通过试剂容器以热对流进行定量聚合酶链式反应的装置的制作方法

本发明涉及一种聚合酶链式反应的装置。更具体的，本发明涉及一种以试剂容器底部加热顶部散热的热对流，于试剂容器内建立一自下而上的温度梯度，启动并进行聚合酶链式反应的装置。

背景技术：

聚合酶链式反应polymerasechainreaction,以下简称pcr为一种快速放大dna信号的技术，其原理及主要操作步骤为(a)变性(denature)：利用高温(90～95℃)将双股dna解离成单股dna，再以单股dna作为复制的模板；(b)引子黏合(primerannealing)：温度降低到适当温度时，引子会粘附到正确的目标基因位置；(c)引子延长(primerextension)：反应温度修正到72℃，dna聚合酶将脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleotidetriphosphate,以下简称dntps)逐次粘附于引子之后，合成另一股新dna片段。

通过变性-引子黏合-引子延长三个步骤不断重复进行核酸信号放大，每重复一次三个步骤的操作，目标基因的数目就可扩增一倍，若设定三个步骤操作共进行40次循环，目标基因的数量就可以放大近109倍，pcr可体外大量获得目标基因片段，因此作为目前临床诊断大量使用的分子诊断技术之一，可应用于包含遗传疾病诊断、病原菌诊断、肿瘤癌症的诊断预后评估、以及基础研究等项目。同理，由pcr技术衍生而来的rt-pcr也具有相类似的应用原理，因此同样作为目前被临床诊断大量运用的技术。

目前常被使用来进行pcr或rt-pcr反应装置多半以温控金属可加热及冷却的特性，用来进行反复升温降温的操作，以达到pcr三个步骤的反应温度，通过加热塑料制成的试剂容器传递热量至试管内的试剂以及反应物(其内包含目标基因的片段)，来达成目标基因信号放大的效果。但此种利用温控金属反复升降温的机台一般而言体积较大，此为求有效温控，整个温控系统必须具有较大的体积及热容比，且依照目前机台的设计，多数时间用于等待温控金属的升温或降温至反应温度，如以一般试验所需的循环次数约为30-35次左右，则利用传统机台所需反应时间约介于二至三个小时间，造成反应时间较难缩减，也因此无法应用于需要在极短时间得知结果的试验。

为了改良传统pcr机台的问题，研究人员开发将微流体芯片应用于pcr的技术。微流体芯片的特点是将检测程序中所需利用的种种元件，如混合反应槽、加热反应槽、分离管道，与检测槽等，以特殊加工技术于玻璃、塑胶、或是硅胶类材料上刻蚀出微米等级的反应管道及分析元件，再通过外加电压所产生的电渗流，或利用微型泵浦或离心力的方式，驱动待测物或指定试剂在各元件间相连的微管道中移动，以完成检测；若是试剂中有添加荧光物质或具有专一性的探针，亦可于芯片中加入检测荧光的机构以利进行目标基因定量，此种一体成型的多功能芯片，也称之为“实验室平台芯片”(lab-on-a-chip)。由于所有分析均在微米管道中进行，因此不仅只需极少量的试剂及反应物即可完成检验，也因系统热传导效率相较于传统机台高出许多，使得分析时间也可相对缩短。目前已开发的pcr生物芯片包含了微温度感测器、微加热器及微控制器。由于感测器及加热器都整合在pcr芯片的内部，芯片得以快速且准确执行温度的循环控制，其温度控制是三个温度，分别是变性(约90～95℃)、引子黏合(50～65℃)、以及引子延长(72℃)三个不同的温度区间，并视测试需求决定循环次数。此种微流体芯片的技术与传统pcr技术相较，其优点在于因微流体芯片减少试剂或反应物的体积以及整体热容比，因此可减少反应时间以及试剂的消耗，但由于此技术仍需要反复在三个不同温度区间升降温，因此仍存在有升降温时间过长的问题。另一种已开发的微流体芯片则排除加热器反复升降温的设定，此系统利用特殊设计的推动力对流道内的反应物及试剂加压，使反应物及试剂在特殊加工设计的流道中，反复流经三个不同的温度区间，而完成目标基因放大的效果。利用此种技术进行pcr虽可以排除因升降温造成的时间耗费，但由于此种技术的系统需要包含复杂的加压系统及液体驱动系统，且液体驱动系统又与液体的体积极粘度息息相关，造成系统及仪器制作及调控上的困难，因此也间接地限制了此种技术的发展。

研究人员亦开发另一种利用热对流循环在不同位置达到不同温度藉此使内部试剂及反应物得以进行pcr的技术来解决传统pcr机台高电容比及高耗时的问题。此种技术利用一高温一低温的热源，对一封闭式且内含试剂及反应物的试管上下端进行加热，通过上下端温差进驱动试管内的液体流经不同的温度区间以进行pcr反应。此种技术虽然克服了加热器因反复升降温而造成的时间耗损，亦不需要通过外部加压的方式来驱动试管内的液体流动循环，但此种双热源加热的技术为排除外界温度的干扰，两个热源需要有个别的温控系统(包含温度感测器)，亦需处理调控二者温度差异以利形成引子粘合所需的反应温度，因此在温度调节部分产生相当复杂的调控机制，兼以加热器多半为块状金属，因此机台的体积因无法降低热容比而无法缩小，且其复杂的温控机制及金属加热系统亦使制造费用居高不下。鉴于上述问题，本发明揭露一种可以解决前述机台体积过大、或反复升降温造成时间耗损问题的聚合酶链链式反应装置。

技术实现要素：

本发明涉及一种热对流式聚合酶链式反应的装置。此装置利用透明导电物质(transparentconductivematerial)涂布的玻璃，或称透明导电薄膜(transparentconductivethinfilm)作为加热装置，并于其上设有温度感测器用以检测加热装置的温度。装置启动后，将添加有反应物及试剂的试剂容器底部与加热装置接触，热源经由透明导电薄膜由试剂容器底部传导至试剂容器中，试剂容器内较靠近底部接触部位的液体首先开始加热，并通过试剂及反应物的对流逐渐将热量传递至较远离接触部位的液体，越远离接触部位的试剂及反应物，其温度会越低，通过不断的热对流循环，试剂容器内部的试剂及反应物将呈现一连续性温度梯度分布的情形。当较靠近接触部位的反应物及试剂加热至95℃时，该部位的反应物及试剂即开始进行变性(denature)的步骤，通过试剂容器内部的热对流循环达到进行引子粘合(primerannealing)以及引子延长(primerextension)的温度，因此此二步骤亦随之循环进行，通过此装置即可达到pcr的效果。

为了确保试剂容器内的温度循环可以顺利进行pcr而不受外界气温的影响，本发明包含一个用于容纳试剂容器的容置空间，且该容置空间分为上下半部。上半部的容置空间可与外部空间联通，并包含有可调控式的风扇、加热线圈，以及通风口，此设置为将容置空间上半部的温度维持在一定温度区间内，以利反应顺利进行；反之，若一仪器未设置此种上部容置空间，而任由试剂容器的顶部暴露于开放环境中，则必然面临环境温度不同和空气流动，此将造成试剂容器顶部温度的不同，进而影响试剂与反应物的热对流温度，而导致pcr无法顺利进行的结果。容置空间的下半部除可容纳试剂容器置放的开口外，并未有其他与外界连通的开口，因此，当试剂容器置放完成后，此容置空间的下半部区域即成为一个密闭空间，该段位于容置空间的试剂容器就不会暴露于外界温度和气流等的不稳定环境中，当装置运作时，位于下半部的试剂容器热循环就不会受到外界温度和气流的变异而影响其内的反应进行，亦可确保此段试剂容器内试剂及反应物的温度循环稳定性。

换句话说，为排除因场域不同造成外部环境温度不同，对于本装置热循环效能带来的影响间接造成pcr反应的成败，且又有足够温差形成试剂容器内部热循环，本发明进一步对于容置空间上下半部的温度区间加以设定。本发明对于容置空间上半部的温度设定界于25℃至38℃之间，当容置空间上半部的温度高于设定温度时，即通过风扇及通风口的协助进行散热；反之当该温度低于设定温度时，即通过加热线圈进行加热，使上半部容置空间的温度恢复至设定温度。本发明对于容置空间下半部的温度则通过设定透明导电薄膜的加热温度界于95℃至160℃之间，来进行对于容置空间下半部的温度管控。

若是反应试剂中有加入荧光物质或专一性的探针，本发明亦可加入光源及搭配光信号接收器(lightreceiver)来检测产生的荧光，进而针对反应物进行定性、半定量、或者定量。本发明可应用的光源包含有led灯、激光灯、或其他光波长与荧光物质或专一性探针波长相符的光源等，而可应用的光信号接收器则包含有光电二极管(photodiode)、光电倍增管(photomultiplier)、感光耦合元件(chargecoupledevice,ccd)与互补式金属氧化物半导体(complementarymetal-oxide-semiconductor,cmos)等。当pcr产物生成时，利用具有特定波长的光源激发荧光物质或专一性探针产生特定波长的荧光，并利用光信号接收器接产生的荧光信号，如此配置则可使本发明应用于定性、半定量、或者定量pcr产物的浓度。若反应试剂中包含两种以上的荧光物质或专一性探针，则可通过扩充光信号接收器及光源的数量，达到同时检测两种以上荧光信号的效果。

在本发明中，光源与光信号接收器的相对位置并无固定，光源若由试剂容器侧边激发荧光物质或单一性探针，则光信号接收器可设置于试剂容器底部、顶部或其他可排除光源干扰的位置来接收产生的荧光信号；反之，光源若由试剂容器底部激发荧光物质或单一性探针，则光信号接收器可设置于试剂容器侧边、顶部或其他可排除光源干扰的位置来接收产生的荧光信号。在下述本发明的一较佳实施例中，光源与光探测元件分别位于试剂容器底部以及试剂容器侧边，二者的相对位置为垂直或接近垂直的角度，此设置乃为避免光信号接收器所接收的信号并非试剂容器内产生的荧光，而是试剂容器反射光源的信号，进而影响检测准确性所致。

本发明亦包含温度调控装置，包含有透明导电薄膜、温度感测器、温度调控器、导电泡棉、及接点(在后述实施例中，即为导热贴片)。透明导电薄膜不仅具有导电性，同时具有透光性，主要应用于平板显示器和建筑两大领域。透明导电薄膜主要可分为金属薄膜与金属氧化物薄膜，其中，金属氧化物薄膜导电性相当优良，接上电源后即可立刻开始进行加热，并在极短时间内就可加温至预设温度，不但具有传统加热金属可快速加热的优点，且无传统加热金属体积过大的缺点；同时，透明导电薄膜亦具有高度透明性，因此应用层面广泛。一般而言，透明导电物质多为氧化锡、氧化铟、氧化锌、或氧化铟锡等物质，本发明亦采用前述几类物质用来涂布玻璃。此外，若光源使用多波长光源，如led，此时，亦可在涂布有透明导电物质的另一侧施用(喷涂、蒸镀、溅射等)过滤非专一性光源的短波通滤光物质，将无法激发荧光物质或专一性探针的光源滤掉，仅容许可激发荧光物质或专一性探针的光源通过透明导电薄膜及试剂容器并激发其内的荧光物质或专一性探针，如此可以使光信号接收器所测得的光信号确实为pcr产物的荧光信号。

在本发明中，当内含反应物及试剂的试剂容器与已加热的透明导电薄膜接触时，接触部位的液体随即开始升温，并通过热对流的方式在试剂容器内进行热循环，当透明导电薄膜的温度已达设定温度，则温度感测器将检测到此状况，并降低或维持加热器的热源输出，使透明导电薄膜不会再继续升温而维持在适当的反应温度；反之，若透明导电薄膜的温度已经低于设定温度时，温度感测器将会提高加热器的热源输出，使透明导电薄膜升温至预设的温度以利pcr反应顺利进行。当试剂容器内的pcr开始产生产物，光源亦可穿透透明导电薄膜激发产物产生荧光并被光信号接收器检测。另外，接点则是应用于输送电源供应器传递的电流，且接点的位置与透明导电薄膜位于同一侧。

本发明包含一光源调控装置，用于调节光源启动或关闭，以利进行荧光激发。本发明亦包含一个或一个以上的处理器，用于协调处理温度调控装置及光源调控装置；此外该处理器亦可用于接收一种或一种以上经由光信号接收器传送的荧光信号，并通过处理器的内建程序分析判断信号的强度及种类，通过程序运算可得一种或一种以上目标基因的浓度，或目标基因是否确实存在于该反应物中。

本发明揭露的装置利用透明导电薄膜而非传统加热器缩小整体装置的体积，又通过试剂容器内液体热对流的方式达到pcr反应温度而省去加热器反复升降温的过程而得以节省整体反应时间，并通过上下层容置空间分别进行温度调控的机制，并且可在短时间内达到目标基因定性及定量的效果。

为了达成前述目的，依据本发明提供一个较佳实施例如后。

附图说明

图1是本发明的装置外观图。

图2为包含本发明架体、穿孔及试剂容器相对位置的示意图。

图3为本发明的夹持空间侧剖面示意图。

图4为本装置中第一架体上平面示意图。

图5为本装置中第一架体下平面示意图。

附图标号

1装置

10第一架体

101第一穿孔

102试管

103风扇

104通风口

105加热线圈

106第一温度感测器

20第二架体

201第二穿孔

202夹持凹槽

30-1上部容置空间

30-2下部容置空间

401第一光电二极管

402第二光电二极管

50玻璃装置

501玻璃装置上平面

502透明导电薄膜

601导电泡棉

602导热贴片

603第二温度感测器

70第三架体

701第三穿孔

80光源

90-1光源调控器

90-2第一温度调控器

90-3第二温度调控器

100处理器

1010第四架体

1020电源供应器

1030底板

具体实施方式

以下即配合附图详细说明本发明的一较佳实施例的结构及功效。另外，本说明书中对于机构或其部位在其位置描述上冠以“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”等，对应于使用者在操作本较佳实施例时的空间关系。

请参考图1，本发明一较佳实施例的热对流式聚合酶链式反应装置1组装外观及如图所示。请参考图2、图3、及图4，本发明一较佳实施例装置1包含一第一架体10、一第二架体20、一第三架体70、一第四架体1010、一底板1030、一上部容置空间30-1、一下部容置空间30-2。第一架体10具有第一穿孔101、一风扇103、通风孔104，其中第一穿孔101可供装有试剂及反应物的试管102插入。请参考图5，第一架体10下表面则包含一加热线圈105及一第一温度感测器106，第一温度感测器106用于感测上部容置空间30-1的温度。前述加热线圈105用于接受信号并进行加热以提高上部容置空间的温度，反之，前述风扇103与四通风孔104则用于散热以降低上部容置空间的温度。

请参考图2及图3，第二架体20具有第二穿孔201以及一夹持凹槽202，第二穿孔201可供前述试管102插入并将试管102固定于夹持凹槽202的上方，夹持凹槽202亦可用于容置一透明导电薄膜50。透明导电薄膜50未与前述试管102接触那一面包含有一导热贴片602。第三架体70位于第一架体10与第二架体20之间，且与第一架体10与第二架体20大约平行，第三架体70包含有第三穿孔701。第一架体10与第三架体70间存有一没有内部隔间的上部容置空间30-1，第三架体70与第二架体20间则存有一有内部隔间的下部容置空间30-2，下部容置空间30-2内部以板材隔间，且其30-2数量与一次可置放的试管102数量相同。此外，第一穿孔101、第二穿孔201、与第三穿孔701的数量亦与一次可置放的试管102数量相同。

试管102放置时，将依序穿过第一穿孔101、第三穿孔701、与第二穿孔201，试管102尾端则与透明导电薄膜50的上平面501接触而固定，则此时上部容置空间30-1会成为一半开放空间，而下部容置空间30-2即成为一密闭空间，置于其内的该段试管102就不会暴露于空气中。

请参考图2，在此实施例中，光信号接收器为光电二极管，本实施例包含两组光电二极管401和402，可分别可检测不同波长的荧光，两组光电二极管401和402分别位于试管102的侧边，并约略与试管102呈现垂直状态，此乃为确保接收到的光电信号并非试管102反射的信号。

请参考图2，本发明尚包含一第四架体1010、一电源供应器1020、一底板1030、一光源80、一第一光源调节器90-1、一第一温度感测器90-2、一第二温度感测器90-3、一处理器100，以及一由一玻璃装置50、一接点组成的玻璃装置，在本实施例中，接点为一导热贴片602。第四架体1010约略与第二架体20大约平行，通过一固定于其上的导电泡棉601与透明导电薄膜502接触。玻璃装置50上平面，亦即其与试管102接触的一面，涂布有短波通滤光物质用以过滤隔离光源80中非专一性的波长，此为增进激发荧光物质或专一性探针的效能。玻璃装置50下平面则为一透明导电薄膜502，透明导电薄膜502利用氧化铟锡涂布于与透明玻璃的一侧。此外，玻璃装置50的形状与体积约略等同于可容置其的夹持凹槽202。

导电泡棉601固定于第四架体1010上靠近夹持凹槽202处，且当本装置1开始运作时，第四架体1010与第二架体20即紧密贴合。导电泡棉601用于将接收到的电能传递至透明导电薄膜502上，使透明导电薄膜502开始加热。第四架体1010未与透明导电薄膜502接触的一侧则包含有一第二温度感测器603，用于感测透明导电薄膜502的温度。前述导热贴片602用于将透明导电薄膜502开始被加热时，将其上的热能传导至前述第二温度感测器603，使该第二温度感测器可以测量透明导电薄膜502的温度。

底板1030用于提供光源80、光源调控器90-1、第一温度调控器90-2、第二温度调控器90-3、处理器100、及电源供应器1020固定使用。光源80用于提供激发荧光物质或专一性探针所需的光线，在本实施例中，利用led灯作为激发光源80，且光源80开关或强弱则受光源调节器90-1的调控。电源供应器1020与处理器100亦固定于底板1030上，处理器100用于接收光源调控器90-1，亦接收第一温度感测器106、第二温度感测器603的信号，加以分析后再调控第一温度调控器90-2与第二温度调控器90-3分别进行温度控制，同时处理器100亦可接收两组光电二极管401和402测得的信号，并针对此信号进行分析，电源供应器1020则用于提供本装置1所需的电源。

当装置1开始运作时，将装有试剂及反应物的试管102置入第一架体10的第一穿孔101中，并依序穿过第三架体70的第三穿孔701及第二架体20的第二穿孔201并将试管102底部碰触到玻璃装置50的玻璃装置上平面501，此时，试管102内的液面高度约略与下部容置空间30-2等高，且此时下部容置空间30-2变成一完全封闭空间，而上部容置空间30-1则为一半开放空间，同时第一温度感测器106开始测量上部容置空间30-1的温度并回报给处理器100昨为环境温度的监控。

电源供应器1020通过导电泡棉601传递电流给透明导电薄膜502并开始加热，并通过导热贴片602将透明导电薄膜502的温度传递给第二温度感测器603，第二温度感测器603再将测得的温度回馈给处理器100。在本实施例中，反应进行时，透明导电薄膜502加热的温度设定于125℃，因此，若第二温度感测器603测得的温度低于设定温度时，此时处理器100会通知第二温度调控器90-3开始进行升温，当透明导电薄膜502温度升温至指定温度时，处理器100停止升温。反之，若第二温度感测器603测得的温度已高于设定温度时，此时处理器100会通知第二温度调控器90-3开始进行降温，当透明导电薄膜502温度降温至指定温度时，处理器100停止降温。

透明导电薄膜502开始加热后，试管102底部因与玻璃装置上平面501接触，热量通过传导的方式使试管102底部的试剂及反应物也一起加热。加热一段时间后，试管102内的试剂与反应物亦开始受热并形成一热对流循环，由于该试剂与反应物在试管102内的高度与下部容置空间30-2约略等高，且下部容置空间30-2在试管102置入装置1后为一完全密闭空间，因此，此段试管102内部的热循环就不会受到外界温度的变异而影响其内的温度。

试管102位于上部容置空间30-1的部分亦会因试管内反应物及试剂的热对流而升温，进而造成上部容置空间30-1的空气温度亦随之提高，此时，第一温度感测器106检测上部容置空间30-1的温度后，再将测得的温度回馈给处理器100，在本实施例中，设定上部容置空间30-1的温度应保持于28℃，因此，若反应进行中，第一温度感测器106测得的温度低于设定温度时，此时处理器100会通知第一温度调控器90-2启动加热线圈105开始进行升温，当上部容置空间30-1温度升温至指定温度区间时，处理器100停止加热线圈105升温。反之，若第一温度感测器106测得的温度已高于设定温度时，此时处理器100会通知第一温度调控器90-2开始进行降温，并同时启动风扇103通过通风口104进行降温，当降温至指定温度时，处理器100停止风扇103降温。

当试管102内部热循环的温度达到pcr三个反应温度时，pcr反应随即开始进行。pcr反应开始进行时，位于底板1030上的光源调控器90-1随即打开光源80，光源80穿透透明导电薄膜502，非特定频宽的光源80被玻璃装置上平面501的短波通滤光物质过过滤，只留下特定频宽光源80穿过短波通滤光物质并激发试管102内预先填装的二种不同专一性的探针，当荧光产生后，随即被第一光电二极管401及第二光电二极管402分别测得，检测到的信号随即被传送至处理器100进行数据分析。当pcr反应结束后，处理器100会协调光源调控器90-1关闭光源80，亦会协调电源供应器1020停止供应电源至导热贴片60，此时透明导电薄膜502就不会再继续升温，处理器100会将所有从第一及第二光电二极管401和402接收到的信号进行数据分析并输出分析结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明权利要求所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。