胶质瘤预后标志物circ7:73686636|73687095及应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种用于胶质瘤预后的circrna标志物、以及检测该标志物的试剂用于制备胶质瘤预后制剂的应用、还有试剂盒。
背景技术：
：胶质瘤是颅内最常见的发病率和恶性程度较高的颅内肿瘤，目前对胶质瘤的治疗主要是手术切除为主，再辅以放化疗。但是，即便如此患者的复发率依然很高，2年存活率仅为5％，恶性胶质母细胞瘤平均生存期仅为14个月左右。导致胶质瘤难以治愈的主要因素之一是胶质瘤本身呈现侵袭性生长，肿瘤细胞与正常脑组织的界限十分模糊而难以做到手术完全切除；此外，由于胶质瘤细胞的快速增殖导致了局部肿瘤缺氧微环境的形成,在缺氧微环境下存活下来的肿瘤细胞具有更强的肿瘤恶性表型，是胶质瘤复发和术后放化疗抵抗的重要因素。因此，寻找胶质瘤预后标志物对患者进行预后分析，以提高胶质瘤患者的术后生活质量，并相应地选择合理的后续治疗方案，提高生存率，是神经科学领域亟待解决研究任务。circrna是一类广泛且多样地存在于哺乳动物细胞中、具有调控基因表达作用的内源性非编码rna分子，具有共价闭合的环形结构，广泛存在于各种细胞中，也是继microrna(mirna)后rna家族的最新研究热点。近年来，随着深度测序技术的广泛应用和生物物理和信息学技术的快速发展，人们发现人类许多外显子的转录本可被非线性地反向剪接或通过基因重排而形成circrna，且它们在所有剪接转录本中占了相当大的比例。近年来逐渐发现外泌体中也含有大量的circrna，可能发挥重要作用。目前，由于circrna具有丰富性、稳定性、高保守性和时空特异性等特点，在肿瘤诊断标志物方面正发挥越来越大的作用。技术实现要素：本发明的第一个目的是：提供一种用于胶质瘤患者预后的胶质瘤组织来源的circrna标志物circ7:73686636|73687095，其序列如seqno:1所示。本发明的第二个目的是，提供检测所述的circrna标志物在胶质瘤组织中表达量的试剂在制备胶质瘤预后制剂中的应用。本发明的第三个目的是，提供一种胶质瘤预后试剂盒，能够测定胶质瘤组织中的circ7:73686636|73687095的含量。所述的胶质瘤预后试剂盒，含有检测circ7:73686636|73687095含量的pcr引物。优选引物的序列如seqno:2和3所示。所述的胶质瘤预后试剂盒，除circ7:73686636|73687095的引物外，还含有从胶质瘤组织中提取rna并进行逆转录及荧光定量pcr的所有试剂。包括：(1)从胶质瘤组织中抽提总rna所用试剂，包括rna稳定溶液、trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总rna为模板将circ7:73686636|73687095逆转录为cdna所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、rna酶抑制剂、mmlv逆转录酶以及circ7:73686636|73687095所用随机引物；(3)将cdna实时定量pcr所用试剂，包括circrnacirc7:73686636|73687095实时荧光定量pcr特异性引物、gapdh内参特异性pcr引物、实时荧光定量sybr染料、无酶水。本发明研究证实胶质瘤组织来源的circrnacirc7:73686636|73687095可用于胶质瘤患者预后分析，胶质瘤组织来源的circrnacirc7:73686636|73687095表达量与患者术后生存率具有相关性。因此，可用于胶质瘤患者的预后分析。申请人通过荧光定量pcr对40例胶质瘤组织与19例正常脑组织进行分析发现，circ7:73686636|73687095在两者中的表达差异明显(p＝0.0487)，后对其中12例胶质瘤患者进行生存曲线分析，发现胶质瘤组织来源的circrnacirc7:73686636|73687095与患者的生存率相关(p＝0.033)，含量越低，生存率越高。此法为胶质瘤的预后分析提供了强有力的技术支持，有助于提高胶质瘤患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义和推广性。附图说明图1为实时荧光定量pcr分析circ7:73686636|73687095在胶质瘤组织与正常脑组织中表达差异。图2为roc曲线分析脑组织来源的circ7:73686636|73687095对胶质瘤与正常脑组织差异的特异性、灵敏性；circ7:73686636|73687095作为生物标记物对胶质瘤具有较高诊断价值，auc＝0.833，p＝0.007，敏感度和特异度分别为66.7％和90.9％。图3为生存曲线分析胶质瘤组织来源的circ7:73686636|73687095表达量与患者生存率的相关性。具体实施方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1：制备检测circrnacirc7:73686636|73687095表达量的试剂用于制备胶质瘤患者预后的试剂盒(50次反应)1.rna稳定溶液50ml2.异丙醇100ml3.三氯甲烷100ml4.trizol(来自molecularresearchcenter公司)50ml5.无酶水10ml6.1μm随机逆转录引物(thermo公司)50μl7.5×逆转录缓冲液(thermo公司)200ml8.10mm三磷酸碱基脱氧核苷酸(thermo公司)100μl9.40u/μlrna酶抑制剂(thermo公司)500μl10.200u/μlmmlv逆转录酶(thermo公司)50μl11.premixextaq(thermo公司)50μl12.10μmcircrnacirc7:73686636|73687095实时荧光定量pcr特异性引物30μlcircrnacirc7:73686636|73687095正向引物：5’-ttaccctgatgggtgtggaga-3’circrnacirc7:73686636|73687095反向引物：5’-ccccagaatctcacccaatatcc-3’13.10μmgapdh特异性引物30μl正向引物为5′-atcatcagcaatgcctcct-3′反向引物为5′-catcacgccacagtttcc-3′。实施例2circrnacirc7:73686636|73687095在胶质瘤组织中的表达量与预后的关系1、胶质瘤组织的保存：收集待测胶质瘤组织存放于盛有rna稳定溶液的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。2、组织中rna的抽提：取适量标本于经180℃烘烤6-8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1mltrizol研钵标本，研磨成液体状后移至tube管，加氯仿200μl于tube中，用手震荡15-30s，冰上放置15min，4℃12000rpm离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml混匀，冰上静置20min，4℃12000rpm离心10min；弃上清，加入75％depc水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃，7500rpm离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入depc水10-20μl溶解rna。分光光度计测rna的浓度及质量，od260/280比值在1.8-2.0之间，-80℃保存。3、circrnacirc7:73686636|73687095逆转录：使用thermo公司的逆转录试剂盒。20μl逆转录反应的体系如下：成分剂量/管随机逆转录引物(1μm)1μlrna样本2μg无酶水to12μl逆转录第一步条件：65℃5分钟成分剂量/管5×逆转录缓冲液4μl三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mm)2μlrna酶抑制剂(40u/μl)1μlmmlv逆转录酶(200u/μl)1μl第一步逆转录的产物12μl总体积20μl逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。4、汉恒生物科技(上海)有限公司合成的circrnacirc7:73686636|73687095特异性引物进行实时定量pcr:先将逆转录产物稀释10倍，混匀。20μl反应体系如下：成分剂量/管sybrpremixextaq10μl特异性引物(上下游均10μm)0.5μlcdna产物(稀释后)5μl无酶水to20μlpcr的特异性引物：正向引物：5’-ttaccctgatgggtgtggaga-3’，反向引物：5’-ccccagaatctcacccaatatcc-3’。gapdh内参特异性pcr引物：正向引物为5′-atcatcagcaatgcctcct-3′，反向引物为5′-catcacgccacagtttcc-3′。实时荧光定量pcr反应程序：95℃3分钟,40个循环，95℃10秒，60℃30秒。5、2-δδct的标定：用2-δδct表示对于对照组变化的倍数，其中△ct＝ct样本–ct内参，△△ct＝△ct病例–△ct对照。本实验数据采用相对定量的分析方法，gapdh作为内参基因，胶质瘤患者△ct的平均值为对照。数据利用软件graphpadprism和spss进行分析。6.对12位患者预后生存曲线分析发现，与胶质瘤组织中circrnacirc7:73686636|73687095高表达(高于平均值)的患者相比，胶质瘤组织中circrnacirc7:73686636|73687095低表达(低于平均值)的患者存活率更高，差异有显著性(p＝0.033)，见图3。以上研究表明，circ7:73686636|73687095可作为胶质瘤患者预后的特异性分子标志物。序列表<110>中南大学湘雅医院<120>胶质瘤预后标志物circ7:73686636|73687095及应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>460<212>rna<213>智人(homosapiens)<400>1cucacggaugauugauauccagaccaggauggcugggcgagcauuggagcuucuuuaucu60gccagagaauaagcccuguuaccugcuggauauugggugagauucuggggccugguucag120auugucuaagguggugaagugucuuuguaaacugacccugagugucuggucaugucuucc180agcuguggcacugggcugaguggaaguuaucugucagaugaagggcacuauugggugggc240cuggauaucagcccugccaugcuggguaaguauguccugucuggcaccaggguggauuac300ccugauggguguggagaagccacagguauuucucuuucucugacugccuuuucucuaaug360uagaugaggcuguggaccgagagauagagggagaccugcugcugggggauaugggccagg420gcaucccauucaagccaggcacauuugaugguugcaucag460<210>2<211>21<212>dna<213>未知(unknown)<400>2ttaccctgatgggtgtggaga21<210>3<211>23<212>dna<213>未知(unknown)<400>3ccccagaatctcacccaatatcc23<210>4<211>19<212>dna<213>未知(unknown)<400>4atcatcagcaatgcctcct19<210>5<211>18<212>dna<213>未知(unknown)<400>5catcacgccacagtttcc18当前第1页12