短型视杆源性视锥活力因子与亲水性肽的融合蛋白的制作方法

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背景技术：

rdcvf是由视网膜中的视杆感光细胞特异性表达的硫氧还蛋白样蛋白(léveillard等，(2004)naturegenetics36:755-759及补充信息)。在人类中有两种不同rdcvf，被称为rdcvf1和rdcvf2。两种rdcvf基因都经选择性剪接来编码两种产物：全长蛋白和c端转录后截短的蛋白，分别称为rdcvf-长(rdcvfl)和rdcvf-短(rdcvfs)。核氧还蛋白样-1基因(nxnl1)通过选择性剪接机制编码长型和短型rdcvf。nxnl1敲除导致小鼠中视杆和视锥的逐渐丧失，表明在基因水平上该基因对于感光细胞的存活以及维持正确的视网膜生理学和功能是至关重要的。

rdcvfs被描述为是促进视锥存活的分泌型营养因子，而rdcvfl是与细胞内蛋白相互作用的氧化还原活性酶(léveillard等，(2010)scitranslmed.2(26):26ps16)。例如，tau被描述为rdcvf-l的结合伴侣，而tau仅位于细胞内(fridlich等，(2009)molecular&cellularproteomics8(6):1206-18)。

已发现，罹患某些视网膜营养不良的个体比未患视网膜营养不良的个体在眼中具有更低水平的rdcvf蛋白(pct公开wo02/081513)。

已证明不同形式的rdcvf蛋白能促进体外和体内的视锥感光细胞存活。例如，在遗传性视网膜退化的动物模型中，眼内注射短型人rdcvf1(rdcvf1s)蛋白不仅挽救了视锥细胞免于退化，而且还维持了其功能(yang等，(2009)moltherapy17:787-795)。然而，表现出该蛋白的体内视锥细胞保护效果需要多次眼内注射。

色素性视网膜炎(rp)是以进行性视杆退化和随后的继发性视锥丧失为特征的视网膜退行性眼病。rp是遗传性失明的主要成因，仅在美国就影响着约10万患者和每年2000例新病例。rp影响所有族裔。全世界有超过150万人受rp影响。对于患者而言不幸的是，对rp没有有效疗法或经批准的疗法。因此，rp仍是迫切而未达成的医学需求。

由于rp是临床进程为数年至数十年的慢性视网膜退行性疾病，通过在视网膜中组成型地表达rdcvf，基因疗法对于rp适应证可以是理想的。对于急性紧急适应证(例如视网膜脱落)，蛋白疗法可以是有益的。即，在视网膜可以重新连接至眼的背部(即，视网膜色素上皮和脉络膜层)之前，使用重组rdcvf蛋白来保护感光细胞免于死亡。不幸的是，本领域的科学家在有效表达和分泌rdcvf蛋白、尤其是短型rdcvf时遇到了相当的困难。参见例如美国专利公开第20110034546号第[0004]段。

技术实现要素：

本发明提供了一种融合蛋白，其包含：第一n端信号肽序列、位于所述信号肽序列的c端的第二肽序列和位于所述第二肽序列的c端的第三肽序列；其中，所述第二肽序列和所述第三肽序列中的一个是rdcvf-短肽序列，而另一个是亲水性肽序列。翻译后，信号肽在内质网中被切下，留下包含第二肽序列和第三肽序列而缺少信号肽的融合蛋白。因此，本发明还提供了一种融合蛋白，其包含第二肽序列和位于所述第二肽序列c端的第三肽序列；其中，所述第二肽序列和所述第三肽序列中的一个是rdcvf-短肽序列，而另一个是亲水性肽序列。本发明还提供了编码所述融合蛋白的核酸和表达载体、包含所述核酸或表达载体的细胞以及所述融合蛋白、核酸和表达载体的治疗方法和用途。本发明还提供了一种制备融合蛋白的方法，该方法包括在允许表达和分泌所编码的融合蛋白的条件下培养本发明的细胞并从细胞培养物中分离出所述融合蛋白。

附图说明

图1a显示了人短型视杆源性视锥活力因子的氨基酸序列。人短rdcvf的氨基酸组成是高度疏水性的。短rdcvf中38.5％的氨基酸为疏水性的。下划线的氨基酸为疏水性氨基酸。

图1b显示了人长型视杆源性视锥活力因子的氨基酸序列。长rdcvf的c端的25％的氨基酸为疏水性的(下划线的氨基酸为长型rdcvf的c端的疏水性氨基酸)。

图2.短rdcvf与亲水性结构域的融合蛋白。

图2显示了两种人短rdcvf融合蛋白的示意图。人短rdcvf在其n端或c端与亲水性结构域融合。融合蛋白具有信号肽以促进从细胞中分泌。

图3.人白蛋白与人短rdcvf的新型融合蛋白的表达和分泌。

图3显示了对人短rdcvf和人白蛋白融合蛋白的western印迹分析。

泳道1:来自用aav-gfp(作为对照的编码gfp的aav载体)转导的人293细胞的30μl细胞培养基；

泳道2:来自用aav-alb-rdcvfs(编码在短rdcvf的n端与人白蛋白融合的短型人rdcvf的aav载体)转导的人293细胞的30μl细胞培养基；

泳道3:来自用aav-rdcvfs-alb(编码在短rdcvf的c端与人白蛋白融合的短型人rdcvf的aav载体)转导的人293细胞的30μl细胞培养基。

左侧的数字指示以kda计的分子量标志物。

序列表说明

seqidno:1.人白蛋白与短rdcvf的融合蛋白(alb-rdcvfs)的氨基酸序列，其中人白蛋白位于融合蛋白的n端。

seqidno:2.编码在n端与人白蛋白融合的人短rdcvf(alb-rdcvfs)的核苷酸序列。

seqidno:3.人白蛋白与短rdcvf的融合蛋白(rdcvfs-alb)的氨基酸序列，其中人白蛋白位于融合蛋白的c端。在rdcvfs和人白蛋白之间存在4个氨基酸的间隔序列。自n端起的前21个氨基酸是来自小鼠igk的信号序列。在信号序列和rdcvfs之间存在14个氨基酸的间隔序列(连接序列)。

seqidno:4.编码在c端与人白蛋白融合的人短rdcvf(rdcvfs-alb)的核苷酸序列。

seqidno:5.人短型视杆源性视锥活力因子的氨基酸序列。

seqidno:6.人长型视杆源性视锥活力因子的氨基酸序列。

具体实施方式

不希望受理论束缚，表达和分泌短型rdcvf的困难可能潜在地归因于其高度疏水性的氨基酸组成。仔细分析短型和长型人rdcvf蛋白的氨基酸组成发现，短型rdcvf蛋白极度疏水(图1a和1b)。在短rdcvf中，109个氨基酸中的42个(38.5％)是疏水性氨基酸。存在一段6个疏水性氨基酸的片段、一段4个疏水性氨基酸的片段、以及两段各有3个疏水性氨基酸的片段。非常可能的是，高百分比的疏水性氨基酸组成使得短rdcvf极难在体外和体内被哺乳动物细胞高效地表达和分泌，因为其更可能通过疏水-疏水相互作用粘附于脂质膜。有趣的是，虽然长型rdcvf的n端的109个氨基酸与整个短rdcvf相同，但长rdcvf的c端的103个氨基酸不是疏水性的，仅有25％的氨基酸为疏水性的(26/103)。长rdcvf的该c端中的最长的疏水性氨基酸片段仅为4个氨基酸长。不存在3疏水氨基酸片段。长rdcvf的c端中的相对亲水性可能在减少长rdcvf的总体疏水性方面起着重要作用。

在本发明的融合蛋白的一个实施方式中，第二肽序列是rdcvf-短肽序列而第三肽序列是亲水性肽序列。在另一个实施方式中，第二肽序列是亲水性肽序列而第三肽序列是rdcvf-短肽序列。

应当存在n端信号肽序列，其会促进融合蛋白从表达该融合蛋白的细胞中分泌出。可以利用任何使蛋白能够从哺乳动物细胞中分泌出的信号肽。在其他实施方式中，信号肽序列选自由igk信号肽序列和白蛋白信号肽序列组成的组。在更具体的实施方式中，igk信号肽序列是小鼠igk信号肽序列，而白蛋白信号肽序列是人白蛋白信号肽序列。

在本发明的优选实施方式中，rdcvf-短肽序列是人rdcvf-短肽序列。合适的rdcvf-短肽序列的实例包括rdcvf1-短肽序列、rdcvf2-短肽序列和不同于相应野生型序列的rdcvf-短肽序列(例如区别在于一个或多个保守性氨基酸替换)。

根据本发明，可以利用任何亲水性肽序列，只要其与不具有该亲水性肽序列的rdcvf-短肽序列相比会降低融合蛋白的疏水性指数即可。在本发明的一个实施方式中，包括任何信号肽序列(如果存在)的融合蛋白的疏水性指数小于-0.20，更优选小于-0.30。

优选地，亲水性肽序列在人中无免疫原性，不会对人视网膜生理学或正常的视网膜功能带来任何其它负面效果，并且不会影响短rdcvf的生物学功能。亲水性肽序列可以是亲水性蛋白、亲水性蛋白结构域、亲水性寡肽或亲水性多肽。多于一个亲水性结构域可以是短rdcvf的亲水性融合伴侣的候选物。在本发明的一个实施方式中，亲水性肽序列是白蛋白，例如人白蛋白。

根据本发明的融合蛋白，在第一肽序列和第二肽序列之间和/或在第二肽序列和第三肽序列之间，可以可选地存在一个或多个氨基酸的间隔序列。在本发明的一个实施方式中，在第一肽序列和第二肽序列之间不存在间隔序列，换言之，第一肽序列通过单一肽键与第二肽序列共价键合。在另一个实施方式中，在第一肽序列和第二肽序列之间存在间隔序列。在本发明的另一实施方式中，在第二肽序列和第三肽序列之间不存在间隔序列，换言之，第二肽序列通过单一肽键与第三肽序列共价键合。在另一个实施方式中，在第二肽序列和第三肽序列之间存在间隔序列。原则上对间隔序列的大小没有限制。在本发明的一个实施方式中，第一和第二肽序列之间的间隔序列具有2至14个氨基酸。在另一个实施方式中，第二和第三肽序列之间的间隔序列具有2至14个氨基酸，更具体而言具有2至4个氨基酸。

本发明的融合蛋白编码序列的一个实施方式进一步包含位于第三肽序列编码序列c端的多腺苷酸化信号。多腺苷酸化信号(聚a)可以是任何聚a。

在本发明的融合蛋白的一个实施方式中，第一肽序列是人白蛋白信号序列，第二肽序列是人白蛋白，第三肽序列是rdcvf-短序列。在更具体的实施方式中，融合蛋白具有序列seqidno:1，或seqidno:1的第25-717号氨基酸。在本发明的融合蛋白的另一实施方式中，第一肽序列是igk信号序列，第二肽序列是rdcvf-短序列，第三肽序列是人白蛋白。在更具体的实施方式中，融合蛋白具有序列seqidno:3，或seqidno:3的第22-732号氨基酸。

在本发明的融合蛋白的实施方式中，信号肽序列、rdcvf-短肽序列和亲水性肽序列中的一个、两个或全部与相应的野生型序列有区别。在更具体的实施方式中，该区别包括一个或多个保守性氨基酸替换。在更具体的实施方式中，氨基酸替换是有限的一个或多个保守性氨基酸替换。

本发明的融合蛋白可以糖基化或未糖基化。一般而言，糖基化有益于蛋白的稳定性和溶解性。在一个实施方式中，在用本发明的表达载体转导的细胞中所表达的融合蛋白发生糖基化，且在从细胞分泌出之后被糖基化。

在一个实施方式中，本发明的核酸是dna。在另一个实施方式中，信号肽序列、rdcvf-短肽序列和亲水性肽序列中的一个、两个或全部的编码序列与相应的野生型序列相比是重编码的。在更具体的实施方式中，rdcvf-短肽序列的编码序列是重编码的。本发明的核酸可以可选地包含一个或多个内含子，其处在第一和第二肽序列之间、第二和第三肽序列之间、或其他位置。在本发明的一个实施方式中，核酸编码具有序列seqidno:1的融合蛋白，例如为具有序列seqidno:2的核酸。在另一个实施方式中，核酸编码具有序列seqidno:3的融合蛋白，例如为具有序列seqidno:4的核酸。鉴于遗传密码的简并性，可以容易地想到其它核酸序列。

本发明的一个实施方式是一种表达载体，其包含可操作地连接至控制序列(例如启动子)的上述核酸。驱动rdcvfs融合蛋白的启动子可以是任何启动子且不限于cmv启动子。当在启动子和融合蛋白编码序列之间存在内含子时，可以使用任何合适的常规内含子。例如，β-珠蛋白内含子是合适的。

在实验中，通过融合人短rdcvf和亲水性结构域而创建了两种融合蛋白(参见图2的示意)。一种为人短rdcvf在n端与人白蛋白融合，且白蛋白信号肽位于融合蛋白的n端(seqidno:1)。表达和分泌该融合蛋白的表达构建体在aav载体的基础上设计，称为raav-alb-rdcvfs。该载体编码经密码子优化(重编码)的在n端与人白蛋白融合的人短rdcvf(sedidno:2)。将该融合蛋白命名为alb-rdcvfs。在融合蛋白编码序列的上游，将人白蛋白信号肽的编码序列并入该融合蛋白表达构建体中。该表达构建体进一步含有连接至融合蛋白编码序列的cmv启动子和内含子。该表达构建体进一步含有位于融合蛋白编码序列c端的多腺苷酸化信号。将整个表达盒克隆至aav表达质粒内，对该质粒进行dna测序以确认表达构建体的完整性。

另一种示例性融合蛋白是人短rdcvf在c端与人白蛋白融合，且在融合蛋白的n端具有小鼠igk信号肽(seqidno:3)。表达和分泌该融合蛋白的表达构建体在aav载体的基础上设，称为raav-rdcvfs-alb。该载体编码经密码子优化(重编码)的在c端与人白蛋白融合的人短rdcvf(sedidno:4)。将该融合蛋白命名为rdcvfs-alb。在融合蛋白编码序列的上游，还将经修改的小鼠igk信号肽的编码序列并入融合蛋白表达构建体中。该表达构建体进一步含有连接至融合蛋白编码序列的cmv启动子和内含子。该表达构建体进一步含有位于融合蛋白编码序列c端的多腺苷酸化信号。将整个表达盒克隆至aav表达质粒内，对该质粒进行dna测序以确认表达构建体的完整性。

存在共20种天然存在的氨基酸。其中一些为疏水性的，一些为亲水性的。氨基酸的疏水性指数是代表其侧链的疏水或亲水性质的数字。该数字越大，氨基酸越疏水(表1)。最疏水的氨基酸是异亮氨酸(4.5)和缬氨酸(4.2)。最亲水的氨基酸是精氨酸(-4.5)和赖氨酸(-3.9)。虽然蛋白的疏水或亲水性取决于其由什么氨基酸构成以及二级、三级和四级结构，但蛋白的疏水性指数对于蛋白的疏水性可以具有预测价值。

表1.氨基酸的疏水性值

ala:1.800

arg:-4.500

asn:-3.500

asp:-3.500

cys:2.500

gln:-3.500

glu:-3.500

gly:-0.400

his:-3.200

ile:4.500

leu:3.800

lys:-3.900

met:1.900

phe:2.800

pro:-1.600

ser:-0.800

thr:-0.700

trp:-0.900

tyr:-1.300

val:4.200

使用公众可获得的gpmaw程序来计算短rdcvf以及两种短rdcvf白蛋白融合蛋白的疏水性指数。天然短型人rdcvf(rdcvfs)的疏水性指数为-0.12。在将人白蛋白融合至rdcvfs的n端后，所得到的融合蛋白alb-rdcvfs的疏水性指数从-0.12降至-0.32(包括信号肽)，疏水性指数下降266.7％。在将人白蛋白融合至rdcvfs的c端后，所得到的融合蛋白rdcvfs-alb的疏水性指数从-0.12降至-0.33(包括信号肽)，疏水性指数下降275％。疏水性指数的极大下降可能有助于该融合蛋白的高效表达和分泌。

此外，已将融合蛋白编码序列克隆至aav-2表达构建体内，本文包括的数据明确表明该新型融合蛋白被高效表达，如采用rdcvf特异性抗体进行的western印迹所检测到的(图3)。短rdcvf的融合伴侣不限于人白蛋白。可以使用任何亲水性蛋白或亲水性蛋白结构域或亲水性肽来产生带有短rdcvf的融合蛋白，以降低该蛋白的疏水性。优选的亲水性结构域对人无免疫原性。

蛋白可以由基因疗法载体(例如aav(腺相关病毒)载体、慢病毒载体、合成载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、裸dna、纳米颗粒等)来编码和递送。作为另选，融合蛋白可以作为重组蛋白递送至视网膜。亲水性融合结构域不应当对人视网膜生理学或正常视网膜功能带来任何负面效果，并且不应当影响短rdcvf的生物学功能。有可能的是，多于一个亲水性结构域可以作为短rdcvf的亲水性融合伴侣的候选物。在实例中，人白蛋白用作亲水性结构域，充当人短rdcvf的融合伴侣。

本发明提供了一种药物组合物，其包含：(i)选自由本发明的融合蛋白、核酸、表达载体或细胞组成的组的成分；和(ii)药学上可接受的载剂。

本发明提供了一种治疗哺乳动物患者的易响应于该治疗的病况的方法，所述治疗包括向所述患者施用有效量的本文所述的蛋白、核酸、载体、细胞或药物组合物，由此治疗所述患者的病况。在本发明的实施方式中，所述病况选自由以下组成的组：视网膜营养不良、斯塔加特病、色素性视网膜炎、干性年龄相关性黄斑变性(干性amd)、地图状萎缩(干性amd晚期)、湿性年龄相关性黄斑变性(湿性amd)、伴有或不伴有高眼压的青光眼、糖尿病性视网膜病变、bardet-biedel综合征、bassen-kornzweig综合征、贝特斯病、脉络膜病(choroidema)、环状萎缩、先天性黑朦、雷夫叙姆综合征、usher综合征、甲状腺相关眼病、格雷夫斯氏病、与视网膜色素上皮细胞相关的疾病、前段疾病、晶状体疾病/白内障、视杯(eyecup)病症、葡萄膜炎、阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病和嗅觉疾病。可以利用任何常规施用途径，例如注射至眼、静脉内注射或其它全身性施用。在本发明的方法的一个实施方式中，所述病况为眼部病况，且所述施用选自视网膜下注射和玻璃体内注射。在更具体的实施方式中，患者为人类患者。

本发明提供了一种保护患者的眼部感光细胞的方法，其包括向患者的眼部施用有效量的本文所述的蛋白、核酸、载体、细胞或药物组合物，由此保护所述患者的眼部感光细胞。在更具体的实施方式中，所述施用选自视网膜下注射和玻璃体内注射。在更具体的实施方式中，患者为人类患者。

现参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅出于说明性目的，且本发明不应在任何意义上被认为受限于这些实施例，而应认为涵盖了因本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化形式。

然而，出于说明的目的已在本文中描述了本发明的特定实施方式，本领域技术人员应该理解，在不背离所附权利要求所述的本发明的情况下可以进行细节上的多种变化。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此通过援引以其整体并入说明书，其程度等同于每一个单独的出版物、专利和专利申请被具体且单独地指明通过援引并入本文。此外，还通过援引并入了与任何前述出版物、专利和专利申请一同公开的任何补充信息。例如，某些期刊文章在公开时还带有通常可在线获取的补充信息。

实施例

实施例1：产生编码人短型视杆源性视锥活力因子和白蛋白融合蛋白的raav载体

质粒克隆

由(一家付费服务公司)合成了经密码子优化的在其n端与人白蛋白融合的人短型rdcvf蛋白的cdna，并将该cdna克隆至腺相关病毒载体质粒paav-mcs(cellbiolabs,sandiego,ca)中，从而创建了质粒paav-alb-rdcvfs。还将来自人白蛋白的信号肽并入了rdcvf和白蛋白融合蛋白编码序列的上游。

该paav-alb-rdcvfs质粒在aav-itr之间含有以下特征：

cmv启动子—β-珠蛋白内含子—信号序列—白蛋白—短rdcvf—聚a

所产生的该rdcvf和白蛋白融合蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。

由(一家付费服务公司)合成了经密码子优化的在其c端与人白蛋白融合的人短型rdcvf蛋白的cdna，并将该cnda克隆至腺相关病毒载体质粒paav-mcs(cellbiolabs,sandiego,ca)中，从而创建了质粒paav-rdcvfs-alb。还将来自小鼠igk的信号肽并入了rdcvf和白蛋白融合蛋白编码序列的上游。

该paav-rdcvfs-alb质粒在aav-itr之间含有以下特征：

cmv启动子—β-珠蛋白内含子—信号序列—短rdcvf—白蛋白—聚a

所产生的该rdcvf和白蛋白融合蛋白的氨基酸序列如seqidno:3所示。

重组aav-alb-rdcvfs和aav-rdcvfs-alb载体的产生和纯化

将质粒paav-alb-rdcvfs或paav-rdcvfs-alb、phelper(cellbiolabs,目录号340202)和prc2(cellbiolabs,目录号340201)转化至dh10b感受态细菌细胞(invitrogen,目录号18297-010)中，并利用qiagenendofreeplasmidmaxikit或endofreeplasmidmegakit根据制造商的说明书进行扩增。质粒浓度利用beckmandu-600分光光度计确定。通过限制性消化和dna测序分析来验证每个质粒的身份。

为了产生raav-alb-rdcvfs或raav-rdcvfs-alb载体，将293aav细胞(cellbiolabs,目录号aav-100)按400万个细胞/15cm培养皿接种到cdmem(dmem，补充有10％fbs、1％谷氨酰胺、1％非必需氨基酸和1％青霉素/链霉素)中。次日，用25ml新鲜cdmem替换培养基。2小时后进行转染。将水(57.4ml)与1.3mgphelper、650μgprc2、650μgpaav-alb-rdcvfs或paav-rdcvfs-alb以及8.1ml2mcacl2混合(水/质粒/cacl2混合物)。向5个50ml锥形管的每一个中转移12.5ml体积的2xhbs(lonza,sku:rr07005)。在进行涡旋的同时，将12.5ml水/质粒/cacl2混合物缓慢添加至含有2xhbs的每个锥形管中。温育5分钟后，将2.5ml该悬浮液添加至含293aav细胞的每个细胞培养皿中。

次日，每个培养皿用25ml新的cdmem培养基更换培养基。两天后，使用细胞提升器收集细胞并将细胞/培养基混合物转移至250ml锥形管中。将样品于4℃、3000rpm下离心15分钟，弃去上清液并将细胞沉淀块重悬于110mldmem中。将重悬的细胞样品等分(30ml)分配至50ml锥形管中，并利用乙醇/干冰浴和37℃水浴进行冷冻/融化/冷冻步骤。将管储存在-80℃直至对材料的进一步处理。采取相同的过程来产生raav-gfp对照载体，其中将质粒paav-alb-rdcvfs替换为质粒paav-gfp(cellbiolabs，目录号aav-400)。

为了纯化raav-alb-rdcvfs载体，将4个含有来自冷冻/融化/冷冻步骤的载体的50ml锥形管在水浴中于37℃融化。向每个管中加入40微升(核酸酶)(sigma,目录号e8263-25ku)，然后在37℃下温育30分钟。将这些管在3000rpm下离心10分钟，并将上清液转移至500ml瓶内。添加6毫升10％的脱氧胆酸钠溶液(8.2g在82ml水中)。将样品短暂混合并在37℃下温育30分钟。使用5μm过滤器将悬浮液过滤。随后，使用0.8μm过滤器进行另一个过滤步骤。准备肝素琼脂糖柱(8ml)(sigma，目录号h6508-25ml)，并用48ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)(invitrogen,目录号10010-049)平衡该柱。将经过滤的细胞裂解液加载至柱上，并用40ml洗涤缓冲液(20ml5mnacl,980mlpbs)洗涤柱。使用15ml洗脱缓冲液(80ml5mnacl,920mlpbs)将载体洗脱出并收集在新的50ml锥形管中。

通过离心过滤来浓缩载体。将amiconultra-15离心过滤单元(millipore,目录号ufc910024)用pbs清洗一次，并将洗脱得到的样品添加至该装置。在beckmanallegro6kr离心机中于2200rpm、22℃进行离心，直到样品浓缩至1-2ml体积。添加15ml体积的pbs并重复进行离心，直到样品体积为≤1ml。收集经纯化的载体，并用100μlpbs清洗过滤器壁。将样品混合，并将30μl载体等分试样在-80℃下储存在600μl锥形管中待用。

重复该过程以纯化raav-rdcvfs-alb和raav-gfp载体。

实施例2：raav载体介导的人短rdcvf和人白蛋白融合蛋白的表达和分泌

使用标准技术，使用采用4％-20％sds-page凝胶的western印迹分析来检测rdcvf和白蛋白融合蛋白的表达。作为对照，将5μl体积的magicmark^tmxpwestern蛋白标准物(invitrogen,目录号lc5602)添加至外围的孔中。每孔中添加30μl细胞培养基，该细胞培养基来自与蛋白样品缓冲液混合的经每种raav载体转导的人293细胞。在200v下跑胶，直到染料到达凝胶底部。采用vectorlaboratories的abc-ampwestern印迹分析试剂盒，根据修改版本的制造商说明书来进行western印迹分析。使sds-page在转移缓冲液中平衡20分钟，并使用transblotsemi-drytransfercell在20v下运行40分钟以将通过sds-page分离的蛋白转移至硝化纤维素膜上。一旦转移完成，在摇臂平台上的轻柔摇晃下，在200ml1x酪蛋白溶液中将膜在室温(rt)下封闭至少2小时或在4℃下封闭过夜。将膜与含1:2000稀释的兔抗rdcvf蛋白特异性抗体(一抗，由covance(denver,pa)生产)的50ml1x酪蛋白溶液一起在轻柔摇晃下在4℃下温育过夜或在室温下温育1小时。于rt下在轻柔摇晃下用30ml1x酪蛋白溶液洗涤膜4次，每次5分钟。于rt下在轻柔摇晃下将膜与30ml的以1:10000稀释在1x酪蛋白溶液中的生物素化山羊抗兔igg(二抗)温育1小时。于rt下在轻柔摇晃下用30ml1x酪蛋白溶液洗涤膜3次，每次5分钟。将膜在含100μl试剂a和100μl试剂b的50ml1x酪蛋白中的vectastainabc-amp中温育45分钟。于rt下在轻柔摇晃下用30ml1x酪蛋白溶液洗涤膜3次，每次5分钟。

将膜在tris,ph9.5中温育。使用6mlduolox底物(vectorlaboratories,目录号sk6605)采集化学发光信号，并将膜在胶片盒中的kodakbiomaxmsx射线胶片(kodakcarestreamhealth,目录号8572786)上曝光10秒至5分钟，随后用kodak显影剂溶液(kodakgbx,目录号1900984)和kodak定影剂溶液使胶片显影。

如图3所示，来自用raav-alb-rdcvfs和raav-rdcvfs-alb转导的人293细胞的细胞培养基均含有与兔抗rdcvf抗体特异性反应的分子量约为80kda的条带。该条带在来自用raav-gfp对照载体转导的细胞的细胞培养基中未检出。该数据表明raav-alb-rdcvfs和raav-rdcvfs-alb载体介导了人短rdcvf与白蛋白的融合蛋白在人细胞中的表达和分泌。

raav-alb-rdcvfs或raav-rdcvfs-alb载体可以用于眼内施用以治疗上文所列的疾病。具体地，载体可以经视网膜下注射或晶状体内注射来递送。

小结

编码经密码子优化(重编码)的人短rdcvf及在其n端融合的人白蛋白融合蛋白编码序列的重组aav载体能够介导该融合蛋白在人细胞中的表达和从人细胞中的分泌。编码经密码子优化的人短rdcvf及在其c端融合的人白蛋白融合蛋白的重组aav载体能够介导该融合蛋白在人细胞中的表达和从人细胞中的分泌。

序列表

<110>威尔斯达眼科制剂公司

<120>短型视杆源性视锥活力因子与亲水性肽的融合蛋白

<130>woc-019pct

<150>us62/406,552

<151>2016-10-11

<160>6

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<223>来自人白蛋白的信号序列

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<223>人白蛋白(含n端信号肽)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<223>来自小鼠igk的n段信号序列，之后是间隔序列，之后是rdcvfs，之后是间隔序列，之后是c端的人白蛋白

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<223>来自小鼠igk的n段信号序列

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<223>间隔序列

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