgcttcttgtcaaaagaaggctgctcctgaagcctgaaagtgtcaacaatatc300aacaaccttgatggcttgatcatcaacaccttcgtcttcatctgcaccttcagcagatgg360attcgccccgatgttcacatcaacagctccctgaacaacccacttcccttgtacttccca420aagcactccattctcaagttcagtgtagggaaatgaatccg461当前第1页12