本发明属于生物发酵行业l-异亮氨酸提取工艺，具体提供一种发酵提取l-异亮氨酸的工艺。
背景技术：
l-异亮氨酸，又称“异白氨酸”。学名“α-氨基-β-甲基戊酸”脂肪族中性氨基酸。蛋白质的基本组成。l-异亮氨酸、l-亮氨酸和l-缬氨酸统称为支链氨基酸，作为人体必需氨基酸的一种，主要用于复合氨基酸输液、三支链氨基酸输液、氨基酸口服液等，用于治疗肝病、肝昏迷、体弱乏力等症状，是氨基酸原料药的必需品，同时也可以用于食品、保健品和饲料添加剂，有很好的市场前景。
申请人之前的专利cn105274179a公开了一种提取l-异亮氨酸的工艺，其包括：1)混合发酵；2)过滤；3)浓缩重溶；4)离子交换，该工艺通过两种菌株混合发酵技术，大大提高了l-异亮氨酸的产量，较单一发酵相比提高了20％以上，但是存在两种菌株发酵工艺复杂，参数条件要求极为严格等缺陷。在此基础上，申请人需要对发酵工艺进行改进。
l-异亮氨酸基本的提取方法有：沉淀法，全膜法，离子交换法。沉淀法具有操作简单、提取产品纯度高等优点，其缺点在于沉淀剂是一种苯类物质具有致癌性，易在产品中残留，而且操作过程是强酸性提取，具有安全隐患，同时存在污水处理困难的问题。全膜法虽然废水量少，但是无法分离与l-异亮氨酸分子量相接近的杂氨基酸，导致提取出的产品杂酸高，只能靠重复结晶来制备高纯度的l-异亮氨酸。离子交换法具有成本低、操作方便、提取效果好、设备简单等优点，但该法产生的有机废水造成后期处理成本较高。目前，单一的提取方法已不能满足l-异亮氨酸生产技术的要求，需要寻求更为经济有效的方法来解决这一技术难题。
技术实现要素：
为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种发酵提取l-异亮氨酸的工艺，该工艺发酵效果高，能够有效的分离出杂酸、盐分等杂质，降低成本，减少水资源浪费，减少环境污染。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种发酵提取l-异亮氨酸的工艺，其包括如下步骤：步骤1)发酵制备l-异亮氨酸，步骤2)脱色，步骤3)浓缩和粗结晶，步骤4)除杂和结晶。
进一步地，所述工艺包括如下步骤：
步骤1)发酵制备l-异亮氨酸：
(1)将谷氨酸棒杆菌种子液按照6-8％的接种量转入发酵培养基中发酵培养，温度30℃，通风量为3-4l/min，发酵培养时间为60小时，得到l-异亮氨酸发酵液；
(2)利用陶瓷膜过滤l-异亮氨酸发酵液得到滤液a和湿菌体分离；将湿菌体进行超声处理，往经过超声处理后的湿菌体中添加1-3wt％的电气石粉，100rpm搅拌30min，然后添加到五倍重量的透析培养基中，培养温度30℃，100rpm搅拌培养6h，陶瓷膜过滤收集菌体和滤液b；
步骤2)脱色：合并滤液a和滤液b，通过脱色膜，工作温度20℃，滤过液经处理后回用，浓缩液备用；
步骤3)浓缩和粗结晶：将浓缩液经双效蒸发器浓缩3倍，然后移至结晶罐进行粗结晶，转速为10r/min，获得粗品，将粗品用6倍重量的纯水重溶，获得重溶液；
步骤4)除杂和结晶：将重溶液通入模拟移动床色谱进行除杂，获得滤液；将滤液经过多效蒸发器浓缩3倍后，再次进入结晶罐结晶，将所得晶体经离心、干燥、包装后获得l-异亮氨酸精品。
优选地，
所述发酵培养基组分为：葡萄糖10％、玉米浆3％、硫酸铵3％、碳酸钙1％、磷酸氢二钾0.5％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁0.2％、硫酸亚铁0.001％、vb10.0001％，ph7.0。
优选地，
所述发酵培养过程中，通过5m的氢氧化钠水溶液来控制发酵液的ph为7.0，通过流加浓度为100g/l的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.2％。
优选地，
所述超声处理的参数：功率为500-600w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90-120s。
优选地，
所述透析培养基为：1％磷酸二氢钾，1％磷酸氢二钾，0.5％硫酸铵，0.08％聚乙二醇6000，0.01％硫酸亚铁，0.01％硫酸镁，0.01％硫酸锌，调整ph为7.0，以上质量百分比。
优选地，
所述陶瓷膜的膜孔径40-50nm。
优选地，
所述脱色膜的孔径1-1.2nm。
本发明的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明针对微生物发酵技术的进行改进，避免l-异亮氨酸浓度积累到引起反馈抑制，针对废弃菌体进行二次处理，增加了细胞膜的通透性，提高了菌株的产酸能力；
低频超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放到细胞外；电气石能够自动释放负离子，负离子具有较强的氧化性，还持续发生直流静电，释放矿物质和微量元素，对微生物繁殖起促进作用；本发明采用透析培养基对菌株进行培养，反馈抑制调节大大降低，产酸效率提高，而且后续的残糖少，不会造成菌株黏着絮凝成团，有利用后续的膜过滤分离；透析培养基中添加适量聚乙二醇6000，具有良好的水溶性和分散性，可改变菌体细胞的生物膜结构，促进物质的利用和转运；
发酵完成后首先采用分离技术，去除含有氨基酸以及乙酸等抑制物质的发酵液，由于抑制作用解除，细胞酶活得到恢复，产酸周期延长，产酸量提高。
提取工艺中采用了陶瓷膜过滤除菌体蛋白，能够有效的过滤菌体，菌体蛋白去除率达到100％，菌体蛋白可以回用，避免了资源的浪费。
提取工艺中采取二次结晶，第一次粗结晶可以去除大部分杂质，减轻后续模拟移动床色谱的负荷和能量消耗，从而降低生产成本；整个工艺无需加入絮凝剂等化学试剂，避免了絮凝剂单体存在的安全隐患。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种发酵提取l-异亮氨酸的工艺，其包括如下步骤：
1)将谷氨酸棒杆菌atcc14309种子液(1×108cfu/ml)按照6％的接种量转入发酵培养基中培养，温度30℃，通风量为3l/min，培养时间60小时，得到l-异亮氨酸发酵液；发酵过程中通过5m的氢氧化钠水溶液来控制发酵液的ph为7.0，并通过流加浓度为100g/l的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.2％；
发酵培养基组分为：葡萄糖10％、玉米浆3％、硫酸铵3％、碳酸钙1％、磷酸氢二钾0.5％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁0.2％、硫酸亚铁0.001％、vb10.0001％，ph7.0；
利用陶瓷膜过滤l-异亮氨酸发酵液将滤液a和湿菌体分离；将湿菌体进行超声处理，超声处理的参数：功率为500w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为120s，往经过超声处理后的湿菌体中添加2wt％的电气石粉，100rpm搅拌30min，然后添加到五倍重量的透析培养基中，培养温度30℃，100rpm搅拌培养6h，陶瓷膜过滤收集菌体和滤液b；所述透析培养基为(质量百分比)：1％磷酸二氢钟，1％磷酸氢二钾，0.5％硫酸铵，0.08％聚乙二醇6000，0.01％硫酸亚铁，0.01％硫酸镁，0.01％硫酸锌，调整ph为7.0；所述陶瓷膜的膜孔径50nm；
2)合并滤液a和滤液b，通过脱色膜，膜孔径1nm，工作温度20℃，滤过液经处理后回用，浓缩液备用；
3)将浓缩液经双效蒸发器浓缩3倍，然后移至结晶罐进行粗结晶，转速为10r/min，获得粗品，将粗品用6倍重量的纯水重溶，获得重溶液；
4)将重溶液通入模拟移动床色谱进行除杂，获得滤液；将滤液经过多效蒸发器浓缩3倍后，再次进入结晶罐结晶，转速为6r/min；将所得晶体经离心、干燥、包装后获得l-异亮氨酸精品。
以100l发酵培养基为例，共获得l-异亮氨酸产品为3.02kg；l-异亮氨酸收率为96.4％，盐分子和其他杂质去除率98.9％；本发明l-异亮氨酸精品经hplc检测，纯度为99.3％，外观洁白透亮，达到医药级产品的要求。
实施例2
一种发酵提取l-异亮氨酸的工艺，其包括如下步骤：
1)将谷氨酸棒杆菌atcc14309种子液(1×108cfu/ml)按照8％的接种量转入发酵培养基中培养，温度30℃，通风量为3l/min，培养时间60小时，得到l-异亮氨酸发酵液；发酵过程中通过5m的氢氧化钠水溶液来控制发酵液的ph为7.0，并通过流加浓度为100g/l的葡萄糖溶液将残糖控制在不低于1.2％；
发酵培养基组分为：葡萄糖10％、玉米浆3％、硫酸铵3％、碳酸钙1％、磷酸氢二钾0.5％、磷酸二氢钾0.5％、硫酸镁0.2％、硫酸亚铁0.001％、vb10.0001％，ph7.0；
利用陶瓷膜过滤l-异亮氨酸发酵液将滤液a和湿菌体分离；将湿菌体进行超声处理，超声处理的参数：功率为600w，超声的作用时间为每次3s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为90s，往经过超声处理后的湿菌体中添加3wt％的电气石粉，100rpm搅拌30min，然后添加到五倍重量的透析培养基中，培养温度30℃，100rpm搅拌培养6h，陶瓷膜过滤收集菌体和滤液b；所述透析培养基为(质量百分比)：1％磷酸二氢钾，1％磷酸氢二钾，0.5％硫酸铵，0.08％聚乙二醇6000，0.01％硫酸亚铁，0.01％硫酸镁，0.01％硫酸锌，调整ph为7.0；所述陶瓷膜的膜孔径40nm；
2)合并滤液a和滤液b，通过脱色膜，膜孔径1-1.2nm，工作温度20℃，滤过液经处理后回用，浓缩液备用；
3)将浓缩液经双效蒸发器浓缩3倍，然后移至结晶罐进行粗结晶，转速为10r/min，获得粗品，将粗品用6倍重量的纯水重溶，获得重溶液；
4)将重溶液通入模拟移动床色谱进行除杂，获得滤液；将滤液经过多效蒸发器浓缩3倍后，再次进入结晶罐结晶，转速为6r/min；将所得晶体经离心、干燥、包装后获得l-异亮氨酸精品。
以100l发酵培养基为例，共获得l-异亮氨酸产品为3.07kg；l-异亮氨酸收率为96.0％，盐分子和其他杂质去除率98.5％；本发明l-异亮氨酸精品经hplc检测，纯度为99.1％，外观洁白透亮，达到医药级产品的要求。
实施例3
本发明各因素对l-异亮氨酸产品收率的影响，设置对照组：其中，对照组1：发酵完成之后，直接进入提取步骤，不采用超声处理、电气石粉处理以及透析培养处理，其余同实施例1；对照组2：发酵完成之后，只进行透析培养处理，不采用超声处理、电气石粉处理，其余同实施例1；对照组3：发酵完成之后，进行超声处理以及透析培养处理，不采用电气石粉处理，其余同实施例1；对照组4：发酵完成之后，进行电气石粉处理以及透析培养处理，不采用超声处理，其余同实施例1；检测各组别l-异亮氨酸产品的产量，以100l发酵培养基为例，具体结果见表1：
表1
结论：如表1所示，与对照组1相比，本发明实施例1、对照组2-4通过菌株二次处理均能够提高l-异亮氨酸的产量，分别是对照组1的1.39、1.23、1.33以及1.29倍，表明，超声处理、电气石粉处理以及透析培养处理均能够提高l-异亮氨酸的发酵水平，但是三种处理方式的协同性能更佳，优于单一处理方式或者两种组合处理方式。
以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。