靶向多功能聚合物纳米探针的制备及其在对含TK细胞显像中的应用的制作方法

本发明属于高分子材料及生物成像领域，涉及一种新型两亲性嵌段聚合物、其后修饰产物及应用，尤其是一种新型靶向多功能聚合物纳米粒子及其制备和其在对TK转染细胞特异性显像中的应用。

背景技术：

目前常用的成像分析方法有磁共振成像(MRI)、光学成像、放射性核素显像。然而，在目前所有的分子影像技术中，各种不同的影像技术分别具有各自的优势，但是不同的显像技术也同时存在自身难以克服的缺点或局限性。光学成像能够提供细胞及分子水平上高分辨率的结构信息.但是光学显像的穿透性限制，只能对皮下组织进行成像；MRI技术对此却不受此限制，它能提供三维解剖式的结构信息，但是灵敏度比较低。放射性核素显像灵敏度很高，但分辨率较差。因此，将两种或者多种成像方式融合进行双模态或多模态成像，对发展高灵敏、高特异性示踪方法具有重要的意义。

迄今为止，聚合物材料的纳米粒子广泛用于生物领域，这是由于聚合物具有以下优点：(1)聚合物分子量大，作为载体能使药物在病灶部位停留较长时间；(2)可以把一些具有靶向作用或治疗显像组分通过化学键合的方式结合到聚合物上；(3)聚合物和降解产物对机体毒副作用小，能避免载体材料在人体器官组织内积聚，产生毒副作用。两亲性嵌段共聚物在水溶液中可以自组装形成胶束，也是一种聚合物纳米粒子。这些纳米粒子大小分布很窄，具有核壳结构，疏水链段之间聚集形成粒子的内核，外壳则由亲水链段形成刷状结构，这些亲水链段通常具有生物相容性并对粒子分散在水中起立体稳定作用，在亲水链段末端还可引入具有靶向功能的组分。

单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV1-TK)基因是基因显像技术中较为常见的报告基因。其能够将核苷类似物磷酸化为5-磷酸核苷，5-磷酸核苷因不能跨越细胞膜，所以将滞留在细胞中，实现在特定TK转染细胞中的聚集。¹⁸F取代的喷昔洛韦小分子药物在正电子发射断层扫描(PET)示踪TK转染细胞中取得了很高的对比度，但是将其作为靶向基团的研究却没有报道。

本发明公开了一种新型靶向多功能聚合物纳米离子及其制备方法。采用可逆-加成-断裂-链转移聚合(RAFT聚合)的方式得到一种新型两亲性嵌段聚合物，通过氨解和酰胺化反应对聚合物进行功能化后修饰。利用巯烯点击反应，将喷昔洛韦药物键接到聚合物末端。在水溶液中自组装成纳米粒子后可以对含TK报告基因的细胞进行特异性识别。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新型两亲性嵌段聚合物、其后修饰产物及其应用，尤其是靶向多功能聚合物纳米探针及其在对TK转染细胞特异性显像中的应用。

新型两亲性嵌段聚合物，是采用含三硫酯的链转移剂以RAFT聚合的方式得到第一嵌段为聚Boc保护的2-氨基丙烯酸乙酯(BEA)、第二嵌段为寡聚PEG丙烯酸酯单体(OEGA)和五氟苯酚丙烯酸酯无规共聚的嵌段聚合物；所述的新型两亲性嵌段聚合物的结构式为：

其中，R1为R2为m、n、x、y均为聚合度，可取任意值。

将得到的嵌段聚合物进行后修饰：将聚合物中的五氟苯酚酯基团用含氨基的功能分子进行氨解形成酰胺，从而将功能分子键接到聚合物侧链上，得到产物1；再将产物1中BEA链段在三氟乙酸中进行脱boc保护，得到的氨基与含酯基或醛基的分子反应，得到产物2。优选的，所述的含氨基的功能分子为氨基酸、氨基钆特酸、阿霉素、或紫杉醇。优选的，所述的含酯基或醛基的分子为罗丹明、荧光素、联吡啶、或喜树碱。

对于上述聚合物后修饰，当所述的功能分子采用钆特酸DOTA，即以氨基-DOTA氨解五氟苯酚酯，得到产物1即DOTA修饰的聚合物，可以与金属离子(Gd³⁺,⁶⁸Ga³⁺,或¹¹¹In³⁺等)进行配位，作为探针用于磁共振成像、正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)；当所述的含酯基或醛基的分子采用花青素染料Cy5.5，与水解的氨基进行酰胺化反应，可以作为探针用于近红外荧光成像。

五氟苯酯被氨解的过程中，端基的三硫酯也会被氨解为巯基，巯基可以与含双键的化合物进行巯烯点击反应。

通过上述的巯烯点击反应，可以将喷昔洛韦药物键接到聚合物末端，得到靶向聚合物，将靶向聚合物分散于去离子水中组装成纳米粒子，作为纳米探针用于对含TK报告基因的细胞进行特异性显像。

本发明的有益效果是：

本发明设计了一种新型的两亲性嵌段聚合物，并对其进行后修饰，在水溶液中可自组装形成粒径30nm左右的纳米粒子。对上述嵌段聚合物进行后修饰的产物可以应用于近红外成像，磁共振成像，及PET成像中。此外，通过引入喷昔洛韦获得靶向聚合物，可使得纳米粒子对TK转染的细胞具有特异性识别，从而进行特异性多模态显像。

附图说明

图1为PBEA的合成路线。

图2为PBEA-b-POEGAPF的合成路线。

图3为PBEA和PBEA-b-POEGAPF的GPC曲线。

图4为PBEA-b-POEGAPF后修饰和自组装的示意图。

图5为自组装的纳米粒子的粒径分布图。

图6为纳米粒子对两种293T细胞显像的激光共聚焦图像。

图7为纳米粒子对TK转染293T细胞显像的激光共聚焦图像。

具体实施方式

仪器与材料

2-氨乙基丙烯酸酯，二碳酸二叔丁酯，OEGA，五氟苯酚，丙烯酰氯，二甲氨基吡啶(DMAP),偶氮二异丁腈(AIBN)，喷昔洛韦(PCV)，GdCl3·6H2O等购于百灵威试剂公司。二甲基甲酰胺(DMF)，石油醚，无水乙醚，二氯甲烷，三乙胺等均购于国药化学试剂有限公司。

实施例1

嵌段聚合物的合成步骤：

1)PBEA的合成

称取215mg(1mmol)BEA 1.1mg(0.006mmol)AIBN,9.0mg(0.03mmol)CTA溶解在1.0mL的THF中。将聚合瓶冷冻-抽真空-解冻循环三次，然后通入氮气，放入65℃油浴中反应8h。后在液氮中终止反应，用THF稀释，然后在石油醚中沉淀，离心分离。如此溶解沉淀三次，得到无色粘稠聚合物135mg，真空条件下室温干燥。2)PBEA-b-PFOEG的合成

58mg PBEA，240mg(0.5mmol)OEGA，24mg(0.1mmol)PFBA，0.5mg(0.003mmol)AIBN溶解在1.0mL的THF中，PBEA:OEGA:PFBA＝1:50:10。将聚合瓶冷冻-抽真空-解冻循环三次，然后通入氮气，放入65℃油浴中反应8h。后在液氮中终止反应，用THF稀释，然后在石油醚中沉淀，离心分离。如此溶解沉淀三次，得到无色粘稠聚合物240mg，真空条件下室温干燥。

实施例2

嵌段聚合物的后修饰步骤：

1)DOTA的后修饰

称取159mg PBEA-b-PFOEG,39mg氨基-DOTA,80mg三乙胺溶于二氯甲烷中，室温反应24h，在石油醚中沉淀，离心得到DOTA修饰的聚合物，该产物通过核磁验证。

2)Cy5.5和PCV的后修饰

将步骤1)所得聚合物溶于1ml三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂中，室温反应4h，将溶剂旋蒸除去，加二氯甲烷溶解，在乙醚中沉淀，离心得到脱掉Boc保护的聚合物。随后将其溶解在二氯甲烷中，加入7mg Cy5.5,17mg己二酸双NHS酯，12.5mg丙烯酸酯修饰的喷昔洛韦和36.6mg DMAP，同时进行荧光染料的修饰，聚合物的交联和PCV的巯烯点击反应。反应24h后在石油醚中沉淀，得到纳米粒子。

3)金属离子的后修饰

将100mg上述纳米粒子和326mg GdCl3·6H2O溶于1mL DMF，室温搅拌24h。随后缓慢加入5ml水，透析除去多余的DMF，得到在水中分散的纳米粒子溶液。

实施例3

细胞成像实验

293T细胞中加入含TK基因的病毒，利用病毒感染使细胞含有TK报告基因，随后除去培养基和病毒，加入495ul新的培养基和5ul纳米粒子溶液，共培养24h后除去培养基，用培养基洗涤，进行染色贴片，进行激光共聚焦测试。显像结果如图6所示，因为TK转染的细胞中含有绿色荧光蛋白(GFP)，所以左上图有绿色荧光，而右侧正常细胞则没有，证明TK基因的成功转染。通过对比左右两图，修饰PCV的纳米探针可以对TK转染的细胞显像，而正常细胞则没有荧光信号。说明修饰PCV的纳米离子容易在TK转染的细胞中滞留，从而实现对TK转染细胞的特异性显像。图7是在同一片区域中含有转染和未转染的293T细胞，通过对比我们发现含有GFP显像的细胞同样可以进行Cy5.5的近红外显像，而未有GFP的则不能进行近红外显像，证明了含PCV纳米探针和tk转染细胞的特异性结合。