用于选择性地调节细胞的不同亚型的活性的方法与流程

本发明涉及用于选择性地调节细胞的不同亚型的活性的方法。

背景技术：

许多类型的病理涉及免疫系统的细胞。因此，增强或减少其活性是许多治疗策略的焦点。功能非常不同的多种类型的免疫细胞可以通过某些细胞表面蛋白的表达来区分。迄今为止还没有技术能够仅选择性激活或失活单独的细胞亚型，尤其是在体内。

使用细胞因子诱导或促进所需免疫应答的产生是针对癌症的免疫疗法中有吸引力的方法。细胞因子通常用作非特异性辅助物质以支持其他免疫疗法或者作为化学疗法的补充而施用。但到目前为止，由于全身毒性未解决，基于细胞因子的治疗很少被使用。此外，细胞因子通常全身应用，从而击中表达相关细胞因子受体的所有细胞类型。因此，在疾病相关部位的微调调整是不可能的。

为了克服这个缺点，可以将细胞因子与抗肿瘤抗体融合或与抗肿瘤抗体一起连接到微米颗粒或纳米颗粒，从而将细胞因子靶向肿瘤并减少全身副作用。然而，这些融合蛋白或负载细胞因子-抗体的颗粒不太稳定并且在体内被快速清除，导致疾病部位的细胞因子浓度较低。此外，负载细胞因子-抗体的颗粒释放细胞因子取决于ph。此外，通过这些先前方法递送至肿瘤的细胞因子(例如il-2)非选择性地刺激复杂肿瘤微环境中的各种类型的不同免疫细胞，包括免疫效应细胞和免疫抑制细胞，因此限制了它们在癌症治疗中的应用。

对于基因疗法，重要的靶细胞如静息人t细胞、b细胞和hsc(造血干细胞)很难用慢病毒载体转导。常规vsv-lv介导的转导仅在t细胞已经被激活时发生。在迄今为止进行的基因疗法试验中，t细胞已经通过同源抗原受体激活，同源抗原受体通常诱导t细胞中的表型和功能变化并最终导致体内t细胞持久性和抗肿瘤效应降低。

为了促进静息t细胞中的基因转移，生成了几种嵌合慢病毒载体。例如，verhoeyen等人(blood,2003,vol.101,n°6)公开了用如下两种类型的包膜糖蛋白假型化的hiv衍生载体：n-末端与il-7融合的嵌合mlv(小鼠白血病病毒)包膜糖蛋白和vsv-g(水泡性口炎病毒糖蛋白)。这些il-7载体颗粒可以有效地转导静息t细胞并诱导t细胞活化，但同样转导cd4+和cd8+t细胞。因此，它们不能区分不同的t细胞子集。此外，需要非靶向包膜gp(例如vsv-ggp)这一事实可能会转导不需要的造血细胞或内皮细胞。麻疹病毒(mev)糖蛋白假型慢病毒载体(mv-lv)是一个例外。mv-lv可以介导静息t淋巴细胞的转导，而不改变g0/g1a细胞周期状态。周等人(jimmunol,2015,vol.195,n°5)也公开了cd4靶向的lv可以转导新分离的静息t细胞，但在高颗粒剂量下效率非常低(小于10％)。

最后，用于产生用于过继性t细胞疗法的低分化肿瘤特异性t细胞的当前策略依赖于优化t细胞刺激和培养方案。例如，为了产生更多tscm细胞(干记忆t细胞)或tcm细胞(中枢记忆t细胞)，使用il-15和il-7或il-21和il-7的组合进行t细胞刺激和扩增。该培养系统非常昂贵，因为需要常规细胞因子补充(每两天一次)。然后，为了获得所需的细胞类型通常要实施数次细胞分选步骤。

因此，仍然需要提供选择性地和有效地调节免疫细胞的不同亚型的活性的方法。

技术实现要素：

本发明人出人意料地发现，通过使用假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体(例如慢病毒样颗粒(vlp)或慢病毒载体(lv))可以选择性地调节免疫细胞的不同亚型的活性，所述假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体携带细胞特异性靶向结构域(例如特异于cd4+t细胞或cd8+t细胞)和功能结构域(例如细胞因子)，所述细胞特异性靶向结构域和功能结构域各自与副粘病毒(paramyxoviridae)科病毒的糖蛋白融合。所述逆转录病毒载体还特异性地且有效地将包装的基因递送到靶细胞中。

事实上，出乎意料地发现，与仅包含细胞特异性靶向结构域的相应颗粒或载体相比，将功能结构域与假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体上的细胞特异性靶向结构域结合极大地改善了免疫细胞的靶亚型的选择性活性调节。

例如，发明人已经表明，呈现刺激性细胞因子的t细胞靶向颗粒在细胞类型混合培养物中和在体内人血液系统小鼠模型中选择性地激活靶t细胞亚群，并且还将包装的基因递送到靶t细胞亚型中，而无需任何刺激性培养条件。基于mev(麻疹病毒)糖蛋白(4^h/il7^h-vlp)的呈现il-7(白细胞介素-7)的cd4靶向的颗粒确实特异性地激活并促进培养的原代cd4+细胞的存活，而基于niv(尼帕(nipah)病毒)糖蛋白(8^g/il7^g-vlp)的呈现il7的cd8靶向的颗粒选择性地激活并促进cd8+t细胞的存活。此外，4^h/il7^h-lv以剂量依赖性方式有效地且特异性地将gfp转基因递送至细胞混合物中的cd4+t细胞中。与亲本cd4靶向的lv(不共同呈现il-7)相比，在将治疗性erbb2car转基因选择性地递送到静息cd4+t细胞方面，4^h/il7^h-lv更有效。用共同呈现cd8/il-7的niv糖蛋白假型化慢病毒载体(8^g/il7^g-lv)也观察到了类似的独特的基因转移和cd8+t细胞的刺激。实际上，在选择性cd8+t细胞活化和靶基因递送方面，8g/il7g-lv比8^g-lv更有效(参见实施例)。

根据本发明的逆转录病毒样颗粒和逆转录病毒载体具有许多优点，例如：

-在细胞靶位点提供高局部浓度的细胞因子，从而提高效率并预防细胞因子疗法的严重副作用，

-与可溶性细胞因子相比，提供更稳定且恒定的靶细胞刺激，从而提高细胞因子疗法的效率，

-提供一个非常灵活的体系，允许在单个颗粒或逆转录病毒载体上结合不同类型的细胞因子和不同类型的靶向结构域，

-允许在体外或体内将细胞刺激与细胞特异性基因转移偶联，从而更有效地转导特异性静息t细胞亚群，

-允许在体外或体内将t细胞表型诱导与基因转移偶联，由于与颗粒或载体表面上所呈现的细胞因子相互作用，转导细胞的分化受到控制，以及更一般地：

-允许在体外或体内向特定细胞或细胞亚群递送生物材料和/或治疗药物，包括但不限于基因、mrna、shrna、microrna、肽、蛋白、蛋白片段及其组合，

-为过继疗法提供了更简单的细胞制备过程(例如t细胞或造血细胞制备过程)

-由于人类中预存在的抗体量低，因此当使用由来自尼帕病毒的糖蛋白假型化的逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体时，防止了体内抗性问题。

本发明因此涉及一种假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体，其包含：

a)至少一种细胞靶向融合蛋白，其包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，所述蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白g或h的胞质区的至少一部分并且优选至少部分不能与所述包膜糖蛋白g或h的至少一种天然受体结合，或跨膜结构域，和(ii)至少一个细胞靶向结构域，

b)至少一种调节融合蛋白，其包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，所述蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白g或h的胞质区的至少一部分并且优选至少部分不能与所述包膜糖蛋白g或h的至少一种天然受体结合，或跨膜结构域，和(ii)至少一个功能结构域，以及

c)至少一种源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白，并且所述糖蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白f的胞质区的至少一部分，

其中所述细胞靶向融合蛋白和/或所述调节融合蛋白包含源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白。

所述副粘病毒科病毒可以是麻疹病毒属(morbillivirus)的病毒，例如选自由以下组成的组：麻疹病毒(mev)、犬瘟热病毒、鲸类麻疹病毒、小反刍兽疫病毒(peste-des-petits-ruminantsvirus)、海豹瘟热病毒和牛瘟病毒，或亨尼帕病毒属(henipavirus)的病毒，例如选自由以下组成的组：尼帕病毒(niv)、雪松病毒(cedarvirus)和亨德拉(hendra)病毒。

与所述包膜糖蛋白g或h的序列相比，a)和/或b)的蛋白优选包含至少两个突变，所述至少两个突变导致至少部分不能与所述包膜糖蛋白g或h的至少一种天然受体结合。

所述细胞靶向结构域可以选自由darpin、scfv、靶向肽及其组合组成的组和/或所述功能结构域可以选自由细胞因子、生长因子、激素、神经递质、凋亡配体及其组合组成的组。

靶细胞可选自由以下组成的组：造血系统的细胞(包括t细胞、b细胞、单核细胞、th1细胞、th2细胞、treg细胞、肥大细胞、树突状细胞(dc)、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、巨噬细胞、造血干细胞、t和/或b祖细胞、成红细胞、血小板和/或中性粒细胞)、基质细胞、内皮细胞、肝细胞、肌肉细胞、神经系统的细胞、患病细胞及其组合。

本发明还涉及如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体用于选择性地调节靶细胞活性和/或选择性地转导靶细胞的用途，所述靶细胞例如如上所定义。

本发明还涉及一种用于选择性地调节靶细胞活性和/或选择性地转导靶细胞的方法，其中所述方法包括使如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体与包含所述靶细胞的细胞接触，所述靶细胞例如如上所定义。

本发明还涉及如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体用作药物，优选用于免疫疗法基因疗法和/或疫苗接种，例如用于预防和/或治疗免疫疾病(例如自身免疫疾病)、癌症、遗传病、过敏性疾病、炎性疾病、传染病、代谢疾病、神经疾病(例如，神经营养不良、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病)、肌肉疾病及其组合。

本发明还涉及一种核酸，其包含编码细胞靶向融合蛋白的序列和/或编码调节融合蛋白的序列，其中：

-所述细胞靶向融合蛋白包含源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，或跨膜结构域，和(ii)至少一个细胞靶向结构域，并且

-所述调节融合蛋白包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，或跨膜结构域，和(ii)至少一个功能结构域。

本发明还涉及一种载体，其包含如上定义的核酸。

本发明还涉及一种用于制备如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的方法，其中所述方法包括用以下物质共转染包装细胞系：

(i)至少一种编码细胞靶向融合蛋白的核酸，所述细胞靶向融合蛋白包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，或跨膜结构域，和(ii)至少一个细胞靶向结构域，

(ii)至少一种编码调节融合蛋白的核酸，所述调节融合蛋白包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，或跨膜结构域，和(ii)至少一个功能结构域，

(iii)至少一种核酸，其编码源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白，

(iv)至少一种载体，其包含编码源自所述逆转录病毒的核心蛋白的核酸，和

(v)任选地，至少一种载体，其包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组，其中所述细胞靶向融合蛋白和/或所述调节融合蛋白包含源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白。

假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体

如本文所用的“逆转录病毒样颗粒”是指包含逆转录病毒蛋白gag、pol和env(包膜)，但不包含任何逆转录病毒衍生的遗传信息的颗粒。

gag、pol和env蛋白源自逆转录病毒，并且通过包装细胞系的手段反式提供。

如本文所用，“逆转录病毒载体”包含gag、pol和env(包膜)蛋白和rna分子。所述rna分子不含任何gag、env或pol基因，但包含将rna分子有效包装成所得颗粒所需的psi元件和ltr。所述rna分子可以进一步包含目的基因，该目的基因受合适的启动子控制，并因此在将所述基因整合到宿主细胞或靶细胞的基因组中后表达。

逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体分别是病毒样颗粒或病毒载体，其核心蛋白(即由gag和pol基因编码的蛋白)源自逆转录病毒。

术语“逆转录病毒”在本文中是指其基因组由rna分子组成并且包含逆转录酶的病毒。

逆转录病毒是逆转录病毒科的成员。逆转录病毒可以是肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。

肿瘤病毒可以是α逆转录病毒、β逆转录病毒、δ逆转录病毒、ε逆转录病毒或γ逆转录病毒。

当逆转录病毒是肿瘤病毒时，所述逆转录病毒可以是mlv(鼠白血病病毒)、asv(禽肉瘤病毒)、猫白血病病毒、牛白血病病毒、rsv(rous肉瘤病毒)、mpmv(mason-pfizer猴病毒)、htlvi(人t细胞白血病病毒-i)或htlvii(人t细胞白血病病毒-ii)。

当逆转录病毒是慢病毒时，所述逆转录病毒可以是hiv(人类免疫缺陷病毒)优选hiv-1或hiv-2、siv(猿猴免疫缺陷病毒)、eiav(马传染性贫血病毒)、fiv(猫免疫缺陷病毒)或caev(山羊关节炎脑炎病毒)。

当逆转录病毒是泡沫病毒时，所述逆转录病毒可以是hfv(人类泡沫病毒)。

例如，逆转录病毒载体可以是慢病毒载体、α逆转录病毒载体、鼠逆转录病毒载体或fiv载体。

这种逆转录病毒的基因组在基因数据库中是容易获得的。

在一个优选的实施方案中，所述逆转录病毒是慢病毒，更优选hiv，例如hiv-1或hiv-2。

因此，本发明优选涉及慢病毒样颗粒(lvp)或慢病毒载体(lv)，优选hiv衍生的lvp或lv。

本文表述“假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体”中的术语“假型”是指逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体携带包膜糖蛋白，所述包膜糖蛋白源自至少另一种病毒而非所述逆转录病毒，和/或所述包膜糖蛋白是工程化的包膜糖蛋白，例如嵌合的和/或突变的包膜糖蛋白。

根据本发明的逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体例如用源自副粘病毒科病毒(优选源自如下所述的麻疹病毒属或亨尼帕病毒属糖蛋白的病毒)的工程化糖蛋白假型化。

副粘病毒科的包膜糖蛋白

用于假型化本发明的逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的修饰型包膜糖蛋白源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白。

副粘病毒科病毒优选是麻疹病毒属或亨尼帕病毒属的病毒。

麻疹病毒属和亨尼帕病毒属的病毒使用两种类型的糖蛋白进入靶细胞中：附着蛋白(在亨尼帕病毒属的病毒中称为糖蛋白g或在麻疹病毒属的病毒中称为糖蛋白h)和糖蛋白f(也称为融合蛋白或蛋白f)。蛋白f介导病毒膜与宿主细胞细胞膜的融合。糖蛋白g/h识别靶膜上的受体并支持f蛋白的膜融合功能。糖蛋白g/h和糖蛋白f均以修饰形式用于假型化本发明的逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体。

麻疹病毒属的病毒例如选自由麻疹病毒、犬瘟热病毒、鲸类麻疹病毒、小反刍兽疫病毒、海豹瘟热病毒和牛瘟病毒组成的组。

优选的麻疹病毒属病毒是麻疹病毒(mev)。

亨尼帕病毒属的病毒例如选自由尼帕病毒、雪松病毒和亨德拉病毒组成的组。

优选的亨尼帕病毒属病毒是尼帕病毒(niv)。

在一个优选的实施方案中，修饰型包膜糖蛋白源自麻疹病毒的包膜糖蛋白h和糖蛋白f或源自尼帕病毒的包膜糖蛋白g和糖蛋白f。

尼帕病毒包膜糖蛋白g的序列的一个实例是序列seqidno：9。

尼帕病毒包膜糖蛋白f的序列的一个实例是序列seqidno：11。

麻疹病毒包膜糖蛋白h(称为糖蛋白h)的序列的一个实例是序列seqidno：10。

麻疹病毒包膜糖蛋白f的序列的一个实例是序列seqidno：12。

源自包膜糖蛋白g/h的蛋白

根据本发明的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体包含至少一种细胞靶向融合蛋白和至少一种调节融合蛋白。细胞靶向融合蛋白和/或调节融合蛋白包含源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的第一蛋白。

包膜糖蛋白g或h如上文“副粘病毒科的包膜糖蛋白”部分中所定义。

副粘病毒科的病毒如上文“假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体”部分中所定义。

表述“源自包膜糖蛋白g或h的蛋白”在本文中是指与包膜糖蛋白g或h的序列相比，该蛋白包含至少一种修饰。

优选的包膜糖蛋白g是尼帕病毒包膜糖蛋白g，也称为niv包膜糖蛋白g、nivg糖蛋白或niv-g。

优选的包膜糖蛋白h是麻疹病毒包膜糖蛋白h，也称为mev糖蛋白h、mev血凝素或mv-h。

包膜糖蛋白g或h是野生型或疫苗株病毒包膜糖蛋白或其变体，条件是所述变体保留了所述野生型或疫苗株糖蛋白识别靶膜上的受体并支持f蛋白的膜融合功能的能力。

niv包膜糖蛋白g的标准序列是序列seqidno：9。

niv包膜糖蛋白g可以是与seqidno：9至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。例如，niv包膜糖蛋白可以是序列seqidno：9。

mev血凝素的标准序列是序列seqidno：10。

mev血凝素可以是与seqidno：10至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。例如，mev血凝素可以是序列seqidno：10。

在一个优选的实施方案中，源自包膜糖蛋白g的蛋白缺少所述包膜糖蛋白g的胞质区的至少一部分。

缺少所述包膜糖蛋白g的胞质区的至少一部分的蛋白也被称为其胞质区被截短的蛋白。

表述“缺少胞质区的x个氨基酸的蛋白”、“在其胞质区截短了x个氨基酸的蛋白”和“蛋白δcx”在本文中是同义的并且可以互换使用。

使用其胞质区有所截短的包膜糖蛋白g大大改善了其向逆转录病毒样粒子和逆转录病毒载体的掺入，从而允许产生具有更高滴度和产量的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体。

包膜糖蛋白g的胞质区位于n末端。

因此，当通过对照未截短的糖蛋白g来确定糖蛋白δcx的截短部分的位置时，在包膜糖蛋白g的n-末端的第二个氨基酸残基处开始计数，即省略第一个甲硫氨酸残基。

例如，序列seqidno：z的糖蛋白g的胞质区中缺少x个氨基酸的蛋白与所述糖蛋白g的不同之处在于它缺少序列seqidno：z的2至1+x位氨基酸。

本领域技术人员可以容易地确定包膜糖蛋白g序列中胞质区的定位。

mevh糖蛋白的胞质区例如由序列seqidno：10的1至34位氨基酸组成。

nivg糖蛋白的胞质区例如由序列seqidno：9的1至45位氨基酸组成。

例如，源自包膜糖蛋白g或h的蛋白可能在胞质区中缺少至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少18个氨基酸、至少20个氨基酸。

例如，源自麻疹病毒包膜的糖蛋白h的蛋白可能在胞质区缺少至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少18个氨基酸、至少20个氨基酸、至少24个氨基酸。在一个优选的实施方案中，源自麻疹病毒包膜糖蛋白h的蛋白缺少15、18、20或24个氨基酸。

例如，源自尼帕病毒包膜糖蛋白g的蛋白可能在胞质区缺少至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少18个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在一个优选的实施方案中，源自尼帕病毒包膜糖蛋白g的蛋白缺少34个氨基酸。

在一个优选的实施方案中，源自包膜糖蛋白g或h的蛋白至少部分不能与所述包膜糖蛋白g或h的至少一种天然受体结合。

至少部分不能与所述包膜糖蛋白g或h的至少一种天然受体结合的能力可以通过在所述包膜糖蛋白g或h的序列中引入至少一种突变而获得。

例如，与所述包膜糖蛋白的序列相比，源自包膜糖蛋白g或h的蛋白可包含至少一个点突变，优选至少两个点突变。

点突变可以是氨基酸缺失、添加或取代。

在一个优选的实施方案中，点突变是取代。

在一个优选的实施方案中，源自包膜糖蛋白g或h的蛋白不能与所述包膜糖蛋白g或h的至少一种天然受体结合，即完全不能结合。

源自包膜糖蛋白g或h的蛋白不与其天然受体结合的能力大大提高了细胞靶向效率。

评估与包膜糖蛋白g的至少一种天然受体结合的能力可以通过技术人员熟知的任意方法评估。

天然niv受体是ephrin-b2和ephrin-b3niv受体。

因此，源自niv包膜糖蛋白g的蛋白优选至少部分不能与ephrin-b2受体和/或ephrin-b3niv受体结合，优选不能与ephrin-b2受体和ephrin-b3niv受体结合。

例如，与序列seqidno：9相比，包膜糖蛋白niv-g可包含至少两个或至少三个点突变，其中所述点突变选自由e501a、w504a、q530a和e533a组成的组。

在一个优选的实施方案中，糖蛋白niv-g包含或由以下点突变组成：e501a、w504a、q530a和e533a，因此导致了不能与ephrin-b2受体和ephrin-b3niv受体结合的能力。

天然mev受体是slam、nectin-4和cd46。

因此，源自mev包膜糖蛋白h的蛋白优选至少部分不能与slam、nectin-4和/或cd46结合，优选至少不能与slam和cd46结合。

例如，与序列seqidno：10相比，包膜糖蛋白mv-h可包含至少两个或至少三个点突变，其中所述点突变选自由y481a、r533a、s548l和f549s组成的组。

在一个优选的实施方案中，包膜糖蛋白mv-h包含或由以下点突变组成：y481a、r533a、s548l和f549s，因此导致了不能与slam和cd46结合的能力。

因此，源自包膜糖蛋白g或h的蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白g或h的胞质区的至少一部分和/或至少部分不能与所述包膜糖蛋白g或h的至少一种天然受体结合。

在一个更优选的实施方案中，源自包膜糖蛋白g或h的蛋白缺少所述包膜糖蛋白g或h的胞质区的至少一部分并且至少部分不能与所述包膜糖蛋白g或h的至少一种天然受体结合。

“与标准序列至少x％相同的序列”在本文中意指该序列与标准序列相同或通过每100个标准序列的氨基酸有至多100-x个氨基酸改变而与标准序列不同。

可以用例如用于多肽序列比较的以下参数：比较矩阵：blosum62，缺口开放罚分：10，缺口延伸罚分：0.5，末端缺口罚分：错误，末端缺口开放罚分＝10，末端缺口延伸罚分＝0.5；和用于多核苷酸序列比较的以下参数：比较矩阵：dnafull；缺口开放罚分＝10，缺口延伸罚分＝0.5，末端缺口罚分：错误，末端缺口开放罚分＝10，末端缺口延伸罚分＝0.5，手动或使用例如基于needleman和wunsch算法(描述于needlemanandwunsch(1970)j.molbiol.48:443-453中)的needle程序自动进行比对和确定同一性百分比。

如本文所定义，与标准序列相比，与标准序列“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同”的氨基酸序列可包含突变，例如缺失、插入和/或取代。

在取代的情况下，取代优选对应于下表1所示的保守取代如。在一个优选的实施方案中，与标准序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列仅通过保守取代与标准序列不同。

表1

在另一个优选的实施方案中，与标准序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列相当于标准序列的天然存在的等位基因变体。

源自包膜糖蛋白f的糖蛋白

根据本发明的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体还包含至少一种源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白，其中所述糖蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白f的胞质区的至少一部分。

包膜糖蛋白f如上文“副粘病毒科的包膜糖蛋白”部分中所定义。

副粘病毒科的病毒如上文“假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体”部分中所定义。

表述“源自包膜糖蛋白f的蛋白”在本文意指，与包膜糖蛋白f的序列相比，该蛋白包含至少一种修饰。

一种优选的包膜糖蛋白f是尼帕病毒包膜糖蛋白f，也称为niv包膜糖蛋白f、nivf糖蛋白或niv-f。

另一种优选的包膜糖蛋白f是麻疹病毒包膜糖蛋白f，也称为mev糖蛋白f或mev-f。

包膜糖蛋白f是野生型病毒或疫苗株包膜糖蛋白或其变体，条件是所述变体保留了野生型或疫苗株糖蛋白f介导病毒膜与靶细胞或宿主细胞的细胞膜融合的能力。

niv包膜糖蛋白f的标准序列是序列seqidno：11。niv包膜糖蛋白f可以是与seqidno：11至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。例如，niv包膜糖蛋白f可以是序列seqidno：11。

mev包膜糖蛋白f的标准序列是序列seqidno：12。

mev包膜糖蛋白f可以是与seqidno：12至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。例如，mev包膜糖蛋白f可以是序列seqidno：12。

在一个优选的实施方案中，源自包膜糖蛋白f的蛋白缺少所述包膜糖蛋白f的胞质区的至少一部分。

缺少所述包膜糖蛋白f的胞质区的至少一部分的蛋白也被称为其胞质区被截短的蛋白。

表述“缺少胞质区的x个氨基酸的蛋白”、“在其胞质区截短了x个氨基酸的蛋白”和“蛋白δcx”在本文中是同义的并且可以互换使用。

使用其胞质区截短了的包膜糖蛋白f大大改善了其向逆转录病毒样粒子和逆转录病毒载体的掺入，从而允许产生具有更高滴度和产量的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体。

包膜糖蛋白f的胞质区位于c末端。

因此，当通过对照未截短的糖蛋白g来确定糖蛋白δcx的截短部分的位置时，从糖蛋白f的c-末端开始计数。

例如，与由n个氨基酸组成的序列seqidno：z的糖蛋白f相比，在其胞质区缺少x个氨基酸的糖蛋白与所述糖蛋白f的不同之处在于它缺少序列seqidno：z的n-x+1至n位氨基酸。

本领域技术人员可以容易地确定包膜糖蛋白f序列中胞质区的定位。

mev糖蛋白f的胞质区例如由序列seqidno：12的518至550位氨基酸(33个氨基酸)组成。

niv糖蛋白f的胞质区例如由序列seqidno：11的519至546位氨基酸(28个氨基酸)组成。

例如，源自包膜糖蛋白f的蛋白可能在胞质区中缺少至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个或至少30个氨基酸。

例如，与所述麻疹病毒包膜糖蛋白f相比，源自麻疹病毒包膜糖蛋白f的蛋白在胞质区中可能缺少30个氨基酸。例如，源自麻疹病毒包膜糖蛋白f并且在胞质区中缺少30个氨基酸的所述蛋白包含或由序列seqidno：15组成。

例如，与所述尼帕病毒包膜糖蛋白f相比，源自尼帕病毒包膜糖蛋白f的蛋白在胞质区中可能缺少22个氨基酸。例如，源自尼帕病毒包膜糖蛋白f并且在胞质区中缺少22个氨基酸的所述蛋白包含或由序列seqidno：16组成。

靶细胞

靶细胞是其活性待调节的目的细胞和/或待用至少一种目的基因转导的目的细胞。

靶细胞在其表面表达特异性细胞表面受体，从而允许特异性靶向这些细胞而不靶向不表达所述细胞表面受体的细胞。

表述“靶细胞”和“靶细胞亚群”在本文中是同义的并且可以互换使用。

靶细胞可选自由造血细胞、基质细胞、内皮细胞、肝细胞、肌细胞(例如心脏细胞)、神经系统的细胞和/或患病细胞组成的组。

神经系统的细胞例如是神经元和/或神经胶质细胞。

“造血细胞”在本文中是指造血系统的细胞。

优选的靶细胞是造血细胞。

造血细胞可以选自由t细胞、b细胞、单核细胞、th1细胞、th2细胞、treg细胞、肥大细胞、树突状细胞(dc)、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、巨噬细胞、造血干细胞、t和/或b祖细胞、成红细胞、血小板、嗜中性粒细胞及其组合组成的组。

更优选的靶造血细胞是t细胞，更优选cd8+t细胞或cd4+t细胞。

患病细胞可以是肿瘤细胞、肿瘤干细胞、缺乏特定功能基因、过表达特定基因和/或表达特定基因的截短或突变形式的的细胞、感染细胞和/或功能受损细胞。

细胞特异性靶向结构域

细胞特异性靶向结构域(也称为“细胞靶向结构域”)允许本发明的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体与由靶细胞选择性表达的表面受体特异性结合。

靶细胞可以如上面在同名部分中所定义。

靶向融合蛋白的细胞靶向结构域优选选自由darpin、scfv、靶向肽及其组合组成的组。

术语“darpin”是指设计的锚蛋白重复蛋白。

术语scfv是指抗体的单链可变片段。

例如，细胞靶向结构域对cd3、cd8、cd4、癌细胞标记物、cd11b、cd19、cd62l、cd56、glut-1(葡萄糖转运体)、cd19、cd22、cd20、ccr5或cxcr4具有特异性。

优选的细胞靶向结构域是对cd4特异的darpin或对cd8特异的scfv。

功能结构域

功能结构域允许调节靶细胞的活性。

“调节靶细胞的活性”在本文中意指激活或抑制、诱导所述靶细胞的表型改变(例如成熟和/或分化)、诱导增殖和/或诱导凋亡。调节靶细胞的活性例如包括增强或抑制免疫、促进细胞类型特异性免疫应答。

调节融合蛋白的功能结构域优选是受体配体。

“受体配体”在本文中是指优选通常由细胞释放，并且改变在其细胞表面表达同源受体的细胞的生理状态的分子，优选蛋白。受体配体例如选自由以下组成的组：细胞因子、生长因子、激素、神经介质、凋亡配体、趋化因子、葡萄糖转运蛋白及其组合。

例如，细胞因子可选自由白细胞介素(il)tnf(肿瘤坏死因子)或干扰素组成的组。

白细胞介素可以是例如il-2、il-3、il-6、il-7、il15、il21、il-17或il-12。

例如，凋亡配体可以是fas配体、cd40配体或tnfα。

例如，趋化因子可以是cxcl4、ccl5或cxcl10。

例如，生长因子可以是gm-scf(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、干细胞因子(scf)、血小板生成素(tpo)或flt-3配体。

例如，激素可以是胰岛素、生长激素或激素肽，例如加压素。例如，神经介质可以是神经肽，例如选自胰岛素、胰高血糖素、降钙素、神经降压素或缓激肽。

优选的功能结构域是细胞因子，优选白细胞介素，更优选il-7。

细胞靶向融合蛋白和调节融合蛋白

根据本发明的逆转录病毒样颗粒和逆转录病毒载体包含两种类型的融合蛋白：一种细胞靶向融合蛋白和一种调节融合蛋白。

细胞靶向融合蛋白包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，或跨膜结构域，和(ii)至少一个细胞靶向结构域。

调节融合蛋白包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，或跨膜结构域，和(ii)至少一个功能结构域。

跨膜结构域可以是任意天然存在的或非天然存在的跨膜结构域。

跨膜结构域可以是受体的跨膜结构域、跨膜蛋白(优选病毒跨膜蛋白)、跨膜蛋白的片段、跨膜肽或其变体，例如基因修饰的受体跨膜结构域、基因修饰的跨膜蛋白、基因修饰的跨膜蛋白片段或基因修饰的跨膜肽。

跨膜结构域的实例是血小板衍生生长因子受体(pdgfr)的跨膜结构域(tmd)、cd34的跨膜结构域或vsvg糖蛋白跨膜结构域。

源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白的c末端优选直接或间接(例如通过接头)与细胞靶向结构域或功能结构域的n末端融合。

跨膜结构域的c末端优选直接或间接(例如通过接头)与细胞靶向结构域或功能结构域的n末端融合。

源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白、源自包膜糖蛋白f的糖蛋白、细胞靶向结构域和功能结构域如上所定义。

当两者都存在于假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体中时，细胞靶向融合蛋白和调节融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白可以源自相同的副粘病毒科病毒或源自不同的副粘病毒科病毒。

当细胞靶向融合蛋白和调节融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白源自不同的副粘病毒科病毒时，它们优选源自相同属的病毒，更优选源自相同物种的病毒。

细胞靶向融合蛋白和调节融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白优选是相同的。在一个优选的实施方案中，因此，细胞靶向融合蛋白与调节融合蛋白的不同之处在于其靶向结构域而非功能结构域，并且可能在于(当存在时)至少一个接头和/或至少一个标签。

融合蛋白的两种蛋白可以用接头连接在一起。可以使用本领域技术人员公知的任意合适的接头。

例如，接头可以是(g4s)3、g4s、因子xa切割位点或螺旋接头(例如hl3、hl7、......)。

融合蛋白可以加标签，例如以有助于它们的纯化和/或检测。

当存在时，标签优选位于融合蛋白的c末端，即与细胞靶向结构域和/或功能结构域的n末端融合。可以使用本领域技术人员公知的任意合适的标签。

例如，标签可以是his-标签、rgs-his标签例如rgsh6、ha标签或c-myc标签。

特异性假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体

本发明特别涉及一种假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体，其包含：

a)至少一种细胞靶向融合蛋白，其包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，或跨膜结构域，和(ii)至少一个细胞靶向结构域，

b)至少一种调节融合蛋白，其包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，或跨膜结构域，和(ii)至少一个功能结构域，和

c)至少一种源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白，

其中所述细胞靶向融合蛋白和/或所述调节融合蛋白包含源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白。

因此，所述假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体包含至少一种融合蛋白，所述融合蛋白包含源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，所述融合蛋白是细胞靶向融合蛋白或调节融合蛋白。在一个实施方案中，假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体包含两种融合蛋白，其各自包含源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，其中一个融合蛋白是细胞靶向融合蛋白，第二个融合蛋白是调节融合蛋白。

在一个实施方案中，所述假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体包含：

a)至少一种细胞靶向融合蛋白，其包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白和(ii)至少一个细胞靶向结构域，

b)至少一种调节融合蛋白，其包含(i)跨膜结构域和(ii)至少一个功能结构域，和

c)至少一种源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白。在一个实施方案中，所述假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体包含：

a)至少一种细胞靶向融合蛋白，其包含(i)跨膜结构域和(ii)至少一个细胞靶向结构域，

b)至少一种调节融合蛋白，其包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白和(ii)至少一个功能结构域，和

c)至少一种源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白。在一个实施方案中，所述假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体包含：

a)至少一种细胞靶向融合蛋白，其包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白和(ii)至少一个细胞靶向结构域，

b)至少一种调节融合蛋白，其包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白和(ii)至少一个功能结构域，和

c)至少一种源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白。

细胞靶向融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白、调节融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白和源自包膜糖蛋白f的糖蛋白可以源自相同的副粘病毒科病毒或源自不同的副粘病毒科病毒。

当细胞靶向融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白、调节融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白和/或源自包膜糖蛋白f的糖蛋白源自不同的副粘病毒科病毒时，它们优选源自相同属的病毒，更优选源自相同物种的病毒。

在一个实施方案中，细胞靶向融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白、调节融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白和源自包膜糖蛋白f的糖蛋白源自相同的副粘病毒科病毒。

在另一个实施方案中，细胞靶向融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白和源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白源自相同的副粘病毒科病毒，而调节融合蛋白包含(i)跨膜结构域，例如血小板衍生生长因子受体(pdgfr)的跨膜结构域(tmd)，和(ii)至少一个功能结构域。

在另一个实施方案中，调节融合蛋白中源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白和源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白源自相同的副粘病毒科病毒，而细胞靶向融合蛋白包含(i)跨膜结构域，例如血小板衍生生长因子受体(pdgfr)的跨膜结构域(tmd)，和(ii)至少一个细胞靶向结构域。

假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的不同组分，特别是细胞靶向融合蛋白、调节融合蛋白、源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白和跨膜结构域如上所定义。

优选的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体包含：

a)至少一种细胞靶向融合蛋白，其包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白，所述蛋白缺少所述包膜糖蛋白g的胞质区的至少一部分并且至少部分不能与所述包膜糖蛋白g的至少一种天然受体结合，或跨膜结构域，和(ii)至少一个细胞靶向结构域，

b)至少一种调节融合蛋白，其包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白，所述蛋白缺少所述包膜糖蛋白g的胞质区的至少一部分并且至少部分不能与所述包膜糖蛋白g的至少一种天然受体结合，或跨膜结构域，和(ii)至少一个功能结构域，以及

c)至少一种源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白，并且所述糖蛋白缺少所述包膜糖蛋白f的胞质区的至少一部分，

其中所述细胞靶向融合蛋白和/或所述调节融合蛋白包含源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白。

假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的实例在下表2中给出。

表2

在一个优选的实施方案中，所述假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体可通过下文“用于产生假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的方法”部分中描述的制备方法获得。

核酸和载体

本发明还涉及一种核酸，所述核酸编码细胞靶向融合蛋白和/或调节融合蛋白，其用于假型化本发明的逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体。

因此，本发明具体涉及一种核酸，其包含编码细胞靶向融合蛋白的序列和/或编码调节融合蛋白的序列，其中：

-所述细胞靶向融合蛋白包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白，所述蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白g的胞质区的至少一部分并且优选至少部分不能与所述包膜糖蛋白g的至少一种天然受体结合，或跨膜结构域，和(ii)至少一个细胞靶向结构域，

-所述调节融合蛋白包含(i)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g的蛋白，所述蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白g的胞质区的至少一部分并且优选至少部分不能与所述包膜糖蛋白g的至少一种天然受体结合，或跨膜结构域，和(ii)至少一个调节结构域。

当核酸包含编码细胞靶向融合蛋白的序列和编码调节融合蛋白的序列时，所述细胞靶向融合蛋白和/或所述调节融合蛋白包含源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白。

核酸优选包含或由以下组成：

(i)编码源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白的蛋白的序列，所述蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白g的胞质区的至少一部分并且优选至少部分不能与所述包膜糖蛋白g的至少一种天然受体结合，

(ii)编码一个细胞靶向结构域或一个功能结构域的序列，以及

(iii)任选地，序列(i)和(ii)之间的接头序列，

(iv)任选地，编码标签的序列，优选在序列(ii)的3'末端，其中序列(i)和(ii)同框融合。

接头序列编码如上定义的接头，例如编码(g4s)3。

序列(i)位于核酸的5'，与之相比，序列(ii)位于核酸的3'。

在一个实施方案中，核酸包含或由如下序列组成，该序列与选自由seqidno：1、seqidno：3、seqidno：5、seqidno：7和seqidno：13组成的组的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，和/或包含或由如下序列组成，该序列编码与选自由seqidno：2、seqidno：4、seqidno：6、seqidno：8和seqidno：14组成的组的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。

在一个优选的实施方案中，核酸包含或由如下序列组成，该序列选自由seqidno：1、seqidno：3、seqidno：5、seqidno：7和seqidno：13组成的组，和/或包含或由如下序列组成，该序列编码选自由seqidno：2、seqidno：4、seqidno：6、seqidno：8和seqidno：14组成的组的序列。

以上提供了序列同一性百分比的定义。

与标准序列相比，核酸序列与标准序列“至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同”可包含突变，例如缺失、插入和/或取代。

在取代的情况下，与标准序列相比，取代优选对应于沉默取代或在翻译后氨基酸序列中导致保守取代的取代，例如如上表1中所示。

在一个优选的实施方案中，与标准序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列与标准序列的不同之处仅在于沉默取代和/或导致保守氨基酸取代的取代。

本发明还涉及一种核酸，其编码源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白，并且所述糖蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白f的胞质区的至少一部分。

源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白如上定义。

核酸优选是分离的核酸。

表述“核酸”在本文中是指单链形式或双链形式的核糖核苷(也称为“rna分子”)、脱氧核糖核苷(也称为“dna分子”)或其任意磷酸酯类似物(如硫代磷酸酯和硫酯)的磷酸酯聚合物形式。

关于生物组分(例如核酸、载体或蛋白)的术语“分离的”是指生物组分已经基本上与生物体细胞中天然存在的其他生物组分(例如其他的染色体和染色体外dna和rna、蛋白、细胞和细胞器)或与该生物体本身分离或纯化。“分离的核酸”或“分离的载体”包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子。这些术语还包括通过扩增和/或克隆制备的核酸和载体，以及化学合成的核酸和载体。

优选将根据本发明的核酸克隆到载体中。

因此，术语“载体”具有与“逆转录病毒载体”不同的含义。

术语“载体”在本文中是指核酸载体。

载体通常包含复制起点、多克隆位点和选择标记。

载体优选包含表达盒，即根据本发明的核酸置于至少一种允许其表达的表达信号的控制下。

表达信号特别选自启动子、终止子、增强子及其组合。

合适的启动子、终止子和增强子是本领域技术人员公知的。

载体的实例是例如质粒。

“质粒”在本文中是指双链环状dna。质粒可以包括能够选择包含所述质粒的细胞的标记基因、允许细胞复制该质粒的复制起点和/或允许插入根据本发明的核酸的多克隆位点。

因此，本发明还涉及一种载体，其包含如上定义的核酸。

载体优选是分离的载体。

载体可包括或由以下组成：

-第一核酸，其包含或由以下组成：

(i)一个序列，其编码a)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，所述蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白g或h的胞质区的至少一部分并且优选至少部分不能与所述包膜糖蛋白g或h的至少一种天然受体结合，或b)跨膜结构域，

(ii)编码一个细胞靶向结构域的序列，

(iii)任选地，序列(i)和(ii)之间的接头序列，

(iv)任选地，编码标签的序列，优选在序列(ii)的3'末端，其中序列(i)和(ii)同框融合，

-第二核酸，其包含或由以下组成：

(i)一个序列，其编码a)源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白，所述蛋白优选缺少所述包膜糖蛋白g或h的胞质区的至少一部分并且优选至少部分不能与所述包膜糖蛋白g或h的至少一种天然受体结合，或b)跨膜结构域，

(ii)编码一个功能结构域的序列，

(iii)任选地，序列(i)和(ii)之间的接头序列，

(iv)任选地，编码标签的序列，优选在序列(ii)的3'末端，其中序列(i)和(ii)同框融合，

其中第一核酸和/或第二核酸包含编码源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白的序列。

因此，所述第一核酸编码细胞靶向融合蛋白，所述第二核酸编码调节融合蛋白。

目的基因

当使用假型逆转录病毒载体时，在所述逆转录病毒载体的逆转录病毒衍生基因组中可存在至少一种目的基因。

目的基因可编码治疗性蛋白、凋亡蛋白、嵌合抗原受体、细胞表面受体、抗体、抗体片段、shrna、抗原、细胞因子、microrna、crispr((成簇规则间隔短回文重复))/cas元件(例如cas9和/或指导rna，特别是用于特定基因破坏或修正)、其他核酸酶系统如锌指核酸酶、s/mar(支架/基质附着区)-附加体、配体和/或受体。

通过逆转录病毒载体将s/mar-附加体插入细胞核中，然后与宿主细胞dna一起复制。

目的基因的实例包括珠蛋白基因、造血生长因子基因(例如促红细胞生成素(epo)基因)、白细胞介素基因(特别是白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-6或白细胞介素-12基因)、集落刺激因子基因(如粒细胞集落刺激因子基因、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子基因或干细胞集落刺激因子基因)、血小板特异性整合素αiibβ基因、多药耐药基因、慢性肉芽肿病(cgd)患者中有缺陷的gp91或gp47基因、使细胞对病原体(例如人类免疫缺陷病毒)感染具有抗性的抗病毒基因、编码血友病中突变的血液凝固因子viii或ix的基因、编码参与t细胞介导的免疫应答的配体(如t细胞抗原受体、嵌合抗原受体(car)、b细胞抗原受体(免疫球蛋白、抗hiv、丙型肝炎、乙型肝炎和/或其他传染病的中和抗体)的基因、白细胞介素受体常见γ链基因、tnf基因、γ干扰素基因、ctla4基因、肿瘤细胞中表达的基因如melana、mage基因(如mage-1、mage-3)、p198基因、p1a基因、gp100基因。

用于制备假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的方法

本发明还涉及一种用于制备如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的方法，其中所述方法包括用以下物质共转染包装细胞系：

(i)至少一种编码细胞靶向融合蛋白的核酸，

(ii)至少一种编码调节融合蛋白的核酸，

(iii)至少一种编码糖蛋白的核酸，所述糖蛋白源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f，并且优选缺少所述包膜糖蛋白f的胞质区的至少一部分，

(iv)至少一种载体，其包含编码源自所述逆转录病毒的核心蛋白的核酸，以及

(v)任选地，至少一种载体，其包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组，由此获得共转染的细胞。

所述细胞靶向融合蛋白和所述调节融合蛋白包含源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白g或h的蛋白。

需要至少一种包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组的载体仅用于制备逆转录病毒载体。

可以使用本领域技术人员熟知的任意合适的包装细胞系。

“包装细胞系”在本文中是指能够表达本发明的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的不同组分的细胞系。

编码本发明的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的不同组分的核酸和载体可以整合到包装细胞系的基因组中，例如在基于鼠白血病的载体的情况下。

包装细胞系优选与慢病毒gag和pol基因的表达兼容。

例如，包装细胞系可选自由293t细胞、昆虫细胞、te671细胞和ht1080细胞组成的组。

术语“转染”是指将至少一种外来核酸或载体(例如dna、cdna或rna)引入细胞中，使得宿主细胞会表达由所述核酸或载体编码的蛋白。外源核酸或载体可包括调节序列或控制序列，例如起始序列、终止序列、启动子序列、信号序列、分泌序列或细胞遗传机制使用的其他序列。

包含衣壳化所必需的psi序列的载体称为psi阳性载体，而不包含所述psi序列的载体称为psi阴性载体。

只有包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组的载体是psi阳性载体。用于共转染的其他核酸和载体是psi阴性的。

编码细胞靶向融合蛋白的核酸、编码调节融合蛋白的核酸和编码源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白的核酸如上所定义。它们可以以两个或三个单独的载体的形式提供：例如，两个单独的载体，例如第一个包含或由以下组成：编码细胞靶向融合蛋白的核酸和编码调节融合蛋白的核酸，第二个包含或由以下组成：编码源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白的核酸；或者三个单独的载体，第一个包含或由以下组成：编码细胞靶向融合蛋白的核酸，第二个包含或由以下组成：编码调节融合蛋白的核酸，第三个包含或由以下组成：编码源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白的核酸。或者，编码细胞靶向融合蛋白的核酸、编码调节融合蛋白的核酸和编码源自副粘病毒科病毒的包膜糖蛋白f的糖蛋白的核酸可以在单个载体中提供，所述单个载体包含或由这三种核酸组成。

还使用了包含编码所述逆转录病毒的核心蛋白的核酸的载体。

“逆转录病毒的核心蛋白”在本文中是指由gag和pol基因编码的蛋白。gag基因编码多蛋白，该多蛋白被逆转录病毒蛋白酶进一步加工成包含核心的结构蛋白。pol基因特别编码逆转录病毒蛋白酶、逆转录酶和整合酶。

编码逆转录病毒的核心蛋白的核酸因此包含所述逆转录病毒的gag基因和pol基因。

逆转录病毒的至少一种核心蛋白可以是经修饰的，例如，与野生型逆转录病毒的相应核心蛋白相比。

在一个实施方案中，逆转录病毒的至少一种核心蛋白经过至少一个氨基酸突变例如氨基酸缺失、插入或取代而被修饰。

在一个优选的实施方案中，所述至少一种经修饰的核心蛋白是缺陷型整合酶。缺陷型整合酶的实例具有d116a突变。

编码核心蛋白的核酸因此可以包含pol基因中的至少一个突变和/或gag基因中的至少一个突变。所述至少一个突变可以是核苷酸缺失、插入或取代。

在一个优选的实施方案中，编码核心蛋白的核酸包含pol基因中的至少一个突变，从而编码缺陷型整合酶。

包含缺陷型整合酶的逆转录病毒载体称为整合缺陷型逆转录病毒载体。这种载体允许瞬时转移编码目的基因的衣壳化rna分子。

优选的整合缺陷型逆转录病毒载体是idlv(整合缺陷型慢病毒载体)。

gag和pol基因的来源为逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体命名。例如，表述“hiv-1衍生的逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体”通常表明gag和pol基因是hiv-1的基因或是hiv-1的经修饰的gag和pol基因。

包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组的载体也可用于共转染，特别是用于产生逆转录病毒载体。

“包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组的载体”在本文中是指包含称为“顺式作用”序列的逆转录病毒核酸序列的载体。这些序列包括用于控制转录和整合的长末端重复序列(ltr)或修饰型(ltr)例如缺少u3区的至少一部分、衣壳化所必需的psi序列和逆转录病毒基因组的逆转录所必需的引物结合位点(pbs)和多嘌呤追踪(polypurinetrack)(ppt)序列。

使用包含缺少u3区的至少一部分的ltr的载体产生的逆转录病毒载体是例如自失活(sin-ltr)载体。

在一个实施方案中，所述包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组的载体还包含目的基因，其包括crispr/cas元件和/或s/mar-附加体。

当使用crispr/cas体系时，包含具有包装能力的逆转录病毒衍生的基因组的载体通常包含编码内切核酸酶cas(例如cas9)的基因、对应于目的基因特异性指导rna(grna)的dna序列和任选地用于基因纠正的序列。

在不存在任何反式互补功能的情况下，所述逆转录病毒衍生基因组优选是复制缺陷型的。具有复制能力的基因组将进一步包含gag、pol和env逆转录病毒基因。在复制缺陷型基因组中，病毒基因gag、pol和env缺失。本发明的逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的组装是通过反式提供另一种编码gag和pol，但对于“顺式”序列(例如(iv)的载体)有缺陷的载体，以及至少另一种编码假型化包膜糖蛋白的载体或核酸(例如(i)、(ii)和(iii)的核酸或包含所述核酸的载体)而实现的。它们的表达允许目的基因的衣壳化，不包括病毒基因组增殖和形成完整病毒颗粒所必需的基因。

用于制备如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的方法还可以包含以下步骤：

b)将共转染细胞培养足够的时间以允许由所述核酸和载体编码的蛋白的表达；

c)使所编码的蛋白形成逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体。

调节特定细胞或细胞亚型的活性和/或转导特定细胞或细胞亚型

本发明的另一个目的是如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体选择性地调节靶细胞的活性和任选地选择性地转导靶细胞的用途，优选体外或离体用途。

本发明的另一个目的是用于选择性地调节靶细胞的活性和任选地选择性地转导靶细胞的方法，优选体外或离体方法，其中所述方法包括使如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体与包含所述靶细胞的细胞接触。

表述“选择性地调节靶细胞活性”中的术语“选择性地”意指基本上只有所述靶细胞的活性被假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体调节。例如，其活性被调节的细胞包含小于10％，例如小于5％或小于1％的非靶细胞。

表述“选择性地转导靶细胞”中的术语“选择性地”意指基本上只有靶细胞被转导。例如，被转导的细胞包含少于10％，例如少于5％或少于1％的非靶向细胞被转导。

表述“调节靶细胞的活性”如上文“功能结构域”部分中所定义。

如本文所用，术语“转移”或“转导”涉及逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体在与靶细胞结合后，将生物材料递送至靶细胞的膜或细胞质的能力。递送后，生物材料可以易位至细胞的其他区室。

如本文所用，表述“生物材料”涉及一种或多种易于改变细胞结构和/或功能的化合物。在本发明的上下文中，优选地，生物材料是包含目的基因的一种或多种核酸，该目的基因可以被包含在逆转录病毒载体的基因组内，如上所述。

进行细胞转导的条件是本领域技术人员所熟知的，并且通常包括优选以0.5至100的moi(感染复数)，将优选在例如用重组人纤维蛋白片段(retronectin)包被的烧瓶、平板或培养皿中培养的并任选地用细胞因子混合物预刺激的待转导细胞与假型化逆转录病毒载体孵育。

靶细胞特别如上同名部分中所定义。

假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体可以在培养基中与包含靶细胞的细胞接触。

技术人员知道适合于给定细胞的培养基。

假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体因此可以在体外或体内用于改变确定的细胞功能，从而为基础研究提供新的工具。

药物组合物

本发明还涉及一种药物组合物，其包含至少一种如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体。

药物组合物中待使用的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的量取决于例如免疫原性、意图给药的受试者的状况(例如，体重、年龄、性别、健康、同时治疗(如果有的话)和治疗频率)、施用方式、制剂类型和/或靶细胞数。

药物组合物优选包含至少一种假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体和至少一种药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指包括不干扰活性成分的生物活性的有效性并且优选对施用的宿主无毒的任意载体。

可用于本发明药物组合物的药学上可接受的载体是本领域技术人员公知的。例如，它们包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(sedds)、例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、用于药物剂型的表面活性剂如吐温或其他类似聚合物递送基质、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、钾磷酸氢盐、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。环糊精如α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，或化学改性的衍生物如羟烷基环糊精(包括2-羟丙基-β-环糊精和3-羟丙基-β-环糊精)，或者其它溶解的衍生物也可有利地用于增强本发明组合物的递送。

药物组合物可包含10⁶iu至10¹²iu的假型逆转录病毒载体，优选10⁷iu至10⁹iu，更优选10⁷iu至10⁸iu。

术语“iu”或“感染单位”在本文中是指在细胞系上通过滴定测定的感染性载体颗粒的量，并表示为iu/ml。

给药可以在单个剂量或数个剂量的本发明药物组合物中实现，所述数个剂量同时注射或随时间分开注射。

在一个实施方案中，药物组合物以单位剂型存在，以促进精确给药。术语“单位剂型”是指适合作为人类受试者和其他哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性物质，以及合适的药物赋形剂。典型的单位剂型包括液体组合物的预填充的、预先测量的安瓿或注射器。在这样的组合物中，假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体通常是次要组分，其余为有助于形成所需剂型的各种媒介物或载体和加工助剂。

本发明还提供了试剂盒，其包含如上定义的含有假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的药物组合物，和关于给药方式的说明书。这些说明书可以例如注明医学适应症、给药途径、剂量和/或待治疗患者组。

待治疗的受试者

待治疗的受试者可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。

人也称为“个体”或“患者”。

所述人类可以是任意年龄，例如婴儿、儿童、青少年、成年人、老年人和任意性别。

非人类哺乳动物优选是啮齿动物(例如小鼠、大鼠或兔子)、猫科动物(例如猫)、犬科动物(例如狗)或灵长类动物(例如黑猩猩)。

待治疗的受试者优选是人。

疾病的预防和/或治疗

本发明特别适用于预防和/或治疗可通过选择性地调节特定细胞或细胞亚群的活性和任选地通过选择性地转导所述特定细胞或细胞亚群来预防和/或治愈的疾病。

所述疾病优选包括特定细胞或细胞亚群。

待治疗的受试者因此可能患有可通过选择性地调节特定细胞或细胞亚群的活性和任选地通过选择性地转导所述特定细胞或细胞亚群来预防和/或治愈的疾病，或可能受到该疾病的影响。

所述疾病可选自由以下组成的组：免疫疾病(例如自身免疫疾病)、癌症、遗传疾病、过敏性疾病、炎性疾病、传染病(特别是细菌和/或病毒感染)、代谢疾病、神经退行性疾病(例如神经营养不良、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病)、肌肉疾病及其组合。

如本文中所使用，表述“自身免疫疾病”是指由于机体对通常存在于机体中的物质和/或组织的过度活跃的免疫应答导致的疾病。因此，通过特异性靶向参与该过度活跃的免疫应答的免疫细胞，本发明的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体是预防和/或治疗自身免疫疾病的有用工具。

自身免疫疾病特别包括急性播散性脑脊髓炎、急性出血性脑白质炎、阿狄森氏病(addison'sdisease)、丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩性侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性变态反应、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴增生综合征、自身免疫性周围神经病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛(balo)病、巴洛同心圆硬化、bechets综合征、伯格氏病(berger'sdisease)、比克斯塔夫氏脑炎(bickerstaff'sencephalitis)、blau综合征、大疱性类天疱疮、卡尔斯曼氏病(castleman'sdisease)、乳糜泻、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、churg-strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、cogan综合征、冷凝集素病、补体组分2缺乏症、颅动脉炎、crest综合征、克罗恩病(crohn'sdisease)、库欣氏综合征(cushing'ssyndrome)、皮肤白血球血管炎、德戈氏病(dego'sdisease)、德尔肯氏病(dercum'sdisease)、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤全身性硬化症、德雷斯勒氏综合征(dressler'ssyndrome)、盘状红斑性狼疮、湿疹、接骨点炎相关的关节炎、嗜酸细胞性筋膜炎、嗜酸细胞性胃肠炎、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、原发性混合型冷球蛋白血症、埃文氏综合征(evan'ssyndrome)、进行性骨化性纤维发育不良(firodysplasiaossificansprogressiva)、纤维化肺泡、胃炎、胃肠道类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、格雷夫斯氏病(grave'sdisease)、guillain-barré综合征(gbs)、桥本氏脑炎(hashimoto'sencephalitis)、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、henoch-schonlein紫癜、妊娠疱疹、低丙球蛋白血症、特发性炎症性脱髓鞘疾病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、iga肾病、包涵体肌炎、炎性脱髓鞘性多发性神经病、间质性膀胱炎、幼年特发性关节炎、幼年型类风湿关节炎、川崎病(kawasaki'sdisease)、lambert-eaton肌无力综合征、白血球破裂性血管炎、扁平苔癣、硬化性苔癣、线状iga病(lad)、卢伽雷氏病(lougehrig'sdisease)、狼疮状肝炎、红斑狼疮、majeed综合征、美尼尔氏病(ménière'sdisease)、显微性多血管炎、miller-fisher综合征、混合性结缔组织病、硬皮病、mucha-habermann病、多发性硬化、重症肌无力、肌炎、正视神经脊髓炎(neuropyelitisoptica)、神经性肌强直、眼瘢痕性类天疱疮、斜视性阵挛肌阵挛综合征、奥德甲状腺炎(ordthyroiditis)、复发性风湿、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、parryromberg综合征、parsonnage-turner综合征、扁平部睫状体炎、天疱疮、寻常型天疱疮、恶性贫血、静脉周围性脑脊髓炎、poems综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎性病变、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍、rasmussen氏脑炎、雷诺氏症(raynaudphenomenon)、复发性多软骨炎、莱特尔氏综合征(reiter'ssyndrome)、多动腿综合征、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、类风湿性发热、结节病、施密特综合征(schmidtsyndrome)、施尼茨勒综合征(schnitzlersyndrome)、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征脊椎关节病、斯蒂尔病(still'sdisease)、僵人综合征、亚急性细菌性心内膜炎、susac氏综合征、sweet氏综合征、西德纳姆舞蹈病(sydenhamchorea)、交感性眼炎、高安氏动脉炎(takayasu'sarteritis)、颞动脉炎、tolosa-hunt综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病、未分化脊柱关节病、血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病(wegener'sgranulomatosis)。

如本文所用，术语“癌症”包括任意类型的癌症，例如成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、乳腺癌、肝细胞癌、由造血细胞引起的癌症包括白血病特别是b-cll(b细胞慢性淋巴细胞性白血病)、cml(慢性粒细胞白血病)或基于t细胞的白血病如atl(急性t细胞白血病)、all(急性淋巴细胞白血病)、aml(急性髓性白血病)和/或黑色素瘤。

治疗应用

本发明还涉及如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体作为药物，优选用于免疫疗法基因治疗和/或疫苗接种。

基因疗法是使用基因作为药物的疗法，其可以例如通过在细胞中递送目的基因和/或纠正内源性部位的目的基因而获得。在基因疗法中，将包含目的基因的核酸递送到患者的细胞中，由目的基因编码的蛋白的表达和/或目的基因的纠正从而允许预防和/或治疗疾病。

所述目的基因可以存在于本发明逆转录病毒载体所包含的rna分子中。

基因的纠正可以由crispr/cas体系进行。

免疫疗法(immunetherapy)，也称为免疫疗法(immunotherapy)，是基于调节免疫系统活性(例如，刺激或抑制)以预防和/或治疗疾病的疗法。

在本发明的上下文中，免疫疗法包括通过使用本发明的逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体来仅调节特定靶向免疫细胞的活性，并任选地选择性地转导所述靶免疫细胞。例如，逆转录病毒载体可用于激活b细胞，例如使它们在浆细胞中分化，并任选地用编码抗感染物(例如抗hiv、hcv或hbc)的异位抗体的核酸转导它们。

免疫疗法还包括t细胞疗法。在t细胞疗法中，除了对其功能进行调节外，t细胞可能更容易进行基因转移，例如t细胞受体(car)基因转移。

过继性t细胞疗法是一种疗法，其中将t细胞输注给需要的受试者。在本发明的上下文中，通过使用本发明的逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体，可以在输注之前调节所述t细胞的活性。

在本发明的上下文中，疫苗接种包括在逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的表面呈现特异性病毒表位，所述特异性病毒表位会同时靶向并激活抗原呈递细胞(例如巨噬细胞)，随后抗原呈递细胞将表位呈递给免疫系统(t和b细胞)。

本发明还涉及如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体用作药物，其中所述假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体选择性地调节靶细胞的活性并任选地选择性地转导靶细胞。

本发明特别涉及如上定义假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体用于预防和/或治疗如上述“疾病的预防和/或治疗”部分中所定义的疾病。

所述疾病例如是免疫疾病(例如自身免疫疾病)、癌症、遗传疾病、过敏性疾病、炎性疾病、传染病(特别是细菌和/或病毒感染)、代谢疾病、神经退行性疾病(例如神经营养不良、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病)、肌肉疾病及其组合。

在一个实施方案中，假型逆转录病毒类似颗粒或逆转录病毒载体用于改善dc(树突细胞)疫苗，例如，通过在载体的表面上共同呈现呈现dc细胞特异性配体(如cd11b)和gm-scf(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)，例如蛋白和基因转移。

在一个有利的实施方案中，t细胞活化与t细胞特异性基因转移结合，这显著增强静息t细胞中的基因转移效率，例如在基于t细胞的基因疗法中。将基因有效体内转移到t细胞亚群中是基因和细胞疗法领域的一次革命，因为它允许省略导致临床应用高成本的离体培养和转导过程。此外，将细胞留在体内正常微环境中使它们能够保持其表型并长期持续存在于患者体内(例如肿瘤特异性cd8细胞毒性细胞)。

在另一个实施方案中，本发明可用于增强选择性基因递送至静息b淋巴细胞，例如在基于b细胞的基因疗法中，例如允许b细胞产生抗感染物的中和抗体或允许b细胞分泌被免疫系统耐受的重组蛋白的免疫疗法，因为b细胞可以作为致耐受性细胞。

此外，在假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的表面上呈现一种或多种细胞因子可诱导t细胞亚群分化成表型如tscm或tcm，它可能在体内长期存在。

在另一个实施方案中，本发明可用于体内扩增(自体)抗癌自然杀伤细胞，用于癌症治疗。

在一个实施方案中，通过共呈现凋亡配体和肿瘤或免疫细胞特异性靶向结构域，使用假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体诱导确定细胞亚群的细胞凋亡。

假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体可以以药物组合物的形式提供。

药物组合物优选如上文同名部分中所定义。

本发明还涉及一种治疗有需要的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体，优选在免疫疗法、基因疗法和/或疫苗接种的框架内。

本发明还涉及一种治疗有需要的受试者的方法，其包括施用治疗有效量的如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体，其中所述假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体选择性地调节靶细胞的活性并任选地选择性地转导靶细胞。

本发明还涉及一种预防和/或治疗疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的如上定义的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体，其中所述疾病优选如上所述。

可以使用本领域技术人员已知的任意合适的施用方法。特别地，根据本发明的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体可以通过口服途径、肠胃外途径(优选通过静脉内注射)、髓内途径特别是股骨内(如骨髓腔内)或肱骨髓内途径注射和/或局部肿瘤内注射施用。

当选择肠胃外途径时，假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体可以是例如在安瓿或烧瓶中调理的可注射溶液或悬浮液的形式。

假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体优选以治疗有效量使用或给药。

“治疗有效量”是指赋予被治疗受试者治疗效果的假型逆转录病毒类似颗粒或逆转录病毒载体的量。治疗效果可以是客观的(即，可通过一些测试或标记测量)或是主观的(即，受试者给出效果的指示或感受效果)。如技术人员已知，有效剂量将取决于施用途径、受试者的大小和/或重量以及与其他试剂共同使用的可能性而变化。

本文所用的术语“包含”包括术语“由...组成”。

本发明将根据以下实施例和附图进一步说明。

本文引用的所有参考文献，包括期刊文章或摘要、已公开或未公开的专利申请、授权专利或任意其他参考文献，均通过引用的方式整体并入本文，包括引用的参考文献中呈现的所有数据、表格、图形和文本。

序列的简要说明

seqidno：1对应于编码截短且突变的(y481a、r533a、s548l、f549s)mvh蛋白(hcδ18)的核酸序列，所述mvh蛋白与对人cd4具有特异性的设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)-29.2融合。

seqidno：2对应于由序列seqidno：1编码的氨基酸序列。

seqidno：3对应于编码截短且突变的(e501a、w504、q530a、e533a)nivg蛋白(gcδ34)的核酸序列，所述nivg蛋白与针对人cd8的单链抗体(scfvc8-vh1)融合，用另外的(g4s)3接头连接。

seqidno：4对应于由序列seqidno：3编码的氨基酸序列。

seqidno：5对应于编码截短且突变的(e501a、w504、q530a、e533a)nivg蛋白(gcδ34)的核酸序列，所述nivg蛋白与il-7融合。

seqidno：6对应于由序列seqidno：5编码的氨基酸序列。

seqidno：7对应于编码截短且突变的(e501a、w504、q530a、e533a)nivg蛋白(gcδ34)的核酸序列，所述nivg蛋白与针对人epcam的设计的锚蛋白重复蛋(darpin)融合。

seqidno：8对应于由序列seqidno：7编码的氨基酸序列。

seqidno：9对应于尼帕病毒包膜糖蛋白g的全长氨基酸序列。

seqidno：10对应于麻疹病毒包膜糖蛋白h的全长氨基酸序列。

seqidno：11对应于尼帕病毒包膜糖蛋白f的全长氨基酸序列。

seqidno：12对应于麻疹病毒包膜糖蛋白f的全长氨基酸序列。

seqidno：13对应于编码截短且突变的mevh蛋白(hcδ15)的核酸序列，所述mevh蛋白与il-7融合。

seqidno：14对应于由序列seqidno：13编码的氨基酸序列。

seqidno：15对应于在细胞质尾部截短了30个氨基酸的麻疹病毒f蛋白(fcδ30)的氨基酸序列。

seqidno：16对应于在细胞质尾部截短了22个氨基酸的尼帕病毒f蛋白(fcδ22)的氨基酸序列。

附图简要说明

图1：通过4^h/il7^h-lv将erbb2-car基因有效且稳定地转移到静息cd4⁺t细胞中。为了评估4^h/il7^h-lv是否可以有效地将治疗基因(erbb2特异性car，erbb2-car)转移到静息t细胞中，用4^h-lv或4^h/il7^h-lv转导新鲜分离的cd3⁺t细胞。用vsv-lv转导或不经转导(ut)的细胞用作阴性对照。三天后，通过facs分析一半的转导的细胞，以确定cd4或cd8门控的细胞中erbb2-car⁺细胞的百分比。为了确认稳定的erbb2-car表达，在洗涤步骤之后，将另外一半的转导的细胞在抗cd3/抗cd28/il-2刺激的存在下再培养另外三天。然后，通过facs测定cd4⁺/erbb2⁺细胞和cd8⁺/erbb2⁺细胞的百分比。

图2：niv包膜糖蛋白g的突变以消除天然受体识别。示出了ephrin-b2(a)和b3(b)与niv-g突变体的结合。将293t细胞用模拟物、编码gcδ34^his的质粒或用不同的gcδ34^epcam突变体转染：未突变的(gcδ34^epcam)、e533a(gcδ34^epcammut1)、q530a+e533a(gcδ34^epcammut2.1)、e501a+w504a(gcδ34^epcammut2.2)或e501a+w504a+q530a+e533a(gcδ34^epcammut4)，并与1μg/ml重组fc-ephrinb2或b3一起孵育。不同突变体对受体的结合量记为mfi值。统计数据涉及未突变的gδ34-darpin-ac1(n＝3；示出了平均值±标准差(sd)；通过非配对t检验*，p<0.1**，p<0.01；***，p<0.001)。

图3：通过4^h/il7^h-vlp选择性活化cd4⁺t细胞。新鲜分离的cd3⁺t细胞不经转导(ut)或用不同类型的vlp转导，所述vlp用cd4-darpin-hmut(4^h-vlp)、cd4-darpin/il7-hmut(4^h/il7^h-vlp)或il7-hnse(hnse/il7^h-vlp)假型化。三天后，细胞被cd8、cd4和cd71抗体染色。示出了cd4或cd8门控的t细胞中的cd71表达。

图4：在靶向vlp上功能性显示的il7促进t细胞存活。用病毒样颗粒(vlp)孵育6天的成人静息cd3⁺t细胞的前向/侧向散射图，所述病毒样颗粒用cd4靶向的mv-h(4^h-vlp)、cd8靶向的mv-h(8^h-vlp)、呈现il7的cd4靶向的mv-h(4^h/il7^h-vlp)、或呈现il7的cd8靶向的mv-h(8^h/il7^h-vlp)假型化。单独在培养基中培养的细胞(未转导的，ut)或在15ng/mlil7存在下培养的细胞用作对照。活细胞的百分比指示于各斑点印记中。

图5：在cd4靶向的lv上功能性显示的il7促进t细胞存活。用慢病毒载体(lv)孵育6天的成人静息cd3⁺t细胞的前向/侧向散射图，所述慢病毒载体用vsvg(vsv-lv)、mv-hmut(hnse-lv)、cd4靶向的mv-h(4^h-lv)、或呈现il7的cd4靶向的mv-h(4^h/il7^h-lv)假型化。单独在培养基中培养的细胞(未转导的，ut)或在15ng/mlil7存在下培养的细胞用作对照。活细胞的百分比指示于各斑点印记中。

图6：通过4^h/il7^h-lv选择性活化cd4⁺t细胞。新鲜分离的cd3⁺t细胞不经转导(ut)或用不同类型的lv转导，所述lv用cd4-darpin-hmut(4^hδ18-lv)、hnse(hnse-lv)、或vsvg(vsvg-lv)假型化。在这里，il7呈现在两种不同版本的hmut上，20个氨基酸c-截短型(hδ20)或15个氨基酸c-截短型(hδ15)。因此，产生了两种类型的4^h/il7^h-lv并转导静息t细胞。三天后，细胞被cd3、cd8、cd69和cd71抗体染色。示出了cd8⁺和cd8^-(cd4⁺)细胞中活化标记cd69和cd71的表达。

图7：假型慢病毒载体(lv)的示意图。4^h-lv是基于mev糖蛋白假型的cd4靶向的lv。4^h/il7^h-lv是基于mev糖蛋白假型的展示il7的cd4靶向的lv。包膜糖蛋白h(mv-h)在其细胞质尾部被截短，例如截短15、18或20个氨基酸，并且引入四个点突变(y481a、r533a、s548l和f549s)中的至少两个以使其不能天然受体识别slam和cd46，从而得到包膜糖蛋白hmut。然后，用或不用接头将靶向结构域(例如cd4-darpin)和/或细胞因子(例如il7)与突变体h(hmut)融合。mv包膜糖蛋白f在其细胞质尾部被截短30个氨基酸(mv-fδ30)。

图8：假型病毒样颗粒(vlp)的示意图。8^g-vlp是基于niv糖蛋白假型的cd8靶向的vlp。8^g/il7^g-vlp是基于niv糖蛋白假型的呈现il7的cd8靶向的vlp。niv-g包膜糖蛋白在其细胞质尾部被截短34个氨基酸(δ34)，并且引入四个点突变(e501a、w504a、q530a和e533a)以使其不能天然受体识别ephrin-b2/b3，从而得到包膜糖蛋白niv-gδ34。然后，用或不用接头将靶向结构域(cd8-scfv)和/或细胞因子(il7)与突变g蛋白(niv-gδ34)融合。niv包膜糖蛋白f在其细胞质尾部被截短22个氨基酸(niv-fδ22)。

图9：通过4^h/il7^h-lv高效且选择性地转导静息cd4⁺t细胞。新鲜分离的cd3⁺t细胞不经转导(ut)或用不同类型的lv转导，所述lv用cd4-darpin-hmut(4h^δ18-lv)、hnse(hnse-lv)或vsvg(vsvg-lv)假型化。在这里，il7呈现在两种不同版本的hmut上，20个氨基酸c-截短型(hδ20)或15个氨基酸c-截短型(hδ15)。因此，产生了两种类型的4^h/il7^h-lv(4^hδ18/il7^hδ15-lv和4^hδ18/il7^hδ20-lv)并转导静息t细胞。三天后，细胞被cd3、cd8和cd4抗体染色。示出了cd4或cd8门控的t细胞中的gfp表达。

图10：niv糖蛋白假型化lv的中和。与连续稀释的合并人血清(ivig)在37℃孵育2小时后，以0.4的moi用nivmutepcam-lv(圆圈)、mvepcam-lv(方块)、nivwt-lv(三角)、或vsvg-lv(菱形)转导cho-epcam或cho-ephrin-b2细胞。72小时后，通过流式细胞术测定gfp+细胞，并示出相对于未处理对照的gfp+细胞数(n＝3)。

图11：通过8^g/il7^g-lv选择性活化cd8⁺t细胞。新鲜分离的cd3⁺t细胞不经转导(ut)或用不同类型的lv转导，所述lv用cd8-scfv-gmut(8^g-lv)或cd8-scfv-gmut/il7-gmut(8^g/il7^g-lv)假型化。三天后，细胞被cd8、cd4和cd71抗体染色。示出了cd4或cd8门控的t细胞中的cd71表达。

图12：通过8^g/il7^g-lv高效且选择性地转导静息cd8⁺t细胞。新鲜分离的cd3⁺t细胞不经转导(ut)或用不同类型的lv转导，所述lv用cd8-scfv-gmut(8^g-lv)或cd8-scfv-gmut/il7-gmut(8^g/il7^g-lv)假型化。三天后，细胞被cd3、cd8和cd4抗体染色。示出了cd4或cd8门控的t细胞中的gfp表达。

图13：通过8^g/il7^g-lv将car19高效转移到静息cd8⁺t细胞中。新鲜分离的cd3⁺t细胞不经转导(ut)或用不同类型的lv转导，所述lv用cd8-scfv-gmut(8^g-lv)或cd8-scfv-gmut/il7-gmut(8^g/il7^g-lv)或vsvg(vsv-lv)假型化。由lv递送编码cd19特异性car(car19)的治疗基因。转导后3天，通过抗cmyc抗体检测car19表达。示出了cd4⁺或cd8⁺t细胞中car19表达细胞的百分比。

图14：4^h/il7^h-lv允许人源化小鼠中cd4+t细胞的靶向体内活化。

nod/scidgc-/-小鼠注射脐带血t细胞，移植后2个月(20％t细胞重建)，iv注射100微升的4^h/il7^h-lv(1e6iu)或4^h/il7^h-lv。注射载体两周后，处死小鼠并评估脾细胞中cd71+cd4+t细胞(活化标志物)的％。

实施例

材料和方法

构建体的产生

将pcr扩增的来自pqe30ss_ac1_corr的epcam特异性darpinac1的编码序列(stefan等人2011)通过sfii/noti插入到质粒phl3-hrs3opt2#2(friedel等人2015)的骨架中，产生编码截短且突变的mvhcδ18mut蛋白以及编码h和his标签之间的(g4s)3接头的质粒phl3-ac1。

编码尼帕病毒g蛋白变体的所有质粒均源自质粒pcaggs-niv-codonop-gn。通过pcr扩增每个片段将ac1靶向结构域的编码序列与g蛋白阅读框的c-末端融合，同时引入用于连接的常见agei限制性酶切位点，得到质粒pcaggs-niv-g-darpin-ac1。所有其他靶标结构域通过agei/noti进行交换。通过pcr扩增g蛋白阅读框并将pcr片段插入到pcaggs-niv-g-darpin-ac1中而引入g蛋白细胞质尾部的截短，得到质粒pcaggs-niv-gcδ33-darpin-ac1和pcaggs-niv-gcδ34-darpin-ac1。通过pcr扩增从pcaggs-niv-codonop-gn生成带his标签的g蛋白和gcδ34蛋白。通过paci/noti限制性酶切将片段克隆到pcaggs-niv-g-darpin-ac1的质粒骨架中，分别得到pcaggs-niv-g-his和pcaggs-niv-gcδ34-his。通过定点突变将干扰天然受体识别的突变引入niv-gcδ34-darpin-ac1蛋白编码序列中。通过用突变位点的同源区扩增携带指定突变的两个片段来产生每个突变。通过侧翼引物对融合并扩增这些片段。通过rsrii/agei将所得片段克隆到pcaggs-niv-gcδ34-darpin-ac1中，生成质粒pcaggs-niv-gcδ34epcammut。

为了生成niv-f变体，从pcaggs-niv-f扩增fcδ22和fcδ25的编码序列，并通过paci/saci限制性酶切克隆到pcaggs-niv-codonop-gn的质粒骨架中，得到质粒pcaggs-niv-fcδ22和pcaggs-niv-fcδ25。通过从pcaggs-niv-f扩增niv-f变体并同时在n-末端添加au1标签，生成带au1标签的niv-f变体，将其用于载体颗粒的western印迹分析。将所得pcr片段通过paci/saci限制性酶切克隆到pcaggs-niv-codonop-gn的骨架中，得到质粒pcaggs-au1-niv-f、pcaggs-au1-niv-fcδ22和pcaggs-au1-niv-fcδ25。

载体制备

通过使用聚乙烯亚胺(pei)瞬时转染hek-293t细胞生成了载体颗粒。转染前24小时，将2.5×107个细胞接种到t175烧瓶中。在转染当天，将细胞培养基替换为含有15％fcs和3mml-谷氨酰胺的10mldmem。通过将35μg总dna与2.3ml不含添加剂的dmem混合来制备dna混合物。

例如，在优化g与f的比例后，将0.9μg编码gcδ34darpin/scfv变体的质粒与4.49μg编码f变体的质粒混合。使用14.4μg的hiv-1包装质粒pcmvδr8.9和15.1μg的转移-lv质粒。通过将140μl的18mmpei水溶液与2.2ml不含添加剂的dmem混合来制备转染试剂混合物。将该溶液与dna混合物混合，涡旋，在室温下孵育20分钟并加入到hek-293t细胞中，得到总共含有10％fcs、2mml-谷氨酰胺的dmem。24小时后，将培养基用含有10％fcs、2mml-谷氨酰胺的dmem替换，以除去剩余的pei/dna复合物。在转染后第2天，将含有慢病毒载体的细胞上清液通过0.45μm过滤器过滤。如果需要，通过在20％蔗糖垫上以450×g离心24小时来纯化载体颗粒。将沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。对于转导，将8×103个cho-epcam和sk-ov-3细胞或2×104molt4.8和raji细胞接种到96孔板的单个孔中并在第二天转导。需要时，在加入载体之前，用含有不同浓度的巴弗洛霉素a1(bafilomycina1)(santacruzbiotechnology，inc，dallas，usa)的培养基替换细胞培养基，并将细胞在37℃预孵育30分钟。对于滴定，使用至少四个连续稀释的载体颗粒。72小时后，通过流式细胞术测定绿色荧光蛋白(gfp)阳性细胞的百分比。通过选择在稀释因子与gfp阳性细胞数量(转导细胞数/载体体积，以μl/0.001表示)之间显示线性相关性的稀释液来计算转导单位/ml(t.u./ml)

本发明的假型逆转录病毒样颗粒或逆转录病毒载体的示意图示出于图7和8中。

实施例1：cd4+t细胞的选择性活化

为了激活cd4⁺淋巴细胞而不激活cd8⁺淋巴细胞，生成了vlp，其在mvh蛋白以及融合蛋白(f)上呈现cd4特异性darpin作为靶向配体并呈现il-7作为激活结构域，得到4^h/il7^h-vlp(包含序列seqidno：2、14和15的蛋白)。为了生成颗粒，建立了转染方案。简而言之，使用0.45μg的pcg-hmut-cd4-darpin(zhou等人，jimmunol，2015)、0.45μg的pcg-hδ15-il7(由elsverhoeyen提供)、4.7μg的pcg-fcδ30(funke等人，moleculartherapy，2008)、14.4μg的hiv-1包装质粒pcmvδr8.9(funke等人，moleculartherapy，2008)和15.1μg的pcg-1在一个t175烧瓶中转染hek293t细胞。收获后，通过超速离心进一步浓缩载体颗粒。获得了lv的滴度为～10⁷tu/ml，获得了vlp的滴度为～1.5μgp24/ml。

在新鲜分离的静息t细胞上证实了4^h/il7^h-vlp的功能。简而言之，使用pant细胞分离试剂盒(miltenyibiotech)通过阴性选择从成人外周血中分离cd3⁺t细胞。随后，在没有任何刺激的情况下将细胞与4^h/il7^h-vlp一起孵育。三天后，如通过facs分析cd71活化标记所证实的，细胞培养物中的cd4⁺t细胞而非cd4^-t细胞被激活(图3)。呈现il-7的非靶向颗粒激活cd4⁺t细胞和cd4^-t细胞。已知il-7是t细胞存活细胞因子。因此，证明所有呈现il7的vlp在防止原代t细胞死亡方面与重组人il-7一样有效，而在常规的il7缺陷型vlp颗粒的存在下6天后，培养物中放置的大多数静息t细胞死亡(图4)。

呈现il7的cd4靶向的lv(4^h/il7^h-lv)也获得了促进t细胞存活和选择性激活cd4⁺t细胞的能力。如上所述制备病毒颗粒，除了用编码gfp的转移质粒取代pcg-1。另外，为了测试系统的灵活性以及颗粒的功能是否可以通过使用其他形式的hmut增强，使用编码hmut-il7的两种不同的质粒来制备载体。pcg-hδ15-il7是hmut-il7的15个氨基酸细胞质截短型(用于4^h/il7^hδ15-lv制备)，pcg-hδ20-il7是hmut-il7的20个氨基酸细胞质截短型(用于4^h/il7^hδ20-lv制备)。没有特别指示，用pcg-hδ15-il7制备呈现il7的vlp和lv。与4^h/il7^h-vlp所达到的结果相似，当新鲜分离的人cd3⁺t细胞与指定的lv在没有刺激的情况下孵育6天时，与亲本4^h-lv和非靶向hnse-lv相比，4^h/il7^h-lv显著促进t细胞存活(图5)。如所预期的，在rhil-7处理的阳性组中观察到了最高百分比的活细胞，在vsv-lv转导或未转导(ut)组中观察到了最少的存活细胞(图5)。此外，在选择性刺激混合细胞培养物中的其靶细胞群方面，4^h/il7^h-lv与4^h/il7^h-vlp一样有效。如图6所示，4^h/il7^h-lv选择性地上调激活因子cd69和cd71表达cd4⁺细胞而非cd4^-细胞。在cd4⁺t细胞刺激方面4^h/il7^hδ15-lv和4^h/il7^hδ20-lv之间没有差异。因此，成功生成了功能性呈现il7的靶向lv。

实施例2：将肿瘤特异性嵌合抗原受体递送到静息t细胞中

由于il7呈现载体引发静息t细胞活化，因此预期这些细胞允许慢病毒转导。为了证明这一点，生成了两种版本的4^h/il7^h-lv递送gfp转基因。如图9所示，4^h/il7^hδ15-lv和4^h/il7^hδ20-lv均可有效地且选择性地转导细胞混合物中的静息cd4⁺t细胞。

嵌合抗原受体(car)是癌症治疗的有力工具。到目前为止，对于car的遗传递送，必须将t细胞亚群纯化并激活。在此，证明car可以选择性地递送到静息cd4⁺细胞中。所述颗粒如实施例1所述产生，不同之处在于pcg-1被编码car的转移质粒取代。当静息t细胞用递送4^h/il7^h-lv的erbb2特异性嵌合抗原受体(erbb2-car)转导时，仅在cd4⁺t细胞群中观察到erbb2-car表达。与il7缺陷型cd4靶向lv(4^h-lv)相比，4^h/il7^h-lv在递送car基因方面更有效，同时保留了对cd4⁺t细胞的选择性(图1)。

实施例3：mv糖蛋白可被niv的mv糖蛋白替代以选择性地激活和转导静息的人cd8⁺t细胞

为了有效地用niv糖蛋白假型化vlp或lv，将niv-g的细胞质尾部截短34个氨基酸(gcδ34)，并将niv-f的细胞质尾部截短22个氨基酸(fδ22)。接下来，通过向gcδ34中引入四个点突变(e501a、w504a、q530a、e533a)，破坏了gcδ34对于ephrin-b2/b3的天然受体识别。用该工程化g蛋白假型化的lv完全丧失了与天然ephrin-b2和ephrin-b3niv受体的结合(图2)，并且不进入表达这些受体的细胞中。

此外，niv假型化的lv具有一些有吸引力的特征，如高产量和对静脉内免疫球蛋白的抗性。由于没有针对niv的疫苗接种，并且少数疫情仅限于马来西亚、孟加拉国和印度(searo|who东南亚地区)的少数病例，因此人类中不应存在中和抗体。为了证明这一点，在转导靶细胞之前，将覆盖了最广泛的人血清供体的静脉注射免疫球蛋白以增加的浓度与nivwt-lv、nivmut^epcam-lv、mv^epcam-lv和vsv-lv一起孵育。然后在转导后三天通过流式细胞术测定gfp表达。如所预期的，由vsvg-lv和nivwt-lv介导的转导不受ivig处理的影响。另一方面，在转导率上mv^epcam-lv显示剂量依赖性降低，在100μg/ml的ivig下完全中和。相比之下，nivmut^epcam-lv在使用的所有浓度下都对ivig具有抗性，因此，与相应的基于mv的载体相比，nivmut^epcam-lv对人免疫球蛋白的敏感性低至少10000倍(图10)。这些结果表明，基于niv糖蛋白的受体靶向载体在注入人体时不会被中和。

因此，由于niv-g的上述特征，进一步使用niv假型来产生呈现细胞因子的cd8靶向颗粒。这里，在niv-gδ34mut4上呈现源自okt8的cd8特异性scfv以产生包膜质粒pcg-gmut-cd8scfv，并且在niv-gδ34mut4上呈现人il7以产生包膜质粒pcg-gmut-il7。为了产生8^g/il7^g-lv，使用0.45μg的pcg-gmut-cd8scfv、0.45μg的pcg-gmut-il7、4.7μg的pcg-fcδ22、14.4μg的hiv-1包装质粒pcmvδr8.9和15.1μg的转移-lv质粒在一个t175烧瓶中转染hek293t细胞。获得了lv的滴度为～10⁷tu/ml，获得了vlp的滴度为～1.5μgp24/ml。

与4^h/il7^h-lv所达到的结果相似，8^g/il7^g-lv(包含序列seqidno：4、6和16的蛋白)能够选择性地刺激和转导外周血混合物中的cd8⁺t细胞。如图11所示，当新鲜分离的人cd3⁺t细胞与8^g/il7^g-lv一起孵育3天时，不仅培养物中的cd8⁺t细胞亚群上调cd71表达，而且只有该细胞群有效地表达报告基因转基因gfp(图12)或治疗性转基因car19(图13)。此外，与亲本il7缺陷型cd8靶向lv(8^g-lv)相比，8^g/il7^g-lv在激活靶细胞和递送转基因方面更有效，而不损害转导cd8⁺t细胞的特异性。

实施例4：鉴定靶向cd8的niv-g与呈现il7的niv-g的最佳比例

为了击中更多靶细胞、改善滴度并增强颗粒选择性激活和转导不同细胞群的特异性同时最大限度地降低脱靶效应，进一步优化转染方案的载体生产，并仔细确定包装细胞中维持的niv-g^{靶向结构域}(或mv-h^{靶向结构域})和niv-g^{功能结构域}(mv-h^{功能结构域})的量。

对于g⁸/g^il7-lv的产生，如实施例3中所述，使用总量为0.9μg的pcg-gmut质粒以及4.7μg的pcg-fcδ22、14.4μg的hiv-1包装质粒pcmvδr8.9和15.1μg的psew在一个t175烧瓶中转染hek293t细胞。同时，将pcg-gmut-cd8scfv和pcg-gmut-il7质粒以20：1、10：1、5：1、1：1或1：5的不同比例混合。使用含有8^g/il7^g-lv的各细胞上清液转导cd8⁺molt或a301细胞，转导后48小时，通过facs测量gfp⁺细胞的百分比以计算滴度。另外，使用8^g/il7^g-lv转导新分离的cd3⁺t细胞，然后测定cd8⁺和cd8^-细胞中的cd71和gfp表达。将最佳比例确定为滴度最高、在靶群体中cd71和gfp的表达最高且在非靶群体中表达最低。

实施例5：通过呈现il7的靶向vlp和lv转导的静息t细胞的表征

t细胞区室是高度异质的，并且t细胞亚组在表型上和功能上是不同的。就癌症的t细胞疗法而言，分化细胞较少通常与更好的体内抗肿瘤效果相关。因此，鉴定由本发明载体颗粒激活或修饰的t细胞亚群是重要的。以8^g/il7^g-lv-car为例，转导的静息t细胞的表型应与转导的预刺激t细胞(最广泛使用的cd3/cd28刺激方案)进行比较。简而言之，在转导静息cd3+t细胞或预刺激的cd3⁺t细胞后3天，监测多种t细胞标志物的表达，包括cd11a、cd11b、cd25、cd27、cd28、cd45ra、cd45ro、cd62l、cd69、cd71、cd95、cd127和ccr7。选择这些分子是因为它们过去曾用于区分cd45ra⁺cd45ro^-cd62l^高cd95^-cd27^高ccr7^高天然t细胞(tn)、cd45ra⁺cd45ro^-cd62l^高cd95⁺cd27^高ccr7^高干细胞记忆t细胞(tscm)、cd45ra^-cd45ro^高cd62l⁺cd95⁺cd27⁺中枢记忆t细胞(tcm)、cd45ra^-/+cd45ro^高cd62l^-cd95⁺cd27^-/+ccr7^-效应记忆t细胞(tem)和cd45ra^-/+cd45ro⁺cd62l^-cd95^高cd27^-cd28^-ccr7^-效应t细胞(te)。通过流式细胞术分析car⁺t细胞的表型。

另外，预先分选的cd4⁺t细胞亚群(tscm、tcm、tem和te)例如与4^h/il7^h-vlp一起孵育，以证明本发明对t细胞活化优于传统tcr刺激的优势。简言之，在用4^h/il7^h-vlp孵育或用cd3/28抗体刺激后3天，分析上述t细胞亚群的表型偏度和活化水平。预期呈现il7的t细胞靶向载体颗粒激活并转导分化程度较低的t细胞。

实施例6：增强离体产生的cart细胞的功能并简化cart细胞生产程序

已证明过继性t细胞免疫疗法是临床上用于治疗多种类型疾病的有效方案。但是，其更广泛的应用受到几个问题的限制。一方面，由于体外刺激、长期扩增和细胞分离和纯化，car工程化或tcr工程化t细胞的生产是非常昂贵且劳动密集的。另一方面，体外扩增的效应t细胞通常在体内持续性不佳，并且不能表现出持久的抗肿瘤效果。本发明通过将细胞刺激和基因转移结合在单一步骤中并实现静息t细胞转导，为这些挑战提供了潜在的解决方案。使用本发明，可以显著简化t细胞生产过程，从而降低t细胞生产的成本。此外，与常规产生的细胞相比，由于如实施例5中所证明的有效工程化的低分化细胞的潜力，本发明产生的car/tcr工程化t细胞在体内可以更有效。

为了证明这些特征，用例如8^g/il7^g-lv-car或vsv-lv-car作为对照转导新鲜分离的人pbmc或cd8⁺t细胞。同时，根据最广泛使用的方案，并行制备常规cart细胞。简而言之，用cd3/cd28抗体和il2刺激来自相同供体的分离的人pbmc或cd8⁺t细胞。然后用8^g/il7^g-lv-car或vsv-lv-car转导细胞，然后在il2的存在下扩增10天。载体转导静息t细胞后2-3天或转导刺激的t细胞后12天，将这些细胞与靶肿瘤细胞体外共培养或将这些细胞注入带有肿瘤的人源化小鼠中。然后，评估体外肿瘤细胞裂解和体内肿瘤缓解、动物存活、肿瘤反应性t细胞持久性和增殖。

实施例7：在类似体内的条件下通过呈现il7的靶向颗粒选择性活化和转导

在下一步中，研究了使用病毒颗粒靶向和功能性修饰体内环境中的不同细胞的可行性。因此，用病毒颗粒，例如用g⁸/g^il7-lv转导新鲜人外周血。这允许在活动人补体系统(病毒颗粒在体内遇到的障碍)的存在下评估cd8⁺t细胞群中的靶向活化和基因转移。

简而言之，将新鲜外周血与8^g/il7^g-lv-gfp或其他对照载体(vsv-lv、8^h/il7^h-lv、8^g-lv或vsv/il7^g-lv)一起孵育6-8小时。然后，从血液中分离总pbmc并在t细胞培养基中进一步培养，不添加任何刺激性试剂。3-4天后，评估培养物中的cd8⁺和cd8^-细胞的cd71和gfp表达。为了确认稳定的基因转移，在分析gfp⁺细胞的百分比之前，将一小部分细胞转移到补充有cd3/cd28抗体和il2的培养基中另外3天。

实施例8：呈现il7的靶向颗粒选择性激活和转导人源化小鼠模型中的循环静息t细胞

为了证明根据本发明的颗粒能够在体内局部地或系统地应用以允许细胞类型特异性激活或修饰，将它们应用于被植入来自健康供体的人cd34⁺造血干细胞(hsc)的小鼠中。在该小鼠模型中，可以产生多系人造血细胞，并且小鼠宿主可以耐受这些细胞。

这里，以将g⁸/g^il7-假型化颗粒应用于人cd8⁺t细胞活化和修饰为例。简而言之，在通过检测到约10％的人cd3⁺t细胞证实成功建立了人免疫系统后，通过静脉内注射(iv)全身施用g⁸/g^il7-假型化颗粒或通过脾内或胸内注射局部施用。注射g⁸/g^il7-vlp以评估体内选择性激活人cd8⁺t细胞的可行性。在该实验设置中，在vlp注射后的不同时间点分析活化水平/持续时间和cd8⁺t细胞增殖。注射g⁸/g^il7-lv-gfp以评估体内基因递送的功能。在该实验设置中，在lv注射后的不同时间点分析gfp表达、转导细胞的表型及其增殖和持久性。注射g⁸/g^il7-lv-car以评估治疗性基因递送和体内产生cart细胞的可行性。在该实验设置中，在lv注射后的不同时间点分析car表达、转导细胞的表型、在存在/不存在靶肿瘤细胞/抗原的情况下转导细胞的增殖和持久性、局部/全身肿瘤的消除。

实施例9：选择性激活恒河猴cd4⁺t细胞

非人类灵长类动物(nhp)的细胞在表型上与人类t细胞相似，使其成为人类免疫和免疫疗法的最佳动物模型。就t细胞疗法而言，nhp模型在预测潜在药物的效果、剂量、应用途径和安全性方面可能更可靠。因此，非常需要一种在nhp中特异性修饰或诱导不同细胞类型的功能变化的工具。

这里，作为一个实例详细描述了用于恒河猴的4^h/il7^h-siv载体及其应用。首先，将恒河猴cd4特异性darpin57.2(cd4^d57.2)用作hmut蛋白上呈现的靶向结构域(h-cd4^d57.2)，将恒河猴反应性il7用作hmut上呈现的功能结构域(h-rmil7)。然后使用上述两种h蛋白(例如用实施例4中测定的比例)假型化猿免疫缺陷病毒mac251(sivmac251)衍生的lv。在通过p27elisa/nano-sight确定载体产量和滴度并转导cd4⁺猿细胞后，用递送gfp或car的4^h/il7^h-siv转导新鲜分离的猿猴cd3⁺t细胞。然后，如上所述测定cd4⁺与cd4^-t细胞中的激活因子和转基因表达。接下来，在nhp模型中评估体内应用的可能性。为此目的，将单剂量的载体缓慢注射到每只登记动物(例如恒河猴)的两个腋窝淋巴结中。注射后一周，收集血样并通过手术取出两个注射后淋巴结中的一个并解离成单细胞悬浮液。进行详细分析以分析体内转导的t细胞的表型、特异性激活、转基因表达水平和/或功能(当递送治疗性转基因时)。此外，第二淋巴结接受了第二剂量的相同载体，并监测登记动物六个月，以评估体内转导的t细胞的增殖、持久性和/或功能(当递送治疗性转基因时)。

实施例10：在免疫活性小鼠模型中选择性活化和扩增抗原特异性t细胞

在免疫活性小鼠黑素瘤肿瘤模型中可以很好地评估靶向细胞因子在疾病部位起作用同时避免全身毒性的可能性。以呈现il12的鼠cd8靶向的vlp(m8^g/mil12^g-vlp)为例。以往的研究表明，il12应用可以增强转移的肿瘤反应性t细胞耐受性和抗肿瘤效果，但它在全身上是非常有毒的。为了克服这个缺点，在我们的研究中，使用m8^g/mil12^g-vlp控制il12在肿瘤部位发生功能。用b16/ova黑色素瘤细胞移植野生型c57/bl6小鼠，肿瘤建立后，通过照射处理小鼠并用从c57/bl6ot-i转基因小鼠分离的t细胞转移。在ot-it细胞移植后，用m8^g/mil12^g-vlp或用鼠il12通过静脉内注射处理小鼠，或用pbs作为对照。分析肿瘤体积、ot-it细胞的体内持久性和功能以及小鼠存活率。

实施例11：人cd4+t细胞的体内靶向靶向激活。

为了评价mv-4^h/il7^h-lv激活人cd4⁺t细胞的体内性能，将cd3⁺脐带血t细胞植入nod/scidgc-/-(nsg)小鼠。每周测定血液中的人t细胞重建。当检测到20％的ht细胞(％hcd3⁺细胞/总hcd45⁺+mcd45⁺细胞)时，用1e6iumv-4^h/il7^h-lv或mv-4^h-lv静脉内注射小鼠。注射载体后两周，处死小鼠并分离脾细胞和外周血单核细胞。值得注意的是，与mv-4^h-lv(8％cd4+cd71+细胞)相比，在mv-4^h/il7^h-lv(25％cd4+cd71+细胞)的情况下，发现了由人cd4+t细胞的cd71晚期激活标记物揭示的更强的特异性il-7活化(图14)。此外，代表cd8+t细胞的cd4-t细胞显示两种靶向载体的cd71表达相同。后者强调il-7存活信号仅激活靶向的cd4+t细胞而不激活cd8+细胞。

总之，用mv-4^h/il7^h-lv实现了靶细胞的体外特异性活化后，在人血液系统小鼠模型中体内证实了mv-4^h/il7^h-lv对cd4+t细胞的特异性活化。

序列表

<110>里昂高等师范学院(enslyon)

国家科学研究中心(cnrs)

里昂第一大学(ucbl)

国家医疗保健研究所(inserm)

<120>用于选择性地调节细胞的不同亚型的活性的方法

<130>bet17l1339

<150>ep16305468.7

<151>2016-04-21

<160>16

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2217

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>截短且突变的（y481a、r533a、s548l、f549s）mvh蛋白

（hcδ18），其与对人cd4具有特异性的设计的锚蛋白重复蛋白

（darpin）-29.2融合

<220>

<221>cds

<222>(1)..(2217)

<400>1

atgggaagtaggatagtcattaacagagaacatcttatgattgataga48

metglyserargilevalileasnarggluhisleumetileasparg

151015

ccttatgttttgctggctgttctgtttgtcatgtttctgagcttgatc96

protyrvalleuleualavalleuphevalmetpheleuserleuile

202530

gggttgctagccattgcaggaattcgacttcatcgggcagccatctac144

glyleuleualailealaglyileargleuhisargalaalailetyr

354045

accgcagagatccataaaagcctcagcaccaatctagatgtaactaac192

thralagluilehislysserleuserthrasnleuaspvalthrasn

505560

tcaatcgagcatcaggtcaaggacgtgctgacaccactcttcaaaatc240

serilegluhisglnvallysaspvalleuthrproleuphelysile

65707580

atcggtgatgaagtgggcctgaggacacctcagagattcactgaccta288

ileglyaspgluvalglyleuargthrproglnargphethraspleu

859095

gtgaaattcatctctgacaagattaaattccttaatccggatagggag336

vallyspheileserasplysilelyspheleuasnproaspargglu

100105110

tacgacttcagagatctcacttggtgtatcaacccgccagagagaatc384

tyrasppheargaspleuthrtrpcysileasnproprogluargile

115120125

aaattggattatgatcaatactgtgcagatgtggctgctgaagagctc432

lysleuasptyraspglntyrcysalaaspvalalaalaglugluleu

130135140

atgaatgcattggtgaactcaactctactggagaccagaacaaccaat480

metasnalaleuvalasnserthrleuleugluthrargthrthrasn

145150155160

cagttcctagctgtctcaaagggaaactgctcagggcccactacaatc528

glnpheleualavalserlysglyasncysserglyprothrthrile

165170175

agaggtcaattctcaaacatgtcgctgtccctgttagacttgtattta576

argglyglnpheserasnmetserleuserleuleuaspleutyrleu

180185190

ggtcgaggttacaatgtgtcatctatagtcactatgacatcccaggga624

glyargglytyrasnvalserserilevalthrmetthrserglngly

195200205

atgtatgggggaacttacctagtggaaaagcctaatctgagcagcaaa672

mettyrglyglythrtyrleuvalglulysproasnleuserserlys

210215220

aggtcagagttgtcacaactgagcatgtaccgagtgtttgaagtaggt720

argsergluleuserglnleusermettyrargvalphegluvalgly

225230235240

gttatcagaaatccgggtttgggggctccggtgttccatatgacaaac768

valileargasnproglyleuglyalaprovalphehismetthrasn

245250255

tatcttgagcaaccagtcagtaatgatctcagcaactgtatggtggct816

tyrleugluglnprovalserasnaspleuserasncysmetvalala

260265270

ttgggggagctcaaactcgcagccctttgtcacggggaagattctatc864

leuglygluleulysleualaalaleucyshisglygluaspserile

275280285

acaattccctatcagggatcagggaaaggtgtcagcttccagctcgtc912

thrileprotyrglnglyserglylysglyvalserpheglnleuval

290295300

aagctaggtgtctggaaatccccaaccgacatgcaatcctgggtcccc960

lysleuglyvaltrplysserprothraspmetglnsertrpvalpro

305310315320

ttatcaacggatgatccagtgatagacaggctttacctctcatctcac1008

leuserthraspaspprovalileaspargleutyrleuserserhis

325330335

agaggtgttatcgctgacaaccaagcaaaatgggctgtcccgacaaca1056

argglyvalilealaaspasnglnalalystrpalavalprothrthr

340345350

cgaacagatgacaagttgcgaatggagacatgcttccaacaggcgtgt1104

argthraspasplysleuargmetgluthrcyspheglnglnalacys

355360365

aagggtaaaatccaagcactctgcgagaatcccgagtgggcaccattg1152

lysglylysileglnalaleucysgluasnproglutrpalaproleu

370375380

aaggataacaggattccttcatacggggtcttgtctgttgatctgagt1200

lysaspasnargileprosertyrglyvalleuservalaspleuser

385390395400

ctgacagttgagcttaaaatcaaaattgcttcgggattcgggccattg1248

leuthrvalgluleulysilelysilealaserglypheglyproleu

405410415

atcacacacggttcagggatggacctatacaaatccaaccacaacaat1296

ilethrhisglyserglymetaspleutyrlysserasnhisasnasn

420425430

gtgtattggctgactatcccgccaatgaagaacctagccttaggtgta1344

valtyrtrpleuthrileproprometlysasnleualaleuglyval

435440445

atcaacacattggagtggataccgagattcaaggttagtcccgcactc1392

ileasnthrleuglutrpileproargphelysvalserproalaleu

450455460

ttcactgtcccaattaaggaagcaggcggagactgccatgccccaaca1440

phethrvalproilelysglualaglyglyaspcyshisalaprothr

465470475480

tacctacctgcggaggtggatggtgatgtcaaactcagttccaatctg1488

tyrleuproalagluvalaspglyaspvallysleuserserasnleu

485490495

gtgattctacctggtcaagatctccaatatgttttggcaacctacgat1536

valileleuproglyglnaspleuglntyrvalleualathrtyrasp

500505510

acttccgcggttgaacatgctgtggtttattacgtttacagcccaagc1584

thrseralavalgluhisalavalvaltyrtyrvaltyrserproser

515520525

cgcctatcgtcttacttttatccttttaggttgcctataaagggggtc1632

argleusersertyrphetyrpropheargleuproilelysglyval

530535540

cccatcgaattacaagtggaatgcttcacatgggaccaaaaactctgg1680

proilegluleuglnvalglucysphethrtrpaspglnlysleutrp

545550555560

tgccgtcacttctgtgtgcttgcggactcagaatctggtggacatatc1728

cysarghisphecysvalleualaaspsergluserglyglyhisile

565570575

actcactctgggatggtgggcatgggagtcagctgcacagtcacccgg1776

thrhisserglymetvalglymetglyvalsercysthrvalthrarg

580585590

gaagatggaaccaatgcggcccagccggccgacctgggtaagaaactg1824

gluaspglythrasnalaalaglnproalaaspleuglylyslysleu

595600605

ctggaagctgctcgtgctggtcaggacgacgaagttcgtatcctgatg1872

leuglualaalaargalaglyglnaspaspgluvalargileleumet

610615620

gctaacggtgctgacgttaacgctactgacactcttggtcgtactccg1920

alaasnglyalaaspvalasnalathraspthrleuglyargthrpro

625630635640

ctacacctggctgctcagaatggtcacctggaaatcgttgaagttctg1968

leuhisleualaalaglnasnglyhisleugluilevalgluvalleu

645650655

ctgaagcacagtgctgacgttaacgctattgaagaggttggtatgact2016

leulyshisseralaaspvalasnalaileglugluvalglymetthr

660665670

ccgctgcacctggctgttgttgctggtcacctggaaatcgttgaagtt2064

proleuhisleualavalvalalaglyhisleugluilevalgluval

675680685

ctgctgaagaacggtgctgacgttaacgctcaggacaaattcggtaag2112

leuleulysasnglyalaaspvalasnalaglnasplyspheglylys

690695700

accgctttcgacatctccatcgactacggtaacgaggacctggctgaa2160

thralapheaspileserileasptyrglyasngluaspleualaglu

705710715720

atcctgcaaaagcttaatgcggccgcaagaggttctcatcaccatcac2208

ileleuglnlysleuasnalaalaalaargglyserhishishishis

725730735

catcactaa2217

hishis

<210>2

<211>738

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>2

metglyserargilevalileasnarggluhisleumetileasparg

151015

protyrvalleuleualavalleuphevalmetpheleuserleuile

202530

glyleuleualailealaglyileargleuhisargalaalailetyr

354045

thralagluilehislysserleuserthrasnleuaspvalthrasn

505560

serilegluhisglnvallysaspvalleuthrproleuphelysile

65707580

ileglyaspgluvalglyleuargthrproglnargphethraspleu

859095

vallyspheileserasplysilelyspheleuasnproaspargglu

100105110

tyrasppheargaspleuthrtrpcysileasnproprogluargile

115120125

lysleuasptyraspglntyrcysalaaspvalalaalaglugluleu

130135140

metasnalaleuvalasnserthrleuleugluthrargthrthrasn

145150155160

glnpheleualavalserlysglyasncysserglyprothrthrile

165170175

argglyglnpheserasnmetserleuserleuleuaspleutyrleu

180185190

glyargglytyrasnvalserserilevalthrmetthrserglngly

195200205

mettyrglyglythrtyrleuvalglulysproasnleuserserlys

210215220

argsergluleuserglnleusermettyrargvalphegluvalgly

225230235240

valileargasnproglyleuglyalaprovalphehismetthrasn

245250255

tyrleugluglnprovalserasnaspleuserasncysmetvalala

260265270

leuglygluleulysleualaalaleucyshisglygluaspserile

275280285

thrileprotyrglnglyserglylysglyvalserpheglnleuval

290295300

lysleuglyvaltrplysserprothraspmetglnsertrpvalpro

305310315320

leuserthraspaspprovalileaspargleutyrleuserserhis

325330335

argglyvalilealaaspasnglnalalystrpalavalprothrthr

340345350

argthraspasplysleuargmetgluthrcyspheglnglnalacys

355360365

lysglylysileglnalaleucysgluasnproglutrpalaproleu

370375380

lysaspasnargileprosertyrglyvalleuservalaspleuser

385390395400

leuthrvalgluleulysilelysilealaserglypheglyproleu

405410415

ilethrhisglyserglymetaspleutyrlysserasnhisasnasn

420425430

valtyrtrpleuthrileproprometlysasnleualaleuglyval

435440445

ileasnthrleuglutrpileproargphelysvalserproalaleu

450455460

phethrvalproilelysglualaglyglyaspcyshisalaprothr

465470475480

tyrleuproalagluvalaspglyaspvallysleuserserasnleu

485490495

valileleuproglyglnaspleuglntyrvalleualathrtyrasp

500505510

thrseralavalgluhisalavalvaltyrtyrvaltyrserproser

515520525

argleusersertyrphetyrpropheargleuproilelysglyval

530535540

proilegluleuglnvalglucysphethrtrpaspglnlysleutrp

545550555560

cysarghisphecysvalleualaaspsergluserglyglyhisile

565570575

thrhisserglymetvalglymetglyvalsercysthrvalthrarg

580585590

gluaspglythrasnalaalaglnproalaaspleuglylyslysleu

595600605

leuglualaalaargalaglyglnaspaspgluvalargileleumet

610615620

alaasnglyalaaspvalasnalathraspthrleuglyargthrpro

625630635640

leuhisleualaalaglnasnglyhisleugluilevalgluvalleu

645650655

leulyshisseralaaspvalasnalaileglugluvalglymetthr

660665670

proleuhisleualavalvalalaglyhisleugluilevalgluval

675680685

leuleulysasnglyalaaspvalasnalaglnasplyspheglylys

690695700

thralapheaspileserileasptyrglyasngluaspleualaglu

705710715720

ileleuglnlysleuasnalaalaalaargglyserhishishishis

725730735

hishis

<210>3

<211>2529

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>截短且突变的（e501a、w504、q530a、e533a）nivg蛋白

（gcδ34），其与针对人cd8的单链抗体（scfvc8-vh1）融合，

用另外的(g4s)3接头连接。

<220>

<221>cds

<222>(1)..(2529)

<400>3

atgaagaagatcaacgagggcctgctggacagcaagatcctgagcgcc48

metlyslysileasngluglyleuleuaspserlysileleuserala

151015

ttcaacaccgtgatcgccctgctgggcagcatcgtgatcattgtgatg96

pheasnthrvalilealaleuleuglyserilevalileilevalmet

202530

aacatcatgatcatccagaactacaccagaagcaccgacaaccaggcc144

asnilemetileileglnasntyrthrargserthraspasnglnala

354045

gtgatcaaggacgctctccaggggatccagcagcagatcaagggcctg192

valilelysaspalaleuglnglyileglnglnglnilelysglyleu

505560

gccgacaagatcggcaccgagatcggccccaaggtgtccctgatcgac240

alaasplysileglythrgluileglyprolysvalserleuileasp

65707580

accagcagcaccatcaccatccccgccaacatcggcctgctggggtcc288

thrserserthrilethrileproalaasnileglyleuleuglyser

859095

aagatcagccagagcaccgccagcatcaacgagaacgtgaacgagaag336

lysileserglnserthralaserileasngluasnvalasnglulys

100105110

tgcaagttcaccctgccccccctgaagatccacgagtgcaacatcagc384

cyslysphethrleuproproleulysilehisglucysasnileser

115120125

tgccccaaccccctgcccttccgggagtaccggccccagaccgagggc432

cysproasnproleupropheargglutyrargproglnthrglugly

130135140

gtgagcaacctggtcggcctgcccaacaacatctgcctgcagaaaacc480

valserasnleuvalglyleuproasnasnilecysleuglnlysthr

145150155160

agcaaccagatcctgaagcccaagctcatttcctacaccctgcccgtg528

serasnglnileleulysprolysleuilesertyrthrleuproval

165170175

gtgggccagagcggcacctgcatcaccgaccccctgctggccatggac576

valglyglnserglythrcysilethraspproleuleualametasp

180185190

gagggctacttcgcctacagccacctggaacggatcggcagctgcagc624

gluglytyrphealatyrserhisleugluargileglysercysser

195200205

aggggcgtgtccaagcagcggatcatcggcgtgggcgaggtgctggac672

argglyvalserlysglnargileileglyvalglygluvalleuasp

210215220

cggggcgacgaggtgcccagcctgttcatgaccaacgtgtggaccccc720

argglyaspgluvalproserleuphemetthrasnvaltrpthrpro

225230235240

cccaaccccaacaccgtgtaccactgcagcgccgtgtacaacaacgag768

proasnproasnthrvaltyrhiscysseralavaltyrasnasnglu

245250255

ttctactacgtgctgtgcgccgtgagcaccgtgggcgaccccatcctg816

phetyrtyrvalleucysalavalserthrvalglyaspproileleu

260265270

aacagcacctactggtccggcagcctgatgatgacccggctggccgtg864

asnserthrtyrtrpserglyserleumetmetthrargleualaval

275280285

aagcctaagagcaatggcggcggatacaaccagcaccagctggccctg912

lysprolysserasnglyglyglytyrasnglnhisglnleualaleu

290295300

cggagcatcgagaagggcagatacgacaaagtgatgccctacggcccc960

argserileglulysglyargtyrasplysvalmetprotyrglypro

305310315320

agcggcatcaagcagggcgacacactgtacttccccgccgtgggcttc1008

serglyilelysglnglyaspthrleutyrpheproalavalglyphe

325330335

ctggtccggaccgagttcaagtacaacgacagcaactgccccatcacc1056

leuvalargthrgluphelystyrasnaspserasncysproilethr

340345350

aagtgccagtacagcaagcccgagaactgcagactgagcatgggcatc1104

lyscysglntyrserlysprogluasncysargleusermetglyile

355360365

cggcccaacagccactacatcctgcggagcggcctgctgaagtacaac1152

argproasnserhistyrileleuargserglyleuleulystyrasn

370375380

ctgagcgacggcgagaaccccaaagtcgtctttattgagatcagcgac1200

leuseraspglygluasnprolysvalvalpheilegluileserasp

385390395400

cagcggctgtccatcggcagccccagcaagatctacgacagcctgggc1248

glnargleuserileglyserproserlysiletyraspserleugly

405410415

cagcccgtgttctaccaggccagcttcagctgggacaccatgatcaag1296

glnprovalphetyrglnalaserphesertrpaspthrmetilelys

420425430

ttcggcgacgtgctgaccgtgaaccccctggtggtgaactggcggaac1344

pheglyaspvalleuthrvalasnproleuvalvalasntrpargasn

435440445

aataccgtgatcagcagacccggccagagccagtgcccccggttcaac1392

asnthrvalileserargproglyglnserglncysproargpheasn

450455460

acctgccccgcgatctgcgcggagggcgtgtacaacgacgccttcctg1440

thrcysproalailecysalagluglyvaltyrasnaspalapheleu

465470475480

atcgaccggatcaactggatctctgccggcgtgttcctggactccaac1488

ileaspargileasntrpileseralaglyvalpheleuaspserasn

485490495

gcgaccgccgcgaatcccgtgttcaccgtgtttaaggacaacgagatc1536

alathralaalaasnprovalphethrvalphelysaspasngluile

500505510

ctgtaccgggcccagctggccagcgaggacaccaacgcccagaaaacc1584

leutyrargalaglnleualasergluaspthrasnalaglnlysthr

515520525

atcaccaactgctttctgctgaagaacaagatctggtgcatcagcctg1632

ilethrasncyspheleuleulysasnlysiletrpcysileserleu

530535540

gtggagatctacgataccggcgacaacgtgatcaggcccaagctgttc1680

valgluiletyraspthrglyaspasnvalileargprolysleuphe

545550555560

gccgtgaagatccccgagcagtgcaccggtggaggtggctctggtgga1728

alavallysileprogluglncysthrglyglyglyglyserglygly

565570575

ggaggctctggaggtggtggatcagcggcccagccggcccaggtgcag1776

glyglyserglyglyglyglyseralaalaglnproalaglnvalgln

580585590

ctggtgcagagcggagccgaggataagaaacctggcgctagcgtgaag1824

leuvalglnserglyalagluasplyslysproglyalaservallys

595600605

gtgtcctgcaaggccagcggcttcaacatcaaggacacctacatccac1872

valsercyslysalaserglypheasnilelysaspthrtyrilehis

610615620

tgggtgcgccaggctccaggacagggcctggaatggatgggccggatc1920

trpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetglyargile

625630635640

gaccccgccaacgacaacaccctgtacgccagcaagttccagggcaga1968

aspproalaasnaspasnthrleutyralaserlyspheglnglyarg

645650655

gtgaccatcaccgccgacaccagcagcaacaccgcctacatggaactg2016

valthrilethralaaspthrserserasnthralatyrmetgluleu

660665670

agcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgtggcagaggc2064

serserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysglyarggly

675680685

tacggctactacgtgttcgaccactggggccagggcaccaccgtgaca2112

tyrglytyrtyrvalpheasphistrpglyglnglythrthrvalthr

690695700

gtgtctagcggcggaggcggaagtggaggcggaggaagcggaggcggc2160

valserserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglygly

705710715720

ggatccgacatcgtgatgacccagagccctagcagcctgtctgccagc2208

glyseraspilevalmetthrglnserproserserleuseralaser

725730735

gtgggcgaccgcgtgaccattacctgccggaccagccggtccatcagc2256

valglyaspargvalthrilethrcysargthrserargserileser

740745750

cagtacctggcctggtatcaggaaaagcccggcaaggcccccaagctg2304

glntyrleualatrptyrglnglulysproglylysalaprolysleu

755760765

ctgatctacagcggcagcaccctgcagagcggcgtgccaagcagattc2352

leuiletyrserglyserthrleuglnserglyvalproserargphe

770775780

agcggcagcggctccggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctg2400

serglyserglyserglythraspphethrleuthrileserserleu

785790795800

cagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagcacaacgagaac2448

glnprogluaspphealathrtyrtyrcysglnglnhisasngluasn

805810815

cccctgaccttcgggcagggaacaaaggtggagatcaagagagcggcc2496

proleuthrpheglyglnglythrlysvalgluilelysargalaala

820825830

gcaagaggttctcatcaccatcaccatcactaa2529

alaargglyserhishishishishishis

835840

<210>4

<211>842

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>4

metlyslysileasngluglyleuleuaspserlysileleuserala

151015

pheasnthrvalilealaleuleuglyserilevalileilevalmet

202530

asnilemetileileglnasntyrthrargserthraspasnglnala

354045

valilelysaspalaleuglnglyileglnglnglnilelysglyleu

505560

alaasplysileglythrgluileglyprolysvalserleuileasp

65707580

thrserserthrilethrileproalaasnileglyleuleuglyser

859095

lysileserglnserthralaserileasngluasnvalasnglulys

100105110

cyslysphethrleuproproleulysilehisglucysasnileser

115120125

cysproasnproleupropheargglutyrargproglnthrglugly

130135140

valserasnleuvalglyleuproasnasnilecysleuglnlysthr

145150155160

serasnglnileleulysprolysleuilesertyrthrleuproval

165170175

valglyglnserglythrcysilethraspproleuleualametasp

180185190

gluglytyrphealatyrserhisleugluargileglysercysser

195200205

argglyvalserlysglnargileileglyvalglygluvalleuasp

210215220

argglyaspgluvalproserleuphemetthrasnvaltrpthrpro

225230235240

proasnproasnthrvaltyrhiscysseralavaltyrasnasnglu

245250255

phetyrtyrvalleucysalavalserthrvalglyaspproileleu

260265270

asnserthrtyrtrpserglyserleumetmetthrargleualaval

275280285

lysprolysserasnglyglyglytyrasnglnhisglnleualaleu

290295300

argserileglulysglyargtyrasplysvalmetprotyrglypro

305310315320

serglyilelysglnglyaspthrleutyrpheproalavalglyphe

325330335

leuvalargthrgluphelystyrasnaspserasncysproilethr

340345350

lyscysglntyrserlysprogluasncysargleusermetglyile

355360365

argproasnserhistyrileleuargserglyleuleulystyrasn

370375380

leuseraspglygluasnprolysvalvalpheilegluileserasp

385390395400

glnargleuserileglyserproserlysiletyraspserleugly

405410415

glnprovalphetyrglnalaserphesertrpaspthrmetilelys

420425430

pheglyaspvalleuthrvalasnproleuvalvalasntrpargasn

435440445

asnthrvalileserargproglyglnserglncysproargpheasn

450455460

thrcysproalailecysalagluglyvaltyrasnaspalapheleu

465470475480

ileaspargileasntrpileseralaglyvalpheleuaspserasn

485490495

alathralaalaasnprovalphethrvalphelysaspasngluile

500505510

leutyrargalaglnleualasergluaspthrasnalaglnlysthr

515520525

ilethrasncyspheleuleulysasnlysiletrpcysileserleu

530535540

valgluiletyraspthrglyaspasnvalileargprolysleuphe

545550555560

alavallysileprogluglncysthrglyglyglyglyserglygly

565570575

glyglyserglyglyglyglyseralaalaglnproalaglnvalgln

580585590

leuvalglnserglyalagluasplyslysproglyalaservallys

595600605

valsercyslysalaserglypheasnilelysaspthrtyrilehis

610615620

trpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmetglyargile

625630635640

aspproalaasnaspasnthrleutyralaserlyspheglnglyarg

645650655

valthrilethralaaspthrserserasnthralatyrmetgluleu

660665670

serserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysglyarggly

675680685

tyrglytyrtyrvalpheasphistrpglyglnglythrthrvalthr

690695700

valserserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglygly

705710715720

glyseraspilevalmetthrglnserproserserleuseralaser

725730735

valglyaspargvalthrilethrcysargthrserargserileser

740745750

glntyrleualatrptyrglnglulysproglylysalaprolysleu

755760765

leuiletyrserglyserthrleuglnserglyvalproserargphe

770775780

serglyserglyserglythraspphethrleuthrileserserleu

785790795800

glnprogluaspphealathrtyrtyrcysglnglnhisasngluasn

805810815

proleuthrpheglyglnglythrlysvalgluilelysargalaala

820825830

alaargglyserhishishishishishis

835840

<210>5

<211>2211

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>截短且突变的（e501a、w504、q530a、e533a）nivg蛋白

（gcδ34），其与il-7融合。

<220>

<221>cds

<222>(1)..(2211)

<400>5

atgaagaagatcaacgagggcctgctggacagcaagatcctgagcgcc48

metlyslysileasngluglyleuleuaspserlysileleuserala

151015

ttcaacaccgtgatcgccctgctgggcagcatcgtgatcattgtgatg96

pheasnthrvalilealaleuleuglyserilevalileilevalmet

202530

aacatcatgatcatccagaactacaccagaagcaccgacaaccaggcc144

asnilemetileileglnasntyrthrargserthraspasnglnala

354045

gtgatcaaggacgctctccaggggatccagcagcagatcaagggcctg192

valilelysaspalaleuglnglyileglnglnglnilelysglyleu

505560

gccgacaagatcggcaccgagatcggccccaaggtgtccctgatcgac240

alaasplysileglythrgluileglyprolysvalserleuileasp

65707580

accagcagcaccatcaccatccccgccaacatcggcctgctggggtcc288

thrserserthrilethrileproalaasnileglyleuleuglyser

859095

aagatcagccagagcaccgccagcatcaacgagaacgtgaacgagaag336

lysileserglnserthralaserileasngluasnvalasnglulys

100105110

tgcaagttcaccctgccccccctgaagatccacgagtgcaacatcagc384

cyslysphethrleuproproleulysilehisglucysasnileser

115120125

tgccccaaccccctgcccttccgggagtaccggccccagaccgagggc432

cysproasnproleupropheargglutyrargproglnthrglugly

130135140

gtgagcaacctggtcggcctgcccaacaacatctgcctgcagaaaacc480

valserasnleuvalglyleuproasnasnilecysleuglnlysthr

145150155160

agcaaccagatcctgaagcccaagctcatttcctacaccctgcccgtg528

serasnglnileleulysprolysleuilesertyrthrleuproval

165170175

gtgggccagagcggcacctgcatcaccgaccccctgctggccatggac576

valglyglnserglythrcysilethraspproleuleualametasp

180185190

gagggctacttcgcctacagccacctggaacggatcggcagctgcagc624

gluglytyrphealatyrserhisleugluargileglysercysser

195200205

aggggcgtgtccaagcagcggatcatcggcgtgggcgaggtgctggac672

argglyvalserlysglnargileileglyvalglygluvalleuasp

210215220

cggggcgacgaggtgcccagcctgttcatgaccaacgtgtggaccccc720

argglyaspgluvalproserleuphemetthrasnvaltrpthrpro

225230235240

cccaaccccaacaccgtgtaccactgcagcgccgtgtacaacaacgag768

proasnproasnthrvaltyrhiscysseralavaltyrasnasnglu

245250255

ttctactacgtgctgtgcgccgtgagcaccgtgggcgaccccatcctg816

phetyrtyrvalleucysalavalserthrvalglyaspproileleu

260265270

aacagcacctactggtccggcagcctgatgatgacccggctggccgtg864

asnserthrtyrtrpserglyserleumetmetthrargleualaval

275280285

aagcctaagagcaatggcggcggatacaaccagcaccagctggccctg912

lysprolysserasnglyglyglytyrasnglnhisglnleualaleu

290295300

cggagcatcgagaagggcagatacgacaaagtgatgccctacggcccc960

argserileglulysglyargtyrasplysvalmetprotyrglypro

305310315320

agcggcatcaagcagggcgacacactgtacttccccgccgtgggcttc1008

serglyilelysglnglyaspthrleutyrpheproalavalglyphe

325330335

ctggtccggaccgagttcaagtacaacgacagcaactgccccatcacc1056

leuvalargthrgluphelystyrasnaspserasncysproilethr

340345350

aagtgccagtacagcaagcccgagaactgcagactgagcatgggcatc1104

lyscysglntyrserlysprogluasncysargleusermetglyile

355360365

cggcccaacagccactacatcctgcggagcggcctgctgaagtacaac1152

argproasnserhistyrileleuargserglyleuleulystyrasn

370375380

ctgagcgacggcgagaaccccaaagtcgtctttattgagatcagcgac1200

leuseraspglygluasnprolysvalvalpheilegluileserasp

385390395400

cagcggctgtccatcggcagccccagcaagatctacgacagcctgggc1248

glnargleuserileglyserproserlysiletyraspserleugly

405410415

cagcccgtgttctaccaggccagcttcagctgggacaccatgatcaag1296

glnprovalphetyrglnalaserphesertrpaspthrmetilelys

420425430

ttcggcgacgtgctgaccgtgaaccccctggtggtgaactggcggaac1344

pheglyaspvalleuthrvalasnproleuvalvalasntrpargasn

435440445

aataccgtgatcagcagacccggccagagccagtgcccccggttcaac1392

asnthrvalileserargproglyglnserglncysproargpheasn

450455460

acctgccccgcgatctgcgcggagggcgtgtacaacgacgccttcctg1440

thrcysproalailecysalagluglyvaltyrasnaspalapheleu

465470475480

atcgaccggatcaactggatctctgccggcgtgttcctggactccaac1488

ileaspargileasntrpileseralaglyvalpheleuaspserasn

485490495

gcgaccgccgcgaatcccgtgttcaccgtgtttaaggacaacgagatc1536

alathralaalaasnprovalphethrvalphelysaspasngluile

500505510

ctgtaccgggcccagctggccagcgaggacaccaacgcccagaaaacc1584

leutyrargalaglnleualasergluaspthrasnalaglnlysthr

515520525

atcaccaactgctttctgctgaagaacaagatctggtgcatcagcctg1632

ilethrasncyspheleuleulysasnlysiletrpcysileserleu

530535540

gtggagatctacgataccggcgacaacgtgatcaggcccaagctgttc1680

valgluiletyraspthrglyaspasnvalileargprolysleuphe

545550555560

gccgtgaagatccccgagcagtgcaccggtatggccgattgtgatatt1728

alavallysileprogluglncysthrglymetalaaspcysaspile

565570575

gaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatc1776

gluglylysaspglylysglntyrgluservalleumetvalserile

580585590

gatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaat1824

aspglnleuleuaspsermetlysgluileglyserasncysleuasn

595600605

aatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaa1872

asnglupheasnphephelysarghisilecysaspalaasnlysglu

610615620

ggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaa1920

glymetpheleupheargalaalaarglysleuargglnpheleulys

625630635640

atgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaa1968

metasnserthrglyasppheaspleuhisleuleulysvalserglu

645650655

ggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaa2016

glythrthrileleuleuasncysthrglyglnvallysglyarglys

660665670

ccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaat2064

proalaalaleuglyglualaglnprothrlysserleuglugluasn

675680685

aaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaag2112

lysserleulysgluglnlyslysleuasnaspleucyspheleulys

690695700

agactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggc2160

argleuleuglngluilelysthrcystrpasnlysileleumetgly

705710715720

actaaagaacacgcggccgcaagaggttctcatcaccatcaccatcac2208

thrlysgluhisalaalaalaargglyserhishishishishishis

725730735

taa2211

<210>6

<211>736

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>6

metlyslysileasngluglyleuleuaspserlysileleuserala

151015

pheasnthrvalilealaleuleuglyserilevalileilevalmet

202530

asnilemetileileglnasntyrthrargserthraspasnglnala

354045

valilelysaspalaleuglnglyileglnglnglnilelysglyleu

505560

alaasplysileglythrgluileglyprolysvalserleuileasp

65707580

thrserserthrilethrileproalaasnileglyleuleuglyser

859095

lysileserglnserthralaserileasngluasnvalasnglulys

100105110

cyslysphethrleuproproleulysilehisglucysasnileser

115120125

cysproasnproleupropheargglutyrargproglnthrglugly

130135140

valserasnleuvalglyleuproasnasnilecysleuglnlysthr

145150155160

serasnglnileleulysprolysleuilesertyrthrleuproval

165170175

valglyglnserglythrcysilethraspproleuleualametasp

180185190

gluglytyrphealatyrserhisleugluargileglysercysser

195200205

argglyvalserlysglnargileileglyvalglygluvalleuasp

210215220

argglyaspgluvalproserleuphemetthrasnvaltrpthrpro

225230235240

proasnproasnthrvaltyrhiscysseralavaltyrasnasnglu

245250255

phetyrtyrvalleucysalavalserthrvalglyaspproileleu

260265270

asnserthrtyrtrpserglyserleumetmetthrargleualaval

275280285

lysprolysserasnglyglyglytyrasnglnhisglnleualaleu

290295300

argserileglulysglyargtyrasplysvalmetprotyrglypro

305310315320

serglyilelysglnglyaspthrleutyrpheproalavalglyphe

325330335

leuvalargthrgluphelystyrasnaspserasncysproilethr

340345350

lyscysglntyrserlysprogluasncysargleusermetglyile

355360365

argproasnserhistyrileleuargserglyleuleulystyrasn

370375380

leuseraspglygluasnprolysvalvalpheilegluileserasp

385390395400

glnargleuserileglyserproserlysiletyraspserleugly

405410415

glnprovalphetyrglnalaserphesertrpaspthrmetilelys

420425430

pheglyaspvalleuthrvalasnproleuvalvalasntrpargasn

435440445

asnthrvalileserargproglyglnserglncysproargpheasn

450455460

thrcysproalailecysalagluglyvaltyrasnaspalapheleu

465470475480

ileaspargileasntrpileseralaglyvalpheleuaspserasn

485490495

alathralaalaasnprovalphethrvalphelysaspasngluile

500505510

leutyrargalaglnleualasergluaspthrasnalaglnlysthr

515520525

ilethrasncyspheleuleulysasnlysiletrpcysileserleu

530535540

valgluiletyraspthrglyaspasnvalileargprolysleuphe

545550555560

alavallysileprogluglncysthrglymetalaaspcysaspile

565570575

gluglylysaspglylysglntyrgluservalleumetvalserile

580585590

aspglnleuleuaspsermetlysgluileglyserasncysleuasn

595600605

asnglupheasnphephelysarghisilecysaspalaasnlysglu

610615620

glymetpheleupheargalaalaarglysleuargglnpheleulys

625630635640

metasnserthrglyasppheaspleuhisleuleulysvalserglu

645650655

glythrthrileleuleuasncysthrglyglnvallysglyarglys

660665670

proalaalaleuglyglualaglnprothrlysserleuglugluasn

675680685

lysserleulysgluglnlyslysleuasnaspleucyspheleulys

690695700

argleuleuglngluilelysthrcystrpasnlysileleumetgly

705710715720

thrlysgluhisalaalaalaargglyserhishishishishishis

725730735

<210>7

<211>2229

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>截短且突变的（e501a、w504、q530a、e533a）nivg蛋白

（gcδ34），其与针对人epcam的设计的锚蛋白重复蛋（darpin）

融合。

<220>

<221>cds

<222>(1)..(2229)

<400>7

atgaagaagatcaacgagggcctgctggacagcaagatcctgagcgcc48

metlyslysileasngluglyleuleuaspserlysileleuserala

151015

ttcaacaccgtgatcgccctgctgggcagcatcgtgatcattgtgatg96

pheasnthrvalilealaleuleuglyserilevalileilevalmet

202530

aacatcatgatcatccagaactacaccagaagcaccgacaaccaggcc144

asnilemetileileglnasntyrthrargserthraspasnglnala

354045

gtgatcaaggacgctctccaggggatccagcagcagatcaagggcctg192

valilelysaspalaleuglnglyileglnglnglnilelysglyleu

505560

gccgacaagatcggcaccgagatcggccccaaggtgtccctgatcgac240

alaasplysileglythrgluileglyprolysvalserleuileasp

65707580

accagcagcaccatcaccatccccgccaacatcggcctgctggggtcc288

thrserserthrilethrileproalaasnileglyleuleuglyser

859095

aagatcagccagagcaccgccagcatcaacgagaacgtgaacgagaag336

lysileserglnserthralaserileasngluasnvalasnglulys

100105110

tgcaagttcaccctgccccccctgaagatccacgagtgcaacatcagc384

cyslysphethrleuproproleulysilehisglucysasnileser

115120125

tgccccaaccccctgcccttccgggagtaccggccccagaccgagggc432

cysproasnproleupropheargglutyrargproglnthrglugly

130135140

gtgagcaacctggtcggcctgcccaacaacatctgcctgcagaaaacc480

valserasnleuvalglyleuproasnasnilecysleuglnlysthr

145150155160

agcaaccagatcctgaagcccaagctcatttcctacaccctgcccgtg528

serasnglnileleulysprolysleuilesertyrthrleuproval

165170175

gtgggccagagcggcacctgcatcaccgaccccctgctggccatggac576

valglyglnserglythrcysilethraspproleuleualametasp

180185190

gagggctacttcgcctacagccacctggaacggatcggcagctgcagc624

gluglytyrphealatyrserhisleugluargileglysercysser

195200205

aggggcgtgtccaagcagcggatcatcggcgtgggcgaggtgctggac672

argglyvalserlysglnargileileglyvalglygluvalleuasp

210215220

cggggcgacgaggtgcccagcctgttcatgaccaacgtgtggaccccc720

argglyaspgluvalproserleuphemetthrasnvaltrpthrpro

225230235240

cccaaccccaacaccgtgtaccactgcagcgccgtgtacaacaacgag768

proasnproasnthrvaltyrhiscysseralavaltyrasnasnglu

245250255

ttctactacgtgctgtgcgccgtgagcaccgtgggcgaccccatcctg816

phetyrtyrvalleucysalavalserthrvalglyaspproileleu

260265270

aacagcacctactggtccggcagcctgatgatgacccggctggccgtg864

asnserthrtyrtrpserglyserleumetmetthrargleualaval

275280285

aagcctaagagcaatggcggcggatacaaccagcaccagctggccctg912

lysprolysserasnglyglyglytyrasnglnhisglnleualaleu

290295300

cggagcatcgagaagggcagatacgacaaagtgatgccctacggcccc960

argserileglulysglyargtyrasplysvalmetprotyrglypro

305310315320

agcggcatcaagcagggcgacacactgtacttccccgccgtgggcttc1008

serglyilelysglnglyaspthrleutyrpheproalavalglyphe

325330335

ctggtccggaccgagttcaagtacaacgacagcaactgccccatcacc1056

leuvalargthrgluphelystyrasnaspserasncysproilethr

340345350

aagtgccagtacagcaagcccgagaactgcagactgagcatgggcatc1104

lyscysglntyrserlysprogluasncysargleusermetglyile

355360365

cggcccaacagccactacatcctgcggagcggcctgctgaagtacaac1152

argproasnserhistyrileleuargserglyleuleulystyrasn

370375380

ctgagcgacggcgagaaccccaaagtcgtctttattgagatcagcgac1200

leuseraspglygluasnprolysvalvalpheilegluileserasp

385390395400

cagcggctgtccatcggcagccccagcaagatctacgacagcctgggc1248

glnargleuserileglyserproserlysiletyraspserleugly

405410415

cagcccgtgttctaccaggccagcttcagctgggacaccatgatcaag1296

glnprovalphetyrglnalaserphesertrpaspthrmetilelys

420425430

ttcggcgacgtgctgaccgtgaaccccctggtggtgaactggcggaac1344

pheglyaspvalleuthrvalasnproleuvalvalasntrpargasn

435440445

aataccgtgatcagcagacccggccagagccagtgcccccggttcaac1392

asnthrvalileserargproglyglnserglncysproargpheasn

450455460

acctgccccgcgatctgcgcggagggcgtgtacaacgacgccttcctg1440

thrcysproalailecysalagluglyvaltyrasnaspalapheleu

465470475480

atcgaccggatcaactggatctctgccggcgtgttcctggactccaac1488

ileaspargileasntrpileseralaglyvalpheleuaspserasn

485490495

gcgaccgccgcgaatcccgtgttcaccgtgtttaaggacaacgagatc1536

alathralaalaasnprovalphethrvalphelysaspasngluile

500505510

ctgtaccgggcccagctggccagcgaggacaccaacgcccagaaaacc1584

leutyrargalaglnleualasergluaspthrasnalaglnlysthr

515520525

atcaccaactgctttctgctgaagaacaagatctggtgcatcagcctg1632

ilethrasncyspheleuleulysasnlysiletrpcysileserleu

530535540

gtggagatctacgataccggcgacaacgtgatcaggcccaagctgttc1680

valgluiletyraspthrglyaspasnvalileargprolysleuphe

545550555560

gccgtgaagatccccgagcagtgcaccggtgacctgggtaagaaactg1728

alavallysileprogluglncysthrglyaspleuglylyslysleu

565570575

ctggaagctgctcgtgctggtcaggacgacgaagttcgtatcctgatg1776

leuglualaalaargalaglyglnaspaspgluvalargileleumet

580585590

gctaacggtgctgacgttaacgctaaggacgagtatggttctactccg1824

alaasnglyalaaspvalasnalalysaspglutyrglyserthrpro

595600605

ctgcacctagctgctactcttggtcacctggaaatcgttgaagttctg1872

leuhisleualaalathrleuglyhisleugluilevalgluvalleu

610615620

ctgaagcacggtgctgacgttaacgctgatgacgctactggtcttact1920

leulyshisglyalaaspvalasnalaaspaspalathrglyleuthr

625630635640

ccgctgcacctggctgcttggaatggtcacctggagatcgttgaagtt1968

proleuhisleualaalatrpasnglyhisleugluilevalgluval

645650655

ctgctgaagtacggtgctgacgttaacgctatggactttgagggttgg2016

leuleulystyrglyalaaspvalasnalametaspphegluglytrp

660665670

actccgctgcacctggctgctcattttggtcacctggaaatcgttgaa2064

thrproleuhisleualaalahispheglyhisleugluilevalglu

675680685

gttctgctgaagtacggtgctgacgttaacgctcaggacaaattcggt2112

valleuleulystyrglyalaaspvalasnalaglnasplysphegly

690695700

aagaccccgttcgacctagcgatcgacaacggtaacgaggacattgct2160

lysthrpropheaspleualaileaspasnglyasngluaspileala

705710715720

gaagtgctgcaaaaagcggcgaagcttaatgcggccgcaagaggttct2208

gluvalleuglnlysalaalalysleuasnalaalaalaargglyser

725730735

catcaccatcaccatcactaa2229

hishishishishishis

740

<210>8

<211>742

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>8

metlyslysileasngluglyleuleuaspserlysileleuserala

151015

pheasnthrvalilealaleuleuglyserilevalileilevalmet

202530

asnilemetileileglnasntyrthrargserthraspasnglnala

354045

valilelysaspalaleuglnglyileglnglnglnilelysglyleu

505560

alaasplysileglythrgluileglyprolysvalserleuileasp

65707580

thrserserthrilethrileproalaasnileglyleuleuglyser

859095

lysileserglnserthralaserileasngluasnvalasnglulys

100105110

cyslysphethrleuproproleulysilehisglucysasnileser

115120125

cysproasnproleupropheargglutyrargproglnthrglugly

130135140

valserasnleuvalglyleuproasnasnilecysleuglnlysthr

145150155160

serasnglnileleulysprolysleuilesertyrthrleuproval

165170175

valglyglnserglythrcysilethraspproleuleualametasp

180185190

gluglytyrphealatyrserhisleugluargileglysercysser

195200205

argglyvalserlysglnargileileglyvalglygluvalleuasp

210215220

argglyaspgluvalproserleuphemetthrasnvaltrpthrpro

225230235240

proasnproasnthrvaltyrhiscysseralavaltyrasnasnglu

245250255

phetyrtyrvalleucysalavalserthrvalglyaspproileleu

260265270

asnserthrtyrtrpserglyserleumetmetthrargleualaval

275280285

lysprolysserasnglyglyglytyrasnglnhisglnleualaleu

290295300

argserileglulysglyargtyrasplysvalmetprotyrglypro

305310315320

serglyilelysglnglyaspthrleutyrpheproalavalglyphe

325330335

leuvalargthrgluphelystyrasnaspserasncysproilethr

340345350

lyscysglntyrserlysprogluasncysargleusermetglyile

355360365

argproasnserhistyrileleuargserglyleuleulystyrasn

370375380

leuseraspglygluasnprolysvalvalpheilegluileserasp

385390395400

glnargleuserileglyserproserlysiletyraspserleugly

405410415

glnprovalphetyrglnalaserphesertrpaspthrmetilelys

420425430

pheglyaspvalleuthrvalasnproleuvalvalasntrpargasn

435440445

asnthrvalileserargproglyglnserglncysproargpheasn

450455460

thrcysproalailecysalagluglyvaltyrasnaspalapheleu

465470475480

ileaspargileasntrpileseralaglyvalpheleuaspserasn

485490495

alathralaalaasnprovalphethrvalphelysaspasngluile

500505510

leutyrargalaglnleualasergluaspthrasnalaglnlysthr

515520525

ilethrasncyspheleuleulysasnlysiletrpcysileserleu

530535540

valgluiletyraspthrglyaspasnvalileargprolysleuphe

545550555560

alavallysileprogluglncysthrglyaspleuglylyslysleu

565570575

leuglualaalaargalaglyglnaspaspgluvalargileleumet

580585590

alaasnglyalaaspvalasnalalysaspglutyrglyserthrpro

595600605

leuhisleualaalathrleuglyhisleugluilevalgluvalleu

610615620

leulyshisglyalaaspvalasnalaaspaspalathrglyleuthr

625630635640

proleuhisleualaalatrpasnglyhisleugluilevalgluval

645650655

leuleulystyrglyalaaspvalasnalametaspphegluglytrp

660665670

thrproleuhisleualaalahispheglyhisleugluilevalglu

675680685

valleuleulystyrglyalaaspvalasnalaglnasplysphegly

690695700

lysthrpropheaspleualaileaspasnglyasngluaspileala

705710715720

gluvalleuglnlysalaalalysleuasnalaalaalaargglyser

725730735

hishishishishishis

740

<210>9

<211>602

<212>prt

<213>尼帕病毒

<400>9

metproalagluasnlyslysvalargphegluasnthrthrserasp

151015

lysglylysileproserlysvalilelyssertyrtyrglythrmet

202530

aspilelyslysileasngluglyleuleuaspserlysileleuser

354045

alapheasnthrvalilealaleuleuglyserilevalileileval

505560

metasnilemetileileglnasntyrthrargserthraspasngln

65707580

alavalilelysaspalaleuglnglyileglnglnglnilelysgly

859095

leualaasplysileglythrgluileglyprolysvalserleuile

100105110

aspthrserserthrilethrileproalaasnileglyleuleugly

115120125

serlysileserglnserthralaserileasngluasnvalasnglu

130135140

lyscyslysphethrleuproproleulysilehisglucysasnile

145150155160

sercysproasnproleupropheargglutyrargproglnthrglu

165170175

glyvalserasnleuvalglyleuproasnasnilecysleuglnlys

180185190

thrserasnglnileleulysprolysleuilesertyrthrleupro

195200205

valvalglyglnserglythrcysilethraspproleuleualamet

210215220

aspgluglytyrphealatyrserhisleugluargileglysercys

225230235240

serargglyvalserlysglnargileileglyvalglygluvalleu

245250255

aspargglyaspgluvalproserleuphemetthrasnvaltrpthr

260265270

proproasnproasnthrvaltyrhiscysseralavaltyrasnasn

275280285

gluphetyrtyrvalleucysalavalserthrvalglyaspproile

290295300

leuasnserthrtyrtrpserglyserleumetmetthrargleuala

305310315320

vallysprolysserasnglyglyglytyrasnglnhisglnleuala

325330335

leuargserileglulysglyargtyrasplysvalmetprotyrgly

340345350

proserglyilelysglnglyaspthrleutyrpheproalavalgly

355360365

pheleuvalargthrgluphelystyrasnaspserasncysproile

370375380

thrlyscysglntyrserlysprogluasncysargleusermetgly

385390395400

ileargproasnserhistyrileleuargserglyleuleulystyr

405410415

asnleuseraspglygluasnprolysvalvalpheilegluileser

420425430

aspglnargleuserileglyserproserlysiletyraspserleu

435440445

glyglnprovalphetyrglnalaserphesertrpaspthrmetile

450455460

lyspheglyaspvalleuthrvalasnproleuvalvalasntrparg

465470475480

asnasnthrvalileserargproglyglnserglncysproargphe

485490495

asnthrcysprogluilecystrpgluglyvaltyrasnaspalaphe

500505510

leuileaspargileasntrpileseralaglyvalpheleuaspser

515520525

asnglnthralagluasnprovalphethrvalphelysaspasnglu

530535540

ileleutyrargalaglnleualasergluaspthrasnalaglnlys

545550555560

thrilethrasncyspheleuleulysasnlysiletrpcysileser

565570575

leuvalgluiletyraspthrglyaspasnvalileargprolysleu

580585590

phealavallysileprogluglncysthr

595600

<210>10

<211>617

<212>prt

<213>麻疹病毒

<400>10

metserproglnargaspargileasnalaphetyrlysaspasnpro

151015

hisprolysglyserargilevalileasnarggluhisleumetile

202530

aspargprotyrvalleuleualavalleuphevalmetpheleuser

354045

leuileglyleuleualailealaglyileargleuhisargalaala

505560

iletyrthralagluilehislysserleuserthrasnleuaspval

65707580

thrasnserilegluhisglnvallysaspvalleuthrproleuphe

859095

lysileileglyaspgluvalglyleuargthrproglnargphethr

100105110

aspleuvallyspheileserasplysilelyspheleuasnproasp

115120125

argglutyrasppheargaspleuthrtrpcysileasnproproglu

130135140

argilelysleuasptyraspglntyrcysalaaspvalalaalaglu

145150155160

gluleumetasnalaleuvalasnserthrleuleugluthrargthr

165170175

thrasnglnpheleualavalserlysglyasncysserglyprothr

180185190

thrileargglyglnpheserasnmetserleuserleuleuaspleu

195200205

tyrleuglyargglytyrasnvalserserilevalthrmetthrser

210215220

glnglymettyrglyglythrtyrleuvalglulysproasnleuser

225230235240

serlysargsergluleuserglnleusermettyrargvalpheglu

245250255

valglyvalileargasnproglyleuglyalaprovalphehismet

260265270

thrasntyrleugluglnprovalserasnaspleuserasncysmet

275280285

valalaleuglygluleulysleualaalaleucyshisglygluasp

290295300

serilethrileprotyrglnglyserglylysglyvalserphegln

305310315320

leuvallysleuglyvaltrplysserprothraspmetglnsertrp

325330335

valproleuserthraspaspprovalileaspargleutyrleuser

340345350

serhisargglyvalilealaaspasnglnalalystrpalavalpro

355360365

thrthrargthraspasplysleuargmetgluthrcyspheglngln

370375380

alacyslysglylysileglnalaleucysgluasnproglutrpala

385390395400

proleulysaspasnargileprosertyrglyvalleuservalasp

405410415

leuserleuthrvalgluleulysilelysilealaserglyphegly

420425430

proleuilethrhisglyserglymetaspleutyrlysserasnhis

435440445

asnasnvaltyrtrpleuthrileproprometlysasnleualaleu

450455460

glyvalileasnthrleuglutrpileproargphelysvalserpro

465470475480

tyrleuphethrvalproilelysglualaglyglyaspcyshisala

485490495

prothrtyrleuproalagluvalaspglyaspvallysleuserser

500505510

asnleuvalileleuproglyglnaspleuglntyrvalleualathr

515520525

tyraspthrserargvalgluhisalavalvaltyrtyrvaltyrser

530535540

proserargserphesertyrphetyrpropheargleuproilelys

545550555560

glyvalproilegluleuglnvalglucysphethrtrpaspglnlys

565570575

leutrpcysarghisphecysvalleualaaspsergluserglygly

580585590

hisilethrhisserglymetvalglymetglyvalsercysthrval

595600605

thrarggluaspglythrasnargarg

610615

<210>11

<211>546

<212>prt

<213>尼帕病毒

<400>11

metvalvalileleuasplysargcystyrcysasnleuleuileleu

151015

ileleumetileserglucysservalglyileleuhistyrglulys

202530

leuserlysileglyleuvallysglyvalthrarglystyrlysile

354045

lysserasnproleuthrlysaspilevalilelysmetileproasn

505560

valserasnmetserglncysthrglyservalmetgluasntyrlys

65707580

thrargleuasnglyileleuthrproilelysglyalaleugluile

859095

tyrlysasnasnthrhisaspleuvalglyaspvalargleualagly

100105110

valilemetalaglyvalalaileglyilealathralaalaglnile

115120125

thralaglyvalalaleutyrglualametlysasnalaaspasnile

130135140

asnlysleulysserserilegluserthrasnglualavalvallys

145150155160

leuglngluthralaglulysthrvaltyrvalleuthralaleugln

165170175

asptyrileasnthrasnleuvalprothrileasplysilesercys

180185190

lysglnthrgluleuserleuaspleualaleuserlystyrleuser

195200205

aspleuleuphevalpheglyproasnleuglnaspprovalserasn

210215220

sermetthrileglnalaileserglnalapheglyglyasntyrglu

225230235240

thrleuleuargthrleuglytyralathrgluasppheaspaspleu

245250255

leugluseraspserilethrglyglnileiletyrvalaspleuser

260265270

sertyrtyrileilevalargvaltyrpheproileleuthrgluile

275280285

glnglnalatyrileglngluleuleuprovalserpheasnasnasp

290295300

asnserglutrpileserilevalproasnpheileleuvalargasn

305310315320

thrleuileserasnilegluileglyphecysleuilethrlysarg

325330335

servalilecysasnglnasptyralathrprometthrasnasnmet

340345350

argglucysleuthrglyserthrglulyscysproarggluleuval

355360365

valserserhisvalproargphealaleuserasnglyvalleuphe

370375380

alaasncysileservalthrcysglncysglnthrthrglyargala

385390395400

ileserglnserglygluglnthrleuleumetileaspasnthrthr

405410415

cysprothralavalleuglyasnvalileileserleuglylystyr

420425430

leuglyservalasntyrasnsergluglyilealaileglypropro

435440445

valphethrasplysvalaspileserserglnilesersermetasn

450455460

glnserleuglnglnserlysasptyrilelysglualaglnargleu

465470475480

leuaspthrvalasnproserleuilesermetleusermetileile

485490495

leutyrvalleuserilealaserleucysileglyleuilethrphe

500505510

ileserpheileilevalglulyslysargasnthrtyrserargleu

515520525

gluaspargargvalargprothrserserglyaspleutyrtyrile

530535540

glythr

545

<210>12

<211>553

<212>prt

<213>麻疹病毒

<400>12

metserilemetglyleulysvalasnvalseralailephemetala

151015

valleuleuthrleuglnthrprothrglyglnilehistrpglyasn

202530

leuserlysileglyvalvalglyileglyseralasertyrlysval

354045

metthrargserserhisglnserleuvalilelysleumetproasn

505560

ilethrleuleuasnasncysthrargvalgluilealaglutyrarg

65707580

argleuleuargthrvalleugluproileargaspalaleuasnala

859095

metthrglnasnileargprovalglnservalalaserserargarg

100105110

hislysargphealaglyvalvalleualaglyalaalaleuglyval

115120125

alathralaalaglnilethralaglyilealaleuhisglnsermet

130135140

leuasnserglnalaileaspasnleuargalaserleugluthrthr

145150155160

asnglnalaileglualaileargglnalaglyglnglumetileleu

165170175

alavalglnglyvalglnasptyrileasnasngluleuileproser

180185190

metasnglnleusercysaspleuileglyglnlysleuglyleulys

195200205

leuleuargtyrtyrthrgluileleuserleupheglyproserleu

210215220

argaspproileseralagluileserileglnalaleusertyrala

225230235240

leuglyglyaspileasnlysvalleuglulysleuglytyrsergly

245250255

glyaspleuleuglyileleugluserargglyilelysalaargile

260265270

thrhisvalaspthrglusertyrpheilevalleuserilealatyr

275280285

prothrleusergluilelysglyvalilevalhisargleuglugly

290295300

valsertyrasnileglyserglnglutrptyrthrthrvalprolys

305310315320

tyrvalalathrglnglytyrleuileserasnpheaspgluserser

325330335

cysthrphemetprogluglythrvalcysserglnasnalaleutyr

340345350

prometserproleuleuglnglucysleuargglyserthrlysser

355360365

cysalaargthrleuvalserglyserpheglyasnargpheileleu

370375380

serglnglyasnleuilealaasncysalaserileleucyslyscys

385390395400

tyrthrthrglythrileileasnglnaspproasplysileleuthr

405410415

tyrilealaalaasphiscysprovalvalgluvalasnglyvalthr

420425430

ileglnvalglyserargargtyrproaspalavaltyrleuhisarg

435440445

ileaspleuglyproproileserleugluargleuaspvalglythr

450455460

asnleuglyasnalailealalysleugluaspalalysgluleuleu

465470475480

gluserseraspglnileleuargsermetlysglyleuserserthr

485490495

serilevaltyrileleuilealavalcysleuglyglyleuilegly

500505510

ileproalaleuilecyscyscysargglyargcysasnlyslysgly

515520525

gluglnvalglymetserargproglyleulysproaspleuthrgly

530535540

thrserlyssertyrvalargserleu

545550

<210>13

<211>2328

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>截短且突变的（y481a、r533a、s548l、f549s）mevh蛋白

（hcδ15），其与il-7融合。

<220>

<221>cds

<222>(1)..(2328)

<400>13

atgcatcccaagggaagtaggatagtcattaacagagaacatcttatg48

methisprolysglyserargilevalileasnarggluhisleumet

151015

attgatagaccttatgttttgctggctgttctgtttgtcatgtttctg96

ileaspargprotyrvalleuleualavalleuphevalmetpheleu

202530

agcttgatcgggttgctagccattgcaggcattagacttcatcgggca144

serleuileglyleuleualailealaglyileargleuhisargala

354045

gccatctacaccgcagagatccataaaagcctcagcaccaatctagat192

alailetyrthralagluilehislysserleuserthrasnleuasp

505560

gtaactaactcaatcgagcatcaggtcaaggacgtgctgacaccactc240

valthrasnserilegluhisglnvallysaspvalleuthrproleu

65707580

ttcaaaatcatcggtgatgaagtgggcctgaggacacctcagagattc288

phelysileileglyaspgluvalglyleuargthrproglnargphe

859095

actgacctagtgaaattcatctctgacaagattaaattccttaatccg336

thraspleuvallyspheileserasplysilelyspheleuasnpro

100105110

gatagggagtacgacttcagagatctcacttggtgtatcaacccgcca384

aspargglutyrasppheargaspleuthrtrpcysileasnpropro

115120125

gagagaatcaaattggattatgatcaatactgtgcagatgtggctgct432

gluargilelysleuasptyraspglntyrcysalaaspvalalaala

130135140

gaagagctcatgaatgcattggtgaactcaactctactggagaccaga480

glugluleumetasnalaleuvalasnserthrleuleugluthrarg

145150155160

acaaccaatcagttcctagctgtctcaaagggaaactgctcagggccc528

thrthrasnglnpheleualavalserlysglyasncysserglypro

165170175

actacaatcagaggtcaattctcaaacatgtcgctgtccctgttagac576

thrthrileargglyglnpheserasnmetserleuserleuleuasp

180185190

ttgtatttaggtcgaggttacaatgtgtcatctatagtcactatgaca624

leutyrleuglyargglytyrasnvalserserilevalthrmetthr

195200205

tcccagggaatgtatgggggaacttacctagtggaaaagcctaatctg672

serglnglymettyrglyglythrtyrleuvalglulysproasnleu

210215220

agcagcaaaaggtcagagttgtcacaactgagcatgtaccgagtgttt720

serserlysargsergluleuserglnleusermettyrargvalphe

225230235240

gaagtaggtgttatcagaaatccgggtttgggggctccggtgttccat768

gluvalglyvalileargasnproglyleuglyalaprovalphehis

245250255

atgacaaactatcttgagcaaccagtcagtaatgatctcagcaactgt816

metthrasntyrleugluglnprovalserasnaspleuserasncys

260265270

atggtggctttgggggagctcaaactcgcagccctttgtcacggggaa864

metvalalaleuglygluleulysleualaalaleucyshisglyglu

275280285

gattctatcacaattccctatcagggatcagggaaaggtgtcagcttc912

aspserilethrileprotyrglnglyserglylysglyvalserphe

290295300

cagctcgtcaagctaggtgtctggaaatccccaaccgacatgcaatcc960

glnleuvallysleuglyvaltrplysserprothraspmetglnser

305310315320

tgggtccccttatcaacggatgatccagtgatagacaggctttacctc1008

trpvalproleuserthraspaspprovalileaspargleutyrleu

325330335

tcatctcacagaggtgttatcgctgacaatcaagcaaaatgggctgtc1056

serserhisargglyvalilealaaspasnglnalalystrpalaval

340345350

ccgacaacacgaacagatgacaagttgcgaatggagacatgcttccaa1104

prothrthrargthraspasplysleuargmetgluthrcysphegln

355360365

caggcgtgtaagggtaaaatccaagcactctgcgagaatcccgagtgg1152

glnalacyslysglylysileglnalaleucysgluasnproglutrp

370375380

gcaccattgaaggataacaggattccttcatacggggtcttgtctgtt1200

alaproleulysaspasnargileprosertyrglyvalleuserval

385390395400

gatctgagtctgacagttgagcttaaaatcaaaattgcttcgggattc1248

aspleuserleuthrvalgluleulysilelysilealaserglyphe

405410415

gggccattgatcacacacggttcagggatggacctatacaaatccaac1296

glyproleuilethrhisglyserglymetaspleutyrlysserasn

420425430

cacaacaatgtgtattggctgactatcccgccaatgaagaacctagcc1344

hisasnasnvaltyrtrpleuthrileproprometlysasnleuala

435440445

ttaggtgtaatcaacacattggagtggataccgagattcaaggttagt1392

leuglyvalileasnthrleuglutrpileproargphelysvalser

450455460

cccgcgctcttcaatgtcccaattaaggaagcaggcgaagactgccat1440

proalaleupheasnvalproilelysglualaglygluaspcyshis

465470475480

gccccaacatacctacctgcggaggtggatggtgatgtcaaactcagt1488

alaprothrtyrleuproalagluvalaspglyaspvallysleuser

485490495

tccaatctggtgattctacctggtcaagatctccaatatgttttggca1536

serasnleuvalileleuproglyglnaspleuglntyrvalleuala

500505510

acctacgatacttccgcggttgaacatgctgtggtttattacgtttac1584

thrtyraspthrseralavalgluhisalavalvaltyrtyrvaltyr

515520525

agcccaagccgctcattttcttacttttatccttttaggttgcctata1632

serproserargserphesertyrphetyrpropheargleuproile

530535540

aagggggtccccatcgaattacaagtggaatgcttcacatgggaccaa1680

lysglyvalproilegluleuglnvalglucysphethrtrpaspgln

545550555560

aaactctggtgccgtcacttctgtgtgcttgcggactcagaatctggt1728

lysleutrpcysarghisphecysvalleualaaspserglusergly

565570575

ggacatatcactcactctgggatggagggcatgggagtcagctgcaca1776

glyhisilethrhisserglymetgluglymetglyvalsercysthr

580585590

gtcacccgggaagatggaaccaatatcgagggaagggcggcccagccg1824

valthrarggluaspglythrasnilegluglyargalaalaglnpro

595600605

gccatggccgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgag1872

alametalaaspcysaspilegluglylysaspglylysglntyrglu

610615620

agtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaa1920

servalleumetvalserileaspglnleuleuaspsermetlysglu

625630635640

attggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacat1968

ileglyserasncysleuasnasnglupheasnphephelysarghis

645650655

atctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgc2016

ilecysaspalaasnlysgluglymetpheleupheargalaalaarg

660665670

aagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctc2064

lysleuargglnpheleulysmetasnserthrglyasppheaspleu

675680685

cacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcact2112

hisleuleulysvalsergluglythrthrileleuleuasncysthr

690695700

ggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaacca2160

glyglnvallysglyarglysproalaalaleuglyglualaglnpro

705710715720

acaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactg2208

thrlysserleuglugluasnlysserleulysgluglnlyslysleu

725730735

aatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgt2256

asnaspleucyspheleulysargleuleuglngluilelysthrcys

740745750

tggaataaaattttgatgggcactaaagaacacgcggccgcaagagga2304

trpasnlysileleumetglythrlysgluhisalaalaalaarggly

755760765

tcgcatcaccatcaccatcactga2328

serhishishishishishis

770775

<210>14

<211>775

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>14

methisprolysglyserargilevalileasnarggluhisleumet

151015

ileaspargprotyrvalleuleualavalleuphevalmetpheleu

202530

serleuileglyleuleualailealaglyileargleuhisargala

354045

alailetyrthralagluilehislysserleuserthrasnleuasp

505560

valthrasnserilegluhisglnvallysaspvalleuthrproleu

65707580

phelysileileglyaspgluvalglyleuargthrproglnargphe

859095

thraspleuvallyspheileserasplysilelyspheleuasnpro

100105110

aspargglutyrasppheargaspleuthrtrpcysileasnpropro

115120125

gluargilelysleuasptyraspglntyrcysalaaspvalalaala

130135140

glugluleumetasnalaleuvalasnserthrleuleugluthrarg

145150155160

thrthrasnglnpheleualavalserlysglyasncysserglypro

165170175

thrthrileargglyglnpheserasnmetserleuserleuleuasp

180185190

leutyrleuglyargglytyrasnvalserserilevalthrmetthr

195200205

serglnglymettyrglyglythrtyrleuvalglulysproasnleu

210215220

serserlysargsergluleuserglnleusermettyrargvalphe

225230235240

gluvalglyvalileargasnproglyleuglyalaprovalphehis

245250255

metthrasntyrleugluglnprovalserasnaspleuserasncys

260265270

metvalalaleuglygluleulysleualaalaleucyshisglyglu

275280285

aspserilethrileprotyrglnglyserglylysglyvalserphe

290295300

glnleuvallysleuglyvaltrplysserprothraspmetglnser

305310315320

trpvalproleuserthraspaspprovalileaspargleutyrleu

325330335

serserhisargglyvalilealaaspasnglnalalystrpalaval

340345350

prothrthrargthraspasplysleuargmetgluthrcysphegln

355360365

glnalacyslysglylysileglnalaleucysgluasnproglutrp

370375380

alaproleulysaspasnargileprosertyrglyvalleuserval

385390395400

aspleuserleuthrvalgluleulysilelysilealaserglyphe

405410415

glyproleuilethrhisglyserglymetaspleutyrlysserasn

420425430

hisasnasnvaltyrtrpleuthrileproprometlysasnleuala

435440445

leuglyvalileasnthrleuglutrpileproargphelysvalser

450455460

proalaleupheasnvalproilelysglualaglygluaspcyshis

465470475480

alaprothrtyrleuproalagluvalaspglyaspvallysleuser

485490495

serasnleuvalileleuproglyglnaspleuglntyrvalleuala

500505510

thrtyraspthrseralavalgluhisalavalvaltyrtyrvaltyr

515520525

serproserargserphesertyrphetyrpropheargleuproile

530535540

lysglyvalproilegluleuglnvalglucysphethrtrpaspgln

545550555560

lysleutrpcysarghisphecysvalleualaaspserglusergly

565570575

glyhisilethrhisserglymetgluglymetglyvalsercysthr

580585590

valthrarggluaspglythrasnilegluglyargalaalaglnpro

595600605

alametalaaspcysaspilegluglylysaspglylysglntyrglu

610615620

servalleumetvalserileaspglnleuleuaspsermetlysglu

625630635640

ileglyserasncysleuasnasnglupheasnphephelysarghis

645650655

ilecysaspalaasnlysgluglymetpheleupheargalaalaarg

660665670

lysleuargglnpheleulysmetasnserthrglyasppheaspleu

675680685

hisleuleulysvalsergluglythrthrileleuleuasncysthr

690695700

glyglnvallysglyarglysproalaalaleuglyglualaglnpro

705710715720

thrlysserleuglugluasnlysserleulysgluglnlyslysleu

725730735

asnaspleucyspheleulysargleuleuglngluilelysthrcys

740745750

trpasnlysileleumetglythrlysgluhisalaalaalaarggly

755760765

serhishishishishishis

770775

<210>15

<211>523

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>截短型mev融合糖蛋白（fcδ30）

<400>15

metserilemetglyleulysvalasnvalseralailephemetala

151015

valleuleuthrleuglnthrprothrglyglnilehistrpglyasn

202530

leuserlysileglyvalvalglyileglyseralasertyrlysval

354045

metthrargserserhisglnserleuvalilelysleumetproasn

505560

ilethrleuleuasnasncysthrargvalgluilealaglutyrarg

65707580

argleuleuargthrvalleugluproileargaspalaleuasnala

859095

metthrglnasnileargprovalglnservalalaserserargarg

100105110

hislysargphealaglyvalvalleualaglyalaalaleuglyval

115120125

alathralaalaglnilethralaglyilealaleuhisglnsermet

130135140

leuasnserglnalaileaspasnleuargalaserleugluthrthr

145150155160

asnglnalaileglualaileargglnalaglyglnglumetileleu

165170175

alavalglnglyvalglnasptyrileasnasngluleuileproser

180185190

metasnglnleusercysaspleuileglyglnlysleuglyleulys

195200205

leuleuargtyrtyrthrgluileleuserleupheglyproserleu

210215220

argaspproileseralagluileserileglnalaleusertyrala

225230235240

leuglyglyaspileasnlysvalleuglulysleuglytyrsergly

245250255

glyaspleuleuglyileleugluserargglyilelysalaargile

260265270

thrhisvalaspthrglusertyrpheilevalleuserilealatyr

275280285

prothrleusergluilelysglyvalilevalhisargleuglugly

290295300

valsertyrasnileglyserglnglutrptyrthrthrvalprolys

305310315320

tyrvalalathrglnglytyrleuileserasnpheaspgluserser

325330335

cysthrphemetprogluglythrvalcysserglnasnalaleutyr

340345350

prometserproleuleuglnglucysleuargglyserthrlysser

355360365

cysalaargthrleuvalserglyserpheglyasnargpheileleu

370375380

serglnglyasnleuilealaasncysalaserileleucyslyscys

385390395400

tyrthrthrglythrileileasnglnaspproasplysileleuthr

405410415

tyrilealaalaasphiscysprovalvalgluvalasnglyvalthr

420425430

ileglnvalglyserargargtyrproaspalavaltyrleuhisarg

435440445

ileaspleuglyproproileserleugluargleuaspvalglythr

450455460

asnleuglyasnalailealalysleugluaspalalysgluleuleu

465470475480

gluserseraspglnileleuargsermetlysglyleuserserthr

485490495

serilevaltyrileleuilealavalcysleuglyglyleuilegly

500505510

ileproalaleuilecyscyscysargglyarg

515520

<210>16

<211>524

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>截短型niv融合糖蛋白（fcδ22）

<400>16

metvalvalileleuasplysargcystyrcysasnleuleuileleu

151015

ileleumetileserglucysservalglyileleuhistyrglulys

202530

leuserlysileglyleuvallysglyvalthrarglystyrlysile

354045

lysserasnproleuthrlysaspilevalilelysmetileproasn

505560

valserasnmetserglncysthrglyservalmetgluasntyrlys

65707580

thrargleuasnglyileleuthrproilelysglyalaleugluile

859095

tyrlysasnasnthrhisaspleuvalglyaspvalargleualagly

100105110

valilemetalaglyvalalaileglyilealathralaalaglnile

115120125

thralaglyvalalaleutyrglualametlysasnalaaspasnile

130135140

asnlysleulysserserilegluserthrasnglualavalvallys

145150155160

leuglngluthralaglulysthrvaltyrvalleuthralaleugln

165170175

asptyrileasnthrasnleuvalprothrileasplysilesercys

180185190

lysglnthrgluleuserleuaspleualaleuserlystyrleuser

195200205

aspleuleuphevalpheglyproasnleuglnaspprovalserasn

210215220

sermetthrileglnalaileserglnalapheglyglyasntyrglu

225230235240

thrleuleuargthrleuglytyralathrgluasppheaspaspleu

245250255

leugluseraspserilethrglyglnileiletyrvalaspleuser

260265270

sertyrtyrileilevalargvaltyrpheproileleuthrgluile

275280285

glnglnalatyrileglngluleuleuprovalserpheasnasnasp

290295300

asnserglutrpileserilevalproasnpheileleuvalargasn

305310315320

thrleuileserasnilegluileglyphecysleuilethrlysarg

325330335

servalilecysasnglnasptyralathrprometthrasnasnmet

340345350

argglucysleuthrglyserthrglulyscysproarggluleuval

355360365

valserserhisvalproargphealaleuserasnglyvalleuphe

370375380

alaasncysileservalthrcysglncysglnthrthrglyargala

385390395400

ileserglnserglygluglnthrleuleumetileaspasnthrthr

405410415

cysprothralavalleuglyasnvalileileserleuglylystyr

420425430

leuglyservalasntyrasnsergluglyilealaileglypropro

435440445

valphethrasplysvalaspileserserglnilesersermetasn

450455460

glnserleuglnglnserlysasptyrilelysglualaglnargleu

465470475480

leuaspthrvalasnproserleuilesermetleusermetileile

485490495

leutyrvalleuserilealaserleucysileglyleuilethrphe

500505510

ileserpheileilevalglulyslysargasnthr

515520