本发明涉及十字花科蔬菜育种技术领域，更具体地，涉及一种芥菜原生质体的提取方法及芥菜杂种原生质体的融合方法。
背景技术：
细胞质雄性不育是十字花科蔬菜杂种优势利用的主要途径。通常是利用不同来源的细胞质雄性不育源，通过杂交和多代回交，选育不育性稳定地细胞质雄性不育系为骨干材料，配制出综合性状优良的杂种一代。通过细胞质雄性不育系进行优势育种，克服了以往十字花科蔬菜采用自交不亲和系所带来的不亲和性难于保持、自交多代易发生双亲生活力衰退以及容易出现假杂种等弊端，但是往往由于核质互作不配套导致的后代植株表型上的不足，不能满足杂种一代的经济性状的要求，引起制种产量低，不利于芥菜新品种的推广。因此，探究利用新的技术手段(如细胞工程和生物技术)改良芥菜不良性状，有重要的理论和育种实践意义。
芥菜起源于中国，由于芥菜花器官小，是常自花授粉作物，自交亲和性好，因此细胞质雄性不育系是芥菜杂种优势利用的主要途径。芥菜haucms是华中农业大学1999年发现的一种新的细胞质雄性不育类型，通过对芥菜haucms的不育性评价、线粒体不育基因的分子鉴定、不育基因克隆、转基因功能验证及线粒体基因组测序，明确了芥菜haucms是一种十字花科作物胞质不育新类型。本发明所采用的芥菜细胞质雄性不育系fany-9a材料，是通过芥菜型油菜haucms与分蘖芥菜(雪里蕻)自交系杂交和回交，选育获得分蘖芥菜(雪里蕻)hau胞质雄性不育系。但是该杂交后代存在种荚弯曲畸形，不直立，导致后代结籽率不高，制种产量偏低。
细胞融合是一种细胞工程技术，是一种细胞水平上对作物进行遗传改良的手段，是对传统育种技术的一种提升，可用于改良原有材料或创制新的种质材料。细胞融合技术将2个不同的材料进行细胞质和细胞核融合，可极大程度地缩短育种周期，增加杂种后代的多样性，育种工作者可以筛选大量高质量的原生质体获得期望的优良表型，但是提高细胞融合效率一直是该技术的关键问题。
技术实现要素：
为了解决目前芥菜原生质体提取过程中原生质体量少、易破裂且提取效果不稳定的问题，本发明的第一目的在于提供了一种芥菜原生质体的提取方法。
该提取方法包括如下步骤：
1)使用酶解液将芥菜无菌苗的真叶酶解，得到芥菜粗原生质体液；所述酶解液由体积比为3:(5-10)的酶液与scw液组成，所述酶液包括0.3％-1.0％纤维素酶、0.05％-0.2％果胶酶、0.1m-0.5m甘露醇和70mm-80mmcacl2；所述scw液包括0.3m-0.8m山梨醇、8mm-15mmcacl2和2mm-10mmmes；
2)向步骤1)的芥菜粗原生质体液中加入w5溶液，离心后向沉淀中加入w5溶液重悬后加入到含有mes的蔗糖溶液中，离心取层析液，所述层析液即为含有所述芥菜原生质体的溶液。
其中，步骤1)中所述酶液包括0.5％纤维素酶、0.1％果胶酶、0.2m甘露醇和80mmcacl2，所述酶液的ph为5.6；所述scw液包括0.5m山梨醇、10mmcacl2和5mmmes，所述scw液的ph为5.8。
在一个优选实施方式中，酶液与scw液的体积比为3:7。
其中，步骤1)中所述酶解的时间为14h～16h，优选为14h。
其中，步骤1)中所述酶解的温度可以为25℃，酶解的转速为50～60rpm，转速优选为54rpm。
其中，步骤1)中，所述酶解液的加入量以20～30片真叶加8-15ml酶解液为准。优选以20～30片真叶加10ml酶解液为准。
其中，真叶的长优选约为15～20mm，宽约为7～10mm，厚约0.5mm～0.8mm。
其中，步骤2)中所述w5溶液包括154mmnacl、125mmcacl2、5mmkcl和5mm葡萄糖，所述w5溶液的ph为5.8。
其中，“向步骤1)的芥菜粗原生质体液中加入w5溶液”中粗原生质体液与w5溶液的体积比优选为1:1。
其中，步骤2)中“向步骤1)的芥菜粗原生质体液中加入w5溶液，离心后向沉淀中加入w5溶液重悬”具体包括：
向芥菜粗原生质体液中加入w5溶液，以转速为700-1000rpm/min离心5-10min，去掉上清液后再加入2mlw5溶液重悬，重悬后取沉淀。
其中，含有mes的蔗糖溶液中蔗糖为0.5m，mes为1mm，所述含有mes的蔗糖溶液的ph为5.8。其中，含有mes的蔗糖溶液优选为5ml。
其中，芥菜无菌苗的真叶的获取步骤优选为：用芥菜的种子通过组织培养获得无菌苗。优选选用在组织培养时第一到第三片真叶长成的时间取无菌苗真叶，通常在组织培养三周左右时取无菌苗的真叶，此时酶解效果最佳。
其中，本发明提供的提取方法尤其适用于芥菜细胞质雄性不育系fany-9a或芥菜细胞质雄性保持系fany-9b。
当芥菜为芥菜细胞质雄性不育系fany-9a或芥菜细胞质雄性保持系fany-9b时，芥菜无菌苗的真叶的获取步骤可以为：
用芥菜细胞质雄性不育系fany-9a或芥菜细胞质雄性保持系fany-9b的种子，通过组织培养获得无菌苗。优选选用在组织培养时第一到三片真叶长成的时间取无菌苗真叶，通常在组织培养三周左右时取无菌苗的真叶，此时酶解效果最佳。
本发明的第二目的在于提供了一种芥菜杂种原生质体的融合方法，该融合方法包括：将含有芥菜细胞质雄性不育系原生质体的溶液与含有芥菜细胞质雄性保持系原生质体的溶液等体积混匀，将混匀的原生质体溶液滴在peg融合液中进行融合；
所述含有芥菜细胞质雄性不育系原生质体的溶液由上述的提取方法提取得到；
所述含有芥菜细胞质雄性保持系原生质体的溶液由上述的提取方法提取得到；
所述peg融合液包括10-20％peg、60mm-70mmcacl2、23-27mm甘露醇、20-30mm甘氨酸和8％-15％dmso。
在一个优选实施方式中，所述peg融合液优选包括15％peg、60mmcacl2、25mm甘露醇、25mm甘氨酸和10％dmso。
其中，该提取方法还包括使用含有mes的w5溶液对融合后的产物逐步稀释后避光培养，所述含有mes的w5溶液中mes为30mm-80mm，所述逐步稀释中所述含有mes的w5溶液的用量呈梯度增加。其中，mes优选为50mm。
其中，该提取方法还包括使用含有mes的w5溶液对融合后的产物逐步稀释后避光培养1.5h，所述含有mes的w5溶液中mes为50mm，所述逐步稀释中所述含有mes的w5溶液的用量呈梯度增加，每一次稀释的时间间隔为1min。
在本发明一个优选实施方式中，该提取方法包括：
将所述含有芥菜细胞质雄性不育系原生质体的溶液与所述含有芥菜细胞质雄性保持系原生质体的溶液的密度均调至2×106个/ml后等体积混匀，将所述peg融合液按4×2或8×2滴滴入直径为6cm-9cm的培养皿中，将混匀的原生质体溶液滴加在每两滴所述peg融合液间，避光培养10-30min后得到融合后的产物；
使用含有mes的w5溶液将融合后的产物稀释5次后避光培养1.5-2h；每次所述mes的w5溶液的用量分别为0.125ml、0.25ml、0.375ml、0.5ml、1.0ml，其中，所述含有mes的w5溶液中mes为30mm-80mm；
将培养后的产物离心，去上清即得到所述芥菜杂种原生质体。
在本发明一个优选实施方式中，该提取方法包括：
将所述含有芥菜细胞质雄性不育系原生质体的溶液与所述含有芥菜细胞质雄性保持系原生质体的溶液的密度均调至2×106个/ml后等体积混匀，将所述peg融合液按4×2或8×2滴滴入直径为6cm-9cm的培养皿中，将混匀的原生质体溶液滴加在每两滴所述peg融合液间，避光培养10min后得到融合后的产物；
使用含有mes的w5溶液将融合后的产物稀释5次后避光培养1.5h；每次所述mes的w5溶液的用量分别为0.125ml、0.25ml、0.375ml、0.5ml、1.0ml，每稀释一次的时间间隔为1min，其中，所述含有mes的w5溶液中mes为50mm；
将培养后的产物离心，去上清即得到芥菜杂种原生质体。
在本发明的具体实施方式中，固体物质的百分比值均为质量体积百分比，液体物质的百分比值均为体积百分比。
本发明提供的芥菜原生质体的提取方法克服了提取过程中原生质体量少、易破裂且提取效果不稳定的缺点，提取率至少为80％以上，得到的原生质体数量大、活性高、质量好。本发明提供的芥菜杂种原生质体的融合方法融合效率稳定且较高，融合效率至少为40％～50％。不会在融合过程中出现大量原生质体破裂或死亡的现象，得到的芥菜杂种原生质体仍能保持较高的细胞活性，为后续的其他实验工作提供了保障，提高了原生质体提取及融合的效率和稳定性，为十字花科蔬菜尤其是芥菜及变种的原生质体的提取和融合提供了可靠依据。
附图说明
图1为本发明实施例1的技术流程图；
图2为本发明实施例1中芥菜细胞质雄性不育fany-9a的原生质体的光学显微镜图(400倍)(a)、其配套保持系fany-9b的原生质体的光学显微镜图(400倍)(b)以及两者原生质体在融合过程中的原生质体融合图(c)和(d)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。
实施例1芥菜细胞质雄性不育fany-9a及其配套保持系fany-9b的原生质体的提取及杂种原生质体的融合
本实施例提供了杂种原生质体的融合方法，包括如下步骤，技术流程图如图1所示：
(1)用芥菜细胞质雄性不育fany-9a及其配套保持系fany-9b的种子，通过组织培养获得无菌苗；
(2)用步骤(1)得到的芥菜fany-9a和芥菜fany-9b的无菌苗分别在三周左右时取真叶，以刀片切割成1mm左右叶条，以薄薄铺满一层培养皿底部为宜，浸泡于9cm玻璃培养皿中配置好的10到15ml酶解液中，其中，酶解液由体积比为3:7的酶液与scw液组成，酶液由0.5％纤维素酶、0.1％果胶酶、0.2m甘露醇和80mmcacl2组成，酶液的ph为5.6；scw液由0.5m山梨醇、10mmcacl2和5mmmes组成，scw液的ph为5.8。将上述体系置于摇床上25℃温度下，以54rpm转速，过夜酶解14小时；
(3)用步骤(2)得到的芥菜fany-9a和芥菜fany-9b的培养皿中的叶片酶解液，以300或400目尼龙网过滤去除未酶解掉的叶片组织或杂质，得到粗原生质体液；
(4)将步骤(3)得到的粗原生质体液，加入w5溶液(其中，w5溶液由154mmnacl、125mmcacl2、5mmkcl和5mm葡萄糖组成，w5溶液的ph为5.8)混匀于10ml离心管中以700rpm/min离心5min，去上清后用2mlw5溶液重悬沉淀，沿管壁轻轻加入另一个装有5ml含有mes的蔗糖溶液(其中，在该蔗糖溶液中，蔗糖为0.5m、mes为1mm，该溶液的ph为5.8)的10ml离心管中，700r/min离心10min，小心收集环形带状的原生质体到10ml的离心管中，再加入w5溶液700r/min离心5min，得到纯原生质体液；其中，芥菜细胞质雄性不育fany-9a的原生质体的光学显微镜图如图2a所示，其配套保持系fany-9b的原生质体的光学显微镜图如图2b所示。芥菜细胞质雄性不育fany-9a的原生质体的提取率达到80％以上，其配套保持系fany-9b的原生质体的提取率为达到80％以上，提取出的原生质体的存活率均为90％左右。
(5)将步骤(4)得到的芥菜fany-9a和芥菜fany-9b的纯原生质体液密度调到2×106个/ml后等体积混匀，然后用配置好的peg融合液(其中，peg融合液由15％peg、60mmcacl2、25mm甘露醇、25mm甘氨酸和10％dmso组成)按4×2或8×2滴分别滴入直径为6cm或9cm的培养皿中，将混好的原生质体液滴加在成对的融合液间，边缘再加一滴融合液，暗培养10min，用悬浮液含有mes的w5溶液(其中，含有mes的w5溶液由154mmnacl、125mmcacl2、5mmkcl、5mm葡萄糖和50mmmes组成，该w5溶液的ph为5.8)将上述培养皿中的原生质体融合团逐步稀释，剂量分别是0.125ml，0.25ml，0.375ml，0.5ml，1.0ml(6cm培养皿)，每稀释一次的时间间隔为1min，然后暗培养1.5小时，观察聚集的细胞团的融合过程，当两种原生质体的化学融合完成后，再用含有mes的w5溶液冲洗培养皿加至离心管中至10ml，700r/min离心5min，去上清得到融合后的杂种原生质体，进行细胞的再生培养。
在倒置显微镜下观察细胞团的融合过程，如图2c和图2d所示，同时计算一对一的融合率可达40％～50％。
对比例1
该对比例中与实施例1的方法和步骤相同，不同仅在于，步骤(2)中所用酶解液包括2％纤维素酶、1％离析酶、0.2m甘露醇和80mmcacl2，该酶解液的ph为5.6。
在该实施例中，步骤(4)中芥菜细胞质雄性不育fany-9a的原生质体的提取率约为10％，其配套保持系fany-9b的原生质体的提取率约为10％。
在倒置显微镜下观察细胞团的融合过程，细胞基本不融合。
对比例2
该对比例中与实施例1的方法和步骤相同，不同仅在于，步骤(2)中所用酶解液包括1％纤维素酶、0.5％离析酶、0.1％mes、0.2％cacl2·2h2o、0.25m甘露醇和0.25m山梨醇，将该体系置于摇床上25℃温度下，以80rpm转速，酶解6小时。
在该实施例中，步骤(4)中芥菜细胞质雄性不育fany-9a的原生质体的提取率为20％～40％，其配套保持系fany-9b的原生质体的提取率为20％～40％。
在倒置显微镜下观察细胞团的融合过程，细胞融合效果差，同时计算一对一的融合率约为10％左右。
对比例3
该对比例中与实施例1的方法和步骤相同，不同仅在于，步骤(2)中所用酶解液包括2％纤维素酶、0.5％离析酶、5mmmes、0.4m甘露醇和5mmcacl2·2h2o，将该体系置于摇床上25℃温度下，以54rpm转速，酶解8小时。
在该实施例中，步骤(4)中芥菜细胞质雄性不育fany-9a的原生质体的提取率为35％～50％，其配套保持系fany-9b的原生质体的提取率为35％～50％。
在倒置显微镜下观察细胞团的融合过程，细胞融合效果差，同时计算一对一的融合率仅为15％～20％。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。