本技术涉及生物制药领域，具体涉及一种低分子果胶的制备方法。
背景技术：
果胶是人体第七大营养素膳食纤维的主要成分，具有多种食用和药用价值。但是由于果胶分子量较大、并且难溶不能有效添加到保健食品中，而低分子果胶(mcp)由于水溶性好、容易被肠道吸收而进入血液循环，因此在保健食品、医药等领域的应用更加广泛。低分子果胶具有多种生物活性，可以降低血液中的胆固醇浓度、抑制肝脏中油脂的积累及提高机体免疫力等，它还可以与血液中的重金属结合进而促使其排出体外。由于具有丰富的半乳糖单体，所以低分子果胶具有抑制肿瘤的功能，对所有具有半乳糖凝集素-3的肿瘤均有作用，且其有效率与半乳糖凝集素-3的表达成正比。据文献报道，mcp对常见的19种肿瘤都有效这些肿瘤包括：前列腺癌、肾癌、卡波济氏肉瘤、慢性白血病、乳腺癌、肉瘤、卵巢癌、结直肠癌、咽喉癌、淋巴瘤,黑色素瘤、小肠肿瘤、膀胱肿瘤、肺癌、支气管癌、咽部鳞状细胞癌、肠癌、胃癌、皮肤癌、肝癌、脑癌、胶质纤维瘤、甲状腺癌和骨髓癌等。由于低分子果胶具有多种生物活性，可以开发成保健食品，在肿瘤预防与治疗、心血管疾病防治与治疗、抗菌消炎、抗氧化、抗自由基、调节免疫、降血脂等方面具有巨大的应用前景。
目前商品化果胶是从植物中提取生产，直接提取的果胶分子量在5-30万之间，因此低分子果胶只能从果胶降解获得。酶法降解是常用的生产果胶方法，但是其只能断裂果胶分子主链不能去除果胶分子的支链，因此本发明采用酸水解与酶水解结合的方法降解果胶生产低分子果胶，旨在提供一种操作简单、分子量分布单一、易于工业化生产的低分子果胶制备方法。
技术实现要素：
本发明的目的是开发一种操作简单、分子量分布单一、易于工业化生产的果胶纯化方法。
一种低分子果胶的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
(1)果胶溶解
称取一定量的苹果果胶在搅拌条件下加入到去离子水中溶解，果胶质量浓度为0.5-4％，搅拌转速为500-1500rpm，温度为20-80℃，搅拌时间1-4h。
(2)果胶溶液微滤
果胶完全溶解后依次进行孔径为0.8、0.45和0.22μm的微滤膜过滤，过滤温度为20-80℃，溶液ph值为2.5-9。
(3)凝胶清洗
过滤后的果胶溶液中加入酸溶液调节ph至1-2形成酸凝胶，快速搅拌将凝胶打碎，搅拌清洗时间为1-4h，温度为20-60℃，清洗次数为1-4次。清洗结束后减压抽滤去除70-90％体积的水分，加入碱溶液调ph至6-7溶解凝胶形成浓溶液。
(4)果胶水解
纯化后的果胶溶液加入酸溶液调节ph至1-2形成酸凝胶，加热进行酸水解，水解温度为70-90℃，水解时间为1-6h，搅拌转速为500-1500rpm。水解结束后减压抽滤去除70％-90％体积的水分，加入碱溶液调ph至6-7溶解凝胶形成溶液。
(5)果胶酶解
水解后的果胶溶液中加入果胶酶进行降解，果胶酶用量为果胶干重的0.1-10％，酶解温度为25-45℃，酶解时间为0.5-5h，底物浓度为0.1-3％。酶解结束后果胶溶液经减圧蒸留去除70-90％体积的水分形成浓溶液。
(6)乙醇沉淀
果胶溶液加入无水乙醇进行沉淀，乙醇体积浓度为50-90％，醇沉温度为2-30℃。
(7)产品干燥
果胶沉淀进行常压干燥，干燥温度为30-80℃。
上述的低分子果胶方法步骤(1)中果胶质量浓度为1-4％，搅拌转速为500-1500rpm，温度为20-80℃，搅拌时间1-4h。
进一步的，上述的低分子果胶方法步骤(2)是果胶溶液微滤，果胶溶液依次进行孔径为0.8、0.45和0.22μm的微滤膜过滤，过滤温度为20-80℃，溶液ph值为2.5-9
进一步的，上述的低分子果胶方法步骤(3)是凝胶清洗法去除杂质，果胶溶液中加入1m的hcl溶液调节ph至1-2形成酸凝胶，酸溶液浓度为0.5m-2m，所用酸为盐酸、醋酸、柠檬酸、硫酸等的一种或两种以上；快速搅拌将凝胶打碎，搅拌清洗时间为1-4h，温度为20-60℃，清洗次数为1-4次。清洗结束后减压抽滤去除70-90％体积的水分，加入1m的naoh溶液调ph至6-7溶解凝胶形成浓溶液，碱溶液浓度为0.5m-2m，所用碱为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾等的一种或两种以上。
进一步的，上述的低分子果胶方法步骤(4)是果胶水解，果胶溶液加入1m的hcl溶液调节ph至1-2形成酸凝胶，酸溶液浓度为0.5m-2m，所用酸为盐酸、醋酸、柠檬酸、硫酸等的一种或两种以上；加热进行酸水解，水解温度为70-90℃，水解时间为1-6h，搅拌转速为500-1500rpm。水解结束后减压抽滤去除70％-90％体积的水分，加入1m的naoh溶液调ph至6-7溶解凝胶形成溶液，碱溶液浓度为0.5m-2m，所用碱为的氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾等的一种或两种以上。
进一步的，上述的低分子果胶方法步骤(5)是果胶酶解，果胶酶用量为果胶干重的0.1-10％，酶解温度为25-45℃，酶解时间为0.5-5h，底物浓度为0.1-3％。酶解结束后果胶溶液经减圧蒸留去除70-90％体积的水分形成浓溶液。
进一步的，上述的低分子果胶方法步骤(6)是乙醇沉淀，果胶质量浓度为5-20％，乙醇体积浓度为50-90％，醇沉温度为2-30℃。
本发明提供的技术方案具有如下的技术优点：
(1)本发明提供的技术方案开发了一种新的低分子果胶制备方法，酸水解可以水解掉果胶分子链侧链分枝，酶水解可以降低果胶分子量。
(2)本发明提供的技术方案生产的低分子果胶分子量可控、并且分子量分布较窄。
(3)本发明提供的技术方案操作简单，易于工艺放大和工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不构成对本发明的任何限制。任何人在本发明权利要求范围内所做的任何形式的修改，仍在本发明权利要求保护范围之内。
实施例1
(1)果胶溶解
称取2.0g的苹果果胶在搅拌条件下加入到去离子水中溶解，果胶质量浓度为2.0％，搅拌转速为1500rpm，温度为30℃，搅拌时间1h。
(2)果胶溶液微滤
完全溶解的果胶溶液依次进行孔径为0.8、0.45和0.22μm的微孔滤膜过滤，过滤温度为30℃，溶液ph值为3.5。
(3)凝胶清洗
过滤后的果胶溶液中加入1m的hcl溶液调节ph至1形成酸凝胶，快速搅拌将凝胶打碎，搅拌清洗时间为2h，温度为30℃，清洗次数为2次。清洗结束后减压抽滤去除80％体积的水分，加入1m的naoh溶液调ph至6溶解凝胶形成浓溶液。
(4)果胶水解
纯化后的果胶溶液加入1m的hcl溶液调节ph至1形成酸凝胶，加热进行酸水解，水解温度为80℃，水解时间为4h，搅拌转速为500rpm。水解结束后减压抽滤去除90％体积的水分，加入1m的naoh溶液调ph至6溶解凝胶形成溶液。
(5)果胶酶解
水解后的果胶溶液中加入果胶酶进行降解，果胶酶用量为步骤(1)中果胶干重的2％，酶解温度为40℃，酶解时间为1h，底物浓度为0.5％。酶解结束后果胶溶液经减圧蒸留去除90％体积的水分形成浓溶液。
(6)乙醇沉淀
果胶溶液中加入无水乙醇进行沉淀，向果胶溶液中加入无水乙醇，乙醇体积终浓度为70％，醇沉温度为4℃。
(7)产品干燥
果胶沉淀进行常压干燥，干燥温度为60℃。
上述制备工艺获得的低分子果胶分子量为3,000dalton，收率为40.7％。
实施例2
(1)果胶溶解
称取1.5g的苹果果胶在搅拌条件下加入到去离子水中溶解，果胶质量浓度为1.5％，搅拌转速为1000rpm，温度为30℃，搅拌时间1h。
(2)果胶溶液微滤
完全溶解的果胶溶液依次进行孔径为0.8、0.45和0.22μm的微孔滤膜过滤，过滤温度为30℃，溶液ph值为3。
(3)凝胶清洗
过滤后的果胶溶液中加入1m的hcl溶液调节ph至1形成酸凝胶，快速搅拌将凝胶打碎，搅拌清洗时间为1h，温度为30℃，清洗次数为3次。清洗结束后减压抽滤去除90％体积的水分，加入1m的naoh溶液调ph至6溶解凝胶形成浓溶液。
(4)果胶水解
纯化后的果胶溶液加入1m的hcl溶液调节ph至1形成酸凝胶，加热进行酸水解，水解温度为90℃，水解时间为2h，搅拌转速为800rpm。水解结束后减压抽滤去除90％体积的水分，加入1m的naoh溶液调ph至6溶解凝胶形成溶液。
(5)果胶酶解
水解后的果胶溶液中加入果胶酶进行降解，果胶酶用量为步骤(1)中果胶干重的1％，酶解温度为40℃，酶解时间为2h，底物浓度为0.5％。酶解结束后果胶溶液经减圧蒸留去除90％体积的水分形成浓溶液。
(6)乙醇沉淀
果胶溶液中加入无水乙醇进行沉淀，向果胶溶液中加入无水乙醇，乙醇体积终浓度为70％，醇沉温度为10℃。
(7)产品干燥
果胶沉淀进行常压干燥，干燥温度为60℃。
上述制备工艺获得的低分子果胶分子量为5,000dalton，收率为40.7％。
实施例3
(1)果胶溶解
称取1.0g的苹果果胶在搅拌条件下加入到去离子水中溶解，果胶质量浓度为1.0％，搅拌转速为1000rpm，温度为50℃，搅拌时间1h。
(2)果胶溶液微滤
完全溶解的果胶溶液依次进行孔径为0.8、0.45和0.22μm的微孔滤膜过滤，过滤温度为80℃，溶液ph值为3。
(3)凝胶清洗
过滤后的果胶溶液中加入1m的hcl溶液调节ph至1形成酸凝胶，快速搅拌将凝胶打碎，搅拌清洗时间为1h，温度为30℃，清洗次数为2次。清洗结束后减压抽滤去除80％体积的水分，加入1m的naoh溶液调ph至6溶解凝胶形成浓溶液。
(4)果胶水解
纯化后的果胶溶液加入1m的hcl溶液调节ph至1形成酸凝胶，加热进行酸水解，水解温度为70℃，水解时间为5h，搅拌转速为1000rpm。水解结束后减压抽滤去除90％体积的水分，加入1m的naoh溶液调ph至6溶解凝胶形成溶液。
(5)果胶酶解
水解后的果胶溶液中加入果胶酶进行降解，果胶酶用量为步骤(1)中果胶干重的0.5％，酶解温度为35℃，酶解时间为4h，底物浓度为1％。酶解结束后果胶溶液经减圧蒸留去除90％的水分形成浓溶液。
(6)乙醇沉淀
果胶溶液中加入无水乙醇进行沉淀，向果胶溶液中加入无水乙醇，乙醇体积终浓度为50％，醇沉温度为10℃。
(7)产品干燥
果胶沉淀进行常压干燥，干燥温度为30℃。
上述制备工艺获得的低分子果胶分子量为10,000dalton，收率为41.6％。