包含非手性3’-S-或5’-S-硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸合成的制作方法

本发明特别涉及含有至少一个式(i)的非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸的制备方法，

所述方法包括使含有式(ii)的核苷间连接体的寡核苷酸在碘存在下反应的步骤，

其中碘的浓度是大约0.001m至大约0.01m；和

其中r¹是磷酸酯保护基。

寡聚脱氧核苷酸作为治疗剂的应用(其中将众所周知的watson-crick杂交原理应用于靶向互补rna链)自从其在19世纪70年代末期出现以来，已取得了显著进步(p.c.zamecnik,m.l.stephenson,pnatlacadsciusa1978,75,280-284；s.t.crooke,antisensedrugtechnology:principles,strategies,andapplications,第二版，bocaraton，fl：crcpress，2008)。

随时间推移，已将几种类型的化学修饰引入合成的寡核苷酸中，为了例如延长其半衰期、改善药代动力学、提高rnaseh活性、降低毒性或提高错配识别。

最成功的修饰之一是硫代磷酸酯连接体的引入，其中将非桥接的磷酸酯氧原子之一用硫原子代替(f.eckstein,antisenseandnucleicaciddrugdevelopment2009,10,117-121)。所述硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸显示提高的蛋白结合，以及对核分解降解显示明显更高的稳定性，并由此在血浆、组织和细胞中比未修饰磷酸二酯类似物显示实质更高的半衰期。所述保证第一代寡核苷酸疗法的研发，并打开了后代修饰例如锁核酸(lnas)的大门。

然而，用硫代磷酸酯代替磷酸二酯连接体在磷原子处创造了手性中心。因此，直到现在，所有批准的寡核苷酸治疗剂是大量非对映异构体化合物的混合物，所述非对映异构体化合物可能具有不同(并可能相反的)物理化学性质。

为了降低所述寡聚脱氧核苷酸的非对映异构的复杂性，硫代磷酸酯内的硫原子理论上可从非桥连位置之一位移至核糖的桥连的3’-位。所述修饰使得围绕磷的取代方式对称，并由此除去手性中心，因此降低分子非对映异构的复杂性。虽然以前已将此类3’-脱氧-3’-巯基-和2’,3’-双脱氧-3’-巯基核苷酸(m.m.piperakis,j.w.gaynor,j.fisher,r.cosstick,org.biomol.chem.2013,11,966-974；j.bentley,j.a.brazier,j.fisher,r.cosstick,org.biomol.chem.2007,5,3698-3702；g.sabbagh,k.j.fettes,r.gosain,i.a.o'neil,r.cosstick,nucleicacidsres.2004,32,495-501；a.p.g.beevers,k.j.fettes,g.sabbagh,f.k.murad,j.r.p.arnold,r.cosstick,j.fisher,org.biomol.chem.2004,2,114-119)引入到寡聚(脱氧)核苷酸中，但是该修饰既没有描述于治疗剂的情况中，也没有用于降低寡聚脱氧核苷酸硫代磷酸酯的非对映异构复杂性。

带有一个或多个修饰的2’,3’-双脱氧-3’-巯基核苷酸的较长寡聚脱氧核苷酸的合成通常通过固相寡核苷酸合成技术实现，所述技术涉及3’-巯基亚磷酰胺结构单元(参见上面的参考文献)。然而，当利用所述修饰的亚磷酰胺时，报道低的偶联效率，致使目标产物的产率低。因此，以前的优化努力通常集中于偶联条件(试剂浓度、偶联时间、活化剂或添加剂)，但是没有发现显著改善合成效率的一套通用条件。

我们证实将2’-3’-双脱氧-3’-巯基-亚磷酰胺引入到较长模型的寡聚脱氧核苷酸中是困难的。此外，我们还发现后续的氧化是令人吃惊地困难的。这在很大程度上造成观察到的低合成效率。在标准条件下，通常将相当高浓度的碘溶液用作氧化剂(经常0.1m高)。然而，在这些条件下，寡核苷酸5’-末端载有另外的磷酸基的缺失片段通常作为副产物而观察到(经常与目标产物等量)。

相反，令人吃惊地发现利用非常低浓度的碘作为氧化剂(通常比本领域已知的标准条件下的浓度低至少50倍)，可以以显著程度抑制竞争性副产物的形成。现在，这些新氧化条件的应用保证将2’,3’-双脱氧-3’-巯基修饰高效引入到寡核苷酸中。

可理解的是上文定义的式(i)硫代磷酸酯核苷间连接体在最终的、脱保护的寡核苷酸(即当r¹是氢时)中是非手性的。然而，甚至当r¹不是氢时，作为非手性连接体的前体，式(i)硫代磷酸酯核苷间连接体在本说明书中将被称为非手性的硫代磷酸酯核苷间连接体。

在本说明书中，单独或组合的术语“烷基”表示具有1-8个碳原子的直链或支链烷基，特别是具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，并更特别是具有1-3个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链c1-c8烷基的示例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基的异构体、己基的异构体、庚基的异构体和辛基的异构体，特别是甲基、乙基、丙基、丁基和戊基，并更特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、叔丁基和异戊基。烷基的特别示例是甲基、乙基和丙基。

单独或组合的术语“烷氧基”或“烷基氧基”表示式烷基-o-基团，其中术语“烷基”具有上文给定的含义，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。特别的“烷氧基”是甲氧基和乙氧基。

单独或组合的术语“羟基”表示-oh基团。

单独或组合的术语“硫羟基”表示-sh基团。

单独或组合的术语“氨基”表示伯氨基基团(-nh2)、仲氨基基团(-nh-)或叔氨基基团(-n-)。

单独或组合的术语“硫烷基”表示-s-基团。

单独或组合的术语“叠氮基”表示-n3基团。

单独或组合的术语“氧基”表示-o-基团。

单独或组合的术语“保护基”表示通过官能团的化学修饰而引入到分子中以在随后的化学反应中获得立体选择性的基团。

“磷酸酯保护基”是磷酸酯基团的保护基。磷酸酯保护基的示例是2-氰乙基和甲基。磷酸酯保护基的特别示例是2-氰乙基。

“羟基保护基”是羟基的保护基，并还用于保护巯基基团。羟基保护基的示例是乙酰基(ac)、苯甲酰基(bz)、苄基(bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(mem)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(dmt)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(tmt)、甲氧基甲基醚(mom)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(mmt)、p-甲氧基苄基醚(pmb)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(piv)、四氢吡喃基(thp)、四氢呋喃(thf)、三苯甲基或三苯基甲基(tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(tms)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、三-异-丙基甲硅烷基氧基甲基(tom)和三异丙基甲硅烷基(tips)醚)、甲基醚和乙氧基乙基醚(ee)。羟基保护基的特别示例是dmt和tmt，特别是dmt。

“硫羟基保护基”是硫羟基基团的保护基。硫羟基保护基的示例是“羟基保护基”的那些。

术语“核碱基”指核苷酸的碱基基团，并覆盖天然存在的以及非天然存在的变体。因此，“核碱基”不仅覆盖已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且覆盖其杂环类似物和互变异构体。核碱基的示例包括但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。

文中所用的术语“核苷酸”指含有糖部分、碱基基团和共价连接基团(连接体基团)例如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接体基团的苷，并覆盖天然存在的核苷酸例如dna或rna，以及含有修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸。

术语“苷”指其中糖通过糖苷键(即糖(或者衍生自糖的分子)的半缩醛或半缩酮基团与另一分子的羟基之间形成的键)连接至另一个官能团的分子。术语“苷”还包含具有糖的半缩醛(或半缩酮)基团与除羟基之外的几种化学基团例如-sr(硫代苷)、-ser(硒代苷)、-nr’r”(n-苷)或-cr’r”r”’(c-苷)之间形成的键的化合物。

术语“固相载体”指用于固相合成的载体，特别是低聚化合物。固相载体的示例包括交联的聚苯乙烯(primersupport5g或nittophasehl)、可控孔径玻璃(controlledporeglass)(cpg)；草酰基-可控孔径玻璃、含硅颗粒例如多孔玻璃珠，以及硅胶例如三氯-[3-(4-氯甲基)苯基]丙基硅烷和多孔玻璃珠(porasil)反应形成的硅胶。可控孔径玻璃是特别有用的固相载体。

术语“寡核苷酸合成活化剂”指能活化未保护的核苷与到来的核苷亚磷酰胺单体的反应的化合物。所述寡核苷酸合成活化剂的示例可见于x.wei，tetrahedron2013，69，3615-3637。寡核苷酸合成活化剂的示例是基于唑的活化剂诸如1h-四唑、5-硝基苯基-1h-四唑(npt)、5-乙硫基-1h-四唑(ett)、5-苄硫基-1h-四唑(btt)、5-甲硫基-1h-四唑(mtt)、5-巯基-四唑(mct)和4,5-二氰基咪唑(dci)或者酸式盐诸如吡啶盐酸盐、三氟甲磺酸咪唑三氟甲磺酸苯并咪唑三氟甲磺酸5-硝基苯并咪唑或者弱酸例如2,4-二硝基苯甲酸或2,4-二硝基苯酚。5-(3,5-双(三氟甲基)苯基)-1h-四唑是特别有用的寡核苷酸合成活化剂。

术语“硫氧化(thiooxidation)剂”指能将亚磷酰胺转化成巯基-亚磷酰胺的试剂。硫氧化剂的示例是苯基乙酰基二硫化物、3h-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物、四乙基秋兰姆二硫化物(tetd)、二苯甲酰基四硫化物、双(o,o-二异丙氧基硫膦基)二硫化物(s-tetra)、苄基三乙基-四硫代钼酸铵(bttm)、双(p-甲苯磺酰基)二硫化物、3-乙氧基-l,2,4-二噻唑啉-5-酮(edith)和l,2,4-二噻唑烷-3,5-二酮(dtsnh)，并特别是3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮。

术语“加帽”或“加帽步骤”指寡核苷酸偶联期间(例如式(v)化合物与式(vi)化合物反应期间或者式(xi)化合物与式(xii)化合物反应期间)，将未反应的羟基或硫羟基转化为保护的羟基或硫羟基基团。因此，加帽阻碍所述羟基或硫羟基基团在下面偶联步骤中的反应。加帽步骤例如通过与乙酸酐(ac2o)或苯氧基乙酸酐(pac-酸酐)的反应方便地完成，所述反应例如与活化剂如吡啶和n-甲基-咪唑组合，例如在thf或乙腈中进行。产生的保护的羟基或硫羟基基团是例如乙酸酯或硫代乙酸酯基团。

术语“糖修饰的核苷”指其中糖不是dna或rna的糖的核苷。

术语“阳离子清除剂”指与反应中形成的游离阳离子反应并由此将其除去的物质。阳离子清除剂的示例是甲硅烷基氢化物例如三乙基硅烷、三苯基硅烷、三异丙基硅烷，硫醇如乙二硫醇，苯硫酚类化合物如甲氧基苯硫酚，苯酚类化合物和硫化物例如苯甲硫醚。特别的阳离子清除剂是三乙基硅烷和甲氧基苯硫酚。

因此，本发明特别涉及：

本发明方法，其中至少一个式(i)或(ii)的非手性硫代磷酸酯核苷酸间连接体的硫原子连接至寡核苷酸的相邻核苷的3’碳原子或5’碳原子；

本发明方法，其中包含至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸含有式(iii)片段

其中

x¹是氧或硫；

y¹是氧或硫；

前提是x¹和y¹不同时是硫；

各r¹独立地如权利要求1中所定义；

r^2a是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-nh2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-sh、-cn、-cf3、-ocf3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；

r^4a是氢或羟基烷基；

或者r^2a和r^4a一起形成-ch2o-、-ch2nh-、-ch2s-、-ch2n(or^p)-、-chch3o-、-c(ch3)2o-、-ch2c(＝ch2)-、-chch3c(＝ch2)-、-chch3s-、-ch2nr^p-、-ch2ch2o-、-ch2ch2ch2o-、-ch2och2-、-ch(ch2och3)o-、-ch(ch2ch3)o-或-ch2och2o-；

前提是当y¹是硫时，则r^4a是氢；

r^2b是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-nh2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-sh、-cn、-cf3、-ocf3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；

r³是羟基保护基；

各个r^p独立地是烷基；且

各个nu独立地是核碱基；

本发明方法，其中含有上文定义的式(ii)核苷间连接体的寡核苷酸包含式(iv)片段

其中x¹、y¹、r¹、r^2a、r^2b、r³、r^4a和nu是上文所定义的；

根据本发明的方法，其中含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸在酸存在下反应，得到含有式(v)片段的寡核苷酸

其中x¹、y¹、r¹、r^2a、r^2b、r^4a和nu如上文所定义；

本发明方法，其中在式(vi)化合物存在下，

使含有上文定义的式(v)片段的寡核苷酸反应，得到含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸，其含有式(vii)片段

其中

y²是氧或硫；

r^2c是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-nh2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-sh、-cn、-cf3、-ocf3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；

r^4c是氢或羟基烷基；

或者r^2c和r^4c一起形成-ch2o-、-ch2nh-、-ch2s-、-ch2n(or^p)-、-chch3o-、-c(ch3)2o-、-ch2c(＝ch2)-、-chch3c(＝ch2)-、-chch3s-、-ch2nr^p-、-ch2ch2o-、-ch2ch2ch2o-、-ch2och2-、-ch(ch2och3)o-、-ch(ch2ch3)o-或-ch2och2o-；

前提是当y²是硫时，则r^4c是氢；

r⁵是二烷基氨基；

各个r^p独立地是烷基；且

x¹、y¹、r¹、r^2a、r^2b、r³、r^4a和nu如上文所定义；

根据本发明的方法，其中使含有上文定义的式(vii)片段的寡核苷酸在硫氧化剂或碘存在下(其中碘的浓度是大约0.001m至大约0.01m)反应，得到含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸，其含有式(viii)片段

其中

x²是氧或硫；

y²是氧或硫；

前提是x²和y²不同时是硫；且

其中x¹、y¹、r¹、r^2a、r^2b、r^2c、r³、r^4a、r^4c和nu如上文所定义；

根据本发明的方法，其中当y²是氧时，使含有上文定义的式(vii)片段的寡核苷酸在硫氧化剂存在下反应；

根据本发明的方法，其中当y²是硫时，使含有上文定义的式(vii)片段的寡核苷酸在碘存在下反应；

根据本发明的方法，其中含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸包含式(ix)片段

其中

x¹是氧或硫；

y¹是氧或硫；

各个r¹独立地如上文所定义；

r^2a是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-nh2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-sh、-cn、-cf3、-ocf3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；

r^4a是氢或羟基烷基；(羟甲基)；

或者r^2a和r^4a一起形成-ch2o-、-ch2nh-、-ch2s-、-ch2n(or^p)-、-chch3o-、-c(ch3)2o-、-ch2c(＝ch2)-、-chch3c(＝ch2)-、-chch3s-、-ch2nr^p-、-ch2ch2o-、-ch2ch2ch2o-、-ch2och2-、-ch(ch2och3)o-、-ch(ch2ch3)o-或-ch2och2o-；

r^2b是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-nh2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-sh、-cn、-cf3、-ocf3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；

r^4b是氢或羟基烷基；

或者r^2b和r^4b一起形成-ch2o-、-ch2nh-、-ch2s-、-ch2n(or^p)-、-chch3o-、-c(ch3)2o-、-ch2c(＝ch2)-、-chch3c(＝ch2)-、-chch3s-、-ch2nr^p-、-ch2ch2o-、-ch2ch2ch2o-、-ch2och2-、-ch(ch2och3)o-、-ch(ch2ch3)o-或-ch2och2o-；

r³是羟基保护基或硫羟基保护基；

各个r^p独立地是烷基；且

各个nu独立地是核碱基；

根据本发明的方法，其中含有上文定义的式(ii)核苷间连接体的寡核苷酸包含式(x)片段

其中x¹、y¹、r¹、r^2a、r^2b、r³、r^4a、r^4b和nu同式(ix)化合物中定义的；

根据本发明的方法，其中使包含上文定义的式(ix)片段的含有至少一个式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸在酸存在下反应，得到含有式(xi)片段的寡核苷酸

其中x¹、y¹、r¹、r^2a、r^2b、r^4a、r^4b和nu同式(ix)化合物中定义的；

根据本发明的方法，其中使含有上文定义的式(xi)片段的寡核苷酸在式(xii)化合物存在下反应，

得到含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸，其包含式(xiii)片段

其中

y²是氧或硫；

r^2c是氢、羟基、氟、烷基、烷氧基、烷氧基烷氧基、-nh2、烷基氨基、二烷基氨基、烷基羰基氨基、叠氮基、-sh、-cn、-cf3、-ocf3、烷基硫烷基烷氧基、氨基氧基烷氧基、烷基氨基氧基烷氧基、二烷基氨基氧基烷氧基、氨基羰基烷氧基、烷基氨基羰基烷氧基或二烷基氨基羰基烷氧基；

r^4c是氢或羟基烷基；

或r^2c和r^4c一起形成-ch2o-、-ch2nh-、-ch2s-、-ch2n(or^p)-、-chch3o-、-c(ch3)2o-、-ch2c(＝ch2)-、-chch3c(＝ch2)-、-chch3s-、-ch2nr^p-、-ch2ch2o-、-ch2ch2ch2o-、-ch2och2-、-ch(ch2och3)o-、-ch(ch2ch3)o-或-ch2och2o-；

r³是羟基保护基或硫羟基保护基；

r⁵是二烷基氨基；

各个r^p独立地是烷基；且

其中x¹、y¹、r¹、r^2a、r^2b、r^4a、r^4b和nu同式(ix)化合物中定义的；

根据本发明的方法，其中使含有上文定义的式(xiii)片段的寡核苷酸在硫氧化剂或碘存在下(其中碘的浓度是大约0.001m至大约0.01m)反应，得到含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸，其含有式(xiv)片段

其中

y¹是氧或硫；

x²是氧或硫；

前提是y¹和x²不同时是硫；且

其中x¹、y²、r¹、r^2a、r^2b、r^2c、r³、r^4a、r^4b、r^4c和nu同式(xiii)化合物中定义的；

根据本发明的方法，其中当y¹是氧时，含有上文定义的式(xiii)片段的寡核苷酸在硫氧化剂存在下反应；

根据本发明的方法，其中当y¹是硫时，含有上文定义的式(xiii)片段的寡核苷酸在碘存在下反应；

根据本发明的方法，其中含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸包含1-8个式(i)核苷间连接体，优选1-6个式(i)核苷间连接体；

根据本发明的方法，其中碘的浓度是大约0.001m至大约0.005m，优选大约0.002m至大约0.005m；

根据本发明的方法，其中r¹是氰乙基；

根据本发明的方法，其中羟基保护基或硫羟基保护基是双-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲基；

根据本发明的方法，其中r⁵是二异丙基氨基；

根据本发明的方法，其中各个nu独立地选自腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶；

根据本发明的方法，其中含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸被偶联至用于固相合成的固相载体；

根据本发明的方法，其中所述酸是二氯乙酸或三氯乙酸；

根据本发明的方法，其中含有上文定义的式(v)片段的寡核苷酸在上文定义的式(vi)化合物存在下、在寡核苷酸合成活化剂存在下反应；

根据本发明的方法，其中含有上文定义的式(xi)片段的寡核苷酸在上文定义的式(xii)化合物存在下、在寡核苷酸合成活化剂存在下反应；

根据本发明的方法，其中寡核苷酸合成活化剂是5-(3,5-双(三氟甲基)苯基)-1h-四唑；

根据本发明的方法，其中硫氧化剂是3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮；

根据本发明的方法，其中含有上文定义的式(ii)核苷间连接体的寡核苷酸在碘存在下反应的步骤跟随有加帽步骤；

根据本发明的方法，其中除去含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸的磷酸酯保护基r¹，得到含有至少一个式(xv)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸

根据本发明的方法，其中通过含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸在氨、氢氧化铵或氢氧化铵和甲胺的混合物存在下反应，除去磷酸酯保护基r¹；

根据本发明的方法，其中通过含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸在氨水存在下反应，除去磷酸酯保护基r¹；

根据本发明的方法，其中将含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸从其结合的固相载体裂解。

根据本发明的方法，其中通过在氨水存在下的反应，将含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸从其结合的固相载体裂解；

根据本发明的方法，其中含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸在酸存在下反应，除去羟基保护基或硫羟基保护基；

根据本发明的方法制备的寡核苷酸；

含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸，其包含7-31个核苷酸；

含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸，其中所述至少一个式(i)硫代磷酸酯核苷酸间连接体的硫原子连接至所述寡核苷酸的相邻核苷的3’碳原子或5’碳原子；

含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸，其中该寡核苷酸含有至少一个式(xvi)的核苷酸

其中

x是氧或硫；

r²和r⁴一起形成-ch2o-、-ch2nh-、-ch2s-、-ch2n(or^p)-、-chch3o-、-c(ch3)2o-、-ch2c(＝ch2)-、-chch3c(＝ch2)-、-chch3s-、-ch2nr^p-、-ch2ch2o-、-ch2ch2ch2o-、-ch2-o-ch2-、-ch(ch2och3)o-、-ch(ch2ch3)o-或-ch2och2o-；

各个r^p独立地是烷基；且

nu是核碱基；

含有至少一个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸，其中该寡核苷酸含有至少一个式(xvii)的核苷酸

其中

x是氧或硫；

r²和r⁴一起形成-ch2o-、-ch2nh-、-ch2s-、-ch2n(or^p)-、-chch3o-、-c(ch3)2o-、-ch2c(＝ch2)-、-chch3c(＝ch2)-、-chch3s-、-ch2nr^p-、-ch2ch2o-、-ch2ch2ch2o-、-ch2-o-ch2-、-ch(ch2och3)o-、-ch(ch2ch3)o-或-ch2och2o-；

各个r^p独立地是烷基；且

nu是核碱基；

根据本发明的寡核苷酸，其含有至少两个上文定义的式(i)核苷间连接体；

根据本发明的寡核苷酸，其含有至少两个或者至少三个上文定义的式(i)核苷间连接体；

根据本发明的寡核苷酸，其含有至少一个lna核苷；

根据本发明的寡核苷酸，其含有至少一个糖修饰的核苷；

根据本发明的寡核苷酸，其中所述至少一个糖修饰的核苷独立地选自亲合力提高的2’糖修饰的核苷；

根据本发明的寡核苷酸，其中所述至少一个糖修饰的核苷独立地选自2’-烷氧基-rna特别是2’-甲氧基-rna、2’-烷氧基烷氧基-rna特别是2’-甲氧基乙氧基-rna、2’-氨基-dna、2’-氟-rna、2’-氟-ana核苷和lna核苷。

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^2a是氢、羟基、氟、烷氧基或烷氧基烷氧基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^2a是氢、羟基、氟、甲氧基或甲氧基乙氧基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^4a是氢或羟基烷基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^4a是氢或羟甲基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^4a是氢；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^2b是氢、羟基、氟、烷氧基或烷氧基烷氧基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^2b是氢、羟基、氟、甲氧基或甲氧基乙氧基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^4b是氢或羟基烷基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^4b是氢或羟甲基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^4b是氢；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^2c是氢、羟基、氟、烷氧基或烷氧基烷氧基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^2c是氢、羟基、氟、甲氧基或甲氧基乙氧基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^4c是氢或羟基烷基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^4c是氢或羟甲基；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^4c是氢；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^2a和r^4a一起形成-ch2o-；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^2b和r^4b一起形成-ch2o-；

本发明的方法或寡核苷酸，其中r^2c和r^4c一起形成-ch2o-；

本发明的方法或寡核苷酸，其中各个r^p独立地是甲基、乙基或丙基；

本发明的寡核苷酸，其中r²和r⁴一起形成-ch2o-；

本发明的方法或寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有1-8个上文定义的式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体；和

含有根据本发明的寡核苷酸的药物组合物。

本发明还涉及根据本发明的方法，其中包含上文定义的式(ix)片段(其中y¹是硫)的含有至少一个式(i)非手性硫代磷酸酯核苷间连接体的寡核苷酸在酸和阳离子清除剂存在下反应，得到含有式(xi)片段的寡核苷酸。

因此，本发明特别涉及用酸和阳离子清除剂的dmt-保护的5’-sdna或5’-slna单体的dmt脱保护或者寡核苷酸中dmt-保护的末端5’-sdna或5’s-lna核苷的dmt脱保护。

酸例如是三氯乙酸或三氟乙酸。

阳离子清除剂的示例是三乙基硅烷、甲氧基苯硫酚及其混合物。

酸和阳离子清除剂的有益组合的示例是三氯乙酸或三氟乙酸与三乙基硅烷和/或甲氧基苯硫酚的组合。

酸特别是三氯乙酸有利地以5-10％(w/v)使用。酸特别是三氟乙酸有利地以1-10％(v/v)、特别是1-5％(v/v)使用。

阳离子清除剂有利地以2-30％(v/v)使用。

阳离子清除剂三乙基硅烷有利地以5-30％(v/v)使用。

阳离子清除剂p-甲氧基苯硫酚有利地以2-10％(v/v)使用。

根据本发明的dmt脱保护有利地在二氯甲烷中进行。

因此，根据本发明的有利的dmt脱保护是：

在20％(v/v)三乙基硅烷的ch2cl2溶液存在下，200μl10％(w/v)三氯乙酸，6次施用，每次持续45秒；

在5％(v/v)p-甲氧基苯硫酚的ch2cl2溶液存在下，200μl10％(w/v)三氯乙酸，6次施用，每次持续45秒；

在20％(v/v)三乙基硅烷的ch2cl2溶液存在下，200μl5％(v/v)三氟乙酸，6次施用，每次持续45秒；

在5％(v/v)p-甲氧基苯硫酚和20％(v/v)三乙基硅烷的ch2cl2溶液存在下，200μl5％(v/v)三氟乙酸，3次施用，每次持续45秒；

在5-30％(v/v)三乙基硅烷的ch2cl2溶液和/或2-10％p-甲氧基苯硫酚的ch2cl2溶液存在下，200μl5-10％(w/v)三氯乙酸，3-6次施用，每次持续45秒；或者

在5-30％(v/v)三乙基硅烷的ch2cl2溶液和/或2-10％p-甲氧基苯硫酚的ch2cl2溶液存在下，200μl1-10％(v/v)三氟乙酸，3-6次施用，每次持续45秒。

含有1个或多个2’,3’-双脱氧-3’-巯基核苷酸的寡核苷酸硫代磷酸酯的合成可以例如利用通用接头修饰的可控孔径玻璃(cpg)作为载体，通过固相寡核苷酸合成实现。利用四唑衍生物作为酸性活化剂，第一个核苷酸(dna或lna)可作为相应的亚磷酰胺偶联至所述载体。偶联条件包括利用10当量亚磷酰胺，以及三重(triple)偶联，以保证完全反应。然后，可将产生的亚磷酸酯中间体进行硫氧化，形成硫代磷酸酯连接体。可能未反应的5’-羟基基团通过乙酰化加帽后，然后将由此固定在固相载体上的保护的单核苷酸通过核糖5’-羟基上二甲氧基三苯甲基保护基的酸促裂解而脱保护。利用适当亚磷酰胺结构单元顺序地重复该合成循环保证需要的寡核苷酸序列的构建。由于其较低的偶联效率，对于每一偶联，2’,3’-双脱氧-3’-巯基核苷酸优选利用4当量相应亚磷酰胺和15min的偶联时间，偶联10次。然后，利用2mm以下浓度的分子碘，可将得到的硫代亚磷酸酯中间体氧化成相应的硫代磷酸酯。加帽步骤后，上述二甲氧基三苯甲基保护基的标准酸促脱除完成合成循环。

在作为酸性活化剂的四唑衍生物存在下，利用三重偶联和10当量亚磷酰胺，将2’,5’-双脱氧-5’-巯基核苷酸引入。将得到的亚磷酸酯中间体利用碘氧化成相应的磷酸酯或者进行硫氧化得到硫代磷酸酯连接体，随后是加帽步骤。为了从二甲氧基三苯甲基保护基中释放5’-巯基，延长的酸处理是必需的。然后，由此得到的游离5’-巯基可偶联至随后的核苷酸，得到硫代亚磷酸酯中间体。然后，利用2mm以下浓度的分子碘，将所述中间体氧化成相应的硫代磷酸酯。加帽和脱三苯甲基完成合成循环。

一旦通过重复所述合成循环构建了所需的寡核苷酸序列，可通过用氨水处理，裂解固相载体和全部脱保护。

这些步骤在随后的流程图中进行简图化描述，流程图不具有限制性特征。x¹、y¹、r¹、r^2a、r^2b、r³、r^4a和nu如上文所定义。

流程图1

流程图2

5’s-lna单体(式(xii)化合物，其中y²＝s，且r^2c和r^4c一起形成-ch2o-、-ch2nh-、-ch2s-、-ch2n(or^p)-、-chch3o-、-c(ch3)2o-、-ch2c(＝ch2)-、-chch3c(＝ch2)-、-chch3s-、-ch2nr^p-、-ch2ch2o-、-ch2ch2ch2o-、-ch2och2-、-ch(ch2och3)o-、-ch(ch2ch3)o-或-ch2och2o-)可根据流程图3描述的方法合成。r³如上文所定义。

流程图3

从保护的核苷开始，通过酸处理而释放5’-羟基。用硫代苯甲酸作为亲核试剂利用mitsunobu反应，随后水解形成的硫酯，引入5’-硫原子。游离巯基保护后，在作为酸性活化剂的四唑衍生物存在下，用适当的亚磷酰二胺亚磷酰化3’-羟基，得到所需的亚磷酰胺结构单元。

现在，利用下述实施例解释说明本发明，所述实施例不具有限制性特性。

实施例

实施例1

单体合成–5’s-lna单体合成

在25℃下，向cl3ccooh(2.98g，18.23mmol)的ch2cl2(150ml)溶液中，加入n-[9-(1-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-7-羟基-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-3-基)-9h-嘌呤-6-基]苯甲酰胺(10g，14.58mmol)。然后，将反应混合物在25℃下搅拌3h。减压除去挥发性物质，并将得到的粗产物经combiflash(10％meoh的ch2cl2溶液)纯化，得到n-{9-[7-羟基-1-(羟甲基)-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-3-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(5g，89％)，为白色固体物。(ms:(esi):m/z＝383.8[m+h]⁺)。

向冰冷的三苯基膦(10.26g，39.13mmol)无水thf(150.0ml)溶液中，加入偶氮二甲酸二乙酯(6.14ml，39.13mmol)，并将反应混合物在0℃下搅拌30min。向反应混合物中，滴加phcosh(4.62ml，39.13mmol)，并将反应混合物在0℃下再搅拌30min。加入n-{9-[7-羟基-1-(羟甲基)-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-3-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(5.0g，13.04mmol)，并将反应混合物在0℃下搅拌2h，随后在室温下搅拌2h。将反应混合物用水(200ml)稀释，并用乙酸乙酯(120mlx3)萃取。合并的有机层用nahco3(100ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤，并减压蒸发，得到n-(9-{1-[(苯甲酰基硫烷基)甲基]-7-羟基-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-3-基}-9h-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(25g，粗品)，为黄色粘稠油状物。(ms:(esi):m/z＝504.3[m+h]⁺)。

将naoh水溶液(0.5m，238ml)和thf-meoh混合物(6:4，250ml)用氩气鼓泡30min。在氩气气氛下，将n-(9-{1-[(苯甲酰基硫烷基)甲基]-7-羟基-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-3-基}-9h-嘌呤-6-基)苯甲酰胺(20g，粗品)溶解于经氩气冲洗的thf-meoh(6:4，250ml)溶液中，并冷却至0℃至-5℃。向所述溶液中，加入naoh溶液(0.5m，238ml，119.16mmol)，并将反应混合物在0℃至-5℃下搅拌30min。在0℃下，加入柠檬酸溶液(30.04g，142.98mmol)。将反应混合物用饱和nahco3溶液(300ml)稀释，并用乙酸乙酯(120mlx3)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸发，得到n-{9-[7-羟基-1-(硫烷基甲基)-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-3-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(20g，粗品)，为灰白色粘稠油状物。(ms:(esi):m/z＝400.2[m+h]⁺).

在25℃下，向n-{9-[7-羟基-1-(硫烷基甲基)-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-3-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(20g，粗品)的无水吡啶(20ml，氩气冲洗的)溶液中，加入dmtrcl(5.09g，15.02mmol)，并将反应混合物在25℃下搅拌4h。减压除去挥发性物质，并将反应混合物用ch2cl2(300ml)稀释。将有机层用饱和nahco3溶液(100mlx2)洗涤，随后用盐水(100ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤并减压蒸发。得到的粗品经combiflash(2％meoh的ch2cl2溶液，含0.5％三乙胺)纯化，得到n-{9-[1-({[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]硫烷基}甲基)-7-羟基-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-3-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(5g，68％，历经3个步骤)，为浅黄色固体物。(ms:(esi):m/z＝702.14[m+h]⁺).

在室温、氩气气氛下，将5-乙基巯基-1h-四唑的溶液(1.3g，9.97mmol，38.4ml干燥乙腈中0.25m溶液)加入到搅拌的n-{9-[1-({[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]硫烷基}甲基)-7-羟基-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-3-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(3.5g，4.99mmol)的干燥ch2cl2(120ml)溶液中，随后加入2-氰乙基四异丙基亚磷酰二胺(3.17ml，9.98mmol)。在室温下搅拌4h后，将反应混合物用ch2cl2(300ml)稀释，并倒入饱和nahco3溶液(100ml)中。分离有机层，并将水层用ch2cl2(70mlx2)萃取。将合并的有机层经na2so4干燥、过滤并减压蒸发。得到的粗化合物经combiflash(10-20％acn的dcm溶液)纯化，得到(2.7g)非纯品。利用相同的策略，以1.0g和2.5g规模完成另外的两批，分别得到0.6g和2.5g不纯的产品。将由不同批次得到的不纯化合物混合，并再纯化，得到n-{9-[1-({[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]硫烷基}甲基)-7-({[双(丙烷-2-基)氨基](2-氰基乙氧基)磷烷基}氧基)-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-3-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(5’-巯基-lna腺苷亚磷酰胺，4.0g，44％)，为白色固体物。(ms:(esi):m/z＝901.6[m+h]⁺).

实施例2

5’-s和3’-sdna单体合成

3’sdna亚磷酰胺

向冰冷的n-{9-[(2r,4s,5r)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-4-羟基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺)(25g，38.01mmol)和4-硝基苯甲酸(12.70g，76.02mmol)的干燥thf(2.0l)溶液中，加入三苯基膦(39.89g，152.04mmol)，随后滴加偶氮二甲酸二异丙酯(30.74g，152.04mmol)，并将反应混合物在0℃下搅拌2h。用tlc检测反应进程。减压除去挥发性物质，得到浅棕色浓稠团状粗化合物，将其经combiflash(70-90％etoac的己烷溶液)纯化，得到n-{9-[(2r,4s,5r)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-4-羟基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(40g，粗品)，为灰白色固体物。(ms:(esi):m/z＝807.6[m+h]⁺).

在氩气气氛下，向冰冷的n-{9-[(2r,4s,5r)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-4-羟基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(40g，粗品)的干燥甲醇(500ml)溶液中，加入k2co3(6.85g，49.58mmol)，并将反应混合物在0℃下搅拌2h。减压除去挥发性物质，得到粗化合物，将其溶解于乙酸乙酯(300ml)中，并用水(100ml)洗涤。将水层再用etoac(2x100ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥，并减压浓缩，得到粗化合物，将其经combiflash(5％meoh的etoac溶液)纯化，得到n-{9-[(2r,4r,5r)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-4-羟基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(13g，两步后52％)，为灰白色固体物。(ms:(esi):m/z＝658.4[m+h]⁺).

向冰冷的三苯基膦(15.55g，59.30mmol)的干燥thf(350ml)溶液中，滴加偶氮二甲酸二乙酯(9.30ml，59.30mmol)，并将反应混合物在氩气气氛下，于0℃搅拌30min。加入硫代苯甲酸(7.00ml，59.30mmol)，并将得到的混合物在0℃下搅拌30min。加入n-{9-[(2r,4r,5r)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-4-羟基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(13.0g，19.77mmol)的干燥thf(150ml)溶液后，在0℃下继续搅拌30min，升至室温，并在25℃下搅拌16h。减压除去挥发性物质，得到粗化合物，将其经combiflash(50％乙酸乙酯的己烷溶液，含0.5％三乙胺)纯化，得到n-{9-[(2r,4s,5r)-4-(苯甲酰基硫烷基)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(8.1g,53％)，为黄色固体物。(ms:(esi):m/z＝777.6[m+h]⁺).

将naoh水溶液(0.5m，38.5ml)和thf-meoh混合物(6:4，75ml)用氩气鼓泡30min。在氩气气氛下，将n-{9-[(2r,4s,5r)-4-(苯甲酰基硫烷基)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(5.0g，6.43mmol)加入到meoh/thf(75.0ml)溶液中，并冷却至0℃至-5℃。向所述溶液中，加入上述naoh溶液(38.5ml,19.28mmol)，并将反应混合物在0℃至-5℃下搅拌30min。在0℃下，用柠檬酸中和后，将饱和nahco3溶液加入到反应混合物，并将溶液用乙酸乙酯(200mlx3)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩，得到n-{9-[(2r,4s,5r)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-4-硫烷基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(5.3g，粗品)，为淡黄色固体物。(ms:(esi):m/z＝673.6[m+h]⁺).

在室温、氩气气氛下，将5-乙基巯基-1h-四唑的溶液(1.64g，12.62mmol，50.0ml干燥乙腈中的0.25m溶液)加入到搅拌的n-{9-[(2r,4s,5r)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-4-硫烷基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(8.5g，粗品)的干燥ch2cl2(80.0ml)溶液中，随后加入2-氰乙基四异丙基亚磷酰二胺(6.004ml，18.92mmol)，并将反应混合物在25℃下搅拌1h。然后，将反应混合物用ch2cl2(300ml)稀释，并倒入饱和nahco3溶液(200ml)中。分离有机层，并将水层用ch2cl2(100mlx2)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，并减压浓缩，得到粗化合物，将其经combiflash(50％乙腈的ch2cl2溶液)纯化，得到n-{9-[(2r,4s,5r)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-4-({[双(丙烷-2-基)氨基](2-氰基乙氧基)磷烷基}硫烷基)氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(3’-巯基-dna腺苷亚磷酰胺，6.3g，经历两步后70％)，为灰白色固体物。(ms:(esi):m/z＝874.7[m+h]⁺).

5’sdna亚磷酰胺

向冰冷的n-{9-[(2r,4s,5r)-5-{[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]甲基}-4-羟基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(20g，30.41mmol)的chcl3(300ml)溶液中，加入cl3ccooh(2.48g，15.20mmol)的chcl3(50ml)溶液。然后，将反应混合物在0℃下搅拌2h。加入三乙胺(8.5ml，60.82mmol)，并减压除去挥发性物质。将得到的粗化合物经闪柱色谱纯化(10％meoh的ch2cl2溶液)。将由此得到的固体物用水洗涤并干燥，得到n-{9-[(2r,4s,5r)-4-羟基-5-(羟甲基)氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(7g，65％)，为白色固体物。(ms:(esi):m/z＝356.0[m+h]⁺).

向冰冷的三苯基膦(10.33g，39.40mmol)的无水thf(200ml)溶液中，加入偶氮二甲酸二乙酯(6.18ml，39.40mmol)，并将反应混合物在0℃搅拌30min。滴加phcosh(4.65ml，39.40mmol)，并在0℃下再搅拌30min。向得到的反应混合物中，加入n-{9-[(2r,4s,5r)-4-羟基-5-(羟甲基)氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(7g，19.70mmol)。在0℃下搅拌2h后，将混合物升至室温，并在25℃下搅拌2h。减压除去挥发性物质，并将由此得到的粗化合物经combiflash(2％meoh的ch2cl2溶液)纯化，得到n-{9-[(2r,4s,5s)-5-[(苯甲酰基硫烷基)甲基]-4-羟基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(5g，53％)，为浅黄色粘稠油状物。(ms:(esi):m/z＝475.6[m+h]⁺).

将naoh水溶液(0.5m，25.25ml)和thf-meoh混合物(6:4，75ml)用氩气鼓泡30min。在氩气气氛下，将n-{9-[(2r,4s,5s)-5-[(苯甲酰基硫烷基)甲基]-4-羟基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(2.0g，4.21mmol)溶解于氩气冲洗的thf-meoh(6:4，75ml)溶液中，并冷却至0℃至-5℃。向所述溶液中，加入naoh溶液(0.5m，25.25ml，12.62mmol)，并将反应混合物在0℃至-5℃下搅拌30min。在0℃下，加入柠檬酸(3.18g，15.14mmol)。向反应混合物中，加入饱和nahco3溶液(70ml)，并用乙酸乙酯(75mlx3)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用na2so4干燥，过滤，并减压浓缩，得到n-{9-[(2r,4s,5s)-4-羟基-5-(硫烷基甲基)氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(1.9g，粗品)，为无色粘稠油状物。(ms:(esi):m/z＝372.1[m+h]⁺).

在25℃下，向n-{9-[(2r,4s,5s)-4-羟基-5-(硫烷基甲基)氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(1.9g，粗品，与吡啶共沸蒸馏的)的干燥吡啶(10ml，氩气冲洗的)溶液中，加入dmtrcl(1.56g，4.60mmol)，并将反应混合物在25℃下搅拌4h。减压除去挥发性物质，得到粗化合物。将得到的粗品经combiflash(0.5％meoh的ch2cl2溶液，含0.5％三乙胺)纯化，得到n-{9-[(2r,4s,5s)-5-({[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]硫烷基}甲基)-4-羟基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(1.2g，两步后42％)，为灰白色固体物。(ms:(esi):m/z＝674.3[m+h]⁺).

在25℃、氩气气氛下，将5-乙基巯基-1h-四唑的溶液(1.93g，14.84mmol，60ml干燥乙腈中的0.25m溶液)加入到搅拌的n-{9-[(2r,4s,5s)-5-({[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]硫烷基}甲基)-4-羟基氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(5g，7.42mmol)的干燥ch2cl2(120ml)溶液中。向得到的反应混合物中，加入2-氰乙基四异丙基亚磷酰二胺(4.71ml，14.84mmol)，并在25℃下继续搅拌4h。然后，将反应混合物用ch2cl2(250ml)稀释，并倒入饱和nahco3溶液(250ml)中，分离有机层，并将水层用ch2cl2(250mlx2)萃取。将合并的有机层经na2so4干燥，并减压浓缩，得到粗化合物，将其经胺硅胶(80％ch2cl2的己烷溶液)纯化，得到不纯的化合物(3.1g)，将其再根据上述纯化，得到所需的n-{9-[(2r,4s,5s)-5-({[双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基]硫烷基}甲基)-4-({[双(丙烷-2-基)氨基](2-氰基乙氧基)磷烷基}氧基)氧戊环-2-基]-9h-嘌呤-6-基}苯甲酰胺(5’-巯基-dna腺苷亚磷酰胺，2.32g，36％)，为白色固体物。(ms:(esi):m/z＝874.8[m+h]⁺).

实施例3

在寡核苷酸合成中引入3’-sdna单体

利用bioautomation的mermade12自动dna合成仪合成寡核苷酸。利用载有通用接头的可控孔径玻璃载体在1μmol规模进行合成。

在用于dna和lna亚磷酰胺偶联的标准循环方法中，用3％(w/v)三氯乙酸的ch2cl2溶液(应用三次，每次200μl30秒)完成dmt脱保护。将各自的亚磷酰胺采用如下条件偶联三次：100μl0.1m乙腈(或者对于lna-^mec结构单元，乙腈/ch2cl21:1)溶液，以及110μl0.1m的5-(3,5-双(三氟甲基苯基))-1h-四唑的乙腈溶液作为活化剂，和180秒的偶联时间。对于硫氧化，使用0.1m3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮的乙腈/吡啶1:1溶液(3x190μl，55秒)。利用thf/二甲基吡啶/ac2o8:1:1(capa，75μmol)和thf/n-甲基咪唑8:2(capb,75μmol)，持续55秒，完成加帽。

用于引入2’,3’-双脱氧-3’-巯基亚磷酰胺的合成循环包括dmt脱保护，利用3％(w/v)三氯乙酸的ch2cl2溶液，使用三次，每次200μl30秒。亚磷酰胺偶联以如下条件进行10次：用40μl0.1m的乙腈溶液和44μl0.1m的5-(3,5-双(三氟甲基苯基))-1h-四唑的乙腈溶液，以及900秒的偶联时间。偶联后立即如下完成氧化：使用6次200μl2mm的碘的thf/h2o/吡啶77:2:21溶液，每次50秒。利用thf/二甲基吡啶/ac2o8:1:1(capa，75μmol)和thf/n-甲基咪唑8:2(capb,75μmol)，持续55秒，完成加帽。

在标准条件下，利用32％氨水于55℃下持续至少8h，完成核碱基保护基的脱除和从固相载体的裂解。粗的具有dmt的寡核苷酸可利用固相萃取柱纯化或者通过rp-hplc用c18柱纯化，随后用80％乙酸水溶液和乙醇沉淀除去dmt。

实施例4

在寡核苷酸合成中引入5’-s-dna单体

利用bioautomation的mermade12自动dna合成仪合成寡核苷酸。利用载有通用接头的可控孔径玻璃载体在1μmol规模进行合成。

在用于dna和lna亚磷酰胺偶联的标准循环方法中，用3％(w/v)三氯乙酸的ch2cl2溶液完成dmt脱保护(使用三次，每次200μl30秒)。将各自的亚磷酰胺采用如下条件偶联三次：100μl0.1m的乙腈(或者对于lna-^mec结构单元，乙腈/ch2cl21:1)溶液，以及110μl0.1m的5-(3,5-双(三氟甲基苯基))-1h-四唑的乙腈溶液作为活化剂，和180秒的偶联时间。对于硫氧化，使用0.1m3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮的乙腈/吡啶1:1溶液(3x190μl，55秒)。利用thf/二甲基吡啶/ac2o8:1:1(capa，75μmol)和thf/n-甲基咪唑8:2(capb,75μmol)，持续55秒，完成加帽。

用于引入2’,5’-双脱氧-5’-巯基亚磷酰胺的合成循环包括如下的亚磷酰胺结构单元的偶联：利用100μl0.1m的乙腈溶液和110μl0.1m的5-(3,5-双(三氟甲基苯基))-1h-四唑的乙腈溶液，以及180秒的偶联时间。进行三重偶联。根据所需的序列，利用0.1m3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮的乙腈/吡啶1:1溶液(3x190μl，55秒)将合成柱进行硫氧化，或者利用2mm碘的thf/h2o/吡啶77:2:21溶液(6x200μl，55秒)将合成柱进行氧化。利用thf/二甲基吡啶/ac2o8:1:1(capa，75μmol)和thf/n-甲基咪唑8:2(capb,75μmol)，持续55秒，完成加帽。用3％(w/v)三氯乙酸的ch2cl2溶液，使用15次，每次200μl持续30秒，进行dmt脱保护和硫醇的释放。根据如上给出的条件偶联随后的亚磷酰胺结构单元后，利用2mm碘的thf/h2o/吡啶77:2:21溶液(6x200μl，55秒)完成氧化。

还采用以下条件有利地完成dmt脱保护和硫醇的释放(liberate)：在5-30％(v/v)三乙基硅烷的ch2cl2溶液和/或2-10％p-甲氧基苯硫酚的ch2cl2溶液存在下，200μl1-10％(v/v)三氟乙酸或5-10％(w/v)三氯乙酸，使用3-6次，每次持续45秒。

在标准条件下，利用32％氨水于55℃下持续至少8h，完成核碱基保护基的脱除和从固相载体的裂解。粗的具有dmt的寡核苷酸可利用固相萃取柱纯化或者通过用c18柱的rp-hplc纯化，随后用80％乙酸水溶液和乙醇沉淀除去dmt。

实施例5

在寡核苷酸合成中引入5’-s-lna单体

利用bioautomation的mermade12自动dna合成仪合成寡核苷酸。利用载有通用接头的可控孔径玻璃载体在1μmol规模进行合成。

在用于dna和lna亚磷酰胺偶联的标准循环方法中，用3％(w/v)三氯乙酸的ch2cl2溶液完成dmt脱保护(使用三次，每次200μl持续30秒)。将各自的亚磷酰胺采用如下条件偶联三次：100μl0.1m的乙腈(或者对于lna-^mec结构单元，乙腈/ch2cl21:1)溶液，以及110μl0.1m的5-(3,5-双(三氟甲基苯基))-1h-四唑的乙腈溶液作为活化剂，和180秒的偶联时间。对于硫氧化，使用0.1m3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮的乙腈/吡啶1:1溶液(3x190μl，55秒)。利用thf/二甲基吡啶/ac2o8:1:1(capa，75μmol)和thf/n-甲基咪唑8:2(capb,75μmol)，持续55秒，完成加帽。

对于引入2’,5’-双脱氧-5’-巯基lna-亚磷酰胺的合成循环包括如下的亚磷酰胺结构单元的偶联：利用100μl0.1m的乙腈溶液和110μl0.1m的5-(3,5-双(三氟甲基苯基))-1h-四唑的乙腈溶液，以及600秒的偶联时间。进行三重(triple)偶联。根据所需的序列，利用0.1m3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮的乙腈/吡啶1:1溶液(3x190μl，55秒)将合成柱进行硫氧化，或者利用2mm碘的thf/h2o/吡啶77:2:21溶液(6x200μl，55秒)将合成柱进行氧化。利用thf/二甲基吡啶/ac2o8:1:1(capa，75μmol)和thf/n-甲基咪唑8:2(capb,75μmol)，持续55秒，完成加帽。用3％(w/v)三氯乙酸的ch2cl2溶液，使用15次，每次200μl持续30秒，进行dmt脱保护和硫醇的释放。根据如上给出的条件偶联随后的亚磷酰胺结构单元后，利用2mm碘的thf/h2o/吡啶77:2:21溶液(6x200μl，55秒)完成氧化。

还采用以下条件有利地完成dmt脱保护和硫醇的释放：在5-30％(v/v)三乙基硅烷的ch2cl2溶液和/或2-10％p-甲氧基苯硫酚的ch2cl2溶液存在下，200μl1-10％(v/v)三氟乙酸或5-10％(w/v)三氯乙酸，使用3-6次，每次持续45秒。

在标准条件下，利用32％氨水于55℃下持续至少8h，完成核碱基保护基的脱除和从固相载体的裂解。粗的具有dmt的寡核苷酸可利用固相萃取柱纯化或者通过用c18柱的rp-hplc纯化，随后用80％乙酸水溶液和乙醇沉淀除去dmt。

实施例6

3’-s寡核苷酸

根据上文列出的通用方法，制备下述分子：

a、g、c、t表示2’,3’-双脱氧-3’-巯基修饰；

a、g、^mc、t表示lna核苷酸；

a、g、c、t表示dna核苷酸；

所有寡核苷酸制备为完全的硫代磷酸酯(硫原子在末端或在3’-位)。

实施例7

5’-s寡核苷酸

根据上文列出的通用方法，制备下述分子：

a、g、c、t表示2’,5’-双脱氧-5’-巯基修饰；

a、g、^mc、t表示lna核苷酸；

a、g、c、t表示dna核苷酸；

所有寡核苷酸制备为完全的硫代磷酸酯(硫原子在末端或在5’-位)。