本发明属于生物技术领域，具体涉及一种白菜瞬时转化的方法。
背景技术：
将外源基因转入到植物体内，是研究基因功能的主要手段。植物遗传转化包括稳定转化和瞬时转化。利用农杆菌介导的稳定转化技术已经应用到很多作物物种中，是目前研究基因体内功能的常用方法。但是稳定转化技术的转化及再生效率低，并且耗时比较长，如果要对多个基因开展功能研究会耗费大量时间和精力。瞬时表达(transienentgeneexpression)是指将外源基因导入到植物细胞后，作为一种基因组外的遗传物质在一定时间内实现转录和翻译并积累相应表达产物的技术。瞬时表达方法较稳定表达方法具有操作简单，周期短，反应植物体内工作环境，表达效率高，安全高效等诸多突出优点。近二十几年来，利用农杆菌介导的叶片注射渗透法(agroinfiltration)，进行基因瞬时表达，已经成为进行rna，smallrna的分析，蛋白定位，蛋白互作，泛素化系统以及抗体制备等方面研究的重要方法(goodinetal.,2002；koscianskaetal.,2005；rodriguezetal.,2005；liuetal.,2010)。
农杆菌注射渗透法是将农杆菌菌液直接应用于不同物种植物体中，其中应用最广泛的是模式植物本氏烟草(nicotianabenthamiana)的叶片。利用本氏烟草不只因为它是实验室中易种植的模式植物，还因为可以在烟草中利用基因沉默抑制子p19和p1/hc-pro大幅提升烟草中蛋白表达水平(kapilaetal.,1997；johansenandcarrington,2001；voinnetetal.,2003；maetal.,2008)。在近二十几年的技术发展中，研究者已经将这种农杆菌注射介导的瞬时转化体系应用到许多物种中，包括拟南芥，番茄，莴笋的叶片中，还有苹果，梨，番茄，桃，草莓的果实细胞中(choietal.,2004；hoffmanetal.,2006；santos-rosaetal.,2008；sohietal.,2005；voinnetetal.,1999；yangetal.,2000；wroblewskietal.,2005；spolaoreetal.,2001)，在植物抗病，启动子分析，外源蛋白的表达以及蛋白定位，蛋白之间互作关系等方面都有广泛的应用。
在白菜中农杆菌介导的瞬时表达体系的应用尚未有报道。目前，白菜稳定遗传转化工作已有了初步进展，农杆菌介导的子叶柄侵染法以及白菜春化后对花柱的农杆菌真空渗透法(lawrensonetal.,2015；heyuke,2013)。但是，这两种方法的转化效率仍然非常低，整个转化的周期长达4-5个月，对于高通量的基因功能研究以及体内基因功能的初步筛选都是非常耗时耗力的。在白菜中，利用瞬时转化体系，可以进行白菜基因的细胞定位研究，蛋白互作研究，以及注射后叶片的抗病研究等。相比获得稳定的白菜转基因植株，瞬时表达体系能够快速高通量的鉴定及筛选基因功能。不仅为大规模的基因功能筛选提供可能，而且也使转基因植株的构建更有针对性。因此，建立白菜叶片的瞬时转化体系是高效进行白菜基因功能研究所必需的。然而，白菜叶片本身很难实现液体的注射渗透，利用常规叶片注射方法并不能顺利实现转化蛋白的瞬时表达。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是如何实现白菜的瞬时转化。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种白菜瞬时转化方法。
本发明提供的白菜瞬时转化方法包括如下步骤：将目的基因导入农杆菌中，得到重组菌；用所述重组菌侵染白菜外植体，实现白菜的瞬时转化；
所述目的基因通过重组载体导入农杆菌中；
所述重组载体是将目的基因克隆至表达载体的多克隆位点得到的载体；
所述重组载体中用于启动目的基因表达的启动子为甘露醇合成酶启动子；
所述甘露醇合成酶启动子的核苷酸序列为序列表中的序列2。本发明的甘露醇合成酶启动子中含有三个重复的章鱼碱合成酶上游激活序列，三个重复的章鱼碱合成酶上游激活序列如序列2第656-1112位所示。
上述方法中，用所述重组菌侵染白菜外植体的方法包括如下步骤：将od600为0.2的所述重组菌与od600为0.1的p19菌液混匀，得到混合菌液；用所述混合菌液侵染白菜子叶。所述p19菌液为将p19质粒转化到农杆菌菌株gv3101中得到。
上述方法中，所述od600为0.2的所述重组菌与od600为0.1的p19菌液等体积混匀。
上述方法中，所述白菜外植体为白菜子叶。所述子叶为真叶刚长出时，即子叶长到最大时的子叶。
上述方法中，所述表达载体为pcambia1300载体。
上述方法中，所述重组载体为将pcambia1300载体的35s启动子替换为甘露醇合成酶启动子，且在pcambia1300载体的kpnⅰ和sacⅰ位点间连入gfp基因序列后得到的载体。
上述方法中，所述农杆菌可为常用的农杆菌菌株，如eha105或gv3101等。在本发明的具体实施例中，所述农杆菌为农杆菌菌株gv3101。
上述方法中，所述侵染的方法为注射。具体注射方法可包括如下步骤：用1ml无针头的注射器将混合菌液注射到白菜子叶中，直至水渍充满整个叶片。
上述方法中，所述侵染后还包括将所述白菜置于如下条件下进行培养的步骤：25℃条件下光照16小时，20℃条件下黑暗8小时，湿度50-60％。
本发明的另一个目的是提供甘露醇合成酶启动子的新用途。所述甘露醇合成酶启动子的核苷酸序列为序列表中的序列2。
本发明提供了甘露醇合成酶启动子在白菜遗传转化中的应用。
上述应用中，所述遗传转化为瞬时转化。
上述方法或应用中，所述白菜可为大白菜；所述大白菜品种具体可为“秦二小”和“a8尖”。
本发明在烟草农杆菌注射方法的基础之上，对注射部位，注射农杆菌浓度，注射载体等方面进行调整，建立了适用于白菜的农杆菌注射渗透介导的瞬时表达体系。通过实验证明：本发明的方法可成功实现白菜瞬时转化，且有较高的转化效率。
附图说明
图1为适宜条件下生长的白菜子叶。图1中上面两颗白菜中的箭头指向的为白菜“a8尖”的子叶，图1中下面两颗白菜中箭头指向为白菜“秦二小”的子叶。
图2为白菜叶片注射表达gfp后绿色荧光检测情况。0.8/1.0，0.3/0.5，0.1/0.2分别代表了注射时p19/gv3101菌液与pcambiasuper1300-gfp/gv3101菌液的od600值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pmdc43载体记载于文献“agatewaycloningvectorsetforhigh-throughputfunctionalanalysisofgenesplanta”中，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的p19质粒记载于文献“anefficientsystemtodetectproteinubiquitinationbyagroinfiltrationinnicotianabenthamiana”中，公众可从北京市农林科学院获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、一种白菜的瞬时转化方法
一、用于白菜瞬时转化的表达载体的构建
1、以pcambia1300载体(购自invitrogen公司)作为瞬时转化的骨架载体，将pcambia1300载体的35spromoter替换为甘露醇合成酶启动子，且在pcambia1300载体的kpnⅰ和sacⅰ位点间连入gfp基因序列(gfp基因核苷酸序列如序列表中的序列1)，得到pcambiasuper1300-gfp重组载体。pcambiasuper1300-gfp重组载体中，用于启动gfp基因表达的启动子为甘露醇合成酶启动子(superpromoter启动子，其核苷酸序列如序列表中的序列2，superpromoter启动子含有三个重复的章鱼碱合成酶上游激活序列，三个重复的章鱼碱合成酶上游激活序列为序列2第656-1112位。
2、以pmdc43载体作为瞬时转化的表达载体。pmdc43载体中包括gfp基因序列和2x35spromoter启动子。2x35spromoter启动子用于启动gfp基因表达。
二、注射菌液的制备
1、分别将步骤一中构建的pcambiasuper1300-gfp重组载体和pmdc43重组载体转化到农杆菌菌株gv3101中，分别得到重组菌pcambiasuper1300-gfp/gv3101和重组菌pmdc43/gv3101。
将p19质粒转化到农杆菌菌株gv3101中，得到重组菌p19/gv3101。
2、完成步骤1后，挑取阳性重组菌(转化成功的农杆菌)单菌落置于5mllb培养基(含载体相应抗生素卡那霉素)中28℃中震荡培养48小时。
3、完成步骤2后，将上述培养后产物转移至培养基甲中，28℃中震荡培养16小时。
培养基甲是将浓度为10mmmes(2-(n-morpholine)-ethanesulfonicacid，ph5.6)溶液、浓度为40mm的乙酰丁香酮(acetosyringone)溶液与lb培养基混匀得到的，其中，mes溶液和乙酰丁香酮溶液均按照1:100体积比加入lb培养基中。
4、完成步骤3后，当上述菌液培养至od600大约为3.0时，3200g离心10分钟，弃上清液，收集菌体沉淀。
5、完成步骤4后，分别将含有pcambiasuper1300-gfp重组载体和pmdc43重组载体的菌体沉淀用浓度为10mm的mgcl2溶液分别重悬至od600为1.5、0.8、0.3和0.1；将含有p19质粒的菌体沉淀用浓度为10mm的mgcl2溶液分别重悬至od600为1.0、0.5和0.2，分别得到od600为1.5、0.8、0.3和0.1的pcambiasuper1300-gfp/gv3101菌液和pmdc43/gv3101菌液及od600为1.0、0.5和0.2的p19/gv3101菌液。
6、完成步骤5后，向重悬后菌液中加入乙酰丁香酮，使其终浓度为200μm，并在室温静置3小时。
7、完成步骤6后，将不同浓度的菌液混匀制备注射菌液：
将od600为1.5的pcambiasuper1300-gfp/gv3101菌液与od600为1.0的p19/gv3101菌液等体积混匀，得到注射菌液a；
将od600为1.5的pmdc43/gv3101菌液与od600为1.0的p19/gv3101菌液等体积混匀，得到注射菌液b；
将od600为1.0的pcambiasuper1300-gfp/gv3101菌液与od600为0.8的p19/gv3101菌液等体积混匀，得到注射菌液c；
将od600为1.0的pmdc43/gv3101菌液与od600为0.8的p19/gv3101菌液等体积混匀，得到注射菌液d；
将od600为0.5的pcambiasuper1300-gfp/gv3101菌液与od600为0.3的p19/gv3101菌液等体积混匀，得到注射菌液e；
将od600为0.5的pmdc43/gv3101菌液与od600为0.3的p19/gv3101菌液等体积混匀，得到注射菌液f；
将od600为0.2的pcambiasuper1300-gfp/gv3101菌液与od600为0.1的p19/gv3101菌液等体积混匀，得到注射菌液g；
将od600为0.2的pmdc43/gv3101菌液与od600为0.1的p19/gv3101菌液等体积混匀，得到注射菌液h。
三、注射外植体的选择
分别选择白菜品种“秦二小”和“a8尖”的真叶(两叶一心、四片叶以及六片叶时期)和子叶(真叶刚长出时即子叶长到最大时)作为外植体进行注射。
四、注射
用1ml无针头的注射器分别将步骤二中制备的注射菌液注射到步骤三选择的外植体叶片中，直至水渍充满整个叶片。注射后将其置于光照16小时25℃，黑暗8小时20℃，湿度50-60％的条件下生长，3-5天后，通过对注射叶片在荧光共聚焦显微镜下的观察方法检测目的基因所携带的报告基因的表达情况。
五、结果
1、外植体的选择对白菜瞬时转化的影响
对白菜真叶进行注射时，注射菌液很难渗透入叶片，也并没有观察到明显的目的基因的表达情况。而对白菜子叶进行注射时，注射菌液很容易渗透入叶片，并成功观察到明显的目的基因的表达。说明白菜瞬时转化宜选择白菜子叶作为注射的外植体。
分别将注射后的白菜放置在适宜的光温湿条件(光照16小时25℃，黑暗8小时20℃，湿度50-60％)下和没有控制湿度、光照、昼夜温差不显著的条件下培养。结果表明：在适宜的光温湿条件下，注射后的白菜子叶的叶片面积明显大于没有控制湿度、光照、昼夜温差不显著的条件下的注射后的白菜子叶的叶片面积。图1为在适宜的光温湿条件下，注射后的白菜的子叶生长情况。
2、瞬时转化的骨架载体的选择对白菜瞬时转化的影响
和pmdc43载体相比，以pcambiasuper1300-gfp重组载体进行瞬时转化可观察到更加明显的绿色荧光(图2)。说明白菜瞬时转化宜选择甘露醇合成酶启动子来启动目的基因的表达。
3、注射菌液浓度对白菜瞬时转化的影响
本发明按照已有的烟草注射方法中注射菌液的浓度(注射菌液a和注射菌液b)进行注射发现：注射后的白菜子叶绝大部分都在注射后2-3小时内发生萎蔫，说明菌液浓度过高，对叶片造成了严重的伤害。使用其他注射菌液的浓度(注射菌液c、注射菌液d、注射菌液e、注射菌液f、注射菌液g、注射菌液h)进行注射发现：目的菌液od600为0.1，p19菌液od600为0.2时(注射菌液g和注射菌液h)，注射后的子叶很少出现萎蔫，且目的基因gfp在叶片中表达率高达100％(10片注射子叶)，并且gfp荧光反应的表达强度以及表达面积都远远高于其他注射菌液浓度。说明用于白菜瞬时转化的目的菌液od600宜为0.1，p19菌液od600宜为0.2。
序列表
<110>北京市农林科学院
<120>一种白菜瞬时转化的方法
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>717
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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<213>人工序列(artificialsequence)
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