一种人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法及应用与流程

本发明属于细胞因子技术领域，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法及应用。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

干细胞是一种具有多向分化潜能及无限自我更新复制能力的细胞，在一定条件下，可分化为特定的组织。干细胞在生长、增殖、分化过程中会向胞外分泌促进细胞生长及调控周围环境的细胞因子等活性物质。

间充质干细胞具有自我复制能力及多项分化的潜能，在体内或特定条件下可分化为功能性细胞，在增殖、分化过程中分泌多种生长因子，改善组织器官内部微环境，有效调节内分泌系统和荷尔蒙系统；还可促进胶原蛋白生成。

细胞因子具有多种功能，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能。细胞因子能促进皮肤组织的生长繁殖，通过与细胞表面特异受体结合，调控皮肤上皮，内皮和基质细胞的分裂、繁殖和生长分化，促进细胞代谢，增强氧化作用；能促进与皮肤损伤有关细胞的迅速生长繁殖，并调节细胞间基质的合成、分泌及分解；能促进角质层细胞的再生，加速皮肤角质层和基质层的修复，促进人体皮肤细胞的生长；能增强皮肤细胞的蛋白质的合成和细胞代谢，具有延缓皮肤细胞衰老、促进表皮细胞的修复和生长作用，使皮肤光滑丰润。

将间充质干细胞用于医疗美容领域，已经成为近些年利用再生医学技术进行美容的研究热点。常见的形式有干细胞皮肤注射美容、干细胞培养液直接使用、干细胞静脉回输。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)干细胞注射，对细胞的质量要求较高，且需要供体的细胞，注射的细胞不一定能完全成活；现有技术没有很好的解决；

(2)干细胞培养液直接使用，培养液中可能含有死细胞裂解的成分和少量血清成分。

(3)专利cn101461772a中，采用pbs培养4-24h，收集细胞因子。此方法中细胞已裂解死亡，细胞因子收集后，细胞不可以再继续传代培养，细胞裂解所释放的毒素也无法除去。

解决上述技术问题的难度和意义：

本发明的细胞因子可用于美容及皮肤修复领域，达到改善肤色、恢复皮肤年轻态的效果。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法及应用。

本发明是这样实现的，一种人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法，所述人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法选用易于获取的脐带组织，经体外干细胞分离与扩大培养，得到纯度较高的干细胞；再将干细胞进行工厂化放大培养，收集细胞培养液，经培养液的浓缩、蛋白含量测定、质检，得到细胞因子。

进一步，所述获取的脐带组织免疫源性最低、干细胞性能最强。

进一步，所述人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法，具体包括：

步骤一，人脐带间充质干细胞的原代分离与培养；

步骤二，人脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定；

步骤三，细胞因子生产与检测。

进一步，所述步骤一，具体包括：

1)将接收的临床检测合格的脐带组织放置在含50-100ml生理盐水的无菌采集瓶中，密封保存；

2)在超净工作台内，从采集瓶中取出脐带，放入培养皿中，用长柄手术剪将脐带剪成长3-4cm小段，用含1％的双抗生理盐水重复清洗3-5次，去除血渍；

3)使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用止血钳撕下两条实心动脉和外膜，其余为华通氏胶即位于羊膜与血管之间的白色结缔组织；用生理盐水冲洗华通氏胶，重复清洗2-3次；

4)将获得的胶体转移至另一平皿中，用眼科弯剪将胶体剪成1mm³×1mm³组织块，收集至50ml离心管中，用生理盐水清洗2-3次，再加入培养基浸泡过夜；组织块用pbs冲洗3遍后，接种于10mm或15mm直径无菌培养皿中，组织块儿间隔约2mm，组织贴好后将培养皿小心放入培养箱中约30min，随后取出，加入含10％fbs，1％双抗的培养基，加入量淹没组织块；

5)细胞贴壁后，第2天首次半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每2～3d换液1次；细胞融合达到80％后，去除组织块，组织块可重复贴壁三次，用0.25％的胰酶消化，按1∶2～1∶3的比例传代，继续扩增培养。

进一步，所述步骤二，具体包括：

取p5代以内细胞，胰酶消化计数后，按1×10⁵-1×10⁶/管的密度接种至7个1.5mlep管中，每管加入1mlpbs，混匀细胞悬液，1000rpm/min，离心5min；离心完毕后，弃掉上清，每管加入100μl的pbs重悬细胞，并在避光条件下分别加入以下流式抗体5μl：peanti-humanhla-dr、peanti-humancd105、fitcanti-humancd90、fitcanti-humancd34、fitcanti-humancd45、fitcanti-human29；

抗体加入后用200μl微量移液器轻轻混匀，不产生气泡，4摄氏度避光孵育30min。

孵育结束后，用pbs洗涤细胞两次，每次用1ml；1000rpm/min，离心5min；离心后用500μlpbs重悬细胞后上流式仪检测。

进一步，所述步骤三，具体包括：

细胞培养融合达到80％后，吸去旧培养基，用不含双抗的pbs清洗3遍，加入不含1％双抗、10％fbs的新基础培养基,置于37℃培养72h,收集细胞上清液，将上清液离心，去除散落的细胞(包括死细胞)，细胞上清液收集完后，加0.25％的胰酶消化，继续扩增传代；

超滤杯清洗、高压灭菌；取滤膜置于无菌培养皿中，用75％酒精清洗3遍，浸泡10min，夹住边缘，用无菌注射用水冲洗3遍，在注射用水中浸泡过夜备用；

将磁力搅拌器用酒精擦拭，放入超净工作台，把灭菌好的超滤杯喷酒精，在超净台中安装好，放置搅拌器上，将上清液加入超滤杯，拧好盖子，插上气管，慢慢打开气阀，压力控制在0.25～0.36mpa，按10％的比例收集浓缩液；

浓缩液用50ml注射器通过0.22um滤膜进行过滤除菌，收集截留液于无菌瓶中，制得细胞因子。可在-20℃长期保存，以备使用。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述的人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法制备的冻干粉。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述的人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法制备的直接适量涂于患处或面部的化妆品。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明选用人体免疫源性最低、干细胞性能最强、易于获取的脐带组织，经体外干细胞分离与扩大培养，得到纯度较高的干细胞。再将干细胞进行工厂化放大培养，收集细胞培养液，经培养液的浓缩、蛋白含量测定、质检，得到细胞因子。该细胞因子可用于美容及皮肤修复领域，达到改善肤色、恢复皮肤年轻态的效果。

本发明的优点有：

成分：采用此种工艺制备的细胞因子含有多种干细胞所分泌的细胞因子；

使用方法：可将稀释的细胞因子注入冻干粉，也可以直接适量涂于患处或面部(按照疗程指示使用)；按一定的有效浓度加入化妆品。

作用：在美容及皮肤修护领域使用，可修复表皮及基底层受损的皮肤细胞，达到皮肤美容的效果。

与现有技术(比如cn101461772a)的对比，如下表：

本发明的细胞因子直接涂于面部，效果明显改善。

附图说明

图1是本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的ucmscs细胞表面标记检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明选用人体免疫源性最低、干细胞性能最强、易于获取的脐带组织，经体外干细胞分离与扩大培养，得到纯度较高的干细胞。再将干细胞进行工厂化放大培养，收集细胞培养液，经培养液的浓缩、蛋白含量测定、质检，得到细胞因子。该细胞因子可用于美容及皮肤修复领域，达到改善肤色、恢复皮肤年轻态的效果。

如图1所示，本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法，其步骤如下：

步骤一：人脐带间充质干细胞的原代分离与培养

1)将接收的临床检测合格的脐带组织放置在含50-100ml生理盐水的无菌采集瓶中，密封保存。使用保温箱(含冰袋运输)，送回无菌实验室。

2)在超净工作台内，从采集瓶中取出脐带，放入培养皿中，用长柄手术剪将脐带剪成长3-4cm小段，用生理盐水(含1％的双抗)重复清洗3-5次，去除血渍，达到清澈。

3)使用眼科弯剪沿静脉血管螺旋走势剪开脐带，将静脉血管去除干净，再使用止血钳撕下两条实心动脉和外膜，其余为华通氏胶即位于羊膜与血管之间的白色结缔组织。用生理盐水冲洗华通氏胶，重复清洗2-3次。(所述静脉和动脉血管的去除，是为了避免所分离到的细胞含有血管细胞的成分，影响细胞的纯度。)

4)将获得的胶体转移至另一平皿中，用眼科弯剪将胶体剪成约1mm3×1mm3组织块，收集至50ml离心管中，用生理盐水清洗2-3次，再加入培养基浸泡过夜。组织块用pbs冲洗3遍后，接种于10mm或15mm直径无菌培养皿中，组织块儿间隔约2mm，组织贴好后将培养皿小心放入培养箱中约30min，随后取出，小心加入(含10％fbs，1％双抗)的培养基，加入量淹没组织块即可，切记加液动作轻柔，勿将组织块冲起。

5)细胞贴壁后，第2天首次半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每2～3d换液1次。在倒置显微镜下观察，细胞融合达到80％后，去除组织块(可重复贴壁3次)，用0.25％的胰酶消化，按1∶2～1∶3的比例传代，继续扩增培养。

步骤二：人脐带间充质干细胞表面标志物的鉴定

1)取p5代以内细胞，胰酶消化计数后，按1×105-1×106/管的密度接种至7个1.5mlep管中，每管加入1mlpbs，混匀细胞悬液，1000rpm/min，离心5min。离心完毕后，弃掉上清，每管加入100μl的pbs重悬细胞，并在避光条件下分别加入以下流式抗体5μl：peanti-humanhla-dr、peanti-humancd105、fitcanti-humancd90、fitcanti-humancd34、fitcanti-humancd45、fitcanti-human29。

2)抗体加入后用200μl微量移液器轻轻混匀，注意不要产生气泡，4度避光孵育30min。

3)孵育结束后，用pbs洗涤细胞两次，每次用1ml。1000rpm/min，离心5min。离心后用500μlpbs重悬细胞后上流式仪检测。

步骤三：细胞因子生产与检测

1)细胞培养融合达到80％后，吸去旧培养基，用pbs(不含双抗)清洗3遍，加入新基础培养基(不含1％双抗，10％fbs),置于37℃培养72h,收集细胞上清液。

2)超滤杯清洗、高压灭菌；取一张滤膜置于无菌培养皿中，用75％酒精清洗3遍，浸泡10min，用镊子夹住边缘，用无菌注射用水冲洗3遍，在注射用水中浸泡过夜备用。

3)将磁力搅拌器用酒精擦拭，放入超净工作台，把灭菌好的超滤杯喷酒精，在超净台中安装好，放置搅拌器上，将上清液加入超滤杯，拧好盖子，插上气管，慢慢打开气阀，压力控制在0.25～0.36mpa，按10％的比例收集浓缩液。

4)浓缩液用50ml注射器通过0.22um滤膜进行过滤除菌，收集截留液于无菌瓶中，即为细胞因子。

下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

外观：澄清、透亮无浑浊液体。

ph值：6.5-7.5之间。

干细胞因子毒性评价：合格样本应不会引起明显的dna损伤。可通过单细胞凝胶电泳(彗星实验)检测样本对细胞如人成纤维细胞等的dna损伤作用，评价样本毒性。

染色体畸变测试：合格样本不会因起受试细胞染色体畸变率的增高。可通过检测样本对受试细胞染色体数目、结构等影响，评价样本的致突变性。

急毒实验：合格样本不会引起动物不良反应、死亡。可通过动物经口急毒实验、经皮急毒实验等评估动物是否有任何不良反应或动物死亡现象。

光毒性试验：合格样本不会引起动物皮肤刺激反应。可通过动物皮肤进行样本光毒性验证，评估样本是否会引起皮肤刺激性反应。

急性眼刺激实验：合格样本不会引起动物眼部刺激反应。可通过动物眼部进行样本眼刺激验证，评估样本是否会引起眼部刺激性反应。

蛋白活性验证：合格样本能够促进细胞的生长作用。通过测定样本对受试细胞，如人成纤维细胞等增殖活力的影响，评价样本含有蛋白的功效。

微生物检测，依据《中华人民共和国药典》2015版第三部中的方法检测。标准为：细菌：阴性，真菌：阴性，支原体：阴性，内毒素：≤0.5eu。

蛋白浓度检测，即采用bca蛋白浓度测定法对细胞因子总蛋白浓度进行测定。标准为：蛋白浓度≥0.5mg/ml。

本发明中，所述培养基，遵循以下标准：

(1)所有成分应有足够纯度(例如水应符合注射用水标准)，残留的培养基或受者不应有明显影响。每个培养细胞的部门应保证所用的各种成分的质量都经过鉴定，并制定标准规格。若用商业来源的培养基，应由厂商提供全部培养基成分资料。

(2)血清的使用

除能证明体细胞培养或激活需要血清外，应避免使用任何血清。如必须使用动物血清，应考虑每批血清都应对潜在的外源因子(包括人的病原体)进行检查、筛选。例如，牛血清应进行病毒和支原体污染的检查筛选等。

(3)人血液成份的应用

若培养基中含有人的血液成份，如白蛋白及转铁蛋白，应说明其来源、批号、质量检定合格报告，应尽可能用已批准上市的产品。

(4)抗生素的应用

培养基中尽量避免使用内酰胺类抗生素。另外，应做不加抗生素的培养对照，以证明能够保持无菌。

(5)其他成份

应充分说明体细胞培养和激活时所采用的有丝分裂原、抗体、细胞因子、化学物质，以及培养物。应尽可能采用国家批准临床应用的产品。如上述成份的生产厂家已获国家批准临床应用，可以引用该批件。如上述成份的生产厂家未获国家批准临床应用，应参照国家对相应产品的质控要点，提供质量标准，并对每批产品提供详尽的质量检定报告。

(7)培养基的检定

对每批制成的培养基(例如已加入血清及生长添加物等)应进行无菌试验。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

本发明实施例提供的人脐带间充质干细胞细胞因子的制备方法中，

细胞因子生产与检测中，

按照以下细胞因子生产配方(以1lucmscs培养液原液用量计算)，进行细胞因子的生产：

图2是本发明实施例提供的ucmscs细胞表面标记检测结果图。

图中a、b、c、d、e、f、g分别为不同的ucmscs细胞表面标记检测结果图。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。